Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые структурные мотивы взаимодействия лигандов с ДНК

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Новые структурные мотивы взаимодействия лигандов с ДНК"

Ь!ПСКОВСКИЙ Ф' 1ЯМ!со-Техническнй Институт Факультет Физико-Химической Биологии Крфэдра Молекулярной Биофизики

РГ6 од

2 0 На прасах рукописи

Салмановг Диля Вильдановна

Новые стуктурные мотивы всег,; V; с и с.тпи п лмгандоа с ДНК.

03.00.02-биосЬизика

Азторэфэрат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

МОСКВА - 1996г.

Работа выполнена на Кафедре молекулярной биофизики Факультета физико-химической биологии Московского физико-технического института и в Лаборатории ДНК-белкового узнавания Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научные руководители:

Доктор физико-математических наук

А.С.Заседателев Кандидат химических наук А.Л.Жузе

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук профессор В.И.Иванов Доктор биологических наук Б.О.Глотов

Ведущая организация:

Московский Государственный . Университет им. М.¿.Ломоносова Химический факультет.

Защита состоится «^Р » июня 1996г. в часов на заседании диссертационного совета К 063.91.10 при Московском Физико-Техническом Институте (147000, г.Долгопрудный, Московская обл., Институтский пер., 10). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского Физико-Технического Института.

Автореферат разослан « > 1996года.

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА КАНДИДАТ ФИЗИКО-МАТЕМАТИЧЕСКИХ НАУК

" у/,- В.Б.Киреев

Аетуальнссть проблемы.

Фармакологические соединения, проявляющие активность при взаимодействии с нуклеиновыми кислотами, являются в настоящее время объектом интенсивных исследований. Особое внимание уделяется изучению новых структурных мотивов, способных связываться с определенной последовательностью пар оснований ДНК. Новые структурные мотивы могут быть не только объектами самостоятельного изучения, но и служить основой для создания высокоспецифичных соединений, оказывающих направленное воздействие на функционирование генома и клетки в целом. Эти исследования закладывают основы направленного синтеза новых поколений высокоспецифичных лекарственных препаратов.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение взаимодействия с ДНК нозых структурных мотивов, которые могут быть использованы при конструировании ДНК-связывающихся соединений.

В " задачу изучения новых структурных мотивов взаимодействия лигандов с ДНК входило исследование возможности образования комплексов мевду несколькими молекулами бис-нэтропсина и участком связывания на ДНК протяженностью в один виток двойной спирали. В ходе исследований обнаружена возможность образования комплекса между тремя ' молекулами бис-нетропсина и участком связывания на лоли^А-сГО-поли^А-сП").

В другой части диссертации в качестве нового структурного мотива исследовалось взаимодействие с ДНК Ы,4-дизамещснного фталимидного фрагмента,

присоединенного к дипирролкарбоксамидному остову в составе молекулы лиганда. Показано, что такое соединение локализуется при связывании в узкой бороздке ДНК. -

В задачу третьей части диссертации входило изучение взаимодействия с ДНК лигандов, содержащих в "своей

структуре М,4-дизамещенные moho- и дифталимидные фрагменты. На примере этих лигандов исследовалось сродство к узкой бороздке ДНК таких структурных фрагментов, в которых есть потенциальные акцепторы водородных связей (С=0 группы), а потенциальные доноры водородных связей отсутствуют.

Научная новизна и пра:ггическап ценность .

До настоящего времени были описаны только мономерный, димерный и тетрамерный типы комплексов между ДНК и лигандами, связывающимися в узкой бороздке. В настоящей работе впервые представлены результаты, свидетельствующие о существовании тримерного типа комплекса для бис-нетропсинов. Обнаружение тримерного типа связывания пирролкарбоксамидсодержащих соединений с ДНК расширяет существующие представления о молекулярных механизмах действия антибиотиков, связывающихся с ДНК, и о новых возможностях конструирования лекарственных соединений, мишенью которых являются двойные спирали нуклеиновых кислот.

Современные сведения о низкомолекулярных соединениях, •специфично взаимодействующих с протяженными участками ДНК, ограничены лишь несколькими различными химическими структурами лигандов, локализующихся при связывании в узкой бороздке ДНК. К таким структурам следует прежде всего отнести пирролкарбоксамидные, бензимидазольные, а также структура антибиотика СС-1065. Для апробации взаимодействия с ДНК лигандов, построенных на основе иного структурного мотива, был изучен новый класс соединений, содержащих Ы,4-дизамещенные фталимидные фрагменты.

Главным отличием олигофталимидных соединений от структур, локализующихся при связывании в узкой бороздке ДНК, является отсутствие потенциальных доноров водородных связей. Олигофталимидные фрагменты, подобно олигобензимидазольным, могут принимать конформацию, изогеометричную узкой бороздке ДНК, но содержат в своей структуре вместо ÑH групп - С=0 группы. В настоящей работе

было впервые экспериментально показано, что наличие в молекуле лиганда 0=0 групп, обращенных в предполагаемом комплексе внутрь узкой бороздки ДИК., препятствует связыванию.

Проведенные исследования являются важным шагом в выяснении факторов, определяющих взаимодействие лига!: до в с ДНК, а таюхе способствуют более глубокому пониманию связи мегкду структурой биологически активных соединений и их сродстзом к узкой бороздке и к определенным последовательностям пар оснований ДНК.

Дг.рсбация работы.

Результаты, полученные в настоящей- работе, были представлены на: Международной конференции "Молекулярная k биология на рубеже XXI века" (Москва,1594г.), Международной молодежной школе "Posttranscriptional Control of Eukaryotic Gene Expression" (Греция,1995r!), II Международном симпозиуме "Protein-Nucleic Acid Interaction" (Берлин, Германия,1995г.), Ill Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1996г.).

Объем и структура диссертации.

Работа изложена в виде печатного труда ( 77 стр.) и иллюстрирована 50 рисунками. Содержит литературный обзор, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы (всего 135 источников).

Результаты- !? обсуждение.

Глава 1. Обнаружение и изучение тримерного типа комплекса бис-нстролсинов с ДНК.

Интерес к соединениям, состоящим из нескольких "узнающих" фрагментов, обусловлен возможностью обнаружения новых особенностей взаимодействия с ДНК. К таковым относятся протяженные молекулы бис-нетропсинов, содержащих .вместо N-металпиррольных

Рис.1. Химические структурь нетропсина и бис-нетропсинов

нетропсин

ми,

Ы-пропилпиррольные кольца,

соединенные олигометиленовой

цепочкой (см.рис.1). Бис-нетропсины были синтезированы СЛ.Гроховским в лаборатории ДНК-белкового

узнавания ИМБ

им. В.А. Энгельгардта РАН. 1 Все эксперименты с использованием бис-нетропсинов с п = 4 и 5 (см.рис.1) дали совпадающие результаты. Поэтому ниже рассматривается связывание бис-нетропсинов, без конкретизации ' длины

олигометиленового линкера.

Связывание бис-нетропсинов с поли(с!А)-поли(сЛ") и поли(ёА-с1Т)-лoли(dA-clT) . сопровождается существенно различными

изменениями в спектрах кругового дихроизма (КД) (см.рис.2). Для того, чтобы выделить спектральные формы, характеризующие образование

комплекса при различных отношениях - -

С/ВР (где С - концзнтрадия добавленного лиганда в молях, ВР - концентрация пар оснований ДНК в молях) были исследованы спектры производной КД по концентрации добавленного бис-нетропсина. Дифференциальные спектры КД, представленные на рис.3, наглядно демонстрируют наличие двух различных спектров КД, которым можно поставить в соответствие два различных типа связывания лиганда с ДНК.

Связыванию бис-нетропсинов с гомополимером поли(бА)' поли(сЛГ) (рис. За) соответствует лишь один тип спектра КД с максимумом в 314 нм. Такой же тип спектра КД наблюдаетдя и в начале титрования этими лигандами

Р

уС

гр4 гг-5

N

бис—нетропгггн

5 6

Рис. 2.

300

350 А.нм

сГ(дА)

сЕС. 00 50 0

00 50 О 50

^ а

1 1 /ТХ ! / 2Ч 5

1 г

300

Рис. 2. Спектры КД бис-Рие. 3. нетропсина, сэязанного-с поли(бЛ)-поли(с1Т) (а) и пол и (ЗА- ЙТ) • пол и (с( А- с!Т) (б). Ий - амплитуда КД, в расчете на моль пар оснований. Отношения концентраций добавленного лиганда к концентрации пар оснований полимера (С/ВР) были следующими: а - 0 (1) . 0.013 (2), 0.045 (3), 0.09 (4) ' 0.18(5), 0.45 (6); б- 0(1), 0.051 (2), 0.10(3), 0.16(4), 350 X а„ 0-26 (5), 0.51 (6).

. 3. Спектры производной кругового дихроизма (йА) по ;ен грации (С) бис-нетропсина, добавленного к поли(а'А)-|(сГГ) (а) и к поли(с1А-сЯ")-поли(йА-сГГ) (б): 1- С/ВР<0.07, .13 < С/ВР < 0.17. Пунктирными линиями отмечены длины 312,5 нм, 317,5 нм и 340 нм.

т

чередующегося полимера поли(с1А-сЛ")'поли(йА-сЛГ), когда С/ВР < 0,07 (см. рис. 36, кривую 1). При дальнейшем титровании поли^А-сЛ^-поли^А-сГГ) в области концентраций, соответствующих 0,13 < С/ВР < 0,17, обнаруживается вторая спектральная форма.

Выделение двух спектральных форм, полученное с помощью дифференциальных спектров , КД, позволяет раздельно следить за образованием первого типа комплекса по кривой титрования в длине волны 312,5 нм, в которой вклад второго типа комплекса в эффект КД равен нулю. С другой стороны, наблюдение за образованием второго типа комплекса удобнее вести по изменению амплитуды КД в 340 нм, где вклад амплитуды соответствующей спектральной, формы примерно в 5 раз выше вклада первой спектральной формы.

Кривые титрования как для поли(ЬА)-поли(сГГ), так и для поли^А-сПУполи^А-сЛ). снятые при 312,5нм, 317,5нм и 340нм, представлены на рис.4. Пересечения асимптот кривых титрования, отмеченные пунктирными линиями, показывают, что при наблюдении в указанных длинах волн, в случае поли(с!А)-поли(аТ) обнаруживается образование только одного типа комплекса, характеризуемого в насыщении значением С/ВР = (0,1 ±0,02). Это означает, что связываясь с поли(с!А)' поли(сП~), протяженная молекула бис-нетропсина занимает, пространство, '" соответствующее одному витку двойной спирали.

В случае связывания бис-нетропсина с поли(с1А-с1Т)-поли(с)А-сЛ') кривые титрования в разных длинах волн существенно различаются. Как следует из рис. 46 (см. кривую титрования в 312,5 нм) первый тип комплекса, выходящий на насыщение при С/ВР = 0,1', образуется аналогично тому случаю, когда бис-нетропсин связызается с поли(с1А),поли(с!Т). Однако при дальнейшем титровании возникает второй тип комплекса (см. кривую титрования в 340нм), формирование которого не вызывает диссоциации комплекса первого типа, на что указывает протяженное плато кривой титрования в 312,5 нм.

Образование комплекса второго типа между бис-нетропсином и поли(с1А-сГГ)-поли(сЗА-сЛ") (см. рис. 46, титрование при 340 нм) имеет .явно кооперативный "

г

л

£

15 10 5

-и

I. 5

а

312,5 нм 317,5 нм

-0-.Ч- Г! „П

Рз

а в~тг

340 нм

I-г

20- -4 !• 1

15

10

317,5 им

340 нм

О,

О!

312,5 нм

О 0.1

0.3

0.5 С/ВР

Рис. 4. Титрование поли(йА)-поли(сЛ") (а) и пoли(dA-dT)•лoли(dA-dT) (б) бис-нетропсином в 312,5 нм, 317,5 нм и 340 нм.

характер. Этот тип комплекса начинает образовываться только в присутствии комплекса первого типа и выходит на насыщение при С/ВР = 0,3. Таким образом, при полном насыщении

поли(йА-сЛГ)-поли(с1А-с1Т) бис-нетропсином, на 10 пар оснований приходится 3 молекулы лиганда.

Комплекс тримерного типа оказался устойчивым к действию ионной силы и его оптические характеристики не менялись вплоть до 0,3 М МаСК •

Как видно из рис. 46 (см. титрование при 340 нм) образование комплекса второго типа происходит при

Рис.5 Схематическое представление пространственной структуры тримерного типа комплекса бис-нетропсина с ДНК.(вид со стороны узкой бороздки).

0,1 < С/ВР < 0,3. Это означает, что

комплекс второго типа может образовываться лишь в местах расположения комплекса первого типа. При этом, к комплексу первого типа (одна молекуле бис-нетропсина + -10 пар оснований полимера) присоединяются дополнительно две молекулы лиганда. Возможный вариант такого комплексообразования схематически представлен на рис.5.

Результаты этого исследования показывают, что образование комплексов со стехиометрией большей, чем 1:1 (отношение числа связанных молекул к участку связывания на ДНК), может также происходить и при связывании протяженных лигандов, способных накрывать участок ДНК, соответствующий целому витку двойной спирали.

Данные рис. 4, указывают также на то, что описанный комплекс тримерного типа состоит из мономерного и димерного комплексов. Поэтому данные ЯМР, полученные ранее для некоторых комплексов димерного типа, возможно относятся на самом деле к тримерным комплексам, поскольку в таком случае могут существовать близкие контакты как между лйгандом и ДНК (в комплексе первого типа) так и между парой лигандов (в комплексе второго типа).

Отсутствие различий в экспериментальных результатах, полученных для бис-нетропсинов с п = 4 и 5 (см. рис.1), указывает на то, что олигометиленовые линкеры такой длины обладают достаточной гибкостью, чтобы обеспечить одинаковое взаимное расположение ковалеэтно связанных дипирролкарбоксамидных фрагментов бис-нетропсинов в комплексе с ДНК.

Т;:аса 2. Еагшг.'одзйстпые с ДНК Pht-iii - аналога потрапсина, содержащего Г!,4-дгапмещенный

фтал?;миднь!й фрагмент, присоединенным с помощью гибкого линкера.

С целью установления сродства к узкой бороздке нового структурного мотива - фталимидного фрагмента, исследовалось взаимодействие с ДНК соединений, содержащих Ы,4-дизамещенные фталимидные фрагменты.

Химические формулы синтезированных соединений I-V, а таюке их сокращенные обозначения приведены в таблицей Синтез фталимидсодержащих соединений был выполнен А.М.Никитиным в Лаборатории ДНК-белкового узнавания ИМБ РАН.

Для изучения оптических характеристик и особенностей связывания фтапимидных фрагментов в узкой бороздке ДНК, было синтезировано соединение .V ( Pht-Nt' .), . химическая формула которого представлена в таблице 1. В левой части молекулы этого соединения содержится Ы,4-дизамещенный фталимидный фрагмент, ковапентно присоединенный с помощью гибкой цепочки к дипирролкарбоксамидному фрагменту, являющемуся гетероциклическим остовом антибиотика нетропсина. Как известно, "этот антибиотик локализуется при связывании в узкой бороздке В-формы ДНК. Поэтому можно было предположить, что дипирролкарбоксамидный фрагмент Pht-Nt при связывании с ДНК будет также локализовываться в узкой бороздке, увлекая за собой и фталимидный фрагмент.

it

Химическая структура и молярная экстинция соединений I —V

таблица!

соединение

структура

IV

П-С1;-Ш1

П-^ч-С!;«!

максимум мдл_ярна_я

сокращение поглощения экстинция нм

С1у-Р!Ц

С1у-РЫ2

250 25000

Ьу«С1у-РЫ 250

250

^сиг-РЫ,. 250

25000

37000

37000

на уу'оуор! 0 О-сош

250 43000

ЧПП "ЗЧППП

Спс ч :гругэ2сго <г.::хры:сма и флуоресценции ;гог-'Л/тэ:гся Р'/Л-"* с г.ж:}(бА)тюлг,((ГГ). Из представленных на рис.6 спектров молярного КД следует, что дипирролкарбоксамидный (фрагмент в РМ-М действительно образует с двойной спиралью пoли(dA)пoли(dT) комплекс, оптические характеристики которого подобны характеристикам связывания антибиотиков нэтроппина и дистамицина А в узкой бороздке ДНК. Об этом свидетельствует пре;аде всего характерная положительная полоса КД с максимумом в 315 нм.

Из данных, представленных на рис.7, можно видеть, что интенсивность флуоресценции фталимидного фрагмента РЫ> N1:, по крайней мере частично локализованного в узкой бороздке поли^А)-поли(РГ), увеличена по сравнению с флуоресценцией езободного лиганда.

Определение стехиометрии связывания РМ-Ш с поли(с1А)-полп(с17). Как видно из рис.8, стехиометрия комплекса РЬ1-№ с поли(ЬА)-поли(йТ), определенная из зависимости амплитуды КД от количества добавленного лиганда, составляет величину, близкую к 0,2. Из этого следует, что одна молекула РМ-М связывается с пятью парами оснований, локализуясь при связывании своим дипирролкарбоксамидным фрагментом в узкой бороздке ДНК. При ..этом часть пространства в узкой- бороздке, соответствующего этим пяти парам, оказывается (по крайней мере, частично) занятым фталимидным фрагментом.

Представленная на рис.9 зависимость интенсивности флуоресценции от количества добавленного к поли^А)

•поли^Т), имеет сложный характер и нуждается в специальном объяснении. Так, при соотношении

С/ВР < 0,2 образуется первый тип комплекса РМ>№ с ДНК, который характеризуется связыванием молекул лиганда в узкой бороздке и большей интенсивностью флуоресценции связанных молекул по сравнению с молекулами, находящимися в растворе. ,

При соотношении концентраций С/ВР » 0,2 все места в узкой бороздке оказываются занятыми. Сооответствующий излом кривой титрования, отмеченный на рис.9 пунктиром, определяет стехиометрию первого

Рис. 7.

О 0.2 0,4 С/ВР

•О 0.5 1.5 С/ВР

Рис. 6. Спектры молярного КД поли(ЬА),поли(с1Т) (1) и комплекса поли(ЬА)-поли(с1Т) с РМ-М (2). Соотношение концентраций С/ВР=0,15 обеспечивает локализацию связанных . молекул лиганда в узкой бороздке ДНК. Рис. 7. Спектры флуоресценции свободного РМ-№ в растворе (1) и связанного с поли^А)-поли^Т) (2). Длина волны возбуждения - 340 нм.

Рис. 8. Определение стехиометрии связывания РМ-№ с поли(йА)-поли^Т): Де - изменение амплитуды молярного КД в 315нм. С/ВР - отношение количества добавленного лиганда к парам оснований полимера.

Рис. 9. Определение стехиометрии связывания с

поли(ЙА),поли(сГГ): изменение интенсивности флуоресценции в 465 нм свободного лиганда в буфере (1) и в комплексе с полимером (2).

Концентрация полимера в этих экспериментах - 1,3-10'^М пар оснований.

типа комплекса. При зтом одна молекула лиганда, связанная в узкой бороздке двойной спирали, приходится на пять пар оснований. Этот вывод полностью согласуется с величиной, полученной методом КД (рис.8).

При дальнейшем добавлении лиганда образуется второй тип комплекса Pht-Nt с ДНК. Фталимидные фрагменты лиганда Pht-Nt, входящего в состаз зтего типа комплекса, являются, по-видимому, тушителями флуоресценции' тех молекул лиганда, которые входят в состав комплекса первого типа, а результате чего интенсивность флуоресценции падает.

Второй излом кривой 2 на рис.9 происходит при соотношении С/ВР>1,2. На зтом участке титрования формирование второго . (внешнего) - типа комплекса завершается, Есе связывающие места 'на полимере оказываются занятыми и дальнейший рост интенсивности флуоресценции соответствует добавлению лиганда в буфер.

Таким образом, Pht-Nt может локализовываться при связывании в узкой бороздке ДНК, занимая пространство, соответствующее пяти парам оснований. При этом фталимидный фрагмент оказывается (по крайней мере ^стично) локализованным в узкой бороздке, что сопровождается увеличением амплитуды его флуоресценции.

Глаза 3. Взаимодействие с ЦН'С соединений, содержащих фтзлт.шдныэ фрагменты.

После определения оптических сарактеристик фталимидного фрагмента, локализованного в жрестности узкой бороздки ДНК, эыло осуществлено исследование

Рис.10 Схема, иллюстрирующая возможность образования водородных связей между олигобензимидазолом и 02 или N3 атомами АТ пар (А) и между олигофталимидом и 2-аминогруппами гуанинов (Б).

сродства к ДНК соединений, содержащих М,4-дизамещенные фталимидные фрагменты, в качестве основного структурного мотива. В ходе этого исследования проверялась возможность образования регулярных водородных связей между С=0 группами слигофталимидного мотива и 2-аминогруппами гуанинов., обращенными в узкую бороздку ДНК, подобно взаимодействию ЫН-групп олигобензимидазолов с 02 атомами тиминов и/или N3 атомами аденинов (см. рис.10). Спектры кругового дихроизма. В растворе молекулы фталимидсодержащих соединений не обладают собственным КД. Однако, как следует из рис.11, при связывании 1_узС1у-РМ2 с ДНК обнаруживается значительный рост полосы КД, с максимумом в 275 нм. Эксперимент проводился в 0,001 М МаС1. При повышении ионной силы до 0,3 М №С! происходит полная диссоциация комплекса, и спектр КД возвращается к исходному виду, соответствующему В-форме ДНК.

Изменение спектров КД в полосе ДНК наблюдалось при титровании ДНК соединениями, содержащими как один, так и два фтапимидных фрагмента.

Спектры флуоресценции. Было обнаружено, что в водных растворах при возбуждении в 340 нм, соединения I - IV обладают флуоресценцией с максимумом в 465 нм. При образовании комплексов с ДНК происходит значительное снижение, интенсивности флуоресценции соединений-■ I - IV без сдвига максимума спектра флуоресценции по длинам волн. Этот эффект продемонстрирован на рис.12 для связывания с ДНК соединения (.увО^-Р^ . При повышении ионной силы до 0,ЗМ №С1 происходит полная диссоциация комплекса, и спектр флуоресценции (аналогично спектру КД) возвращается к исходному виду.

Определение стехиометрии комплексов

фталимидсодержащих соединений с различными полинуклеотидами. Связывание фталимидных соединений I-IV с различными полинуклеотидами изучали как методом КД, так и с помощью флуоресценции. Оба метода дали совпадающие результаты.

О 0.5 1 С/в?

0 0,5

Рис. 11. Спектры молярного КД ДНК тимуса теленка (1),

комплекса ДНК тимуса теленка с ЬуэС^-Р^ в насыщении

связывания (2) и того же комплекса, диссоциированного в 0,ЗМ

ЫаС1 (3). Концентрация ДНК - 10-4 ¡у] пар оснований.

Рис. 12. Спектры флуоресценции свободного Ь-уэ^у-Р!^ в

растворе (1) и связанного с ДНК тимуса теленка (2).

Г - интенсивность флуоресценции в относительных единицах.

Длина волны возбуждения - 340 нм. Концентрация ДНК -

10_4М пар оснований, концентрация лиганда - 3-10_5 М.

Рис. 13. Изменение амплитуды молярного КД в 275 нм комплекса

¡.узИу-Р!^ с ДНК тимуса теленка в зависимости от отношения

добавленного лиганда к парам оснований ДНК (С/ВР). Пунктирной

линией отмечено значение С/ВР=Ю,5, соответствующее насыщению

комплекса. Концентрация ДНК -Ю-4 М пар оснований.

Рис. 14. Зависимость интенсивности флуоресценции в 465 нм при

добавлении 1_уБС1у-РМ2 в раствор буфера (1) и ДНК тимуса теленка

(2). Концентрация ДНК - 2-Ю"4 М пар оснований. Точка

пересечения асимптот начального и конечного участков титрования

(кривая 2) определяет стехиометрию комплекса (С/ВР ~ 0,5).

На рис.13 приведена типичная зависимость амплитуды КД в 275 нм от доли добавленного лиганда, полученная для случая связывания LysG!y-Pht2 с ДНК тимуса теленка. Стехиометрия комплекса, определенная из пересечения асимптот в начале и в конце титрования, равна 0,5, что соответствует типу связывания, при котором одна молекула лиганда приходится на две пары оснований деойной спирали. Эксперименты по титрованию соединениями I-IV различных полинуклеотидов подтвердили значение стехиометрии 0,5.

Зависимость амплитуды флуоресценции LysGIy-Pht2 от количества лиганда, добавленного к буферному раствору и к раствору ДНК тимуса теленка, представлена на рис.14. Положение точки" излома кривой титрования на рис.14 указывает на то, что при насыщении связывания одна молекула лиганда приходится на две пары оснований ДНК, в полном соответствии с данным^, полученными методом КД.

Такое же значение стехиометрии связывания получено нами и для комплексов соединений I-IV с ДНК фага Т2, поли(сКз)-поли(сЮ), поли(с!А)-поли(сГГ)Гполи(с1А)-поли(с1Т) + дистамицин А и поли(гА)-поли(г1)).

Устойчивость комплексов фталымидсодерзхащпх соединений с ДНК к действию ионной силы. Кривые диссоциации комплексов LysGly-PhÎ2 с ДНК и синтетическими полинуклеотидами - в зависимости • от концентрации NaCI представлены на рис.15. Доля (а) связанных с ДНК молекул лиганда рассчитызалась из интенсивностей флуоресценции (см. рис.15). Зависимость стабильности комплексов от ионной силы идентична для соединений I-IV.

Как видно из рис.15, комплексы полностью диссоциируют в 0,3 M NaCI, причем кривые диссоциации, полученные для комлексов .всех лигандов с полинуклеотидами различной природы, располагаются на графике в области 0,2-0,3 M NaCI. В,, совокупности с результатами предыдущих экспериментов такой вид зависимостей позволяет предположить преимущественно ионный характер взаимодействий, обусловленных

1S

г ОС

(О

0,6

0.2

0

о

fr,

er

о

ло

о

л.

■к

1 2

3

4

гО

6

-

0.2 0.4 (NaCl),M

Р:*с. 15. Диссоциация комплексов LysGly-Fht2 с различными двуспиральными полинуклеотидами в зависимости от концентрации NaCl: 1 - ДНК тимуса теленка; 2 - поли(йЗ)-поли(с!С); 3 - поли(с!С-с1С)-поли(сЮ-dC); 4 - поли(0А)-поли(сЛ"); 5 - поли(с!А)-поли(сЯГ) + дистамицин А; 6 - поли(гА)-поли(г1)). Доля (а) лигзнца, входящего з состав комплекса, вычислялась из соотношения:

а ={!buff ~ hompl) / (¡°buff ~ l°compl), где Ifruff и /comp/ - интенсивности флуоресценции в 465 нм одинакового количества лиганда в буфере и в комплексе с полинуклеотадом, соответственно, при одинаковой концентрации NaCl; !°t>uff и i°compl - то же при 10-3 м NaC!. Концентрация полинуклеотидов- Ю-4 М пар оснований.

наличием отрицательно заряженных фосфатных групп полимеров и положительно заряженных концевых остатков молекул лигандов.

Результаты исследований методом линейного дихроизма. С использованием метода линейного дихроизма (ЛД) были проведены эксперименты по сравнению изменений в спектрах ЛД комплексов с ДНК дистамицика А, этадий бромида и 1уБС1у-Р1^2. Отрицательный эффект ЛД в полосе ДНК обусловлен тем, что пары оснований перпендикулярны оси спирали ДНК. В полосе поглощения интеркалятора этидий бромида тоже наблюдается отрицательный эффект ЛД. Для дистамицина А был получен положительный эффект "ЛД, что соответсвует расположению лиганда в узкой бороздке ДНК. Для соединения Ьуэйу-Р^ было определено, что угол между моментом оптического перехода молекулы лиганда (в 340нм) и аксиальной осью ДНК находится в диапазоне от 60° до 90°. Поскольку зтот момент оптического перехода ориентирован преимущественно вдоль длинной оси фталимидного фрагмента, то полученный результат свидетельствует в пользу внешнего типа присоединения исследуемых лигандов.

Таким образом, на связывание с ДНК не оказывают заметного влияния следующие факторы:

1) различие в составе пар оснований между ДНК тимуса теленка, поли(йА)-поли(сГГ) и поли(сЮ)-поли(с!С);-

2) заполнение узкой бороздки поли(йА)-поли(сЛ") прочно связывающимися молекулами антибиотика дистамицина А;

3) присутствие остатков глюкозы в широкой бороздке ДНК фага ;

4) различие между пространственными структурами А- и В-форм двойных спиралей (наряду с ДНК и полидезоксирибонуклеотидами использовали поли(гА)-поли(г1)));

5) различие в протяженных размерах моно- и дифтапимидов (во всех случаях в насыщении одна связанная молекула приходилась на две пары оснований ДНК).

Изложенные в этом разделе экспериментальные результаты согласуются с представлением о том, что молекулы лигандов, остов которых построен на основе N,4-дизамещенных • фталимйдных фрагментов, образуют с нуклеиновыми кислотами комплекс по типу внешнего

присоединения, взаимодейстсипми.

ста б и л и з и руе м ого

ионными

Выводы

1. Впервые обнаружен и' исследован физико-химическими методами тримерный тип комплекса между ДНК и протяженными молекулами бис-нетропсинов.

2. Охарактеризованы спектральные свойства N',4-дизамещенного фталимидного фрагмента, локализуемого в окрестности узкой бороздки ДНК с помощью гибкого линкс-ра, козалентно присоединенного к аналогу нетропсина, специфично связывающемуся r зтой бороздке.

3. Физико-химическими методами - исследовано взаимодействие с ДНК нового класса соединений, содержащих в своей структуре М,4-дизамещенные мсно-, и дифталкмидные фрагменты.

4. На примере М,4-дизамещенных моно- и дифталимидов экспериментально продемонстрировано, что введение в молекулу лиганда ОО групп, несущих частичный отрицательный заряд и обращенных к оси спирали ДНК, существенно понижает константу связывания, препятствуя связыванию лиганда в узкой бороздке. Это обстоятельство ставит вопрос о необходимости поиска специальных решений, чомпенсиругащих действие частичного отрицательного заряда при введении акцепторов водородных сзяззй з рассматриваемые позиции молекул смквенс-специфичных лигандов.

Искренне благодарю A.M.Никитина за синтез соединений и

предоставление результатов конформационных расчетов.

Публикации

1. Д.В. Сапманова, A.M. Никитин, А.Л. Жузе, Г.В. Гурский, A.C.

Заседателев. "Взаимодействие с ДНК синтетических лигандов,

содержащих Ы,4-дизамещенные моно- и

дифталимиды", Молекулярная биология (1995) 29, 848-860.

2. A.S. Zasedatelev, V.B. Borodulin, S.L Grokhovsky, A.M. Nikitin,

D.V. Salmanova, A.L. Zhuze, G.V. Gursky, R.H. Shafer. "Mono-, Di-

and trimeric binding of a bis-netropsin to DNA", FEBS Letters (1995) 375, 304-306. !

3. В.Б. Бородулин, А.Л. Михейкин, СЛ.-ГрохоБСКий, A.M. Никитин, Д.В. Салманова, А.Л. Жузе, Г.В. Гурский, Р. Шафер, А.С. Заседателев. "Новые структурные мотивы взаимодействия лигандов с ДНК: тримерный тип комплекса бцс-нетропсина с поли^А^Т)-поли^А-сЛ")'', Молекулярная биология (1996) 30 ( в печати).