Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности организации и эволюции митохондриальных геномов байкальских губок

ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Особенности организации и эволюции митохондриальных геномов байкальских губок"

На правах рукописи

МАЙКОВА Ольга Олеговна

Особенности организации и эволюции митохондриальных геномов байкальских губок (ЬиЬотігскіісІае)

03.01.07 - молекулярная генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005062290

Новосибирск - 2013 г.

005062290

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном, учреждении науки Лимнологическом институте СО РАН

Научный руководитель:

Беликов Сергей Иванович д. б. н., профессор, зав. лабораторией аналитической биоорганической химии, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск

Официальные оппоненты:

Дымшиц Григорий Моисеевич, д. б. н., профессор, зав. кафедрой естественных наук СУНЦ при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

Омельянчук Леонид Владимирович, д. б. н., i, ^

зав. лабораторией генетики клеточного цикла, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии РАН, г. Москва.

Защита состоится: /4 a^aj* 2013 г. на заседании совета Д 003.045.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8/2. Тел: +7- 952-916-7858. e-mail: kokoza@mcb.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН Автореферат разослан « 3 » аъ^//^, 2013 г.

Ученый секретарь //

диссертационного совета, к.б.н. РСег^л^.— Е. Б. Кокоза

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время большое внимание уделяется изучению различных аспектов биологии губок. Рост интереса к исследованиям этих животных обусловлен, прежде всего, их экологической значимостью: губки являются биофильтраторами, и, как следствие, биоиндикаторами состояния водной среды. Кроме того, губки представляют собой уникальный объект для изучения процессов микро- и макроэволюции, поскольку являются начальным звеном эволюции многоклеточных животных на Земле. В последние десятилетия возросло количество работ, посвященных молекулярно-филогенетическим и эволюционным исследованиям митохондриальной ДНК (мтДНК). К настоящему времени эволюция митохондриального генома губок на высоких таксономических уровнях достаточно хорошо изучена. Однако большинство исследованных митохондриальных геномов губок класса Demospongiae принадлежат к отдаленным видам (Wang, Lavrov, 2007, 2008; Lavrov, 2005, 2010; Lavrov, Lang, 2005; Erpenbeck, 2007; Eve et al., 2010; Belinky et al, 2008). Поэтому к настоящему времени изменения в мтДНК на близкородственном уровне остаются малоизученными. Чтобы понять, какие первичные мутации происходят в мтДНК в процессе эволюции, необходимо провести сравнение нескольких геномов близкородственных видов губок. В связи с этим виды байкальского эндемичного семейства Lubomirskiidae представляют собой интересный объект для изучения микроэволюционных процессов. Исследование полных митохондриальных геномов байкальских губок интересно не только для понимания глобальных эволюционных процессов, но и направлено на решение таких актуальных в настоящее время проблем, как филогенетические отношения внутри семейства Lubomirskiidae и идентификация видов. Данное исследование также позволяет углубиться в понимание механизмов эволюции и функционирования митохондриальной ДНК в целом.

Цель и задачи исследования.

Изучить особенности организации и эволюции митохондриальных геномов байкальских эндемичных губок семейства Lubomirskiidae.

Для достижения цели были сформулированы следующие задачи:

1) Определить нуклеотидные последовательности полных митохондриальных геномов губок семейства Lubomirskiidae, принадлежащих к разным родам: Rezinkovia echinata, Swartschewskia papyracea, Baikalospongia intermedia morpha profundalis. Провести сравнительный анализ их нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей с аналогичными последовательностями байкальской губки Lubomirskia baicalensis и космополитного вида Ephydatia muelleri из базы данных

2) Провести сравнительный и филогенетический анализы последовательностей митохондриальных геномов байкальских губок с последовательностями митохондриальных ДНК других губок класса Demospongiae.

3) Установить относительные скорости эволюции митохондриальной ДНК байкальских губок с помощью филогенетического анализа.

4) Вычислить скорости накопления нуклеотидных замен в кодирующих последовательностях мтДНК байкальских губок с учетом палеонтологических данных о времени дивергенции семейства Lubomirskiidae около 25-30 млн. лет назад.

5) Провести анализ эволюционной истории губок семейства Lubomirskiidae на основе нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей мтДНК.

6) Исследовать особенности организации и эволюции межгенных спейсеров митохондриальной ДНК байкальских губок

Научная новизна.

Впервые в результате проведенной работы определены нуклеотидные последовательности полных митохондриальных геномов представителей разных родов байкальского семейства Lubomirskiidae: Baikalospongia intermedia profundalis, Rezinkovia echinata и Swartschewskia papyracea. На основе анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей впервые выявлены особенности организации и эволюции мтДНК байкальских губок: разная скорость эволюции последовательностей мтДНК среди исследованных видов Lubomirskiidae. Также на примере байкальских эндемичных губок впервые показана быстрая эволюция межгенных спейсеров на близкородственном уровне.

Впервые на основе существующих палеонтологических данных о времени дивергенции семейства Lubomirskiidae с помощью

молекулярно-филогенетических методов реконструирована эволюционная история трех видов байкальских губок.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Настоящая работа вносит существенный вклад в понимание механизмов эволюции и функционирования митохондриального генома животных в целом и процесса эволюции семейства Lubomirskiidae в частности.

Материалы диссертационной работы могут быть полезны при проведении таксономической ревизии байкальских эндемичных губок.

Апробация результатов.

Материалы диссертации были представлены: на IV международной научной конференции «Биоразнообразие и роль животных в экосистемах» (Днепропетровск, 2007), на X съезде гидробиологического общества при РАН (Владивосток, 2009), на ежегодном съезде «Общества общей и сравнительной биологии» (США, Сиэтл, 2010), на восьмой международной конференции по губкам «VIII World Sponge Conference» (Гирона, Испания, 2010), на V Верещагинской Байкальской конференции (Иркутск, 2010), на II международной научной конференции «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии» (Улан-Удэ, 2011), на II международной научно-практической конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 2011), на 3-й Московской международной конференции «Молекулярная филогенетика MolPhy-3» (г. Москва, 2012).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. К особенности организации митохондриального генома байкальских эндемичных губок относится быстрая экспансия межгенных районов, вызванная внедрением и распространением множества инвертированных последовательностей.

2. Виды семейства Lubomirskiidae обладают разной скоростью накопления нуклеотидных замен в мтДНК, но в среднем в несколько раз ниже скорости эволюции мтДНК других групп животных.

3. Глубоководный вид В. intermedia profundalis является представителем наиболее древней эндемичной спонгиофауны. Время дивергенции видов L. baicalensis и R. echinata не превышает 5 миллионов лет.

Личный вклад соискателя. Выделение ДНК, амплификация и создание библиотек клонов фрагментов митохондриальных геномов, определение нуклеотидных последовательностей межгенных районов мтДНК, а также анализ полученных данных выполнены автором самостоятельно.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа включает следующие разделы: введение, 3 главы (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), заключение, выводы, список используемой литературы и приложение. Работа изложена на 127 страницах, иллюстрирована 29 рисунками и 12 таблицами. Список литературы содержит 8 отечественных и 147 зарубежных источников.

Благодарности.

Автор выражает благодарность своему руководителю д. б. н., профессору С. И. Беликову. Автор глубоко признателен профессору Д. В. Лаврову, в чьей лаборатории было проведено определение нуклеотидных последовательностей

митохондриальных геномов губок. Огромную благодарность автор выражает д. б. н. Д. Ю. Щербакову за помощь в обработке данных и ценные замечания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для определения полных нуклеотидных последовательностей митохондриальных геномов были выбраны образцы губок байкальского семейства Lubomirskiidae, относящихся к разным родам: Rezinkovia echinata, Swartschewskia раругасеа и Baikalospongia intermedia morphaprofundalis.

Амплификацию митохондриальных геномов проводили в виде пяти фрагментов длиной от 3 до 8 т.п.н. с помощью специфических праймеров, сконструированных на основе последовательности мтДНК байкальской губки L. baicalensis, гомологичных консервативным участкам белок-кодирующих генов: lb-cob-fl (GGATTTAGTGTCTCAAATGCAAC), lb-cob-rl

(TTTGATCCATCCTCATGTAAAGC), lb-coxl-fl (GATAGGTACAG С ATTTAGTATG С), lb-coxl-rl

(CATACAAATAATGGCAGTCTATCC), lb-cox2-fl

(TGTTCCTATACAAACACAAGTGC), lb-cox2-rl (TTAACTGATA GGGATGGAACAGC), lb-nad5-fl

(CTATTATGTTTAATTGAATTCGGTAC), lb-nad5-rl

(ATTAGGCGTCACTAATAAACCAG), lb-rns-í2 (CCTGAAG AGTACGATCGC), lb-rns-rl (TAAGGACCTGACGTCATC).

Амплификацию и секвенирование фрагментов межгенных районов мтДНК проводили с использованием специфических праймеров: (trnY-trnM_L) 5'-GATGGCAGAGCGGTAATGC-3 (trnM-trnY_R) 5 '-GTAGGTTCGAGTCCTGCCT-3'. Сбор консенсусных последовательностей трех митохондриальных геномов байкальских губок осуществляли при помощи программ STUDEN (Staden, 1996), MAFFT и BioEdit.

Скорости синонимичных (dS) и несинонимичных замен (dN), а также их соотношение (dN/dS) для каждого митохондриального гена и всей кодирующей последовательности определяли при помощи программы PAML (Yang, 1997). Модели вторичных структур межгенных районов мтДНК были получены с помощью Mfold (версия 3.2) (Zuker, 2003) (при температуре 4° С) и пакета программ Vienna RNA (RNAfold, RNAalifold) (Hofacker, 2003).

Для проведения филогенетического анализа модели нуклеотидных и аминокислотных замен для каждого гена определяли с помощью программ jModelTest (Posada 2008) и ProtTest (Abascal at al., 2005) соответственно, согласно критерию Akaike (AIC). Филогенетические деревья строили байесовским методом (Bayesian method, MB), используя программу MrBayes версии 3.2. (Ronquist, Huelsenbeck, 2003). Для оценки предположительного времени кладогенетических событий в эволюции байкальского семейства Lubomirskiidae применяли анализ «молекулярных часов», основываясь на палеонтологических данных о дивергенции семейства Lubomirskiidae около 30 млн. лет назад (Мартинсон, 1940).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Определение нуклеотидных последовательностей

Определены последовательности трех полных митохондриальных геномов байкальских губок, принадлежащих к разным родам байкальского эндемичного семейства Lubomirskiidae: Rezinkovia echinata, Swartschewskia papyracea, Baikalospongia intermedia morpha profundalis (глубоководная губка). Для анализа внутривидовой и межвидовой вариабельности межгенных районов митохондриального генома байкальских губок выбраны

протяженные участки между генами тРНК-Met и тРНК-Ile, тРНК-Ие и тРНК-Tyr. Последовательности районов между генами тРНК-Met и тРНК-11е, тРНК-Ile и тРНК-Tyr определены для 36 образцов губок из семейств Lubomirskiidae и Spongillidae, включая губок из озер Чагытай и Торе-Холь (Тува). Из 36 полученных последовательностей 31 принадлежит байкальским эндемичным губкам (Lubomirskiidae, 8 видов) и 5 - космополитным губкам (Spongillidae, 3 вида).

Структура митохондрнального генома байкальских губок

Длина последовательностей митохондриальных геномов составила у S. раругасеа 26518 п.н., у В. intermedia profundalis -28227 п.н. и у R. echinata - 28614 п.н. В анализ также включены последовательности митохондриальных геномов видов L. baicalensis (Lubomirskiidae, род Lubomirskia) (Lavrov, 2010) и вида Е. muelleri (Wang, Lavrov, 2008), представителя космополитного семейства Spongillidae. Длина последовательностей составила 28958 п.н. и 23929 п.н. соответственно. Увеличение размера митохондриальной ДНК байкальских губок обусловлено главным образом удлинением межгенных районов, протяженность которых, включая вид L. baicalensis, варьирует от 7633 п.н. до 9707 п.н., что составляет от 28,8% до 35,5% от общей длины генома. Митохондриальный геном байкальских губок имеет набор и порядок расположения генов, идентичный таковому у Е. muelleri и включает 2 гена рРНК (rnl, rns), 25 генов тРНК и 14 белок-кодирующих генов (atp6, atp 8-9, cob, nad-6, 4L, coxl-3).

Эволюция кодирующих последовательностей

митохондриальной ДНК байкальских губок

Последовательности митохондриальных генов среди видов Lubomirskiidae обладают высоким генетическим сходством, не позволяющим применять эти гены по отдельности в качестве молекулярных маркеров для филогенетических реконструкций эндемичного семейства.

Для видов R. echinata, S. раругасеа, В. intermedia profundalis, L. baicalensis и E. muelleri проведены попарные вычисления скоростей синонимичных (dS) и несинонимичных (dN) замен по каждому гену относительно последовательности отдаленной пресноводной губки Corvomeyenia sp. (неопубликованная последовательность этой губки предоставлена лично Д.В. Лавровым). В результате выявлено, что ускорение темпов накопления нуклеотидных замен у

байкальских губок происходит как по синонимичным, так и по несинонимичным сайтам. Такая тенденция наблюдается у всех байкальских губок в генах сох2, atp8, atpö, cob, nad4, nadó, nad3, nadl, nad2 и nad5. В генах сохЗ, nad4L и coxl ускорение темпов накопления нуклеотидных замен по несинонимичным позициям кодона наблюдается только у вида S. раругасеа. Максимальные относительные значения ускорения эволюции последовательностей мтДНК как по синонимичным, так и по несинонимичным позициям кодона обнаружены у вида S. раругасеа по гену cob.

В результате подсчета соотношения несинонимичных замен к синонимичным (dN/dS) можно говорить о том, что все белок-кодирующие гены мтДНК четырех видов байкальских губок находятся под действием стабилизирующего отбора.

Эволюция индивидуальных видов байкальских губок

Анализ нуклеотидных последовательностей 14 кодирующих генов мтДНК байесовским методом с 95% вероятностью показал ускорение темпов накопления нуклеотидных замен у S. раругасеа (95% HPD интервал > 1, Var > 1), тогда как ускорение эволюции мтДНК видов R. echinata, В. intermedia profundalis и L. baicalensis не выявлено (95% HPD интервал <1). С помощью молекулярно-филогенетического анализа (Рис. 1) на основе палеонтологических данных о дивергенции семейства Lubomirskiidae около 30 млн лет назад показано, что скорость накопления нуклеотидных замен мтДНК видов R. echinata, В. intermedia profundalis и L. baicalensis составляет около 0,055 х 10"9 замен на сайт в год, тогда как у S. раругасеа этот показатель увеличен почти вдвое - 0,13 х 10"9. Такая скорость эволюции мтДНК в 2,6-9 раз ниже скорости накопления нуклеотидных замен в мтДНК растений (0.34) и кораллов (0.5) (Hellberg, 2006; Lynch et al., 2006).

Поскольку скорость эволюции в разных ветвях байкальских губок существенно различается (Рис. 1), а именно скорость накопления нуклеотидных замен в мтДНК вида S. раругасеа в два раза превышает скорость эволюции мтДНК R. echinata, В. intermedia profundalis и L. baicalensis, не представляется возможным применять гипотезу о молекулярных часах для всех этих четырех видов.

0,0007

0.0026

В. ШегтесНа рго^пбаПБ

°Г1/_. Ьшс&епэя

0,0002

[]

Я. есЫпага

0.0002

0,0046

Э. раругасеа

0,0002

Е. тие11еп

Рис. 1. Филогенетическое древо, построенное байесовским методом на основе нуклеотидной последовательности 14 митохондриальных генов, цифрами показаны длины ветвей.

и Ьа/'са^пэ/э

есШпага

-В. ШегтесНа ргоГипйаИз

Е. тиеПеп

035,030,025,020,015,010,0 5,0 0,0

Рис. 2. Байесовское дерево построено с предположением о верности гипотезы молекулярных часов на основе нуклеотидной последовательности 14 митохондриальных генов. Черными линиями показаны значения 95% доверительного интервала, на линейке цифрами обозначены миллионы лет.

Поэтому дальнейшее построение филогенетического древа с целью определения кладогенетических событий проводили без вида S. раругасеа. В результате молекулярно-филогенетического анализа, на основании оценки времени дивергенции Lubomirskiidae ~25-30 млн. лет назад показано, что около 12-4,3 млн. лет назад от общего предка байкальских губок отделился предок современного глубоководного вида В. intermedia profundalis. Виды L. baicalensis и R. echinata образуют молодую кладу, отделившуюся в плиоцен-плейстоцене около 4,8-0,4 млн. лет назад (Рис. 2).

Филогенетический анализ губок на основе белок-кодирующих генов

Для филогенетического анализа были использованы последовательности 20 митохондриальных геномов Demospongiae из базы данных. В качестве внешней группы использована последовательность хоанофлагеллята Monosida brevicollis (NC 004309) (King, 2008).

В результате филогенетических реконструкций на основе предсказанных аминокислотных последовательностей 14 митохондриальных генов подтверждена монофилетичность семейства Lubomirskiidae, а также ближайшее родство байкальских губок с сестринским космополитным видом Е. muelleri.

Анализ межгенных районов мтДНК байкальских губок Общая длина межгенных районов составила 7790 п.н. (29.4%) для S. раругасеа, 9002 п.н. (32%) для В. intermedia profundalis и 8970 п.н. (32%) для R. echinata, в то время как для L. baicalensis и Е. muelleri эти значения составили 9707 п.н. (33.5%) и 5220 п.н. (21.8%) соответственно.

Ранее опубликованные данные свидетельствуют о наличии в составе некодирующей мтДНК L. baicalensis множества инвертированных повторов, способных формировать устойчивые шпилечные структуры. На основании этих данных проведен поиск и сравнительный анализ инвертированных последовательностей в межгенных районах мтДНК исследуемых нами трех видов байкальских губок. В результате было выявлено 97 таких последовательностей у S. раругасеа, 96 - у В. intermedia profundalis и 144 - у R. echinata, тогда как у L. baicalensis Лавровым Д.В. было обнаружено 160 инвертированных повторов (Lavrov, 2010). Согласно ранее предложенной классификации, подразделяющей инвертированные последовательности мтДНК L. baicalensis на 8

классов (Hl-8) (Lavrov, 2010), у видов S. papyracea, В. intermedia profundalis и R. echinata были обнаружены последовательности, принадлежащие ко всем этим классам. Кроме этого, обнаружен дополнительный тип повтора, имеющийся только у вида В. intermedia profundalis. В результате моделирования вторичных структур показано, что инвертированные последовательности способны формировать как одиночные, так и двойные шпилечные структуры.

Анализ распределения вторичных элементов в некодирующей мтДНК байкальских губок показал их таксономическую специфичность. Показано, что некоторые двойные вторичные элементы представляют собой псевдоузлы (Рис. 3). Наличие псевдоузлов в мтДНК байкальских губок свидетельствует о высокой вероятности внутримолекулярной рекомбинации, как возможного механизма распространения инвертированных последовательностей в межгенных областях.

49 и-а

Ч'Ч и-а

у-а a-ii

»i а-и

9'S

а О, u u L » a tt

а-и

g-u -1

33-, t 9 9 с

.. а-9

u а ■

i Ч

и *

а и

М »4

9 9 и

f

9

I с и

В

Рис. 3. Конформации потенциальных псевдоузлов: А - у L. baicalensis, - у В. internedia profundalis, С - у S. papyracea.

Многие исследования показывают, что накопление инвертированных повторов в геноме в дальнейшем может способствовать рекомбинационным событиям, способствующим реорганизации митохондриального генома (Nash et al., 2007, 2008).

В результате анализа распределения шпилечных структур, можно сказать, что эти элементы являются динамичными и быстро эволюционирующими. Мы предполагаем, что некоторые вторичные структуры представляют собой мобильные элементы (Wessler et. al„ 1995).

Сравнительный анализ двух некодирующих районов мтДНК пресноводных губок

3.8.1. Вторичная структура двух межгенных районов мтДНК байкальских губок. В результате сравнительного анализа последовательностей двух межгенных районов мтДНК четырех видов байкальских губок показано наличие как одинаковых шпилек у всех губок семейств Lubomirskiidae, так и уникальных шпилек у отдельных видов, что может указывать на их неоднократное внедрение в митохондриальный геном байкальских губок в ходе эволюции. Интересно, что у байкальских губок, как и у разных представителей класса Demospongiae, большинство вторичных элементов имеют повышенный G+C-состав, который может достигать 100% (Erpenbeck et al., 2009), что также может указывать на преемственность этих структур на высоких таксономических уровнях.

Наличие консервативных по нуклеотидной последовательности и месту локализации шпилек у представителей разных родов байкальских близкородственных губок дает повод предполагать, что они могут нести функциональную нагрузку. Например, подобные шпильки с G+C-кластерами охарактеризованы как сайты рекомбинации у грибов (Paquin et al., 2000).

3.8.2 Вариабельность нуклеотидных последовательностей двух межгенных районов мтДНК губок. Для изучения внутривидовой и межвидовой вариабельности некодирующей мтДНК губок определены нуклеотидные последовательности фрагмента митохондриального генома, включающего два высоко вариабельных участка между генами тРНК-Tyr и тРНК-Ile, тРНК-11е и тРНК-Met. Из 36 полученных нуклеотидных последовательностей 31 принадлежит байкальским эндемичным губкам (Lubomirskiidae, 8 видов) и 5 - космополитным губкам (Spongillidae, 3 вида). Длина амплифицированных последовательностей варьировала от 400 п.н. у Е. fluviatilis (Spongillidae) до 1000 п.н. у L.fusifera (Lubomirskiidae), что связано с присутствием множественных делеций/вставок у байкальских

губок. В результате сравнительного и молекулярно-филогенетического анализа последовательностей межгенных спейсеров показано, что их экспансия обусловлена главным образом делециями и вставками, частота появления которых в 4,5 раза превышает скорость накопления одиночных нуклеотидных замен в некодирующей мтДНК. Показано, что делеции/вставки содержат инвертированные повторы и в большинстве случаев являются таксонспецифичными.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы впервые определены нуклеотидные последовательности полных митохондриальных геномов представителей трех родов байкальского эндемичного семейства Lubomirskiidae: Baikalospongia intermedia profundalis, Rezinkovia echinata и Swartschewskia papyracea. Подробно исследованы особенности организации и эволюции мтДНК байкальских губок, отличающие их от других пресноводных губок. К таким особенностям относятся: протяженность митохондриального генома, обусловленная главным образом экспансией межгенных районов; разная скорость эволюции последовательностей мтДНК. Показано, что нуклеотидная последовательность мтДНК вида S. papyracea эволюционирует в два раза быстрее, чем у остальных байкальских видов. В целом же выявлена очень низкая скорость накопления нуклеотидных замен в митохондриальном геноме байкальских губок - около 0,055-0,13*10"9 замен на сайт в год, что в 2,6-9 раз ниже скорости эволюции мтДНК растений и кораллов. Основываясь на палеонтологических данных и дивергенции Lubomirskiidae -28-30 млн. лет назад определен порядок дивергенции четырех видов.

На примере байкальских эндемичных губок впервые показана быстрая эволюция межгенных спейсеров на близкородственном уровне. Причем обусловлено это главным образом делециями и вставками, частота появления которых в 4,5 раза превышает скорость накопления одиночных нуклеотидных замен в некодирующей мтДНК. Показано, что делеции/вставки несут инвертированные повторы. Поиск и сравнительный анализ инвертированных повторов выявил ряд интересных особенностей. Во-первых, мтДНК байкальских губок обладает необычным для губок большим количеством инвертированных повторов,

способных формировать шпильки. Во-вторых, обнаружена преемственность этих структур не только среди представителей Lubomirskiidae, но и с космополитным видом Е. muelleri. Наибольшее сходство в их распространении и локализации обнаружено у филогенетически наиболее близких видов. В результате подробного сравнительного анализа инвертированных повторов показано, что они могут формировать не только одиночные, но и двойные шпильки, схожие с таковыми у ряда других организмов в мтТНК, где они описаны как мобильные элементы. Механизм распространения инвертированных повторов не ясен. Однако показано, что некоторые двойные шпильки представляют собой псевдоузлы. Это указывает на то, что возможным механизмом распространения повторов может являться внутримолекулярная рекомбинация.

ВЫВОДЫ

1. Байкальские эндемичные губки обладают самым протяженным среди представителей класса Demospongiae митохондриальным геномом, что вызвано не изменением в генном составе, который является консервативным для байкальских губок, а увеличением размеров межгенных районов.

2. Показано, что необычные для мтДНК губок эволюционные преобразования, заключающиеся в быстрой экспансии межгенных районов, происходят в результате внедрения и распространения множества инвертированных последовательностей, подобных мобильным элементам.

3. На основании сравнения полногеномных последовательностей мтДНК показано, что скорость эволюции в разных ветвях байкальских губок существенно различается. Выявлено достоверное ускорение темпов накопления нуклеотидных замен в мтДНК вида S. раругасеа.

4. На основе палеонтологических данных о дивергенции семейства Lubomirskiidae около 30 млн. лет назад вычислена низкая скорость эволюции последовательностей мтДНК губок: около 0,055 х 10"9 замен на сайт в год для видов R. echinata, В. intermedia profundalis и L. baicalensis, и около 0,13 х 10"9 - для S. раругасеа.

5. Анализ эволюционной истории семейства Lubomirskiidae на основе молекулярно-филогенетических реконструкций показал, что около 12-4,3 млн. лет назад от общего предка байкальских губок

отделился предок современного глубоководного вида В. intermedia profundalis. Виды L. baicalensis и R. echinata образуют молодую кладу, отделившуюся в плиоцене-плейстоцене около 4,8-0,4 млн. лет назад.

6. В результате проведенного молекулярно-филогенетического анализа последовательностей двух межгенных районов митохондриального генома губок впервые показана быстрая эволюция некодирую щей мтДНК на близкородственном уровне, обусловленная главным образом вставками и делециями, частота появления которых в 4,5 раза превышает скорость накопления одиночных нуклеотидных замен в межгенных спейсерах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Майкова О.О., Беликов С.И. Некоторые особенности организации митохондриального генома байкальских губок // Вестник ТГУ. 2010. № 341. С. 209-213.

2. Майкова О.О., Ицкович В.Б., Семитуркина H.A., Калюжная О.В., Беликов С.И. Филогенетическое положение губок озер Чагытай и Торе-Холь // Генетика. 2010. Т. 46, № 12. С. 1471-1478.

3. Майкова О.О., Степнова Г.Н., Беликов С.И. Вариабельность некодирующих последовательностей митохондриальной ДНК губок семейства Lubomirskiidae // Доклады академии наук. 2012. Т. 442, № 5. С. 1-3.

4. Lavrov D.V., Maikova О.О., Pett W. and Belikov S.I. Small inverted repeats drive mitochondrial genome evolution in Lake Baikal sponges // GENE. 2012. Vol. 505. P. 91-99.

5. Бурлакова (Майкова) O.O., Калюжная O.B., Ицкович В.Б., Беликов С.И. Определение филогенетического положения губок Тувинской котловины // Биоразнообразие и роль животных в экосистеме: Материалы IV международной научной конференции, Днепропетровский национальный университет. 9-12 октября 2007 г. Изд-во ДНУ. С. 55-56.

6. Бурлакова (Майкова) О.О., Ицкович В.Б., Беликов С.И., Лавров Д.В. Исследование филогенетических отношений пресноводных губок на основе анализа фрагментов митохондриального генома // X съезд Гидробиологического общества при РАН. Тезисы докладов, г. Владивосток. 28 сентября-2 октября 2009 г. Изд-во Дальнаука. С. 56-57.

7. Maikova О., Belikov S. Some features of Baikal sponge mitochondrial genome organization // VIII World Sponge conference. 20-24 September 2010. Spain, Girona. P. 261.

8. Майкова O.O., Беликов С.И. Некоторые особенности организации митохондриального генома байкальских губок // Пятая Верещагинская Байкальская конференция, ЛИН СО РАН. 4-9 октября 2010. Иркутск. Тезисы докладов, С. 77.

9. Lavrov D.V., Burlakova О.О., Itskovich V.B., Weinberg E.V., Belikov, S.I. Baikalian sponges as a model for the study of endemic speciation // Integrative and comparative biology. 2010. Vol. 50. Supplement 1. P. 98.

10. Майкова O.O., Лавров Д.В., Беликов С.И. Митохондриальный геном байкальских губок: структура и филогенетический анализ // II международная научная конференция «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии», ИОЭБ СО РАН. 20-25 июня 2011. Изд-во Бурятского научного центра СО РАН. С. 202-203.

11. Майкова О.О., Лавров Д.В., Беликов С.И. Митохондриальный геном байкальских губок: особенности организации и эволюции // II международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика», Дом ученых СО РАН, 14-17 ноября 2011. Новосибирск. Тезисы докладов. С. 137.

12. Maikova О.О., Belikov S.I. Mitochondrial genome evolution of Baikal sponges (Lubomirskiidae) // Contributions to the 3rd Moscow International Conference «Molecular Phylogenetics (MolPhy-3)», Moscow, 2012. P. 24

Подписано к печати 01.04.2013 г. Формат 60*84/16. Объем 1,2 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 586. Издательство Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН. 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Майкова, Ольга Олеговна, Новосибирск

;н

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук

На правах ру

МАЙКОВА Ольга Олеговна

Особенности организации и эволюции митохондрйальны геномов байкальских губок (І-ілЬотігвкМ^ае).

КОП'ИСИ

Iі ! I: \ і і

03.01.07 - молекулярная генетика

і

Диссертация на соискание ученой степени

і кандидата биологических наук

| Ь! і ,

Научный руководит

доктор

С.И. Беликов,

биологических наук, профессор'

і і і

.пір'

\К

¥і

И

и ІІІ

І!

Новосибирск - 2013

т

:!:11 і

Ы

і і ! I

¿1

К

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение...................................................................................................................5

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР................................................................12

1.1. Современное состояние проблемы изучения эволюции и классификации губок..........................................................................................12

1.2. Проблема исследования и классификации губок семейства ЬиЬопшзкпёае........................................................................................................14

1.3. История палеонтологических исследований формирования байкальской спонгиофауны в контексте геологической истории озера Байкал...................18

1.4. Митохондриальная ДНК животных.............................................................23

1.5. Особенности репликации митохондриальной ДНК животных..............26

1.6. Особенности организации митохондриального генома губок..................29

1.7. Инвертированные последовательности в некодирующей митохондриальной ДНК.......................................................................................32

1.8. Скорость эволюции митохондриальной ДНК животных...........................36

1.9. Митохондриальная ДНК как молекулярно-генетический маркер............40

1.10. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК...................................41

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................43

2.1. Сбор материала...............................................................................................43

2.2. Идентификация видов губок по морфологическим признакам.................46

2.3. Выделение ДНК..............................................................................................47

2.4. Конструирование праймеров.........................................................................48

2.5. Амплификация и очистка ДНК.....................................................................49

2.6. Клонирование и определение нуклеотидных последовательностей мтДНК.....................................................................................................................50

2.7. Сборка геномов и выравнивание нуклеотидных последовательностей..^ 1

2.8. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей...........52

2.9. Анализ последовательносей межгенных районов..............................52

2.10. Филогенетический анализ.........................................................53

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..................................................56

3.1. Определение нуклеотидных последовательностей.....................................56

3.2. Структура митохондриального генома байкальских губок.......................59

3.3. Нуклеотидный состав последовательностей мтДНК..................................63

3.4. Эволюция кодирующих последовательностей митохондриальной ДНК байкальских губок.................................................................................................65

3.5. Эволюция индивидуальных видов байкальских губок..............................73

3.6. Филогенетический анализ пресноводных губок на основе белок-кодирующих митохондриальных генов..............................................................78

3.7. Анализ межгенных районов мтДНК байкальских губок...........................79

3.7.1.Тест на рекомбинацию.............................................................86

3.8. Сравнительный анализ двух некодирующих районов мтДНК пресноводных губок..............................................................................................88

3.8.1. Вторичная структура двух межгенных районов мтДНК байкальских губок........................................................................................................................88

3.8.2. Вариабельность нуклеотидных последовательностей двух межгенных

районов мтДНК губок...........................................................................................92

Заключение.........................................................................................................101

Выводы................................................................................................................104

Список используемой литературы.................................................................106

Приложение...............................................................................124

Список сокращений и условных обозначений

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

мтДНК - митохондриальная ДНК

п.н. - пар нуклеотидов

т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

ПНР - полимеразная цепная реакция

ITS - внутренний некодирующий спейсер ядерной рДНК

РНК - рибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная РНК

тРНК - транспортная РНК

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Озеро Байкал представляет собой уникальную экосистему, возраст которой определен в 25-30 млн лет. По количеству эндемичных видов оно превосходит все пресные озера мира: к настоящему времени в Байкале описано около 2500 видов и подвидов животных, из которых 82% считаются эндемиками. Среди бентосных животных по биомассе доминируют эндемичные губки, которые играют важную роль в экологии озера и представляют собой яркий пример взрывного видообразования.

Губки (тип Роп£ега) представляют собой самостоятельную эволюционную ветвь многоклеточных животных, дивергировавшую от общего предка Ме1агоа около 580-635 млн. лет назад [1, 2]. В настоящее время большое внимание уделяется изучению различных аспектов биологии этих животных. Рост интереса к исследованиям губок обусловлен, прежде всего, их экологической значимостью: в качестве природных биофильтраторов губки можно рассматривать, как биоиндикаторы состояния водной среды. В последнее время интенсивно развиваются прикладные исследования губок с целью получения биологически активных веществ и биоматериалов для использования в фармакологии и различных областях промышленности [3]. Кроме того, губки представляют собой уникальный объект для изучения процессов микро- и макроэволюции, поскольку являются начальным звеном эволюции многоклеточных животных на Земле. В последние десятилетия в молекулярно-филогенетических и эволюционных исследованиях изучение митохондриальной ДНК является более распространенным, чем изучение ядерных геномов. Эволюция митохондриального генома губок достаточно хорошо изучена на высоких таксономических уровнях. В результате этих исследований внутри типа Рог^ега показаны значительные изменения митохондриального генома в ходе эволюции. Сравнение мтДНК разных видов класса Оетозрог^ае

позволило выявить такие общие признаки, как компактная организация генома, схожий состав генов, консервативные структуры тРНК генов, минимально модифицированный генетический код и отсутствие единого большого контрольного региона. С другой стороны, выявлены существенные изменения в структуре генома, такие как перестановки генов, изменения количества генов тРНК и некодирующей ДНК [4]. Однако большинство исследованных митохондриальных геномов губок класса Demospongiae принадлежат к отдаленным видам [4-10]. Поэтому к настоящему времени изменения в митохондрильной ДНК на близкородственном уровне остаются малоизученными. Чтобы понять, какие изменения происходят в мтДНК в процессе микроэволюции, необходимо провести сравнение нескольких геномов близкородственных видов губок. В связи с этим виды байкальского эндемичного семейства Lubomirskiidae представляют собой интересный объект для изучения микроэволюционных процессов. Исследование полных митохондриальных геномов байкальских губок интересно не только для понимания глобальных эволюционных процессов, но и направлено на решение таких актуальных в настоящее время проблем, как филогенетические отношения внутри семейства Lubomirskiidae и идентификация видов. Данное исследование также позволяет углубиться в понимание механизмов эволюции и функционирования митохондриальных геномов в целом.

Ранее была определена и опубликована нуклеотидная последовательность митохондриального генома байкальской губки Lubomirskia baicalensis (Pallas) [9]. При сравнении его с геномом сестринского пресноводного вида Ephydatia muelleri показано, что они имеют идентичный набор и порядок расположения генов, однако размеры геномов отличаются более чем на 5000 п.н. из-за увеличения межгенных районов у L. baicalensis. При этом изменение длин межгенных районов произошло в результате появления и распространения множества инвертированных

повторов, способных формировать устойчивые шпильки. Анализ дополнительных митохондриальных геномов губок из семейства Lubomirskiidae может помочь в понимании не только природы этих повторов, но и механизма их появления и распространения.

Цель и задачи исследования.

Изучить особенности организации и эволюции митохондриальных геномов байкальских эндемичных губок семейства Lubomirskiidae.

Для достижения цели были сформулированы следующие задачи:

1) Определить нуклеотидные последовательности полных митохондриальных геномов губок семейства Lubomirskiidae, принадлежащих к разным родам: Rezinkovia echinata, Swartschewskia papyracea, Baikalospongia intermedia morpha profundalis. Провести сравнительный анализ их нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей с аналогичными последовательностями байкальской губки Lubomirskia baicalensis и космополитного вида Ephydatia muelleri из базы данных

2) Провести сравнительный и филогенетический анализы последовательностей митохондриальных геномов байкальских губок с последовательностями митохондриальных ДНК других губок класса Demospongiae.

3) Установить относительные скорости эволюции митохондриальной ДНК байкальских губок с помощью филогенетического анализа.

4) Вычислить скорости накопления нуклеотидных замен в кодирующих последовательностях мтДНК байкальских губок с учетом палеонтологических данных о времени дивергенции семейства Lubomirskiidae около 25-30 млн. лет назад.

5) Провести анализ эволюционной истории губок семейства Lubomirskiidae на основе нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей мтДНК.

6) Исследовать особенности организации и эволюции межгенных спейсеров митохондриальной ДНК байкальских губок

Научная новизна.

Впервые в результате проведенной работы определены нуклеотидные последовательности полных митохондриальных геномов представителей разных родов байкальского семейства Lubomirskiidae: Baikalospongia intermedia profundalis, Rezinkovia echinata и Swartschewskia papyracea. Ha основе анализа нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей впервые выявлены особенности в организации и эволюции мтДНК байкальских губок, отличающие их от других пресноводных таксонов типа Porifera. К таким особенностям относятся повышенная скорость эволюции последовательностей мтДНК относительно общего пресноводного предка Е. muelleri, при этом темпы накопления замен среди исследованных видов Lubomirskiidae неравномерны. Также на примере байкальских эндемичных губок впервые показана быстрая эволюция межгенных спейсеров на близкородственном уровне.

В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей межгенных районов мтДНК различных видов семейства Lubomirskiidae впервые показана их пригодность для видовой идентификации и, возможно, популяционного анализа. Получены свидетельства в пользу того, что между исследованными губками семейства Lubomirskiidae был возможен ассиметричный горизонтальный перенос фрагментов ДНК.

Степень обоснованности и достоверности полученных научных результатов подтверждена использованием в качестве теоретической и методической базы трудов отечественных и зарубежных исследователей. В результате анализа последних научных достижений, опубликованных в ведущих зарубежных журналах, показано состояние исследуемой в данной работе проблемы на мировом уровне.

Для исследования использованы современные методы, основанные на анализе нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей полных митохондриальных геномов губок. Молекулярно-филогенетический анализ последовательностей выполнен с применением программ, используемых во всем мире для полногеномных исследований: STUDEN, MAFFT v.6.240, MEGA4, PAML, Mfold (версия 3.2), пакет программ Vienna RNA (RNAfold, RNAalifold), pknotsRG версия 1.3, MrBayes v. З.1.2., jModelTest, ProtTest, Phyml, TreeFinder, TOPALi.

Достоверность полученных результатов подтверждена статистическим анализом с использованием программ MrBayes 3.2. и Tracer 1.5.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Настоящая работа вносит существенный вклад в понимание механизмов эволюции и функционирования митохондриального генома животных в целом и процесса эволюции семейства Lubomirskiidae в частности.

Материалы диссертационной работы могут быть полезны при проведении таксономической ревизии байкальских эндемичных губок.

Апробация результатов.

Материалы диссертации были представлены: на IV международной научной конференции «Биоразнообразие и роль животных в экосистемах» (Днепропетровск, 2007), на X съезде гидробиологического общества при РАН (Владивосток, 2009), на ежегодном съезде «Общества общей и сравнительной биологии» (США, Сиэтл, 2010), на восьмой международной конференции по губкам «VIII World Sponge Conference» (Гирона, Испания, 2010), на V Верещагинской Байкальской конференции (Иркутск, 2010), на II международной научной конференции «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии» (Улан-Удэ, 2011), на II международной научно-практической конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика,

биоинформатика» (Новосибирск, 2011), на 3-й Московской международной конференции «Молекулярная филогенетика Мо1РИу-3» (г. Москва, 2012).

Реализация и внедрение результатов исследования.

Теоретические положения, результаты исследований и рекомендации использованы при подготовке научно-исследовательских отчетов по бюджетному проекту № VI.42.L3 «Геномные и протеомные исследования космополитных и эндемичных байкальских губок: видообразование и формирование симбиотических отношений» (рук. Беликов С.И.). Нуклеотидные последовательности полных митохондриальных геномов трех видов байкальских губок депонированы в международный компьютерный банк данных ОепВапк под номерами: Л3302308-К2302310.

Нуклеотидные последовательности межгенных районов мтДНК пресноводных губок депонированы в ОепВапк с номерами доступа: 0и057847-0и057856,0и98093(кш980944.

Личный вклад соискателя. В основу диссертации положены исследования автора, проведенные в лаборатории аналитической биоорганической химии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Лимнологического института СО РАН, а именно выделение ДНК и определение части нуклеотидных последовательностей межгенных районов мтДНК байкальских губок и анализ данных. Другая часть работы выполнена автором в лаборатории экологии, эволюции и биологии организмов профессора Лаврова Д.В. в Университете штата Айова, город Эймс, США, а именно выделение ДНК, амплификация и определение нуклеотидных последовательностей митохондриальных геномов трех видов губок, а также части последовательностей межгенных районов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает следующие разделы: введение, 3 главы (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), заключение, выводы, список используемой литературы и приложение. Работа изложена на 127 страницах,

иллюстрирована 29 рисунками и 12 таблицами. Список литературы содержит 8 отечественных и 147 зарубежных источников. Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 4 в рецензируемых журналах из списка ВАК и 8 - тезисы конференций. Благодарности.

Автор выражает благодарность своему руководителю д. б. н., профессору С. И. Беликову. Автор глубоко признателен профессору Д. В. Лаврову, в чьей лаборатории было проведено определение нуклеотидных последовательностей полных митохондриальных геномов байкальских губок. Огромную благодарность автор выражает д. б. н. Д. Ю. Щербакову за помощь в обработке данных и ценные замечания. Автор искренне благодарен Н. А. Семитуркиной за помощь в определении видов байкальских губок и сотрудничество в написании совместной статьи. Автор также благодарит всех сотрудников лаборатории аналитической биоорганической химии Лимнологического института СО РАН и особенно Т. В. Бутину за поддержку на всех этапах подготовки диссертационной работы. Автор искренне признателен О. В. Калюжной, И. В. Ханаеву, А. Купчинскому и Ю. Загибаловой за помощь в сборе образцов губок.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современное состояние проблемы изучения эволюции и классификации губок

Губки (тип Porifera) предствляют собой сестринскую группу с остальными многоклеточными животными, дивергировавшую от общего предка Metazoa около 580-635 млн. лет назад [1, 2]. Согласно современной классификации губки (Porifera) подразделяются на три класса: класс Hexactinellida (стеклянные губки), класс Calcarea (кальциевые губки) и класс Demospongiae, который включает в себя более 85% всех известных ныне губок [11]. Байкальские эндемичные губки представлены семейством Lubomirskiidae и, наряду с остальными шестью семействами отряда Haplosclerida, относятся к классу Demospongiae. Из 15000 описанных видов губок лишь около 150 видов �