Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые биоактивные аналоги инсулина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новые биоактивные аналоги инсулина"

"РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМВДИЦИНСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.152.1.

Максимова Елена Марковна

НОВЫЕ БИОАКТИВНЫЕ АНАЛОГИ ИНСУЛИНА.

(специальность 03.00.04 - биологическая химия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -1997

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В НИИ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биол. наук В. Н. Прозоровский.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

зав. лабораторией молекулярной эндокринологии Института эксперименталъ эндокринологии (Эндокринологический научный центр РАМН), академик РАМН А. Панков;

зав. лабораторией медицинской биотехнологии НИИ биомедицинской химии РЛ? д. б. и. Н. Н. Соколов.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институг питания РАМН.

Защита диссертации состоится .¿¿ИЛЛ^ 1997 г. в /о часов на заседа Диссертационного Совета Д 001. 10. 01 при НИИ биомедицинской химии РАМЬ адресу: 119832, Москва, ул. Погодинская, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ биомедицинской хи РАМН.

Автореферат разослан " _ 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Инсулин играет важную роль в процессах шедеятельности и ему принадлежит центральное место в регуляции углеводного лена у животных и человека.

Важное практическое значение инсулина определяется тем, что этот гормон роко используется в современной медицине для заместительной терапии при »бете.

Инсулин во многих отношениях может служить моделью пептидных гормонов, еле того, как он был выделен (Banting, Best, 1922), инсулин явился первым белком, даторого установлена аминокислотная последовательность (Sanger at al, 1955), >вым белком, синтезированным химическими методами (Du, Zahn, Katsoyanis, ,4).

Именно для инсулина впервые было показано, что молекула может [тезироваться в виде более крупного предшественника (Steiner at al, 1968). (eirrop инсулина оказался первым выделенным и охарактеризованным рецептором [тидных гормонов (Cuatrecasas, 1972).

Кроме того, инсулин оказался первым белком, полученным для коммерческих ¡ей с использованием технологии рекомбинантных ДНК (Goeddell, 1979).

Однако молекулярные механизмы действия инсулина и общие закономерности имосвязи между структурой и активностью этого гормона остаются до конца мяснеиными. Поэтому весьма актуальным является проведение периментальных исследований по получению структурных аналогов инсулина, чешио их свойств и оценке функциональной роли определенных участков фомолекулы гормона.

Цель настоящего исследования: Создать новые пептидные аналоги инсулина, ойчивые к протеолизу, как основы для получения в дальнейшем лекарственной рмы пептидного препарата, применяемого при ивсулшшвисимом диабете.

Конкретные задачи исследования:

1. На основе имеющихся литературных данных по синтетическим аналоп инсулина, по аналогам, полученным направленным мутагенезом и с учет< результатов при применении метода компьютерного моделирован: пространственной структуры молекул (программа ONIX, ИБМХ РАМ! сконструировать новые пептидные аналоги инсулина, непосредствен) ответственные за связывание гормона с рецептором и обладают инсулиноподобной биологической активностью.

2. Методом твердофазного синтеза получить пептиды, отражающие строен: центра связывания с рецептором, очистить их. Выделить пептидные знали инсулина в окисленной и восстановленной формах.

3. Изучить лабильность ннсулиноподобных пептидов воздействи протеолнтических ферментов.

4. Осуществить скрининг биологического действия пептидных аналоп инсулина в двух формах на культуре клеток.

5. Провести тестирование на животных со стрептозотоциновь экспериментальным диабетом.

Принципиальная новизна и научно-техническая ценность предлагаемой работ состоит в том, что получены новые пептидные аналоги инсулина, обладают биологической активностью, сравнимой с активностью нативного инсулина in vivo in vitro.

Результаты работы могут быть использованы :

- в медицине для разработки в дальнейшем лекарственных форм пептидш препаратов (пептидомиметиков), устойчивых к протеолизу, с улучшенные фармакохарактеристиками, применяемых при инсулинзависимом диабете.

- в фундаментальных научных исследованиях механизмов молекулярно) узнавания (гормон-рецептор), в выявлении минимальных, функционально-значнмь участков связывания белков с рецептором.

Апробация диссертации состоялась 13. 1. 1997 г. на межлабораторной конфе-снции НИИ биомедицинской химии РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах машинописен) текста, включая 33 рисунка, 10 таблиц и 2 схемы. Состоит из следующих азделов: Введите, Литературный обзор, Материалы и методы, Результаты кспериментов, Обсуждение полученных результатов, Выводы, Список литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Использовали реактивы: ирм Nova Biochem, США; Applied Biosystems, США; Fluka, Германия; Wako Pure liemica) Industries, LTD, Китай; Serva, Германия; Bio Red, США; Sigma, США; Novo, ,ания; реактивы отечественного производства "осч" и "хч" и др.

Использовали оборудование: .ептидный синтезатор модели 431А фирмы Applied Biosystems, США; пептидный игеезатор модели 9500 фирмы Millipore, США; аминокислотный анализатор одели 3201 фирмы LKB, Швеция; жидкостной хроматограф высокого давления ирмы Waten, США; жидкостной хроматограф высокого давления модели 324 ирмы Altex, США; спектрофотометр СФ-49 фирмы ЛОМО, Россия; юктрофлуориметр BAIRD ATOMIC, Англия; спектрофотометр HEWLETT A.CKARD, США; сцинтиляяционный счетчик 1219 RACKBETA фирмы LKB, 1веция.

Пептиды синтезировали твердофазным методом с использованием Fmoc -;щшценных аминокислот карбодиимидным методом с N-гидроксибензотриазолом.

Аналог 1 получали сшивкой Asn-Cys и Cys-Gly-Glu-Arg-GIy-Phe-Phe-Tyr. В [Честве твердой фазы для дипептида применили смолу Fmoc - Asn (Trt) Wang Resin, m октапептида - Fmoc Wang Resin.

Аналоги 2 и 3 синтезировали пошаговым наращиванием цепи до получения декапептидов, используя смолу Fmoc - Asn (Trt) Wang Resin. Fmoc-защиту снимали смесью 30% пиперидин/70% 1:1 Ы-мэтилпирролидон-.толуол. Каждую стадию присоединения новой аминокислоты контролировали качественной нингидриновой реакцией - Кайзер - тестом (Kaiser, 1970).

Снятие пептидов со смолы с одновременным удалением всех боковых защитных групп (кроме ацетамидометильной группы Cys) проводили инкубацией в смеси: 90% трифторуксусная кислота, 5% тиоанизол, 3% этандитиол, 2% анизол в течение 4 ч. в атмосфере азота в темноте. Раствор фильтровывалн и осаждали в холодном дютиловом эфире. Выпавший осадок фильтровали и сушили под вакуумом над Р2О5

Для очистки пептидов использовали ВЭЖХ. Фракции с пептидным материалом лиофилизовали.

Аминокислотный анализ аналога 1 проводили после сшивки ди- и октапептидов дисульфидной связью; для аналога 2 - осуществляли как при наличии ацетамидометильной защиты Cys, так и после получения пептида в окисленном виде; для аналога 3 - проводили при наличии ацетамидометильной защиты Cys.

Содержание аминокислот аналогов 1, 2 определяли на аминокислотном анализаторе модели 3201 фирмы LKB, Швеция; для аналога 3 - на хроматографе Altex Model 324, США, с предколоночной модификацией пептидного гидролизата воздействием фенилизотиоцианата (Heinrikson et al., 1984).

Получение аналогов 1,2. 3 в окисленной форме осуществляли согласно методу (Kamber, 1971) добавлением раствора йода в метаноле.

Получение аналогов в восстановленной форме (аналоги 2а, За) проводили воздействием ДТТ на аналоги 2, 3 в соответствии со следующей реакцией (Iyer et al., 1973):

fS1

t-S-S-R + SH-CH;-{CHOH)2-CH2-SH -> 2 R-SH + H0

OII

'еакцию останавливали подкислением 6 н HCl до pH 2-3 и лиофилизованный ютериал, растворенный в 30% СНзСООН, разделяли ВЭЖХ.

Протеолиз трипсином (Дэвени, Гергей, 1976) аналогов в окисленной форме [роводили в 0,1 М ТРИС«НС1 буфере pH 8,5 добавлением раствора трипсина в ом же буфере (весовое соотношение пептид: трипсин 1:1/50 и 1:1/30 для аналогов и 3 соответственно). Смесь инкубировали 24 ч. при 37СС в атмосфере азота, 'словия протеолиза трипсином аналогов в восстановленной форме аналогичны словиям протеолиза трипсином аналогов в окисленной форме с добавлением I моль ДТТ.

Протеолиз химотрипсином (Дэвени, Гергей, 1976) аналогов в окисленной юрме проводили в 0,1 М ТРИС'ИС! буфере pH 8,5 добавлением растворов имотрипсина и ингибитора трипсина в том же буфере (в соотношении пептид: нмотрипсин: ингибитор трипсина 1 : 1/50 : 1/100 и 1:1/25: 1/50 для аналогов 2 и 3 >ответственно). Смесь инкубировали 24 ч. при 37°С в атмосфере азота. Условия ротеолиза химотрипсином аналогов в восстановленной форме аналогичны словиям протеолиза химотрипсином аналогов в окисленной форме с добавлением нмоль ДТТ.

Мониторинг протеолиза пептидов осуществляли измерением флуоресценции шешенного изоиндола, который образуется при взаимодействии о-

талевого альдегида с освобождающимися при протеолизе первичными «иногруппами в присутствии ß-меркаптоэтанола по следующей схеме (Simons et 1978): .....

IS-CHj—CIlj—OH

О-фталевый альдегид перекристаллгаовывали из горячего гексана. Выпавшие кристаллы светло-лимонного цвета отфильтровывали, сушили над СаСЬ, хранили при 0°С в темной склянке.

О-фталевый реактив готовили согласно (Cooper е! а!., 1984). Хранили при 0°С в темной склянке.

Проведение флуориметрической реакции осуществляли по методу (Дарбре, 1989), модифицированному нами. К 10 мкл отобранной реакционной пробы добавляли для остановки реакции 10 мкл 0,2 мМ раствора фенилметилсульфофторида в изопропаноле. Затем приливали 470 мкл 0,4 М боратного буфера рН 9,5 и 30 мкл ОФ-реактива. Через 2 мин. после прибавления последнего измеряли флуоресценцию с максимумом возбуждения при 360 им и максимумом эмиссии при 455 ни.

Скрининг биологического действия аналогов инсулина на культуре клеток проводили по способности стимулировать поглощение клетками глюкозы и влиянию на синтез гликогена, триглицеридов и ДНК. В качестве контроля сравнения использовали коммерческие препараты инсулина (Россия, активность 40 ед\мл, 0,13 ед=0,83 нмоль) и тетрапептида (ТО) Арг-Гли-Фен-Фен (Novabiochem, В 22-25).

Для определения инсулиноподобной активности аналогов инсулина использовали адипоциты крыс и клетки L-929 (фибробластоподобные клетки фибросаркомы мышей). Адипоциты получали из элидидимальной жировой ткани крыс по методу (Kueng et al., 1982). Клетки L-929 культивировали в атмосфере 95% воздуха, 5% СОг при 37°С в среде ДМЕМ, содержащей 10% бычьей сыворотки и антибиотики до состояния плотного монослоя (2x105 клегок\лунку). Расчет количества клеток проводили по методу (K.ueng et al., 1982).

Для определения влияния аналогов инсулина на биосинтез гликогена по етоду (Kikuchi et а!., 1980) адипоциты инкубировали при 37°С в 0.02 M «карбонатном буферном растворе Кребс - Рингера, рН 7,4, содержащем 1% БСА, С-4 глюкозу, инсулин или пептиды. Через 10 и 20 мин. инкубации реакцию станавливали добавлением 10 н КОН. Щелочной гидролизат наносили на диски из ильтровальной бумаги Ватман 3 M и промывали 60% С?Н-,ОН для удаления юбодной C-14-глюкозы. Радиоактивность гликогена измеряли, помещая ысушенные диски в толуоловый сцинтиллятор.

При определении влияния аналогов инсулина на биосинтез триглицеридов по етоду (Lacasa et al., 1994) адипоциты инкубировали при 37°С в роллернсй установке 0.02 M бпкарбонатном буферном растворе Кребс - Рингера, рН 7,4, содержащем ¡% СА, С-14 глюкозу, инсулин или пептиды. Через 3 часа к пробам добавлял!! 5 и :S04. Триглицериды экстрагировали толуоловым сцинтилятором и проводили адиометрическое измерение.

Для определения влияния аналогов инсулина на поглощение глюкозы нетками L-929 по методу (Weitzel et al., 1971) ростовую среду (ДМЕМ с добавками) шеняли на глюкозодефицитную среду DPBS (PBS с добавками). Через 24 часа к яеткам вносили анализируемый материал и инкубировали в течение 3-х часов при 7°С. Добавляли С-!4-глюкозу и инкубировали 10 мин. Затем среду удаляли, клетки ромывали холодным PBS, лидировали добавлением 0.3 н КОН. Радиоактивность лзата клеток определяли после его нейтрализации 1 н HCfO-i.

Действие аналогов на синтез ДНК оценивали, измеряя включение С-14-мидина в ДНК клеток L-929. Клетки, достигшие состояния конфлюента, 1нхронизовали в среде DMEM, содержащей 0.5% эмбриональной телячьей лворотки и антибиотики, в течение 48 час. со сменой среды через сутки. Добавляли сследуемый материал и инсулин, а через 21 час - С - 14 тимидин, инкубировали 4 ас. при 37° С. После удаления среды клетки промывали холодным PBS (0,1 M осфатным буфером рН 7.4), фиксировали при 0°С смесью G>HsOH : ледяная

СНзСООН (9:1), лиировади добавлением 0,3 н. КОН и определяли радиоактивносп лизата клеток как описана выше (Abakumova eí al., ¡990).

Результаты этих исследований, являющиеся средними значениями полученными на 4-5 лунках в двух аналогичных опытах, рассчитывали в имгЛмин нг I06 клеток и выражали % к контролю, При статистической обработке получении) данных использовали критерии Стыодента (t - тест).

Тестирование на животных со стрептозотоциновым экспериментальный диабетом. Использовшга белых беспородных крыс самцов весом 200 - 275 г. содержащихся на стандартной диете. Диабет, вызванный внутрибрюшинным введением стрептозотоцина в дозе 70 мг/кг веса, развивался в течение 10-12 дней. Дш. определения уровня гликемии брали кровь из хвостовой вены. Содержание глкжозь в крови определяли ферментативным глюкозооксидазным методом (Лукомская и др. 1961).

Аналоги 1, 2, 3, растворенные в стерильном физ. растворе и инсулин для инъекций в дозе 4 ед/250 г веса крысы вводили в/б. После инъекций определяли уровень глюкозы в крови с интервалом 30 мин. в течение 4-х час.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. КОНСТРУИРОВАНИЕ НОВЫХ ПЕПТИДНЫХ АНАЛОГОВ ИНСУЛИНА

Анализ имеющихся литературных данных по синтетическим аналогам инсулина, по аналогам, полученным направленным мутагенезом и с учетом результатов метода компьютерного моделирования пространственной структуры молекулы инсулина (программа ONIX, ИБМХ РАМН) показал, что район связывания гормона с рецептором сформирован на С - концевых участках А (20-21) и В (19-26) цепей инсулина, пространственно сближенных между собой и формирующих область активного центра гормона. Сближенность в пространстве участков А (20-21) и В (19-26) обусловлена наличием дисульфидной связи между цистеинами в позициях В 19 и А 20.

Для синтеза предложены следующие пептиды:

1. А5П-Су5-3-—8-Су5-С1у-0!и-Лгй-01у-РЬе-РЬе-Туг

Б---------------------------------------------Э

I I

2. Су5-С1у-С!и-А^-01у-РЬе- РЬе-Туг-СуБ-А$п

5Н БН

1 I

2 а. Су5-С}1у-Ок1-Агв-С1у-РЬе-РЬе-Туг-Су5-А5п

5----------------------------------------------Б

I I

3. Суя-ау-аи-Агд-Авр-ОРЬе-РЬе-ОТуг-Суз^п

БН 5Н

I I

3 а. Суз-ау-аи-Атя-АБр-ОРЬе-РЬе-ОТуг-СуБ^п

Каждый пептид содержит функционально важный район для связывания с нсулиновым рецептором, но обладает принципиальными отличиями в локализации статков цистеина и, следовательно, ориентации дисульфидной связи.

Аналог 1 - пептид, представляющий собой фрагмент инсулина, составленный з участков В цепи (19-26) и А цепи (20-21), соединенных между собой дисульфидной аязью.

Аналоги 2 и 2а характеризуется тем, что важные для проявления иологической активности районы А 20-21 и В 19-26 непосредственно соединены ептидной связью.

Аналог 2 является дальнейшей разработкой структуры аналога I Преимуществом аналога 2 является тот фахт, что триптический гидролиз иш гидролиз тромбином по связи Arg - Gly не исключает из взаимодействия рецептором участок связывания благодаря наличию внутримолекулярно! дисульфидной связи.

S--------------------------------------S

I I

Cys-Giy-GIu-Arg - Gly-Phe-Phe-Tyr-Cys-Asn аналог 2

t трипсин (тромбин) S--------------S

I I

Gly-Phe-Phe-Tyr-Cys-Asn Cys-Gly-Glu-Arg

Аналог 1 в результате подобного же протеолиза оказывается лишенны уч;астка рецепторного связывания и, следовательно, уже не может проявлять своег действия.

Asn-Cys-S----S-Cys-Gly-Glu-Arg - Gly-Phe-Phe-Tyr аналог 1

t трипсин (тромбин)

Asn-Cys-S—--S-Cys-Gly-Glu-Arg . +

Gly-Phe-Phe-Tyr

Аналог 2 в окисленной форме более стабилен по сравнению со сво<. восстановленной формой, аналогом 2а, т. к. внутримолекулярная дисульфида; связь фиксирует структуру молекулы, делая ее более жесткой.

Селективное расщепление пептидной связи посте Туг в аналоге 2 приводит образованию фрагмента инсулина - линейному аналогу 1.

s................................................s

I I

Cys-Gly-G!u-Arg-GIy-Phe-Phe-Tyr - Cys-Asn аналог 2 бромелаин t

Asn-Cys-S----S-Cys-Gly-Glu-Arg-Giy-Phe-Phe-Tyr аналог 1

Аналоги 3 и 3 а. характеризуются тем, что с целью увеличения устойчивости пептидов к протеолитическому расщеплению в организме животного или человека, имеют замену Gly (В 23 по нумерации В цепи инсулина) на Asp. Данная связь становится неспецифичной для тромбина, скорость триптического гидролиза связи Arg-Asp снижается, г. к. наличие кислого аминокислотного остатка после Arg приводит к снижению скорости гидролиза связи трипсином (Дарбре, 1989). Замены Phe (В24), Туг (В26) на оптические антиподы обусловлены созданием пептида, более устойчивого воздействию хнмотрипсинподобных протеаз (например, инсулиипротеазы).

Расщепление химотрипсином пептидной связи после Phe в аналоге 3 может приводить к образованию структуры, аналогичной фрагменту инсулина, но, в отличие от аналога 1, где Туг отражает положение в В - цепи инсулина, расщепленный аналог 3 (аналог Зр) имитирует данную аминокислоту из А - цепи. S---------------------------------------------S

I I

Cys-Gly-Glu-Arg-Asp-DPhe-Phe - DTyr-Cys-Asn аналог 3

хнмотрипсин Т Asn-Cys-S—S-Cys-Gly-Glu-Arg-Asp-DPhe-Phe аналог Зр

I

DTyr (Туг из А-цепи) Asn-Cys-S-—S-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr аналог 1 (Тут из В-цепи)

2. СИНТЕЗ, ОЧИСТКА, АМИНОКИСЛОТНЫЙ АНАЛИЗ АНАЛОГОВ.

ПОЛУЧЕНИЕ В ОКИСЛЕННОЙ И ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМАХ.

Аналоги получены методом твердофазного синтеза с использованием Ртос -защищенных аминокислот карбодиимидшым методом с К-гидроксибензотриазолом, очищены методом ВЭЖХ и их структуры подтверждены данными аминокислотного анализа.

Все пептиды содержали в своем составе остатки Су$. Во время синтеза БН-группу Суз защищали ацетамидометилыюй группировкой, которая стабильна к трифторуксусной кислоте при снятии пептида со смолы. Снятие защитной группировки с Суз проводили раствором йода в метаноле (КатЬег, 1971), в результате чего происходило одновременное окисление БН-групп Сув и образование дисульфидной связи

Получение аналога 2 можно рассматривать как оптимизацию синтеза аналога 1, т. к. из аналога 2 (линейного пептида) возможно получение непосредственно самого фрагмента инсулина (аналога 1) при специфическом протеолизе пептидной связи за остатком Туг. Поэтому аналог 2 удобен для получения фрагмента инсулина (аналога 1), т. к. синтезируется в виде линейного пептида и является про - активным центром инсулина с возможной дальнейшей активацией при протеолизе.

Следует отметить, что аналог 2 вследствие своей линейности удобен для получения и методами генной инженерии.

Синтезированные аналоги были очищены ВЭЖХ и их структуры подтверждены данными аминокислотного анализа.

Типичная хроматограмма очистки аналога 1 методом ВЭЖХ представлена на

рис. 1.

А 254 .0

-1-Г-7--Г~

35 36 37 ЗВ 39 40 41 42 43 44 45 4*5 47 48 1Я 50 51 52 53 64 55 54 57 58 69 60

Время (мин.) рис.). Очистка аналога 1 методом ВЭЖХ. 1 - аналог 1 2 - октапелтид 3 - димер, образованный октапептидами.

По данным аминокислотного анализа фракция 1 содержала пептидный атериал, соответствующий аналогу 1, фракция 2 - октапептиду. Во фракции 3 было тачигельно снижено содержание А ер по сравнению с фракцией 1, хотя содержание ;тальных аминокислотных остатков соответствовало октапептиду. Очевидно, шная фракция содержала более высокомолекулярный пептидный фрагмент, слученный за счет образования дисульфидной связи между октапептидами.

Фракция 1 (время удержания 40 мин.) содержала 57% пептидного материала, ракция 2 (время удержания 44 мин.) - 20%, а фракция 3 (время удержания 48 мин.) -5%. Собранный материал по фракциям высушивали под вакуумом и сохраняли при ' С. Материал фракции I при рехроматографии методом ВЭЖХ в тех же условиях шал единственный пик с поглощением в ультрафиолете при 254 им (за счет остатка уг) и при 214 нм (за счет пептидной связи).

Таблица I.

Данные анализа аминокислотного состава пептидных фракций, полученных при разделении методом ВЭЖХ*

Аминокислоты Фракция 1 Фракция 2 Фракция 3

Asp (1.0)1 (0.2)0 (0.4)0

Glu (1.3)1 (1.2) 1 (1.4) 1

Gly (2.2)2 (2.1) 2 (2.1)2

Туг (0.8) 1 (0.8) 1 (0.7) 1

Phe (1.9)2 (1.9)2 (2.1)2

Arg (l.J)l (1.0)1 (0.9) 1

'Результаты приведены в количестве аминокислотных остатков на фрагмент инсулина. Цистеин не определяли.

Результаты анализа аминокислотного состава фракции 1 (состав отвечал заданной для синтеза структуре), присутствие единственного пика при использовании метода ВЭЖХ с соответствующими спектральными данными после окончательной очистки (рехроматографии), свидетельствует о соответствии синтезированного материала фрагменту инсулина, состоящему из двух пептидов (дилептида Asn-Cys и октапептида Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr), соединенных между собой дисульфидной связью.

Аналоги в восстановленной форме (2а и За) получали воздействием ДТТ в различных мольных соотношениях с восстанавливаемым дисульфидом. ДТТ является мягким восстанавливающим агентом, действующим в сгехиометрическом соотношении с восстанавливаемым веществом (в отличие, например, от р-меркаптоэтанола).

Поскольку максимальное поглощение окисленного ДТТ наблюдается при 283 нм и, следовательно, перекрывает область поглощения пептида, измерения проводили при 310 нм, что составляет 40% от величины максимального поглощения, молярный коэффициент эхстинции 110 (Iyer et al., 1973), (рис. 2).

А зю

0.8 —

О.в

0.4

0.2

3 /

/

-а- ------в

/У

у,____

10

15

20

25

Время (минуты) рис. 2. Скорость восстановления аналога 2 ДТТ. 1- 2,4 х 10-* моль аналога 2 I х 105 моль ДТТ

2 - 2,4 х 10-6 моль аналога 2 2,4 х 1 (И моль ДТТ

3 - 5,5 х 106 моль аналога 2 1 х 10-5 моль ДТТ

Как видно из рис. 2 величина молярной абсорбции восстановленного ДТТ зависит:

1 - от концентрации восстанавливаемого пептида (пропорционально возрастает с увеличением последней, кривые 1 и 3),

2 - от концентрации ДТТ (возрастает с увеличением концентрации ДТТ, кривые 1 и 2).

ПЮТЕОЛИЗ АНАЛОГОВ ИНСУЛИНА Эксперименты по модельному протеолизу аналогов инсулина трипсином и химотрипсином показали, что в ряду аналогов 1, 2, 2а, 3, За наиболее трудногндролизуемым является аналог 3, что соответствует его структуре. Отсутствие дисульфидиых связей приводит к быстрому протеолизу и потере активности.

СКРИНИНГ ПЕПТИДНЫХ АНАЛОГОВ ИНСУЛИНА НА КУЛЬТУРЕ

КЛЕТОК.

Скрининг биологической активности аналогов инсулина проводили по способности симулировать поглощение глюкозы клетками Ь-929, по влиянию на гяикогенез в адипоцитах крыс, на синтез ДНК в Ь-929 клетках и триглицеридов в адипоцитах крыс.

Скрининг биологической активности представлен на примере аншюга 1.

Обнаружили, что аналог 1 и ТГ1 обладают способностью достоверно увеличивать (хотя и в меньшей степени, чем инсулин) скорость включения С-14 глюкозы в гликоген адипоцитов крыс. Количество включившейся за 20 мин. С-14 глюкозы для инсулина, аналога 1 и ТП составляет соответственно 185%, 155%, 125% по отношению к контролю (рис. 3).

имп\ мин на 106 клеток

2000

1ЪОО

1000

500

О ' 1П ' У Г:

Время (минуты)

рас. 3. Влияние аналога 1, ТП и инсулина на синтез гликогена в адипоцитах

крыс.

1 - инсулин 2 - аналог 1 3 - ТП 4 - контроль (Инсулин и пептиды - в концентрации 1мкМ.) * - р<0,05 **-р<0,0!

Проводили сравнительное исследование влияния аналога 1, ТП и инсулина на поглощение C-¡4 глюкозы клетками L-929. Показали, что оба иисулиновых пептида достоверно стимулируют поглощение С-14 глюкозы, причем аналог I значительно активнее, чем ТП. В концентрации 0.1 мкМ ТП не влияет на поглощение глюкозы, а аналог 1 стимулирует поглощение до 180% по сравнению с контролем. В концентрации 1 мкМ ТП стимулирует поглощение С-14 глюкозы примерно до 150%, а аналог ! до 305% (рис. 4).

% к контролю

-ЮО

зоо

zoo

1 ОС

о

рис. 4. Влияние аналога I, ТП и инсулина на поглощение С-14 глюкозы [слетками L-929.

1 - инсулин 2 - аналог 1 3 - ТП *-р<0,01 **-р<0,001

Поскольку инсулин является также и ростовым фактором, способным симулировать пролиферацию клеток, был проведен сравнительный анализ влияния [налогов инсулина и самого инсулина на синтез ДНК.

Было установлено, что при добавлении к меткам L-929 аналога 1 в :онцентрацнях 0.05 и 0.1 мкМ аналог I не активен в синтезе ДНК в этих клетках. Три добавлении инсулина в концентрации 0.05 и 0.1 мкМ синтез ДНК составляет

концентрация (мкМ)

соответственно 160% и 220% по сравнению с контролем. Добавление же к клеткам аналога 1 в концентрации 0.5 и 1 мкМ вызывает возрастание синтеза ДН К до 220% и 245% соответственно.

Совместное добавление инсулина и аналога 1 вызывает такое же усиление синтеза ДНК, что и добавление одного инсулина (гтри обеих концентрациях), что, по всей видимости, косвенно свидетельствует о несколько меньшем сродстве аналога 1 к рецептору, чем самого инсулина (рис. 5).

% к контролю

А А* Б^ Б*

концентрация (мкМ) рис. 5. Влияние аналога 1 и инсулина на синтез ДНК.

1 - инсулин в А - 0,05мкМ; в Б - 0,1мкМ

2 - аналог 1 в А - 0,5мкМ; в Б - 1,0 мкМ

3 - инсулин, аналог 1 совместно: в А*-0,05мкМ инсулина; 0,5 мкМ аналога 1

в Б*-0,! мкМ инсулина; 1,0 мкМ аналога 1 * - р<0,05 **- р<0,01 Скрининг биологического действия пептидных аналогов инсулина по способности стимулировать поглощение глюкозы клетками Ь-929 показал, что активность аналогов 1, 2, 3 составляет 80%, 52%. 64% от активности инсулина, соответственно (активность инсулина принята за 100%), (табл. 2).

Коммерческий препарат аналога инсулина фирмы ЫоуаЫосЬет (В 22-25) обладает биологической активностью, составляющей 40% от активности инсулина.

Таблица 2.

Сравнительная характеристика биологической активности пептидных аналогов инсулина по способности стимулировать поглощение глюкозы клетками Ь-929.

(в % к активности инсулина).

инсулин 100

аналог 1 80

аналог 2 52

аналог 2а 66

аналог 3 64

аналог За 74

аналог Зр 75,6

Снижение активности аналога 2 по сравнению с аналогом 1, по всей видимости, происходит из - за отличной от фрагмента инсулина локализации остатков цистеина и, следовательно, ориентации дисульфидной связи и наличия пептидной связи Туг - Сув, отсутствующей в аналоге 1 .•

Более низкая активность аналога 3 в сравнении с аналогом 1 обусловлена наличием О - аминокислот, с одной стороны, и отличной от фрагмента инсулина локализацией остатков цистеина, с другой.

Однако, активность аналога Зр, образующегося в результате расщепления кимотрипсином пептидной связи после РЬе в аналоге 3 и приводящее к образованию структуры, аналогичной фрагмену инсулина, возрастает с 129% к контролю до 170%, приближаясь таким образом к активности аналога 1 (170% и 178%, соответственно). Данный факт также свидетельствует о том, что положение Туг не является ;ущественным, т. е. аналоги

Asn-Cys-S-----S-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr из В - цепи

и

Asn-Cys-S-—S-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe из А - цепи

I

Туг (19)

проявляют сходную биологическую активность несмотря на замены L - аминокислот на D - и Gly на Asp.

Следует также учитывать процесс восстановления дисульфидной связи. Так, восстановление аналога 1 ведет к потере активности, т. к. теряются участки, необходимые для рецепторного связывания и проявления биологической активности. Восстановленные аналоги 2 и 3 (аналога 2а и За) обладают активностью вследствие сохранения выше перечисленных участков, причем ее величина выше активности в окисленной форме (активность аналогов 2 и 2а - 52% и 66%, 3 и За - 64% и 74% от активности инсулина, соответственно).

Аналоги в окисленной форме (2, 3) хотя более стабильны и трудногидролизуемы по сравнению с восстановленными, но обладают меньшим биологическим эффектом. Скорее всего этот факт объясняется тем, что наличие дисульфидных связей в них стабилизирует менее выгодную конформацию пептидов для взаимодействия с рецептором инсулина по сравнению с восстановленными формами, у которых конформационное состояние не застабилизировано и вероятно существование более выгодных конформаций для взаимодействия.

ТЕСТИРОВАНИЕ НА ЖИВОТНЫХ СО СТРЕПТОЗОТОЦИНОВЫМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ДИАБЕТОМ.

Аналоги были проверены в интервале концентраций от 1150 нм/кг до 5500

нм/кг.

Фрагмент инсулина (аналог 1) не показал пшогликемического действия, что, з всей видимости, объясняется высокой скоростью расщепления данного пептида до пщиации биологического эффекта.

Аналоги 2 и 3 проявили инсулиноподобное действие (снизили концентрацию гсокозы в крови с 22,1 ммоль/л до 10,2 ммоль/л и с 20,5 ммоль/л до 10,2 ммоль/л за 3 ica, соответственно, рис. 6. и 7.) за счет исключения потери района связывания с '.цептором до восстановления пептидов и разрыва дисульфидной связи. Однако мены аминокислот в аналоге 3 на D - изомеры и Oly на Asp привели к изменению [рактера действия - наличию латентного периода для проявления активности по >авнению с инсулином и аналогом 2.

Концентрация глюкозы в крови, ммоль/л

гзо

Время (минуты)

рис. 6. Гипогликемический эффект аналога 2 (в сравнении с инсулином) на гаотных со сгрептозотошшовым экспериментальным диабетом. 1- аналог 2- инсулин

Концентрация глюкозы в крови, ммоль/л

Время (минуты)

рис. 7. Гипогликемический эффект аналога 3 (в сравнении с инсулином) на животных со стрептозотоциновыи экспериментальным диабетом.

1 - аналог 3 2 - инсулин

Выше приведенные данные позволяют заключить, что оба процесса - и протеолиз и восстаношкние - должны быть приняты во внимание, т. к. в конечном счете приводят к разрушению любого аналога и, следовательно, утрате биологической активности.

Оба аналога (2, 3) являются перспективными (по их предварительной характеристике) в плане дальнейших исследований при различных способах введения в организм • внутримышечном, внутрибрюшинном, перораяьном (в составе шшосом). Кроме того, возможно их использование в исследовании механизма взаимодействия инсулина и его рецептора.

ВЫВОДЫ.

1. Сконструированы новые пептидные аналоги инсулина, состоящие из 10 аминокислотных остатков, непосредственно ответственных за связывание гормона с

рецептором и проявление инсулином биологической активности. Район связывания с рецептором сформирован на С - концевых участках А (20-21) и В (19-26) цепей инсулина, пространственно сближенных между собой и формирующих область активного центра гормона.

2. Аналоги получены методом твердофазного синтеза с использованием Fmoc -защищенных аминокислот карбодиимидным методом с N-гидроксибензотриазолом, очищены методом ВЭЖХ и их структуры подтверждены данными аминокислотного анализа.

3. Показано, что:

- пептиды в окисленной форме более стабильны в условиях протеолитического расщепления по сравнению с их восстановленной формой;

- аналог 3 (замена Gly (В23) на Asp и Phe (В24), Туг (В26) на оптические антипода) более устойчив в сравнении с аналогом 2 (наличие внутримолекулярной дисульфидной связи и пептидной связи Туг - Cys, отсутствующей в фрагменте инсулина, аналоге 1) в отношении гидролиза химотрипсином в виду расщепления только одной связи за Phe (В25);

- аналог 3 вследствие замены Arg-Gly на Arg-Asp характеризуется сниженной скоростью триптического гидролиза по сравнению с аналогом 2.

4. Скрининг биологического действия пептидных аналогов инсулина по способности стимулировать поглощение глюкозы клетками L-929, по влиянию на синтез гликогена, триглицеридов в адипоцитах крыс и ДНК в клетках L-929 выявил, что все аналоги обладают инсулиноподобной биологической активностью.

5. При тестировании на животных со сгрептозотоциновым экспериментальным диабетом установлено, что аналоги 2 и 3 обладают пшогликемическим эффектом, сопоставимым с действием инсулина. Максимальное снижение уровня глюкозы в крови достигается через 3 часа после инъекции, однако эффект аналога 3 характеризуется наличием латентного периода для проявления активности по сравнению с инсулином и аналогом 2.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Prozorovskiy V. N., Eldarov М. A., Ptitzsyn L. R., Alexandrova S. S., Chupirina I. Vr., Maksimova E. M., and Solodar L. f. Purification of minimal insulin analogue expressed in Escerichia coli asfusion with maltose-binding protein. KaradenizJ. Med. Sci., 1996, v. 9(4)

2. Prozorovskiy ,V. N., Maksimova E. M., Abakumova O. Yu., Kutsenko N. G., Tsvetkova T. N. The novel peptide with insulin - like biological activity. Karadeniz J. Med. Sci., 1996, v. 9 (4)

3. Дюмаев К. M., Княжев В. А., Арчаков А. И., Прозоровский В. 11., Ипатова О. М„ Гусева М. К., Алексеева А. Е., Гребенщикова О. Г., Максимова Е. М., Куценко Н. Г. Пептидный фрагмент, обладающий биологической активностью инсулина. Авторское свидетельство . Бюллетень изобретений в России, 13,1997.

4. В. Н. Прозоровский, Е. М. Максимова, А. Е. Алексеева, О. Г. Гребенщикова, О. Ю. Абакумова, Н. Г. Куценко, А. И. Арчаков. Синтетический фрагмент инсулина с инсулиноиодобной биологической активностью. Вопросы мед. химии, 1996, т. 42, вып. 4, стр. 292 - 305.