Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Очистка, характеристика и иммунодиагностика вирусов крестоцветных растений

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Очистка, характеристика и иммунодиагностика вирусов крестоцветных растений"

Ащещ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИЖЛЖУТ 1ШР0БИ0Л0ЩЕ1

На правах рухсопйси

ДЕШНОВА ЗАИША НАСИРОВНА

ОЧИСТКА t • XAPÂKTEEÎCTIÎKA Л Ш/ШЮДЙШЮСИШ. Е57С0В КРЕСЯЩЕЖГШХ РАСТЕНИЙ; г''~си^альноо?л:.03,00»23 - Езсгехводогяя 03,00.CS - Вяр7салоп1я!

À з т о р • g ф е р а т

йпссертадиз на сспсзтпе ученей стеденд ■ даадцдата бподоютесках наук

Тгзен? - 1992 •

. Работа вшюлкека з лаборагараа вирусологии Института микробиологии АНРУз и на кафедре вирусологии биологического.; факультета Московского государственного университета.имена Ломоносова

чяен.-корр. АН СССР, академик В&СЛШ, . доктор баологичеокиг иаук, профеосор и#г> атдбзюз

доктор биологических Еаук,

' А.Х.ВШЕ0В кандидат бполопгазских наук В.К.НОВИКОВ

доктор биологических наук, профессор КД.ДЙВРАЕОВ

доктор сельскохозлКстЕсишх наук профессор л.н.ТВЖШЩ ■

Ведущая ооганазация: Киевский Государственный .

Университет. им. Т. Г. Шев- . • , чекяо

Защнта состоится " iiL" ilKiP УЩ! .1583 г. в_чао

на згседаюш стцизлизированиого ¿овета Д.015.02.01 при Института ьхкробиологии АН РУз по адресу:-700123, Та2кенг-128,. ул. Абдулла Кадарий, 76.

С диссертацией msso ознакомиться б библиотек Института гяпсробиологги АН PJ3. ' •

t t

Азторефорат разослан "_п___ 1922 Iv

НаучныЭ лоЕсультант:

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Учены?, секретарь спс^глцзяровгишого совета,

уэкзазет биологически наук C.ia.Äü^iSAEHA

0Е11Ш .ХЛРЛЮЕР^Шч'А ?АБШл

Актуальность. пробляуд. Шгорсо. бгогопксдогсв з рмза-вд&нга вируса« связан, по геньпэй кэрэ, .о рзгэЕкы дьух лавных проблем: I) перопэкгавы использовали вирусов Сшс олннуклеотэдкцх кс^донеитоз) з качество вэ/.горов для гзнноЗ наенории; 2) разработка лл^обпотохколопноская подходов обнарупзннэ вирусов растений п, а перзуз очерэдь, тзгуво-Еатазстша вкрусниз забояэвЕГПй.

Что касается первой проблемы, полз пкзогся больпэ труд-сетей, чем подедлгольша: рзегнзй. В отпонкэшш второй, доо-дгкугя опродзлзнкко успехи: оиа."успэгпю ргшэна д ня глнопа аезЕгельних вирусов а лапболео звачагелышо результаты колупни в развотял Ешлупсфзрквнгнык глоюдов анализа.

Необходимым этапом рошонгл обоих дроблен яаляэтоя полу-;енпэ раогетвдышх вирусов э оадезаноа оосгеяшя.

3 цагпзЗ работа з основное изучеа нктевцдций взрус рапса. Гпелсс) гэ иосладоаанго впруеша богезгой рапса, редлса и :-одькл явзгзтоя всокла актуальной задачей среднеазиатского ¡оггога. Нагл лревэденн доследования по устаноБлекгэ природы. шфелгщз, идэзтп^пкщст вирусов, Езучояпзз • ех ^изило-зевл;— юсяля свойств, способов яорэдачл и дугой распространения в фиродэ, разработка выссхочувсгапхаяьных гэтодов юшуводпар-юогп::и изучаемых вирусов п по разработка мер борьбе дротлв гцруспоЗ япхегщпз рапса, родаса п другие крестоцвегшх вуль-

Есльсэл чаезь работа вроэодека нгяз ва прааерэ ззруоа .йзата турнепса а вируса по-агяз рэдгоа, что а составляло эсповпс-о содерпапггэ дпссоргацэжноа ргбога.

я. гчтязч. Цзлвэ Е2СГОЯЦЗЙ работы было внязлешх-э зцрусез крзогодввкшх рзсгеппЗ, остатка л заразгерлотяна пап-5олоэ гггзах их яредотагптзлоЗ, гшутаязв азгдапзороток к мегэлусгна вцрускл, разработка подходов для па^зофэркэет- -вого гзазгзз, а тгкю подке кер борьба с эарусгой пвхаэдгой.

Для репгная поставленной гэлз кеобдодгко было ре:гг?5 слодугг^з задали:

- разработка сф^олтхгяого глэтеда о^пстхз вирусов иозаи-22 турнепса. редгеа и цветной л-пустя подбор рсотенгй Еако-

гаггелэй, выявление, очистка);

- разработка методов получения высокоспецифичных иммунных ак'хиоыворогок к вышеперечисленным вирусам;

- изучений возможности использования иммунодиагностики для выявления иммунных сортообразцов, выявления порагаемости рапса, редиса и.редьки, разработка новых подходов получения безвируоныж растений.

Научная и- лтктьческая. новизна. Биотехнологическая часть работы заключается в следующем: а) впервые разработана препаративные метода очистки вируса мозаики турнепса и вируса мозаики редиса;

б) получекя иммунные сыворотки и предложены иымунобиотех-нояогич&сккэ методы анализа: виробактериалькой агглютинации

и ишуноферментный анализ.

' В вирусологической части работы получены следующие данные:

а) на послах рапса и рэдиоа выявлены и идентифицированы ЕЛТ, ШР и ШЩ, определена вредонооность этих вирусов, изучены и описаны особенности проявления симптомов и способов циркуляции их возбудителей; ■ ' •; б) выявлены иммунные образцы рапса, редиса и редьки;

в) изучена биологические и физико-химические свойства-этих вирусов; ■

■' г) разработаны чувствительные серологические методы определения вфусов_ в полевых условиях,- которые могут быть испол. зоваш в- йаучнюс исследованиях в целях идентификации ШТ,- ШР и оценки распространенности инфекции; ыегод использован дал выявления 1имг<уншх и усто&чивых образцов рапса, редьки и редиса ка коллекционном участке СМЩИИР, а такай изучение распространенности ШТ и ШР в Ташкентской области.

-Пуйгикагоги:. щ атгообагош работы. До результатам дассерта- . цил опубликовано.13 работ, издана методическая рекомендация "Ускоренная диагностика растительных ьируеов реакцией виро-бактериальной агглютинации".

Материалы диссертации доложены на 3 и 4 республиканских лаучно-теоретЕческкх конференциях молодых учешх-ыикробиоло-гов (.Таикент, 1УВЗ, 1939 гг.), республиканской научно-практи-

ческой конференции "Актуальные проблемы комплексного изучония природы и хозяйства шных районов Узбекистана" (Каряа, 1991 г), Всесоюзных конференциях "йгатехнология и биофизика микробных популяций (Алма-Ата, 1991 г), "Экология тлей" 1Ацдиаан, 1991 г).

Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит введение, обзор литературы, посвященных характеристике вирусов крестоцветных, методов их диагностики и мерам борьбы с нем. Диссертация содераит описание материалов и методов иссле-. дований, результаты исследований, включающие в себе 6 глав, заключение» выводы, список литературы и приложение.

Общий объем диссертации составляет 151- стр., 22 рисунка, 17 таблиц, список литературы содержит 203 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. И. Ж 0В5ОДЕНИВ.

I. Биологические свойства ШТ ii EiP. Выявление ШТ и ВШ? в условиях Узбекистана,

При маршрутных исследованиях посвоэ рапса отмечеад симптомы вирусных заболеваний в гаде мозаики, хлоротдчности, лисил гофрированные иногда нитевидные, в результате этого растения становились карликовыми.

Обследование 7 хозяйств Ташкентской области Сна плоцадп 85 га) показало, что процент доражаеыостд растений- и рапса • составляет от 0,6 до 52,2$.

Вирус на- здоровые растения передается механически и о-помощьв т^ей Bxarvecoryne trassicae ь^ЕеЕерсЕСтентныы способом, но на передается сеизн'ал.

Свойства ШТ и М? в соке зяраявннвдс растений. Одним из критериев определения вируса в процзссо идентификации является предельное разведение данного вируса в данной растении, от иифекшонности вируса и т.д. G другой стороны это является очень вагным моментом в процессе очистки и подбора растеши - • накопителя вирусов. Инфекционный сок, выделенный из зараженных листьев редиса ШТ при разбавлении в 1000 раз сохраняет хшфекционнооть, при последующи разбавлениях инфокцаонность вируса не аабладалось(г10л71)7

Эксперименты, проведенные по определению точки тепловой инактивации (ТТИ) ШТ свидетельствовала о том, что вирус в ■

инфекционном соке терязт шфекционность при 52°С. Аналогичные опыты, проведенныэ с ШР показали, что он имеет ТТИ -65-70°С, а предельное разведение В!.!Т - 10"3(табл.1,2).

Сохранение инФекшонности ШТ в зависимости от температуры. Вирусы, относящиеся к группе потивирусов лабильны и обладают низкой-устойчивостью при. хранении.

Результаты свидетельствуют о том, что инфекционность ШТ из этой группы снижается в зависимости от условий хранения. Экспериментально установлено, что для сохранения ин&ек-ционности Ш'Г наиболее оптимальная температура +5°0, при хранении зараженного вирусом листа при комнаткой температуре и в замороженном состоянии инфекционность снижается быстрее. Максимальное время хранения - 4-6 дней (в зараженном листе при комнатной температуре - 4 дня, при 5°С - 6, при -10° -2, в инфекционном соке соответственно - 3, 8 и 5 дней), к 14-ому - дна во всех случаях шфекшонность вируса не проявляется.

2. Разработка метода выделения очищенных препаратов ШТ и Ш.

• BïiT и ШР выделяли из свежесобранных листьев редиса сорта ^Майский".' Обработка экстрактов .смесью хлороформ-бутанол С1/4 часть объема экстракта) в. течение 15 ыин. не нарушает целостность вирусных частиц и дает.удовлетворительный результат. Для осавдэния ШТ нами использованы 4$-ный ПЭГ с мол. массой 6000, а для ШР - ЖЕ,с"добавлёшшм 2.%,Ш1.

Ми -попытались татаз разделить ЕМТ и ШР з экстрактах из смешанно зараженных растений,'добавляя к раствору различные концентрации ПЭГ. К осветленному соку вначале добавляли 4% ПЗГ, через час центрифугировали при Î0Û00 об/мин, в течение 20 мак. Осадки препаратов растворяли а 0,05 M фосфатном буфере, рН 7,5. К надосадочной жидкости добавляли; 1% ПЭГ Оконечная концентрация вновь центрифугировали и осадок триады экстрагировали. После этого центрифугировали на ультрг центрифуге Spinco х, ■ при 35000 об/мин 2,5 часа. Результаты электронноыихрооЕоаичзских исследований показали,- что .осажденные 4 и Ь% ПЭГ, содержали смесь вирусов- .нитевидных и сферических частиц. Препараты были пв$оипошш при тестировании на тест-растешхях.

Таким образом,-разделить вирусы при использовании различных концентраций ЕЭГ не удавалось. Полное осакдение ШР наблвдалось при применении В% ДЗГ, однако часть вируса после первой экстракции оставалась нерастворимой. Для растворения вирусов осадок экстрагировали триада. Всс экстракты объединили и центрифугировали при 30000 об/мин 2,5 ч через 30^-нуи сахарозную подушку на удьтрацентрируге spinco 1-2,.. Осадок растворяли в 0,05 M фосфатном буфере pH 7,5, содержащей 0,001 M MqCIg, ЭлекгроннсшикроскопЕЧеский анализ получен- . ' ных препаратов ешщал присутствие нитевидных и сферических частиц. Для разделения этих вирусов (нитевидной и сферической дзормы) использовали различные методики: метод гельфильт-радин на сефароэе 4В, центрифугирование в градиенте концен-• траши сахарозы 10-40?, в градиенте плотности хлористого цез>-.'Ия л сульфата цезия. В первом варианте наблюдалось полное разделение, вирусов ШТ л ШР,~ однако, ВАТ элюировался s свободном объеме колонки» где содержится некоторое количество клеточных компонентов. Во втором варианте не наблюдалось полное разделение вирусов, хотя препарат был чистым я высслонн-фекционнш.В третьем а четвертом вариантах зирусы полностью разделялись и были токе внсохоинфекшюннымя.

В процессе центрифугирования вирусного'препарата, в градиенте плотности сульфата цезия образуются два зоны. Одна зона находится Еа'уровне 25$-ного слоя градиент^, вторай -30-35$. ' - • ;

■Электронномикроскопическио исследования показала, что верхняя зона содеркиз .нитевидные частицы SIT, ягяняя - сферические частицы BIP.. Материал из врехкей.зоны поглощал УФ-свет с максимумом. при длине волны, 260 ал и минимум ара 250 ш; соотношение 260/280. составило 1,16-1,2 (рко.1, кривая ДС), что характерно для очищенных препаратов нитевидных вирусов.

При аналогичном анализе препарата из нижней зоны отношение Б 260/280 было высоким - 1,4-1,5, что свидетельствует о более высоком содержании ШК з ЕирусноЗ частице (рис.1, кривая В).

.3. Фззкко-хпачссЕие свойства ЕЛТ и EiP.

Изучение физико-химического состава очищенного препарата

В!!?.показало, что полученный препарат был гомогенным, этому свидетельствовало седиментационный анализ и коэффициент седиментации который составил 200 '.S B 0,5 И фосфатной буфера рН 7 170-200 s в зависимости от буферов. Препараты белка, полученные депротенизацией очищенных препаратов ШТ в 2М растворе 'хлористого лития характеризуется типичным для белков спектром , поглощения УФ-света с макетном при E^q и минимуыом при Е^

Препарат белка при анализе методом электрофореза в-доли-акрилащдном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДОН) содержал один компонент с молекулярной массой ¿5-26 1уЬ.(та5л.' """" Аналогичное определение молекулярных масс структурных'белков BMP и ВЩК показали,что молекулярная масса полипзптида BMP составлязт 27-29 кДа.ВМЦК - 42.кДа,39.кДа и 13-15 кДа(табл.2).

По данным электрофореза в 2% агарозе в неденатурирующих условиях в суммарном препарате нуклеионозых кислот из очищенной вирусной суспензии присутствовали: ДНК см'.м. 5 млн, ДНК с гл. ¡л. 3,4 млн и РНК 2 млн и 1,4 млн, при этом две последние по подвианости совпадали с подвизхносхями двух компонентов РНК, выделенных из ШР. (Дальневосточный изолятК

- Оппздбление размера частиц ВДТ. Сравнение размеров•вири-•онов E-iT в гистограммах,- полученных препаратов с использованием 0,1 М боратного буфера рН 7,5 и 0,3 М глицинового буфера рН '7,5 и 0,5 М фосфатного буфера рН 7,5 показало, что при использовании 0,3 И глицинового и 0,5 М фосфатного буферах ■ рН 7,5 получаетсЯдНаибольшее количество нативных вириоков с длиной 7200-7250 А(табл,I). '

В препаратах, полученных в идентичных условиях, но с при мекением 0,1 М боратного буфера, выход вируса ощутима сникает ся, причем длина большинства вирионов составляет 6000-7000 Препараты, полученные из разных растений-хозяев такзе давали подтверждающие результаты.

4. Разработка иьиунологичеокюс тестов к диагностика ШТ и ШР.

Диагностика БЛТ к Ш? методом. реакции двойной дкТФузт:. ¿ля изучеикя серологических свойств вирусов растений кеобходх ко получить васолоси;;:".:и;/л1еские антисыворотки & очищенным

хс. I . Спектр поглощения 7Ф-света оштеншса препаратами £ЫГ / А / я ШР / Б /, получениями центрифугированием э градиенте , плотности сульфата цезия / 20 - 35Й /.

&

Таблица I.

Сходство _и разл:га:а в свойствах штаммов ШТ.

Показатели ! В М Т - уг ! Другие.плата Sil

Зида симптомов мозаика на рапсе. мозаика на рапсе,

редкое редисе

Степень поражае- 10-100%, очень висо- Сорт рапса Rafal

мое ти коустойчивые сорта ' высокоустойчзз к

. на выявлены зарагениз Е.5Т

Способ передачи капустная тли, семе- капустная, парсц-

нами не передается козая тли, семе-

нами но передается

Резерватов 1^глявник, вышок по- не выявлен

левой

Т Т И 50-52°С 50-60°С 65°С

п ? Ю"3 • 10"3-Ю"4

Круг'растений- кз зарагяет Европейский изоллт

хозяев : П.Glutinosa зарагаэт к. siutinos

Японский и Кп

тайские кзоляк: из

зарааают «.giutinos

алией ь;:риоков 720-725 кз 600-700 ем

720-780 KÍ

Мол.масса белка 25-26000 кДа 25000 кДа

27000, 290Q0 и

3G00D кДа

Коэдапциек? 170-2-00 а

седис,цитации

?

Таблица 2.

Сходство и различия в свойствах ВЫ? и другие вирусы крестоцветных.

Показатели ! Ь М Р - уз ¡другие штаммы ШР

5иды симптомов мозаика на рапсе, реди- мозаика на рапсе, се и др. редисе и др.

¡пособ поре- не изучен ВШТ, ВгТ, B¿T, ШР- '

[ачи • жуками, ШЩ - ка-

пустной тлей

'езерватор ¡^глявник, выанок пола- не изучен вой ' ■

. - _ _ _ - _ ! ~ r ÍKÍXISO-95°G7 ШТ- •

1 1 И 65-70 с 70-75°С, ЕРТ-85-90°С,

КМ-60-70°С '

__ -- _ - Е^-То^Т БЕЙТАМ"*-"

П Р Н0 изучен iQ-e>t ви-ю"5-10~6,

.BOM-IO"4 . .

руг растений- не заражает съ.. ЕСТ, ШР заражаем еж.,

:озяев ( слагалticolor,СЬ. . eaaranticolor,Ch.quer.oa,

quenoa,Ch. crural o Cb.nurale

азиер вириока 25-30 m EKT-28 ш, ВШТ-28 нм,

BPT-30 на», Е-АЩ-50 нм

ол.касса белка 28,¿30,5 вДа ШР-19,833,26,29и

и 39,950 кДа

Примечание: КГ - вирус хфапчатастл турнепса ■ ШТ- вирус желтой тзаика турнепса РТ - вирус розетчатоста турнепса D1Í - вирус огуречной мозаика

препаратам вируса. Нами полученная антисыворотка к очищенному препарату ШТ реагировала о соков больного растения разведенная 1:1024 при постановке капельной реакции, антисыворотка к ШР - до разведения 1:2048, Сыворотка к ШТ при , постановке реакции двойной диффузии (РДД) в ]$-ном агаре • "Дифко" имела титр 1516, сыворотка к ШР - 1:32, Обе сыворотки не реагировали с.соком здоровых раотений редиса. Реакции проявлялись в виде одной линии прецшштают при использовании препарата ШТ и ШР в концентрации 0,1 мг/мя в присутствии ДЗН.

Диагностика'ШТ и МР методом. випобаатеркалъной агглто-ттптт, В наших опытах при постановке АНЗ-тзс^а предельное разведение сока, вызывающего реакцию агглютинации стафилококка за 1-2 шц (при разведении сыворотки ЕЯ. 1:50, ШР 1:100) составило 1:4093.

Еняо проведено сравнение чувствительности АЕЗ-теста и капельного метода.и метода двойной'диффузии диагностика ЕЙ и ШР в растениях редиса сорта "Майский". АЕВ-тест более чувствительный, чем'капельный метод-и дзойной диффузии.

• Диагностика ИТ методом ИФА. Метод КФА является одним ■из наиболее чувствительных методов, позволяющий выявлять ми-шшалькок количество вирусов .

Б наших.исследованиях мы использовала глобулины кммунно! ■ сыворотки к Е|Т, конь'юг'ированныз с пероксцдазой хрена,

В серии опытов бшш определены оптимальные условия пост; козкк ИФА. Оптимальная концентрация иглму к ото булинбв (15 к ШТ при нанесении на плашку' составляет 10 мкг/мл. В приоут-отвш антигена специфическое окрашивание происходит при обработке конмэгатом в концентрации 1С мкг/мл. В наших опытах метод ША выявлял вирус в очищенных препаратах в кокц-экграцн 70 нг/мл, в иЕфзкцаонном соке К""4 разведения. В качество контроля были использованы глобулина нормальной сыворотки * крови кролика и г-з-анрус картофеля (рис,2).'

5. Вредоносность ЕЛТ и способы борьбы с кш в-условиях Узбекистана.

Босприточгвость растений к Э'Т птж искусственном заражении . В серии опытов была определена восприимчивость раотэ-

п

Связывание АТ

Огыквка несвязанного АТ

Добавление АГ.

Отиквка несвязанного АГ Добавление коньюгата

Отмявка несвязанного кокъюгата

Добавланиз субстрата

Увеличение окраски прямо пропо; цпонально количеству вируса

Рис. 2.. Схема'определение вируса тшунофарызнтнь-:.: анализом.

Е - фермент-, Ьь^-- АТ, Г ^ - .АГ

О- субстрат.

0-*

ЩЩЕЯТРАЩН ВИРУСА, НГ/ье

I--1., .... __1-;_ ' ■ • ■ ♦

101 1СГ2 10"3 КГ4 1С""5 ¿о"6 10~7 10"®

РЛЗВЩНИЕ -СОКА,

Л. - .Определение ЕЯ методом ЛФА / с;ндвач-вариант /

si! редиса к SIT на разных фаза:-: развития. ЕоспрниотиЕость ШТ зависел от фаза развития растений редиса. Восприимчи-ость редиса к ШТ особенно велика в период появления всхо-ов редиса и образования настоящего листа. Масса корнеплодов ■ этих растений почти в 2 раза наго, чем в контроле. Немного лабее патогенный эффзкт проявляется при заражении в фазу на-:ала образования корнеплодов, при заражении в фазу техничес-:ой спелости влияние вируса почти незаметно.

Таким образом, степень вредоносности вирусной инфекции .авиоит от фазы заражения и ыокзт изменяться от О до Ь2%.

При заражении растений редиса ШТ снижается не только ■розайность, но-и ухудшается качество корнеплода. Данные биотических анализов, полученных из зараженных а здоровых кор-геплодов растений редиса, показали, что при заражении растений >едиса HIT содержание'сухого вещества снижается от 7,9 до >,0/5, сумма Сахаров при заражении в первую и вторую фазы рос-га в 2 раза, з третью и четвертуй фазы - 1,8-0,3 мг, соответственно.

Заметного влияния на содержание аскорбиновой кислоты в ■ гаших экспериментах не наблюдалось.

Таким образом, ШТ сливает при заражении урояайность редиса сорта "Майский", особенно, в ранние фазы развития. Вирус raiuso влияет на содержание сухих веществ корнеплода редиса г на cyiсахароз.

Изучение пооаааемостд посевов тапса ЕМТ и ВДР ТашентсаоГ-зблаоти. Обследование посевов рапса в различных хозяйствах Гашкентско?; области (рис,3) показало, что. посевы рапса nopase-зы ШТ от 0,6 до 18%, ШР от 0,6 до 16,6%. Наибольшая пора-кэнность наблюдалась в колхозах ил. Карла-Маркса, XXI партоъез-ца и Коммунизма Ш,Э-18,7;1 - ШТ и 13,1-15,8 - ШР). Следует отметить, что в ряде случаев нэ удалось выявить ШР и В-.1Т в растениях рапса 'с симптомами мозаичности.

Электрогпкшкроскошгчеоко2 исследование частично считанных препаратов вирусов, выделенных из псрояэягшх растений рапса о производственных участков показало, что рапс поралэн ¿хот-.ипло ШТ и S.1P' так~э вирусом мэзапки цветной капусты, относящейся к ¡хаулаловярусатз.

•а

и

О - 09ив ПОрВХЗб' пси

1-ВИ

Рис. 4 . Поракаемосгь ■ растений рапса по'Ташкентской области

. Ташкентский р-н:.

1. к-з им. Ленина

Калининский р-н:;

2. с-з Иваново

Янгиюльсиий р-н|

3. к-з Октябрь

4. к-з Коммунизм

5. к-з XXI партс-ьезяа

Чпназскай р-н;

6. к-з Навои

7. к-'з см. Карла Маркса

Интересно отметить, что в некоторых случаях ШТ и ШР бнаружены и на бессимптомных растениях рапса, присутствие оторых подтвердилось чувствительным АБВ-тестоы и методом идикаторных растений. Наблюдения показали,- что с повыиени-м температуры воздуха, исчезали симптомы на зараженных рас-еняях.

IIiîp-суляттия ЖТ т ШР в природа. С применением АЕВ-теста метода индикаторных растений мы обнаружили ШТ, ШР в рас-ениях-сорняках: вьюнка полевого и гулязржа, являющихся по-идимому резерзаторавга этих двух вирусов. Это позволяет пред-олонить, что'растения-сорняки играют существенную ро.ль в цир-уляции вирусов.в природе. Эксперименты такл:е свидетельствовали то с этих растений.весной тлями вирусы неперскстентным спосо-ом переносятся на молодые растения из семейства крестопвет-ых (капуста, редис, гулявник), а тан.?.е на выояок полевой и збеду. Летом вирусы переносятся на растения репы, редьки и -. ередача вирусной инфекции тлями на растения происходит' до лубокой осени. Заражению вирусами подвергается и рапс, в по-ором в;грусы перезимовывают также как в растениях-сорняках. . .

6. Мероприятия по снияениш поранаемости краст^цветных растений ШТ и ЕДР.

Естественное поражение различных обвазнов рапса, редьки : редиса и выявление устойчивых сортов к ШТ и ЕДР. Выявление : выращивание высокоустойчивых к вирусным заболеваниям сортов ■ один из способов предотвращения вирусных эшфитокй. В свя-и с этил изучали степень пораяенности образцов рапса, редиса ; редьки на коллекции САФВНЙИРа.- Для выполнения данной работы :спользовали ускоренный метод диагностики - ЛЕЗ-тест.

В результате проведенных анализов были выявлены растения, юторые поражаются как ШТ, так и BIP. Часто оба вируса поразит растения одновременно. Все образцы после анализа разбн-¡ались на пять групп по проценту порагеннссти. Всего проаналз-проьано 52 образна рапса, 85 оо'разпов редьки и 20' образцов .-зднеа.

Образцы радза, редьки :: редиса поралзются вирусами в не-данаковой степени. Наибольпая поранаемость найладается на об->а?пах рапса, Трехлетние обследования показали, что образет

рапса поражаются вирусами в разной степени. Нами не удалось выявить иммунные образцы рапса, образцы редьки и редиса вирусами поражаются в меньшей степени. '

Разработка биологического способа борьбы. Один из способов предотвращения вирусных заболеваний крестоцветных является разработка метода борьбы против переносчика. Как было отмечено, переносчиком ШТ является капустная тля. При обработке 3%-ным "битоксибащшшом" численность тлей снижалось на 43,5-56,5$,

Рекомендации производству. В качестве мероприятий для пре> дупревдения распространения вирусной инфекции на крестоцветных растений основной рекомендацией считаем выращивание устойчивых к вирусным заболеваниям сортов рапса - Благодатный, Мытнитий, Libellé,редьки - Ашхабадский, Маргиланский и редиса - Rose Chine Winter.

Уничтожение капустной тли - переносчика вирусов, обрабатывая растений 3%-wm "битоксибащшшом".

Прочистка полей от сорных и дикорастущих растений - гу- . лявника и вьюнка полевого, резерваторов ЖГ и ШР. *

Пространственная изоляция озимого рапса от других крестоцветных растений, особенно ранние посевы редиса и капусты отделять от озимого рапса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ■

Разработанные иммунологические методы диагностики - виро-бактериальная агглютинация и иымуноферментный анализ ШТ и Ей дают много 'Ценных информации. Так, впервые ШТ и Е£Р выявлены и идентифицированы в экологических условиях Республики Узбекистан. Установлено, что ШТ и ЕЛР имеют широкий спектр растений - хозяев и оба вируса в основном имеют одинаковый круг растений-хозяев, кроме Chs{iKarmÇicolor » Ch.quenoa» Ch.nurale.

. Вирусы ■ передаются от больных растений к здоровым путем механической инокуляции соком, а также переносчиком §.t ssicae l. , но не передаются семенаш s через почву; резервате рами являются сорные и дикораогущвз растения - вьюнок пола-вой и гулявник.

Определена точка тепловой .инактивации. ШТ - 50-52°С и . SilP - 65-70°С, предельное разведение ШТ в соке больного

¡астения находится з интервале

Разработаны оптимальные условия очистки вирусов, где го-¡огешгаадая мозаичных листьев проводится з 0,5 M фосфатном буфере рН 7,5, содержащегося 1% даркаптоэтанола и. 0,001 M ЭД1А t обрабатывается 1/4 частью хлорстгарм-бутанолом С1:1). Концен-:рирование достигалось осаздением 8% ПЭГ с добавлением 2$ хло-жстого натрия с последующим дифференциальным центрифугирова-шем. Дальнейшая очистка и разделение вирусов производится в градиенте плотности сульфата цезия. Полученные таким образом ¡читанные препараты были высокоинфекционными, спектр поглоще-шя 7Ф-света типичен для очищенных препаратов: отношение опти-îecKEX плотностей В 250/280 составило для ШТ -1,2, а для BIP - 1,5. Элзктронномикроскопические исследования показали, что ipenapaT BIT состоит из нитевидных частиц с длиной 7000-7250 юн соэффициент седиментации 200 ; s » структурный белок ШТ тлеет .'.олекулярнуа массу 25-26 кДа. ■ -

Препарат ШР состоит из сферических частиц, с диаметром 58-30 ем. Структурный белок имеет молекулярную массу

2?-2!ГнДа. ' . .

В реакции двойной диффузии антисыворотки, полученные к А'Т и ШР образовывали одну полосу преципитации с вирусами '.с добавлением ДСН).

Применение чувствительных методов, иммунодиагностики позволяет выявить минимальное количество вируса: при индикации SWT и ЗЛР с использованием АБВ-таота и "сэндвич" варианта ИФА выявляется вирусный антиген до разведения 1:4093 и I0~-, а чистые препарата HIT этими.методами 300 и 70 нг/ж, соответственно.

С помощью АЕВ-тэста изучена распространенность ШТ и НАР зо Ташкентской области на посевах рапса, которая составляет зт 0,6 'до 16,7$ - ЕЛГ и от 0,6 до 18<2% - ШР. Однако при визуальном обследования обнаружено большое количество мозаичных растений. Электронномикроскопическиэ псследования очищенных -. препаратов из естественно пораженных растений рапса показали,-ïto рапс поразт еще одним патогеном - глруссм мозаики цветной капусты (ЕЩО.

- Против вирусных заболезанай на крестоцветных растениях предложена борьба против переносчика вируса - капустной тля.

Микробиологический препарат - "Битоксибацилин" при опрыскивании растений рапса позволил уничтожить насекомых переносчиков. Высокая эффективность наблюдалась при использовании 30 г/л раствора биопрепарата на I га.

Euje одним способом уменьшения вирусного заболевания является выведение и выращивание иммунных и высокоустойчив] сорто-образцов крестоцветных растений. Применением АБВ-тес1 выявлены высокоустойчивые сорта рапса, редьки и редиса.

ВЫВОДЫ

1. На посевах рапса, редиса и редьки Республики Узбекз тан выявлен и идентифицирован ШТ, ШР и ШЩ. Установлено, что посевы рапса поражаются вирусами до 52,8%. Вирусы зимуз в корневищах гулявника, вьюнка полевого и на рапсе. Изучен круг растений-хозяев ШТ и НДР. Выявлены сходство и различз свойств изучаемых вирусов-от известных в литературе.

2. Разработаны' способы очистки ШТ и BMP, При этом щи нено осветление инфекционного сока с помощью хлороформ-бутг нола, осаждение полиэтиленгликолем о последующим дифферент альным центрифугированием и центрифугирование в градиенте плотности сульфата цезия.

Исследованы физико-химические свойства вириояов и бел! ШТ и В5Р.

3. Получена диагностическая антисыворотка к очищенным препаратам ШТ и ШР. Проведена шлуводиагноотика ШТ, ШР с применением чувствительных серологических тестов - вироб« териальной агглютинации и идауноферментного анализа.

4. Разработаны различные способы мер борьбы о фитовик шаш инфекциями - борьба с переносчиками вирусов, выявление в выращивание высокоустойчивых образцов крестоцветных растс

НИЁ.

Основной материал диссертации опубликован в следующих работах:

1. Дехк&нова З.Н., Вахабов'АД. Поражаемость редиса и редьки вирусом мозаики редиса в условиях Узбекистана // Узе биол.звура.-1982.-]Й.-СЛ6-18.

2. Вахабсз А.Х., Дехканова З.Н., йсамухаыедов М.З. Вы

im свойства и идентификация вируса мозаики редаса // 5.бяол.нурн.-Г982.-йб.-С.15-18.

3. Дехканова З.Н., Вахабов АД., Новиков В.К. Очистка руса мозаики турнепса, выделенного из редиса // Тезисы ил. Ш Республиканской конференщш молодых ученых - мик-Зиологов "Биол.культквзр. и испсяьэ.микроорг. (бактерии, ибов, водорослей) в народном хозяйстве". Ташкент.-1933.-92-93.

4. Вахабов АД., Давранов K.G., Юлдаиэв Е., Дехканова I., Рахимов М.М. "Ускоренная диагностика растительных висов реакцией зиробактериадьной агглютинации": Метод:реко-нд.Ташкент: "Фан".-1988.-25 с.

.5. Покровский В.Б., Дехканова З.Н. Болезни и вредители посевах озимого рапса // Информационный листок. УзНЖГИ.-38.- 2с. .

6. Дехканова З.Н., Вахабов АД. Влияние вируса мозаики д'несса на урожайность и химический состав редиса при искус-венком заражении // Узб.биол.журн.-1989.-Ж.-в.. 9-11.

7. Дэхканова З.Н,, Прокофьева О.Б., Вахабов А.Х. Вирусы пса, свойства, диагностика и меры борьбы // Tsc^jh докл.

Республиканская научко-теоретич.конференция молодых учз-х и спец. микробиологов "Биология, куль1из. и биотехноло-я микроорганизмов". Ташкент.-1989.-С.85-86.

8. Покровский В.Б., Дехканова З.Н., Вахабов АД. Оценка раяаемости озимого раяса BMP и-ШТ с помощью АЕВ-теста //■ стениеводство, селекция и генетика технических культур. Сб. уч.трудов по прикладной ботанике, генетике и селекции, том 5. Ленинград.-L989.-Ö.99-113.

9. Завдова А.З., Дехканова З.Н., Вахабов А.Х., Рахимов М. Разработка методов очистки вирусных антигенов, антител новых методов ИФА.//Тезясы докл.конференции "Актуальные облэкы комплексного изучения природы и хозяйства южных ра-ноз Узбекистана. Карша.-1991.-С.8Х.

10. Еураева У.М., Дехканова З.Н., Вахабов А.Х. Потенци-ьно опасные вирусы для тонковолокнистого хлопчатника //. Там

С.140.

11. Лехканова 3.H., Жураева 7JA., Абдуллаев P.A.-, Ра:о ыов U.M., Вахабов АД. Применение вцробактериальной агглютинации для обнаружения фдтопатогенных вирусов // Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Биотехнология и биофизика ыакробшд: популяций". Алма-Ата.-19Э1.-С.97.

12. Дехканова З.Н., Вахабов АД., Новиков В.К. Вирускш болезни рапса // Уз б. б дол. дурн.-I991. -;t2.-С.II-I3.

13. Дехканова З.Н., £ураева У.IL, Вахабов АД. Капустг: тля - переносчик вирусов крестоцветных // Тезисн докл. Boos« юзкой конференции! по экологии -алей. Андижан.-I99I.-C.42-43.

ЗАКАЗ? /V" /?. ТИРАХ ЮО ЭК д. Та о/ ке.н т. Оосер в а 'тс р ил

• „ % к с/л ги Р 0№ ТА '