Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности взаимодействия мультимодальных лигандов с одно- и двухцепочечными ДНК

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Особенности взаимодействия мультимодальных лигандов с одно- и двухцепочечными ДНК"

« иР0-ПНсЬ31ГЬ ьч аЬБПМЭ-ЗЦЪ ЪЩиЦРЦРПЗЗДПКф Д ЪРЪЧИЪЬ «1Ь8№1ГЬ <иШ1ШЦРЦЪ

1 8 ДЕК

ииъпь^зиъ иР8-ЗПЬ№

Цпцифйпцш]. ф^шОцОЬр!! 11]аш- и Ьр^црш ^УЫЭ-ф ЬЬиг фп}иищ1}Ьдтр_)ш6 шпшбййшЬипп^тррШОЬрр

О-.00.02 - 11шийшц}ипш|уш11ц ЭДк^шгёшрЬгёшиф^шЦшй

qllшnlpJmGйh]lll рЬЦйш&пф ц^шш^шй шиифбш011 Ьщдйшб штЬбифапипщшО

иьштьр

ь-рьчигг-гооо

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РА ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

МАНУКЯН ГРИГОР АРТЮШЕВИЧ

Особенности взаимодействия мультимодальных лигандов с одно- и двухцепочечными ДНК.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 - Биофизика

ЕРЕВАН- 2000

г

11тЬОш}шшпф.)шО рЫшО Ьшитшт^шй I ЬрЪшС}1 "1Ьшш1(шО <шйш1ишриШпи5

О-^тшЦшО цЫщЦшр'. ЗДфЦидйшрЬйшиф^шЦщй ц}иптр]т00Ьр}1

цпЦшпр, щрпфЬипр (1.1Э-Л1шриш]Ь1П|шС

'ПшгшпОшЦшИ ЗфсфЦшйшрЬйшиф^шЦиШ ч^ттр^ШОЬр!!

рй1у!}и1ш}ипиОЬр' цп1;тпр, ицтфЬипр Зт.и. ЙшрицшО,

^ЬОишршОшЦшО ц^тпадтССЬр!) цгйцппр и.О-.Ч-шрр^ЬишС 11пш2шшшр ЦищйшЦЬрщшздпШ' ЬришО}1 ЗфсфЦш^ ^Виш^ттш

итЬОш^пипцушО щшгтщшОтрзтбс тЬф ЦпШЬОш

"/б*" чЫрпЬ15рЬр11 2000р. <}чш5р № .фй Ър1ииВ}1 щЬтш^шй Ьш|5ш1ишршОпи5 цпрйпц 051 ЦшиСи^тшЦшй ^ипрЬргф (¡[шифО (375049, ЬрЬшС, Ч^Ьр [ХшСп11ишО ф. 1, Ь"14 ^ЬйишршОш^ши фшЦтрпЬт):

ЦтЬОш^пит^шСр ^шрЬф I &шОпршйш[ ЬришС}! щЬтшЦшй 1иш5шрдиршО[1 ЧршгциршСпи!:

иЬ^им^рй шпиффи£г I йгуМрЬр}! 2000р.

Тема диссертации утверждена в Ереванском государственном университете

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор А.Т.Карапетян Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Ю.С.Бабаян, доктор биологических А.Г.Габриеашн Ведущая организация: Ереванский физический институт

Защита состоится " декабря 2000г. в ^У часов на заседании Специализированного Совета 051 при Ереванском государственном университете (375049, Ереван, ул. Алека Мапукяна 1, ЕГУ, биологический факультет)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ереванского государственного университета

Автореферат разослан " поября 2000г.

Ученый секретарь Специализированного совета, р

кандидат биологических наук, доцент САГоняп

ВоШ^-Я/'М, 0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В ходе реализации генетической информации молекула ДНК претерпевает различные конформационные переходы (ЗА, ^клубок, ^клубок и т.д.)- При этом ни один из конформационных переходов не происходит в "чистой" молекуле: она всегда окружена и взаимодействует с огромным количеством разнообразных низкомолекуляных веществ (лигандов), которые в свою очередь взаимодействуя с ДНК, могут стабилизировать или дестабилизировать то или иное конформационное состояние полимерной молекулы. О том, стабилизирует или дестабилизирует лиганд ту или иную определенную конформацию ДНК можно судить если исследовать конформационный переход ДНК в комплексе с ли-гандами под воздействием какого-либо внешнего фактора, вызывающего переход (температура, рН, химическое воздействие и др.), и сравнить его с переходом "чистого" полимера.

Для объяснения механизмов связывания лигандов с нуклеиновыми кислотами и выяснения их роли в конформационных переходах комплексов, а также понимания биологических функций ДНК в клетке, важно знание термодинамических параметров взаимодействия.

В настоящее время существуют различного рода природные и синтезированные биологически активные лиганды, которые, взаимодействуя с полинуклеотидами, стабилизируют или дестабилизируют их определенную конформацию (ДДД клубок). Определение стабилизирующего и дестабилизирующего действия этих соединений на ДНК важно с точки зрения их применения в практических целях. С другой стороны, сравнение дифференцальных кривых плавления (ДКП) "чистой" ДНК и ее комплексов с бимодальными ли-гандами, которые специфически связываются с определенными участками биомолекулы, дает возможность внести ясность в решение такой физически важной задачи, как "предплавление" линейных кристаллических структур, которая, в свою очередь, может служить ключом для понимания

3

' Г '

процессов, лежащих в основе транскрипции ДНК В связи с этим актуальны новые подходы в изучении конформацион-ных переходов ДНК и ее комплексов с лигандами.

Цель и задачи работы.

Настоящая работа посвящена экспериментальному изучению особенностей взаимодействия бромистого этидия (БЭ) и актиномицина D (АМД) с ДНК, с целю обосновать основные выводы, полученные при помощи сравнения ранее разработанной теории с экспериментом.

В задачи диссертации входило:

Нахождение условий, при которых poly(dA)-poly(dT) и ДНК с различным <7£содержанием находятся в двухцепочечном (цц-) или одноцепочечном (оц-) состояниях в присутствии взаимодействующих с ними лигандов;

Экспериментальное доказательство существования более одного способа связывания БЭ и АМД с оц-полинуклеотидами и определение термодинамических параметров этих взаимодействий;

Определение свободной энергии ДG° и энтропии Д5° соответствующих разным типам связывания БЭ с дц-и оц-полимерами, с целью выяснения их (типов связывания) роли в стабилизации двойной спирали ДНК

Экспериментальное исследование зависимости относительной концентрации соответствующих типов связывания лигандов с дц- и оц-биополимером (сч) от общей относительной концентрации лиганда (с) и от термодинамических параметров взаимодействия;

Сравнение ДКП "чистой" ДНК и ее комплексов с ^Тлюбивым лигандом Hoechst-33258, с целью обнаружения участков на биополимере, ответственных за "предплавление" линейного кристалла.

Научное значение и новизна.

Перечисленные экспериментальные результаты получены впервые. В работе выполнены экспериментальные исследования перехода спираль-клубок комплексов БЭ с ДНК с различным СС - содержанием под воздействием температуры и рН-среды.

С помощью изотерм адсорбции Скетчарда, полученных из спектров поглощения и флуоресценции комплексов ДНК-БЭ определены термодинамические параметры (константы связывая (К) и число нуклеотидов приходящихся на одно место связывания (п)) пяти способов взаимодействия лиган-да с биополимером (три из них с дц- и два с оц-биополимером). Экспериментально доказано существование по крайней мере двух способов связывания на оц-ДНК и на оц-синтетических полинуклеотидах. При помощи Скетчард анализа кривых адсорбции, а также расчитаных методом Вант-Гоффа Д<?° и А& впервые показано, что один из способов связывания с оц- полинуклеотидом - "сильный", другой - "слабый". Доказано, что термодинамичские параметры для „сильного,, комплекса не зависят от условий эксперимента (ионной силы раствора, рН среды, йС-содержания ДНК) На основании сравнения полученных значенй АС" комплексов БЭ с оц- полимерами и „сильных,, комплкесов с оц- и дц-полимерами, впервые предложена модель, согласно которой связывание БЭ с ро!у(с1А) и ро1у(с!Т) осуществляется за счет образования стекинг-контакта.

Сравнение спектров поглощения и флуоресценции комплексов ДНК-лиганд позволили получить зависимости перераспределения БЭ по типам связывания от общей концентрации лиганда (с). Показано, что чем больше отношение константы связывания данного типа взаимодействия к числу лигандов приходящихся на пару оснований, тем меньше общая концентрация лиганда при которой наблюдается насыщение этих мест.

Оцененны значения ССсодержания участков, ответа ственных за процесс "предплавления" ДНК.

, г .

Практическая ценность.

Экспериментальные результаты, полученные в работе могут быть полезны при уточнении и рассмотрении различных теоретических моделей конформационных переходов в ДНК, а также при исследовании взаимодействия мультимо-дальных лигандов с биополимерами различной структуры. Предложенная новая модель связывания БЭ с оц-биополи-мерами дает возможность наметить новые направления экспериментальных исследований, с целью выяснения влияния различных стекишчсонтактов на образование комплексов по-линуклеотид-лиганд.

Изучение особенностей взаимодействия комплексов ДНК-лиганд позволит дать рекомендации по их практическому применению, а также целенаправленному синтезу новых биологически активных веществ.

Полученные данные могут быть использованы в специальных лекционных курсам для студентов соответствующих кафедр ЕГУ, МФТИ, ГГУ и в различных научных лабораториях, где ведутся исследования по взаимодействию лигандов с ДНК

Апробация работы.

Материалы диссертации обсуждались на семинарах кафедр физики ЕГУАС, биофизики ЕГУ, в лаборатории радиобиологии ЕрФИ и доложены на одиннадцатой конференции по стереодинамике биомолекул (Олбани, США, 1999).

Публикации.

Основные результаты исследований отражены в 4-х научных публикациях.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, заключения и списка цитируемой литературы (147 ссылок), Диссертация содержит 112 страниц, 21 рисунок и 7 таблиц.

6

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе дан обзор работ, касающихся современным представлениям о структуре ДНК, и ее конфор-мационных состояниях. Приводятся некоторые существующие теоретические модели конформационных переходов ДНК и ее комплексов с лигандами, а также краткие характеристики современных методов изучения структуры и конформационных переходов нуклеиновых кислот.

Вторая глава посвящена анализу результатов сравнения обобщенной теории конформационных переходов комплексов ДНК с мультимодальными лигандами и ранее полученных экспериментальных результатов.

Обсуждается вопрос о необходимости рассмотрения теоретической модели кооперативных переходов комплексов ДНК с лигандами, в которой учтена возможность существования различных независимых типов связывания лигандов с различными формами полинуклеотида. Представлены основные результаты теоретического рассмотрения такой модели, а также результаты сравнения теории с ранее полученными экспериментальными данными, касающимися перехода спираль-клубок комплексов ДНК с БЭ и АМД, которые позволили сделать следующие выводы:

• Взаимодействуя с оц-ДНК, БЭ может образовать по крайней мере два независимых типа комплексов, один из которых «сильный», но редкий, а второй - «слабый», но частый.

• БЭ и АМД могут образовать по крайней три типа комплексов с дц-ДНК при ионной силе ц=10"2 М [№+]. Пятикратное уменьшение ц приводит к появлению еще одного (очень слабого) взаимодействия только в случае БЭ.

• При выполнении определенных соотношений между термодинамическими параметрами взаимодействия, ширина конформационного перехода для комплексов ДНК с мультимодальными лигандами выравнивается с шириной конформационного перехода "чистой" ДНК

• Концентрации связанных лигандов различных комплексов с дц- и оц- полинуклеотидами (с,), зависят от термодинамических параметров комплексообразования и от общей концентрации лиганда (с).

Третья глава посвящена экспериментальному исследованию гетерогенности взаимодействия БЭ с оц- и дц-ДНК. Опытным путем определены те условия, в которых образцы полинуклеотидов (poly(dA)poly(dT), ДНК различного GC -содержания) в присутствии исследуемых концентраций лиганда находятся в одноцепочечной форме (клубок).

На рис. 1а приведены кривые, вызванного температурой, перехода спираль-клубок poly(dA)-poly(dT) (кривая 1), и его комплекса с БЭ (кривая 2), а на рис.1 б - результаты рН-индуцированного перехода в случае ДНК тимуса теленка (ДНК Т.Т.), при комнатной температуре.

На основании данных рис. 1а и 16, можно заключить, что цепи poly(dA) и poly(dT) в интервале изменения ионной силы раствора 2,2103<ц<2,2-1а2М [Na+], при t >70°С, рН 7,0,а ДНК Т.Т., при температуре t =25°С и рН 3,0 находятся в виде отделенных полинуклеотидных клубкообразных цепочек.

РисЛа. Кривые плавления poly(dA)poly(dT)t в отсутствии (1) и

присутствии БЭ (2). Концентрация poly(dA)poly(dT) 8,3310"5М,

БЭ - 4,16-105М. c=2D/m,5. ц=2,2102 М [Na4]. в - степень спиральности.

Рис. 16. Кривые рН индуцированного перехода спираль-клубок ДНК тимуса теленка в отсутствии (1), и присутствии БЭ (2). Концентрация ДНК 7,8105 и БЭ - 7,810'5 М, (с=2Б/Р = 1). ¡а-2,210" 2М [N3+], /=25°С.

Как видно из рисунка 2, кривая связывания лиганда в координатах Скетчарда характеризуются двумя линейными

Рис.2. Изотермы адсорбции в координатах Скетчарда для одноцепочечных р1оу(с1А) и ро1у((1Т), ¿=70°С, рН 7,0 (1), для ДНК Т.Т., ¿=25°С, рН 3,0 (2)

участками, каждый из которых хорошо описывается уравнением г/6} = Кп - К„ где г - число мест связывания, С{ -концентрация свободного лиганда в растворе, К - константа связывания лиганда с полимером, п - число пар оснований приходящихся на одно место связывания. Этот экспериментальный факт свидетельствует о существовании двух независимых мест связывания, каждое из которых характеризуется своими термодинамическими парамерами (табл. 1).

Таблица 1. Термодинамические параметры связывания БЭ с оц-полимерами, определенные в двух разных условиях, при ц - 2,2102 М [№+)

-Ks-lO'5, М'1 АГиДОЛ М"1 ns nw

poly(dA)poly(dT) рН 7,0; t= 70°С 1,7±0,1 2,9±0,1 7,5+0,5 4,5±0,5

ДНК Т.Т, />#3,0; f= 25°С 1,4±0,1 2,3±0,1 8,0±0,5 3,0±0,5

Индекс s - относится к сильному, а — W к слабому способам связывания

Наблюдаемое отличие между числом пар нуклеотидов занимаемых лигандом на ДНК Т.Т. и одноцепочечных poly(dA) и poly(dT), в случае "слабого" типа связывания (Таблица 1) легко объяснить структурным различием как между оц-ДНК и оц-полинуклеотидом, так и отсутствием стекинг-взаимодействия оснований и высокой лабильностью poly(dT).

Как уже было отмечено выше, сравнение теории с экспериментом предсказывало по крайней мере три типа независимых способов связывания БЭ с дц-ДНК

Для подтверждения такого вывода, были проведены опыты по взаимодействию БЭ с ДНК различного ССсодер-жания в различных условиях (в разных ц и рН). Как видно из рис.1а и б (кривая 1) poly(dA) poly(dT) не плавится вплоть до 48°С. Это позволяет изучить связывание БЭ с дц-полимером в условиях существования двойной спирали (20°С< t < 48°С) при ц =2,2-10'2М [№}.

При определении типов связывания учитывалось, что флуоресцирующие комплексы БЭ относятся к интеркалиро-

ванному в двойную или более высокого порядка спираль лиганду (они получили название "сильных" из-за высокой константы связывания), а нефлуоресцирующие типы комплексов - за счет связывания лиганда с одной из бороздок полинуклеотидов и/или за счет неполной интеркаляции между основаниями одной цепи. Другой тип взаимодействия также нефлуоресцирующий и образуется за счет внешнего связывания БЭ с отрицательно заряженными фосфатными группами. Таким образом, при помощи сравнения спектров флуоресценции и поглощения комплексов БЭ с ро1у(йА) ро1у(с!Т), ДНК Т.Т. дали возможность обнаружить три способа связывания лиганда с дц-полинуклеотидами и определить термодинамические параметры соответствующих комплексов (таблица 2).

Таблица 2. Термодинамические параметры связывания па

двухцепочечпых ДНК Т.Т. и ро!у((1А)ро1у(с!Т)

К5ф-10"5 К5"ф-10"5 К\у-10"5 п5ф п5нф Пуу

ДНК Т.Т. 3.6±0,1 1,5±0,1 0,7+0,1 6±0,5 10±0,5 2,2±0,5

ро1у(&\ )-ро!у(с1Т) 11+0,5 2,8±0,3 0,8±0,1 5±0,5 10±0,5 4,0+0,5

индексы относятся "э*" -к сильному флуоресцирующему, "знф" к сильному нефлуоресцнрующему, "V/" - к слабому способам связывания, ц- 2,2-10"* М [N8+], рН 7,0 при температуре 25°С.

Сравнение теории с экспериментом обнаружило еще одну особенность поведения БЭ и АМД при комплексо-образовании с ДНК, который проявляется при высоких относительных концентрациях лиганда. В зависимости от величины соотношения констант связывания лиганда со спиральной и клубкообразной формой ДНК, низкомолекулярное вещество стабилизирует или дестабилизирует вторичную структуру биополимера. На опыте это действие проявляется в сдвиге точки перехода комплекса Тт в ту или иную сторону по отношению к Т0 чистого полимера, (при стабилизации 5Тт=Тт-Т0 увеличивается, а при дестабилизации -уменьшается, а ширина интервала перехода и в том, и в другом случае увеличивается). Такое изменение параметров перехода предсказывает теория, что связано с перерас-

пределением лигандов в ходе плавления между спиральными и клубкообразными участками в соответствии с их сродством к этим участкам. Многочисленные эксперименты с различными лигандами (антибиотики, красители, белки, ион-ны тяжелых металлов) подтвердили это предсказание теории. Кроме этого, раннее разработанная теория указывала, что если термодинамические параметры связывания удовлетворяют условию

1 Л т Л I п т Р .

Х-> Е — и Е — (1)

/=1 ■ ]=1+1 Г/ /=1 Г1 ]=М Г}

где гд - число мест связывания, рд - отношения константы связывания лиганда Кд к константе связывания К, произвольно выбранного взаимодействия (д = /, у), У - относится к дц-, У - к оц-полимерам, 1 - число типов взаимодействия на дц-полинуклеотиде, т - общее число типов взаимодействия, то существует определенная относительная концентрация лиганда с при которой 5(АТ/Тт2) = 0. Это происходит за счет того, что при выполнении условий (1), в точке

/

перехода (Т„) количество связаных лигандов с дц- ^ о, ,и

/=1

/77

оц-ДНК ^Су равны, а в силу условия (1) места связывания у=/+1

на оц- полимере ненасыщены. Дальнейшее увеличение с приводит к уменьшению температуры (7^) и резкому увеличению ширины интервала (А 7), перехода спираль-клубок комплекса.

На рис. За и 36 приведены результаты экспериментальных исследований перехода спираль-клубок комплексов ДНК с БЭ при относительных концентрациях лиганда от 0,25 до 0,55 в интервале изменения ионной силы от 2,2 -10"3М [7Уа+] до 2,210"2М [ЛЪ+].

Как видно из рисунка, при с = 0,5 ширина интервала плавления становится равной ширине интервала плавления чистой ДНК (рис.3). Дальнейшее увелечение концентрации

лиганда приводит к понижению температуры плавления (рис.Зб) при этом А71 комплекса возрастает.

Рис.3. Экспериментальные кривые зависимостей е(ЛТ/Тт2) (а) и 5(1/Тга) (Ь) от с (о2Б/Р), полученные из кривых плавления комплексов ДНК с БЭ при ионных силах ц=2,210"3М [Иа+] (1>, ц=1,010'2М[Ыа*] (2), м=2,210"Л М[Иа*] (3); рН 7,0. Показаны среднеквадратичные ошибки.

Этот экспериментальный факт указывает на то, что тачиная с некоторых, вполне определенных высоких «шцентраций бывший стабилизатор двухспиральной ДНК,

превращается в дестабилизатор этой структуры (стабилизатором клубкообразной конформации).

Уменьшение ионной силы на один порядок, увеличивает то значение с, при котором наблюдается указанная инверсия стабилизирующего эффекта БЭ, что говорит в пользу появления новых, очень слабых типов взаимодействия этого лиганда с ДНК, при ц=2,2-10"3М [№+]. Что касается АМД, то изменения ионной силы на порядок не влияет, на точку инверсии (с = 0,5), что хорошо согласуется с результатами сравнения теории с экспериментом.

С целью выяснения роли того или иного типа связывания лиганда в стабилизации двойной спирали ДНК были расчитаны изменения свободной энергии АС и энтропии Д5° с использованием уравнения Вант-Гоффа:

АЯ° _ сИпК Д ~ <1(1/ТУ

где АН" - энтальпия перехода, Я - универсальная газовая постоянная, К - константа связывания, Г - абсолютная температура.

АН° для сильного флуоресцирующего комплекса был определен из графика зависимости 1пК от 1/Т (рис.4), а с помошью уравнений Ав° = - ЯИпК, и ДБ0= (ДН° - АС)/Т были определены ДС и Д5° (табл. 3). Приведенные в таблице 3 значения АС = - 8,7 ккал/моль хорошо согласуется с известными литературными данными аналогичных исследований связывания БЭ с ДНК и находится в соответствии с данными о сильном интеркаляционном (флуоресцирующем) комплексе. С другой стороны расчитанные значения АН° = 0 и ЛБ" = 28 ккал/моль-град (таблица 3) свидетельствуют о том, что связывание интеркаляционным способом носит энтропийный характер.

InK

20 15 10 5 0

3.10

i I

3.20

3.30

3.40

1/Т-10яК

Рис.4. Логарифмическое отложение константы связывания сильного комплекса БЭ - poly(dA) poly(dT) от температуры раствора, как 1/Т

Таблица З.Термодинамические параметры комплексов БЭ с дц- и оц- poly(dA)poly(dT). р-йёЛОЧР [Na+].

Вид комплекса t,°C ДС°, ккал/моль ДН°, ккал/моль кал/мольград

Нативный poly (dA) poly (dT)

Сильный 20 -8,2+0,1 -0,06 28±0,5

Сильный 41 -8,85±0,01 -0,06 28,2±0,1

Сильный 48 -8,90±0,01 -0,06 27,7±0Д

Денатурированный poly (dA) poly (dT)

Сильный 70 -8,1+0.03 -0,06 23,3±0,05

Слабый 70 -7,0±0,3 - -

Этот результат также хорошо согласуется с известными в литературе термодинамическими параметрами комплексов лигандов-интеркаляторов (АМД, акридиновые красители) с ДНК. Уменьшение ионной силы раствора на порядок (от 2,2-10~2М [Ка+] до 2,2-10"3М [Иа+]) не влияло на параметры связывания как "сильного", так и "слабого" комплексов (рис.5).

Рис.5. Изотерма адсорбции БЭ в отложении Скетчарда для ploy(dA) poly(dT) f-70°C, рН 7,0 при трех ионных силах: 2,2-103; 1.1-10"2; 2,2-10'2 Соответствующие экспериментальные точки при трех ионных силах совпадали в пределах ошибки опыта.

Этот факт указывает на неэлектростатическую природу взаимодействия БЭ с poly(dA) и poly(dT) для сильного комплекса. Сравнение величин A G° для "сильного" и "слабого" комплексов БЭ с оц-полимером и AG° сильных комплексов с оц- и дц- полимерами (в обоих случаях разница составляет ~ 1 ккал/моль) дало возможность предложить модель (рис.6), согласно которой при 70°С связывание БЭ с poly(dA) и poly(dT) осуществляется за счет образования стекинг-кон-такта с основаниями. Стекшимззаимодействие с пуриновыми основаниями poly(dA) будет больше, чем с пиримидиновыми основаниями poly(dT). Экспериментально мы наблюдаем два независимых способа связывания с константами отличающимися в ~5 раз. Число мест связывания слабого комплекса (см. табл.1) оказалось в два раза больше числа мест сильного комплекса, что легко объясняется слабым стекинг^взаимодействием оснований и высокой лабильностью poly(dT).

Poly(dА)

Poly(dT]

Рис.6. Модель взаимодействия БЭ с одноцепочечными poly(dA) и poly(dT) при 70°С. Пунктирами обозначены лиганды, связанные с poly(dT) слабым способом. Из-за слабою стекинг взаимодействия и высокой лабильности poly(dT) число нуклеотидов, приходящих на одно место сильного связывания -ns poly(dA) (7-8 нуклеотидов) примерно в два раза меньше nw poly(dT) (4-5 нуклеотидов). (Бледный фон соответствует слабо связанным лигандам.)

Представлены также результаты исследования перераспределения лигандов по типам связывания в ходе перехода спираль-клубок (Рис.7). Известно, что абсорбционный метод регистрирует общую концентрацию

С ( О-в 0.5 0.4

0.3

0.2 0.1

Рис.7. Зависимость перераспределения БЭ по типам связывания (сч) от общей относительной концентрации с=2И/Р, полученные для дц-ДНК при рН 7,0 из спектров флуоресценции (1). для нефлуоресцирующего сильного комплекса (2), для нефлуоресцирующего слабого комплекса (3), из спектров адсорбции оц-ДНК рШ,0 (4) .На вставке экспериментальные кривые 1,2,3. ¿=25°С, ц=2,2-10-2 М [Ыа%

флуориметрический - концентрацию интеркалированного БЭ, поэтому разность этих двух методов характеризует нефлуоресцирующий комплекс.

Из анализа кривых связывания БЭ с дц- {рН 7, г=25°С) и оц-(рН 3, £=25°С) ДНК Т.Т. в координатах Скетчарда, полученных при помощи спектров поглощения и флуоресценции комплексов, построены зависимости сд от общей относительной концентрации лиганда с в растворе (рис. 7). Кривая 1 получена из спектров флуоресценции комплексов и соответствует перераспределению интеркалирующего лиганда. Нелинейность для нефлуоресцирующего комплекса позволила обнаружить "сильный", и "слабый" типы связывания лиганда (кривая 3) с дц-полинуклеотидом. При взаимодействии БЭ с оц-ДНК заметное изменение спектров флуоресценции молекул БЭ не регистрируется, что обусловлено тушением флуоресценции молекулами воды. Отсутствие флуоресценции при связывании БЭ с оц-ДНК, делает невозможным получе-

ние хода кривых cq(c), которые описали бы особенности заполнения одноцепочечных участков. Поэтому, кривая 4 на рис.7 представляет суммарную зависимость изменения концентрации лиганда с оц-полимером.

Полученные в этой главе данные являются обоснованием выводов, вытекающих из сревнения теории с экспериментом.

В четвертой главе рассмотрена возможность использования бимодальных лигандов в исследовании процесса пред-плавления ДНК. С этой целью было проведено изучение комплексов ДНК Т.Т. с ЛТлюбивым бимодальным лигандом Hoechst 33258. Свойство избирательности этого лиганда можно использовать для обнаружения участков, ответственных за плавление ДНК при температурах заведомо ниже Тт. Для этого сравнивались дифференциальные кривые плавления чистой ДНК (кривая, 1рис.8) с ДКП комплекса ^ЩК-Hoechst 33258 (кривая,2рис.8).

t°c

Рис. 8 Дифференциальные кривые плавления ДНК тимуса теленка (1) и его комплекса с Hoechst 33258 в соотношении 2Z?/A1:25 - (2). ц=2,210'2М [Nal; pH 7,0.

Видно, что при плавлении комплекса участок, среднее СС-содержание которого оказалось равным -33%, ниже

среднего ¿^содержания ДНК Т.Т., равного 43% сдвинуто в область более высоких температур. Этот экспериментальный факт говорит в пользу того, что именно эти участки ответственны за предплавление.

В пятой главе приведены материалы и экспериментальные методы использованные в работе.

ВЫВОДЫ

1. Определены экспериментальные условия, оптимальные для изучения особенностей взаимодействия лигандов с двухцепочечной и одноцепочечной ДНК Показано, что в случаях £=70°С, ц=2,2-1(У2М[Ыа+.] и рН 7,0, а также при ¿=25°С, и той же ионной силе и рН 3,0 - ро1у(с!А) ■ро1у((1Т) и природные ДНК в присутствии используемых концентраций лиганда находятся в виде одноцепочечных, а при Ь <48°С в интервале изменения ионной силы раствора 2,2- 10-3<ц<2,2- 102М и рН 7,0 - в виде двухцепочечных полинуклеотидов.

2. Экспериментально установлено, что БЭ образует на однонитевых гомополимерах ро1у(йА) и ро1у(с1Т) два типа комплексов: сильный, с термодинамическими параметрами Л^и-Ю5^!'1, п3=8 оснований, Дб:°=-8,1±0,03 ккал/моль и слабый - Д,=2,9- 104М'\ пш=4 оснований, Дбг°=-7,0±0,3 ккал/моль, причем сильный комплекс относится к взаимодействию с гомопуриновой нитью (ро1у(йА)), а слабый к гомопиримидиновой (ро1у(<1Т)}. значение г% в два раза меньше, чем щ, из-за высокой лабильности и очень слабого стекинг взаимодействия с ро1у((1Т). На основании сравнения расчитанных величин А £7° "сильного" и "слабого" комплексов лиганда с оц-полимерами и того же параметра сильных комплексов с дц- и оц-полимера, предложена модель стэкинг-контакта БЭ с ро1у(<1А) и ро1у(<1Т).

3. Впервые экспериментально доказано существование сильных нефлуоресцирующих комплексов БЭ с ДНК, которые образуются при помощи стекинг-контакта с основаниями, расположенными в узкой бороздке полинуклеотида.

4. Показано,что при некоторых больших концентрациях лиганда (БЭ, АМД), он из стабилизатора двойной спирали превращается в ее дестабилизатор. Концентрация, при которой наблюдается указанная инверсия, зависит от ионной силы раствора в случае БЭ, в то время, как в случае АМД эта зависимость слабая. Такое различие связано с появлением при низких ц у БЭ очень слабого ионного взаимодействия с дц- и оц- ДНК

5. Впервые экспериментально подтвержден вывод теории о том, что чем больше отношение pq/rq для каждого типа связывания, тем при меньшей общей концентрации лиганда происходит насыщение мест связывания для данного типа взаимодействия.

6. Путем сравнения ДКП чистой ДНК Т.Т. и ее комплексов с ЛТлюбивым лигандом Hoechst 33258 выявлены участки, ответственные за "предплавление" биополимера, ¿^содержание этих участков оказалось меньше (-33%), чем среднее ¿¡^содержание ДНК Т.Т. (-43%).

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. А/Г. Karapetian, G.A. Manukian, G.A. Terzikian, P.O. Vardevanian// Thermodynamic Parameters of Conformational Transition of DNA and its Complexes with Ligands Theory and experiment- life Sciences Newsletter.v.l,n.2, p. 10-13, 1999.

2. P.O. Vardevanian, G.A. Terzikian, A.P. Antonian, G.A.Manukian, A.T. Karapetian//Premelting Regions of DNA as Revealed by the Comparision of the Differential Melting Curves of DNA and DNA-Hoechst Complex. J.Biomolec. Struct. Dyn. , 16,1247, 1999

3. A. T. Karapetian, G. A. Manukian, P.O. Vardevanian

//Effect of the Concentration of the Multimodal Ligands on the Stabilization of the Double Helix of DNA. J.Biomol. Struct.Dyn.v.16, n.6, 1279, 1999. •

4. П.О. Вардеванян, А.П. Антонян, ГА Манукян, А.Т. Карапетян, А.К. Щелкина, О.Ф. Борисова // Связывание бромистого этидия с нативным и денатурированным poly(dA)-poly(dT). Молекулярная биология, 34, 2, 310315,2000.

ITuiGniljjuiG Q-pJiqnji llpuijni2li

Цпцифйгщш^ iliqmûqQbpli üfiui- U Ьр^црш ОЛЛЭ-ф hhin ijin{uuiqi}hgnLpjuiG mnmGáQuihuiinlirupjniGGbpp

шгфпфцо.ьр

<mûqnijgmjliû puinbp1 П-"ЫЭ-( iqni]iQmliihnm¡ii|Gbp, rV4jí9--j]iqmQii hmúmúlimgnipjniúQhp, tui]iqlmnJ ppnúfii} (tP), uilpn{iQnúligliG О- (ТИП-), iquipiujp-liöjili luGgniii, IjuiiqúiuG Jiqnpbpúbp, Guijuuihuqmú,:

Tjbplpujuigiluiö ui2luuiuiuiGpniú пштййипфрф^ t TbO-tP L ГУЫЭ--ШП- hmümiSJimgnipjniúühpli uiiupntjp-l^&Jilj uiGgnuîp tfJijiiiiliiijpJi pH-Ji U çbpiSuiumfiûuiGfi mqrjb&nipjmü uimlj U првд^Ь]. Ьй GpuiGg phptfuxqli-йшйВДш^шй huimljnipjniGGhpp pGnipuiqpnii übönipjniQQhpp: Иицшдтд^Ь^ t tP-Ji итйфщй bplpii mjiujli ijinlumqqhgmpjmû qnjnipjniûp üjiu^qpui ГУЪifr-Ji, U й1гш2Прш uliGphuiJili poly(dA) U poly(dT) iqnijiGnilubninliqGbpji hhin: U|iuigúiuG ljnpbp{i inbupp iHjmjniú t, np tP-fr tíliui2qpiu ujn]]iQmlj[tminliqli hhin i|inlumqrplmü bquiGuiljGbplig úhljp «nidhq» t, lîjniup' «pnij[»: l>inmpnúbmp}il|uiljiuG U ou}mlil)iiiljiuG lnuiGtfuiG bquiGuiljGbpnil пштййши^рфий Ьй bplpqmpnijp 'УЫЭ--^ hhuitP-li «nidbq» b «pnijp> mtiujfi hmúmúJimgnipjniQQbpp, npryijhi bQ Gpuiûg К b n -рЬрйилфйшйВДш^шй upupuiiSbuipbpli uipdhpGhpp:

U]im- b Ьр1}2прш u}ni]iúbpQbpli pnij[ b nidbq huiiîiuù|iuignipjmQQbpJi AG0 pbpiîmrjJiûmiîlilimljmû iqiupuitfbmpli huitfbiSuiuinipjiuG hJnîuiG ijpm шпш?шр1р1ш& t poly(dA)-\i b poIy(dT)-\i Pt-fi hhin umhljliGq-lpiGuimlim}i lînqhip:

ônijg t тр4ш&, np úJnugiíuiG jnipuipuiûynip brpiiGuilijiG hiuiîuiiqui-muiufuuiGnq mbqbpliû 1рии]фц0 tliquiúrjli IpiGgbGinpuigJiuiG (cq) Ijuifuiluxö t pq/rq hmpmpbpntpjniûlig (pq=K</K|): pq/rq-li iîb& uipdhpQhp}i qbujpniiî hmqbgniiîp IpujiuGnid t iliquiûqli фпрр pGqhuiGnip lInGgbGlnpшgllШJlx qhtqpniú, Uujmgntgilmö t, np iliqmQr^i pmpàp ЬшршрЬршЦшй Ipiûgbûmpiu-g[imûbp[i qbiqpnid, bpp bpl^qpui uibquiduiubpp huiqbGntd bG iJiqmGqni}, ilbpjJiGu bpl^qpui 'УЫЭ-ф Ijuijmûuignigfolig qumGniiî t ûpui uivquilpu-jniGmgnigli¿:

Snijg t трфий, np uijG IpiGghGuipuigJiiuG, bpp тЬц]1 t niGbGntú uijq 1|Ьршфп1итйр tP-fr qbiqgniú, ljmtui[mir t, foui} UlR-ji ijbiqpnití qphpb ljujfui[iud ¿t tinüujlpuG nidjig: TbfcbHoechst huiúuiú[íuignipj ui G huipîuiG illi$bpbGglxm[ Ipipbpli djigngnil qGmhmimlmö bG uijG ифрпурОЬрр, npnûgni| iquijiîuiGu^npi{ui& bG IjbQuuiujniluîbpfi GuiJuuihiuiiîuiG qnpöpGpuigp: