Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новая система доставки биологически активных веществ на основе олигоэфирполиола

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новая система доставки биологически активных веществ на основе олигоэфирполиола"

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

На правах рущ

005008847

ИКСАНОВА АЛЬФИЯ ГАБДУЛАХАТОВНА

НОВАЯ СИСТЕМА ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ОСНОВЕ ОЛИГОЭФИРПОЛИОЛА

03.01.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 ФЕВ Ш

Казань-2012

005008847

Работа выполнена йа кафедре биохимии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет».

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

кандидат биологических наук, доцент Фаттахова Альфия Нурлимановйа

кандидат химических наук, доцент Штырлин Юрий Григорьевич

доктор ветеринарных наук, профессор Хазипов Марйман ЗаЛилович

кандидат биологических наук, доцент МарДанова Айсылу МирКасымовна

Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки «Казанский институт биохимии н биофизнки Казанского научного центра РАН»

Защита диссертации ‘состоится 22 Февраля 2012 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д212.081.08 прй Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, Казанский (Приволжский) федеральный университет, аудиторий №211.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Нм. Н.И. Лобачевского прй Казанском'(Приволжском) федеральном университете.

Автореферат разослан «А£у> января 2012 г.

Просьба высылать отзывы на автореферат Но адресу: 420008, Казань, ул. Кремлевская 18, главное здание КФУ к.104> отдел аттестации, ученому секретарю диссертационного совета Д212.081.08 йроф. Абрамовой З.Й., факс: (843)238-76-01. Е-йіаіІ: affiya_iksaftOva@fnail.fu

Ученый секретарь Диссертационного

совета, доктор биологических наук -/ Абрамова З.И.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Одной из важнейших задач современной биологии, химии, медицины и других наук является разработка технологий внутриклеточной доставки биологически активных веществ (БАВ), основанных на преодолении защитных барьеров организма. Необходимость разработки подобных подходов обусловлена тем, что многие БАВ плохо преодолевают эти барьеры вследствие высокой гидрофильности, которая затрудняет их транспорт через липидные барьеры, например, межклеточный жировой слой кожи и/или мембраны клеток. Накоплению активных веществ в устойчивых к ним (резистентных) клетках, таких как опухолевые клетки и патогенные микроорганизмы, также препятствует высокая активность в этих клетках мембранных транспортных белков, которые осуществляют выброс веществ из цитоплазмы. Для достижения нужной терапевтической концентрации активного вещества в клетках и тканях традиционным подходом является увеличение используемой дозы вещества. В результате увеличиваются побочные эффекты БАВ, которые часто превосходят по последствиям положительный терапевтический эффект.

Перспективным подходом к увеличению проницаемости биологических барьеров для активных веществ является создание эффективных и безопасных систем доставки, которые продлевают действие лекарственного средства, увеличивают его биодоступность, снижают возможные побочные эффекты и обеспечивают направленный транспорт вещества к очагу патологического процесса. Применение систем, контролируемой доставки лекарств в клетки позволяет повысить эффективность лекарственных препаратов и уменьшить их побочное действие.

Перспективными носителями для внутриклеточной доставки БАВ являются синтетические полимеры, важная группа -амфифильные блоксополимеры окисей этилена и пропилена (торговое название фирмы БАББ (США) Плуроники). Ряд композиций на основе Плуроников проходит клинические испытания. Механизм действия Плуроников основан, во-первых, на снижении микровязкости

плазматической мембраны и, во-вторых, на подавлении АТФ-азной активности обратных транспортеров опухолевых клеток. Несмотря на определенный прогресс в терапии с помощью Плуроников, следует отметить, что недостатками этих полимеров являются узкий диапазон терапевтических доз и относительно высокая токсичность (максимально переносимая доза для Плуроника L-61 составляет 0.1 г/кг, a LDjo 0.8 г/кг). По этой причине поиск высокоэффективных и безопасных систем доставки лекарственных препаратов остается актуальной задачей полимерной терапии.

В связи с вышеизложенным была поставлена цель - количественно оценить биологические эффекты и выявить механизм действия олигоэфирполиольного носителя (ПЭ-240) биологически активных веществ.

В соответствии с целью решались следующие задачи:

1. Оценить цитотоксичность ГО-240 in vitro, подострую токсичность в системе in vivo. Определить влияние ПЭ-240 на цитотоксичность противоопухолевых препаратов доксорубицина и Ага-С.

2. Охарактеризовать влияние ПЭ-240 на микровязкость плазматических мембран клеток líela и MCF-7-, на АТФ-азную активность мембран, гиперэкспрессирующих P-gp и MRP-7; на внутриклеточный уровень АТФ опухолевых клеток MCF-7, СаСо-2 PC и М7-2.

3. Оценить влияние ПЭ-240 на транспорт флуорофоров родамина 6G, родамина 123, кальцеина-АМ и доксорубицина в опухолевые клетки HeLa и MCF-7.

4. Оценить влияние ПЭ-240 на проницаемость клеток головного мозга и активность микросом печени мышей при пероральном введении;

5. Определить влияние ПЭ-240 на противовоспалительную активность гелей наружного применения на основе кетопрофена.

Научная новизна

В работе впервые исследованы биологические свойства системы доставки БАВ на основе олигоэфирполиола ПЭ-240. Показано, что олигоэфирполиол увеличивает проницаемость плазматических мембран эукариотических клеток для широкого ряда биологически активных веществ, в том числе противоопухолевых

и противовоспалительных препаратов. При этом ПЭ-240 является более активным носителем БАВ по сравнению с Плурониками марок L-61 и F-127. Механизм действия олигоэфирполиола ПЭ-240 на опухолевые клетки заключается в ингибировании АТФазной активности обратных переносчиков, таких Как P-gp (Р* гликопротеин).

Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты представляют интерес для разработки новых и усовершенствования известных противовоспалительных и противоопухолевых препаратов, в том числе за счет снижения Побочных эффектов и увеличения терапевтической эффективности.

Количественные результаты исследования также представляют Интерес в качестве справочных данных для таких областей науки, как биохимия, молекулярная фармакология, клеточная биология, медицина и могут быть использовады в учебном процессе на биологических, Химических и медицинских факультетах.

Положения, выносимые 'на защиту:

1. Олигоэфирполиол ПЭ-240 влияе*г на транспорт БАВ через 'плазматическую мембрану клеток в зависимости от биологических условий.

2. ПЭ-240 увеличивает эффективность некоторых противоопухолевых й противовоспалительных препаратов. ■

3. ЙЭ-240 в экспериментах in vivo обладает тропностью к ткани головного мозга мышей.

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского (Приволжского) федерального университета (2008-2011 гг.), «а V съезде Общества биоТехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008), на П международной научно-практической конференции '"ПостгеНомная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2008), на XII ПущинскоЙ школе-конференции молодых ученых (Цущино, 2008), на 2-й Региональной научно-практической конференции «Синтез и перспективы

использования новых биологически активных соединений» (Казань, 2009), наХШ Всероссийской конференций «Структура и динамика молекулярных систем (Казань, 2009), на ID международной конференции «Актуальные проблемы биологий, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009), на ХШ европейском симпозиуме студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз 2009» (Казань, 2009), на Ш Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Рйссия 2010» (Нижний Новгород, 2010), на I Всероссийской виртуальной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий» (Казань, 2010), на 'Всероссийской научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии" (Санкт>Петербург, 2010). Работа была Поддержана Фондом содействия развитию малых форм Предприятий в научно-технической сфере По программе «Участник Молодежного НаучноИнновационного Конкурса» («УМНИК») (№ Т-90-1-08),

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 научных ¡работ, среди которых 1 публикация в рецензируемом журнале, включенном в перечень ВАК.

Структура и объем диссертаций

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 'описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения» выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, включает 40 рисунков и 2 таблицы. Библиография включает 180 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В экспериментах in vitro использовали клетки карциномы эндометрия человека HeLa, клетки |рака молочной железы MCF-7, клетки эпителиальной Колоректальной аденокарциномы человека СаСо-2 PC и М7-2. Соединениями для исследований служили олигоэфирполиол ПЭ-240, синтезированный в Химическом институте им. А.М. Бутлерова КФУ. В качестве реперных соединений использовали Коммерческие препараты Плуроников L-61 и

F-127. Для токсикологических Исследований in vivo использовали самцов аутбредных мышей SPF-категории CFW (SWISS Webster) и CD-I (поставщик НПП «Питомник Лабораторных животных» ФИБХ РАН, г. Пущино).

Определение цитотоксичности полимеров. ИитотокСичность полимеров на культуре клеток HeLa и MCF-7 оценивали с использованием пролиферативного MTT-Теста согласно инструкции фирмы-производителя (Promega, США). Регистрацию продукта восстановления МТТ клетками проводили на планшетном спектрофотометре Stat Fax 2100 (Awareness Technology, США) в единицах оптической Плотности прй длине волны 590 нм.

Чувствительность клеток CdCo-2 PC (контрольные) и СаСо-2 М7-2 (с гиперэкспрессией обратного транспортера MRP-7) к противоопухолевому препарату Ara-С анализировали с помощью MTS-теста (CellTiter 96 'Cell Proliferation Assay, Promega). Оптическое поглощение растворов измеряли прй 490 нм с ¡использованием планшетного спектрофотометра SpectaMax 250 (Molecular devices, США).

Определение микровязкости плазматических мембран. Микровязкость плазматических мембран опухолевых клеток определяли по анизотропий флуоресценции флуоресцентного зонда 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена, растворённого в мембране (Batrakova, 2003). Измерение интенсивности флуоресценции проводили на флуоресцентном спектрометре FL3-221-NIR (Horiba Jùbin Yvon, Франция) при длинах волн Возбуждения И испускания 360 юй и 435 нм соответственно при ¡регистрирующих поляризаторах, параллельно илй перпендикулярно ориентированных по отношению к возбуждающему свету. Исходя из значений интенсивности флуоресценций зонда, рассчитывали величину анизотропии флуоресценции и микровязкость плазматических мембран.

Определение влияния полимеров на накопление ФлуопоФоров в опухолевых клетках HeLa и MCF-7. В качестве флуорофоров использовали родамин 6G, доксорубицин, родамин 123, кальцеин-АМ. Клетки HeLa и MCF-7 предварительно инкубировали с полимерами (ЙЭ-240, L-61 или F-127), затем

добавляли флуорофоры, В зависимости от условий эксперимента регистрацию флуорофоров проводили с использованием флуоресцентного спектрометра FL3-221-NIR для родамина 123 (Horiba Jobin Yvön, Франция), флуоресцентного микроскопа AxioScopeAl (Carl Zeiss, Германия) для родамина 6G, доксорубицина, проточного цитофлуориметра BD FACSCa'libur (BD Biosciences, США) дйя кальцеина-АМ.

Для определения влияния полимеров на Транспорт флуорофоров in situ, клетки HeLa и MCF-7 выращивали на покровных стеклах. Клетки инкубировали в растворах Полимеров, далее - в ¡растворах флуорофоров (доксорубицина, родамина 123, кальцеина-АМ). Флуоресценцию флуорофоров в клетках регистрировали с помощью конфокального Микроскопа LSM 510 {Carl Zeiss, Германия).

Определение ДНК-повреждаюшей активности провопили с использованием метода ДНК-комет согласно методике Trevigen (Trevigen Inc., США). Степень ДНК-пойреждающей активности Доксорубицина оценивали с помощью программы TriTek ComeíScore™Freeware vi.5 и выражали в единицах ТМ («момент хвоста кометы»).

Определение Р-кр и MRP-7 АТФ-азной активности мембран. МрмАрянм гиперэкспрессирующие P-gp или MRP-7, были любезно предоставлены лабораторией Е. Hopper-lBorger (Fox 'Chase Cancer Center, США). P-gp и MRP-7 АТФ-азНую активность определяли согласно методике, предложенной Takahashi с соавт. с модификациями (Takahashi et al, 2006). В качестве активаторов использовали винбластий для P-gp и Ara-С для MRP-7.

Определение .внутриклеточного содержания АТФ провпвйли согласно методике, предложенной Batrakova et al (2001). Уровень АТФ рассчитывали, исходя из йелйчины люминесценции клеточных лизатов, измеряемой на люминометре Хемилюм-12 (Пущино) и планшетном анализаторе 2102 EnVision (Perkin Élwier, США).

Подострая—токсичность ПЭ-240. В соответствии с вводимой дозой олигоэфирполиола ПЭ-240 (2000, 600, 40,10, 5 и 1 мг/кГ) мыши были разделены

на 6 групп по 5 голов в группе. ПЭ-240 вводили перорально с помощью канюли один раз в сутки в течение 7 дней. По окончании опыта производили эвтаназию делонгацией, экстерпарировали печень, почки, сердце и головной мозг. При этом регистрировали наблюдаемые по сравнению с контролем патологии* которые могли быть связаны с повреждающим действием вещества.

Гистологические исследования. Органы фиксировали в растворе формалина и метанола, обезвоживали и пропитывали парафином. Далее из парафиновых блоков получали срезы толщиной 4-6 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином и исследовали с помощью светового микроскопа AxioImagerAl (Carl Zeiss, Германия).

Определение скорости С-гидроксилирования эритромицина микоосомами печени. Активность С-гидроксилирования эритромицина (маркерного субстрата ЗА4) определяли в PC спектрофотометрическим методом при 340 нм согласно методике (Фаттахова, 2002).

Исследование влияния ПЭ-240' на повреждение ДНК в клетках головного мозга. Первичную суспензию клеток головного мозга мышей, получавших ПЭ-240 при жизни, выделяли согласно методике Ashammakhi (Ashammakhi N., 2008). Выделенную суспензию клеток исследовали с помощью метода ДНК-комет (Trevigen Inc.* США).

Исследование активности комплексов ПЭ-240 и нестероидных противовоспалительных средств на модели подострого воспаления. Формалиновый отек у мышей вызывали путем введения 1% раствора формалина в субплантарный апоневроз задней правой лапки и противовоспалительные эффекты комплексов регистрировали согласно методике (Хабриев, 2002).

Статистический анализ. Полученные результаты представлены медианами, для описания разброса данных использовали 2.5-ный и 97.5-ный персентили. Достоверность различий между вариантами оценивали с помощью непараметрических критериев Крускала-Уолдиса и Дана (p¿0.05) (Акберова, 2002).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Цитотоксичность и транспортные свойства носителей БАВ Цитотоксичность полимеров ПЭ-240, L-61, F-127 Согласно результатам эксперимента (рис.1) ПЭ-240 и F-127 в диапазоне

концентраций 0,001 - 1 мг/мл не проявляют цитотоксичности по отношению к

клеткам MCF-7.

—«—РЕ-240 ——U-81 —*-М27

1 т

Ï О,

1 °-6 I

¿ 0,4

g 0,2

i ° 0,001

N

Рис. 1. Цитотоксичность ПЭ-240, Плуроников L-6I и F-J27 на культуре клеток MCF-7 (МТТ-тест). Штриховая линия - контроль, не обработанный полимерами

0,01 0,1 1 10 100 мкг/мл

Плуроник Ь-61 снижает жизнеспособность клеток в 1,5 раза при концентрации 100 мкг/мл и в 12 раз в концентрации 1 мг/мл, В дальнейших исследованиях мы использовали диапазон концентраций 0,001 - 1 мг/мл как рабочий диапазон для олигоэфирполиола, при котором полимер не проявляет цитотоксичности. Такой же диапазон концентраций был использован и для реперных Плуроников. Аналогичные результаты были получены для культур клеток СаСо-2 РС и М7-2.

Транспортные свойства носителей БАВ Влияние олигоэфирполиола на цитотоксичность противоопухолевого препарата Ага-С в сопоставлении с Плурониками 1-61 и Р-127

На клеточной культуре СаСо-2 РС установлено, что полимеры в композиции с противоопухолевым препаратом Ага-С достоверно увеличивают его токсичность (рис.2). При этом эффективность носителей практически не зависит от природы полимера.

СаСо-2 РС

-О—Ага-С О Ага-С+РЕ-240 -А—Ara-С+L-61 Ara-C+F-127

-о—Ага-С О Ага-С+РЕ-240 -A- Ara-C+L-61 Ara-C+F-127

Рис.2. Виталитет клеток СаСо-2 РС (контрольные) и М7-2 (с гиперэкспрессией MRP-7), подвергшихся влиянию Ага-С с и без полимеров

При переходе к клеточной культуре СаСо-2 М7-2 достоверное снижение жизнеспособности наблюдается лишь для Плуроников.

Влияние олигоэфирполиола на накопление доксорубицина клетками HeLa

Эффективность внутриклеточного накопления доксорубицина in situ оценивали по удельной интенсивности флуоресценции клеток, фиксированных на покровных стеклах параформальдегидом после прижизненной окраски их доксорубицином в присутствии полимеров (рис. 3 и рис. 4).

Как следует из полученных данных, все полимеры увеличивают накопление доксорубицина. При этом ПЭ-240 проявляет большую активность в сравнении с Плурониками L-61 и F-127. Применение теста «Comet-assay» позволило получить дополнительные аргументы. При повышении концентрации ПЭ-240 до 2 мг/мл повреждающая активность доксорубицина достигала 78,4% на фоне реперного Н2О2. Для Плуроников максимальный эффект не превышал 50%.

Рис.З. Клетки HeLa, окрашенные Рис.4. Удельная интенсивность доксорубицином in situ: А — автофлуоресценция флуоресценции доксорубицина в клетках клеток, Б - контроль без полимеров, В - HeLa при воздействии ПЭ-240, Плуроников верапамил, Г - ПЭ-240, Д - L-61, Е - F-127. L-61 и F-127 (0.01мг/мп) in situ.

Концентрация полимеров 0,01 мг/мл, Концентрация доксорубицина Ю^М

концентрация доксорубицина Ю'6М полимеров

Исследование механизма действия ПЭ-240 на транспортные системы опухолевых клеток Влияние полимеров на микровязкость плазматических мембран клеток

HeLa и MCF-7

На рис. 5 представлены данные о влиянии полимеров на микровязкость мембран клеток линий HeLa и MCF-7, полученные по методике (Batrakova, 2003).

Рис.5. Микровязкость плазматических мембран клеток .пиний HeLa (А) и MCF-7 (Б) при воздействии ПЭ-240, Плуроников L-61 и F-127 (0.001 - / мг/мл)

ПЭ-240 в рабочем диапазоне концентраций не оказывает значимого влияния на микровязкость мембран. В то же время Плуроники L-61 и F-127 значительно снижают микровязкость плазматических мембран клеток HeLa и MCF-7, что находится в соответствии с данными литературы, полученными в экспериментах на других клеточных культурах.

Таким образом, можно сделать вывод, что в отличие от Плуроников, ПЭ-240 не оказывает существенного влияния на систему пассивного транспорта опухолевых клеток.

Влияние полимеров на систему обратных переносчиков опухолевых клеток HeLa и MCF-7

В этом эксперименте нами был использован флуоресцентный краситель родамин 123, который часто применяется в качестве субстрата при изучении Р-gp - опосредованного транспорта в клетках с множественной лекарственной устойчивостью (Jancis et al, 1993) при поиске потенциальных ингибиторов данного транспортера.

На рис.6, 7 представлены результаты, полученные с использованием методов флуоресцентной спектроскопии и конфокальной микроскопии. Установлено, что все исследуемые полимеры способствуют накоплению субстрата P-gp родамина 123, проявляя свойства ингибиторов этого

транспортера. При этом в эксперименте на клеточной линии HeLa ПЭ-240 достоверно более эффективен по сравнению с Плурониками L-61 и F-127.

А Б

Рис.6. Интенсивность флуоресценции родамина 123, накопленного клетками HeLa (А) и MCF-7 (Б), под воздействие.м ПЭ-240, Плуроников L-61 и F-127 (0.001 - 1 мг/т). Концентрация родамина 123 5-10 М

А Б

Рис. 7. Удельная интенсивность флуоресценции родамина 123 в клетках HeLa (А) и MCF-7 (Б) при воздействии ПЭ-240,Плуроников L-61 и F-127 (0.01мг/мл). Концентрация родамина 12310~6Мт situ

Таким образом, можно предположить, что ПЭ-240, наряду с Плурониками Ь-61 и Р-127, увеличивает внутриклеточное накопление родамина 123, ингибируя обратный транспортер Р^р в клеткахНеЬа и МСР-7.

В качестве другого субстрата Р-§р нами был использован кальцеин-АМ. Известно, что при ингибировании обратных транспортеров кальцеин-АМ задерживается в клетке и расщепляется внутриклеточными эстеразами до флуоресцирующего соединения кальцеина, который не является субстратом обратных переносчиков. Таким образом, по интенсивности флуоресценции

кальцеина в клетках можно судить об активности P-gp (Yasuda et al, 2002; Kerns et al., 2008). Количественную оценку влияния полимеров ПЭ-240, L-61, F-127 на внутриклеточное накопление флуоресцентного красителя кальцеина клетками HeLa и MCF-7 осуществляли с помощью методов проточной цитофлуориметрии и конфокальной микроскопии. Как следует из рис.8, ПЭ-240 и Плуроник L-61 в концентрации 10мкг/мл увеличивают интенсивность свечения основной популяции окрашенных клеток HeLa, степень воздействия полимеров при этом сопоставима с эффектом верапамила, стандартного ингибитора обратных транспортеров. Плуроник F-127 в исследуемой концентрации оказался неэффективным.

Рис. 8. Уровень интенсивности флуоресценции кальцеина в основной популяции окрашенных клеток HeLa при воздействии ПЭ-240, Ппуроников L-61 и F-127 (0.01мг/мл).

Концентрация кальцеина-АМ 1(У'‘М (чёрная линия - контроль без полимеров, цветная линия

- исследуемое вещество)

Данные проточной цитофлуориметрии хорошо согласуются с результатами, полученными при использовании метода конфокальной микроскопии при прижизненной окраске клеток кальцеином в присутствии полимеров. Результаты, представленные на рис. 9 и 10, показывают, что исследуемые полимеры в концентрации 10 мкг/мл увеличивают удельную флуоресценцию кальцеина в клетках HeLa.

Контроль без полимеров ПЭ-240 L61 F127

Рис.9. Клетки HeLa, окрашенные рис ¡q удельная интенсивность флуоресценции кальцеином in situ: Л - автофлуоресценция кальцеина в клетках линии HeLa при клеток, Б - контроль (верапамил), В - ПЭ- воздействии ПЭ-240, Плуроников L-61 и F-127

^ ~ R ~ f'-lU- Концентрация (о.01мг/мл) in situ. Концентрация кальцеина-АМ полимеров 0.01 мг/мл, концентрация кальцеина-АМ 10~6М

Представленные на рис. 11-13 данные показывают, что все исследуемые полимеры увеличивают флуоресценцию кальцеина внутри клеток МСР-7, и, следовательно, являются ингибиторами Р-£р, субстратом которых является кальцеин-АМ.

А

10°

ló2

FL1-H

І

10° 101

1(£

FL1-H

104 10°

ПЭ-240 10 мкг/мл

w

аі-н

F-12710 мкг/мл

"'id* 104

/V 105 1? 104 FL1-H

80 л

З 70

I s 60 li50 S I40

1 8 зо

I 20 10 0

ñ

Рис.11. Уровень интенсивности флуоресценции кальцеина в основной популяции окрашенных клеток МСР-7 при воздействии ПЭ-240,Плуроников L-бl и р-127 (0.01мг/мл). Концентрация кальцеина-АМ Ю'бМ (чёрная линия - контроль без полимеров, цветная линия - исследуемое вещество)

Рис. 13. Удельная интенсивность Рис. 12. Клетки MCF-7, окрашенные кальцеином флуоресценции кальцеина в клетках линии in situ: А - автофлуоресценцш клеток. Б - MCF.7 при воздействии ПЭ-контроль, В-верапамил, Г- ПЭ-240, Д - L-61, Е 240,Плуроников L-6I и F-127 (0.01мг/мл) in

- F-127. Концентрация полимеров 0,01 мг/мп, situ. Концентрация кальцеина-AM Iff6М концентрация капьцеина-АМ lif'M

Влияние полимеров на P-gp и MRP-7 АТФ-азную активность Влияние полимеров на АТФ-азную активность исследовали на мембранах, гиперэкспрессирующих P-gp или MRP-7. Согласно результатам эксперимента все полимеры ингибируют P-gp АТФ-азную активность (рис, 14). При увеличении концентрации ПЭ-240 до 1 мг/мл уровень АТФ-азной активности в клетках снижается до 50%. Аналогичные результаты получены для MRP-7

гиперэкспрессирующих мембран.

Рис. 14. Влияние ПЭ-240, L-61, F-127 на P-gp (А) и MRP-7 (Б) АТФ-азную активность. Р-gp, MRP-7 - мембраны, не подвергшиеся действию полимеров, Vin - винбластин

Влияние полимеров на внутриклеточный уровень АТФ в клетках МСР-7 и СаСо-2 РС и М7-2

Установлено, что олигоэфирполиол ПЭ-240 и Пйуроник Б-127 в рассматриваемом диапазоне концентраций не влияют на уровень АТФ в клетках МСР-7. Плуронйк 1--61 в концентрации 0,1 мг/мл снижает уровень АТФ в клетках в среднем на 60%, а при увеличении концентрации до 1 мг/мл уровень АТФ понижается до 85% (рис. 15).

Не исключено, что наблюдаемый эффект обусловлен высокой цитотоксичностью Плуроника Ь-61 в этом диапазоне концентраций. Таким образом, ПЭ-240 реализует иной, отличный от Плуроников, механизм действия на опухолевые клетки МСР-7, не связанный с воздействием на

1000

“-О— РЁ-240

-1.-61

- Р-127

0,001

0,01 , 0,1 МГ/МЛ

Рис.15. Уровень содержант АТФ в клетках МСР-7 после воздействия ПЭ-240, синтез АТФ Плуроников 1-61 и'Р-127 (0:001 - / мг/мл)

Похожая картина наблюдается при использовании в опытах клеточной культуры СаСо-2 РС'и М7-2.

Таким образом, на основании этого блока экспериментов можно констатировать тот факт, что ПЭ-240 способен ингибировать обратные транспортеры опухолевых клеток. Нельзя, однако, исключать и возможность влияния олигоэфирполиола на систему прямого транспорта посредством образования межмолекулярных комплексов БАВ, ПЭ-240 и транспортных белков.

Іоксичность и фармакологическая активность ПЭ-240 в экспериментах іп уіуп Подострая токсичность ПЭ-240 на мышах Для определения подострой токсичности опытным мышам с помощью зонда внутрижелудочно вводили ПЭ в концентрациях 2000, 600, 40, 10, 5 И 1 мг/кг один раз в сутки в течение 7 дней. По окончании эксперимента провели эвтаназию животных для дальнейшего патоморфологического исследования. При просмотре Гистологических Препаратов изучаемых органов контрольных

животных и животных, получавших олигоэфирполиол ПЭ-240, были обнаружены следующие (различия. В дозах 2000 мг/кг и 600 мг/кг ПЭ-240 вызывает жировую дистрофию гепатоцитов. В цитоплазме гепатоцитов обнаруживаются нейтральные жиры по всему полю зрения. Доза в 2000 мг/кг близка к максимально переносимой дозе - 2500 мг/кг, что ранее было показано Насыбуллиной, Залялютдиновой (2003). Однако, при снижении нами Подобных патологий не выявлено.

В дозе 600 мг/кг в клетках головного мозга были отмечены очаговая дегенерация и шбель клеточных элементов. В дозе 40 мг/кг - дистрофия, хроматолиз, атрофия ядер, в дозе 10 мг/кг - разжижение мозговой ткани, глиоз. Данные патологии, очевидно, связаны с нарушением белково-водноэлектролитного обмена и ведут к изменению коллоидно-осмотического давления и повышению проницаемости мембран клеток. Гистологическая картина всех органов после введения ПЭ-240 в дозах 1-5 мг/кг остается в норме.

Исследование влияния ПЭ-240 на систему Р450 печени мышей

Скорость С-гиДроксилирования эритромицина достоверно выше в группах,

получавших ПЭ-240,os в безопасных дозах 1 и 5 мг/кг (р<0,05) (рис, 16).

Рис. 16. Скорость С-гчдроксширования эритромицина микросомами печени мышей, получавшим ПЭ-240 per os в дозах 1 и 5 Мг/кг

На основании этих данных, указывающих на непосредственное влияние ПЭ-240 на микросомы печени, можно предположить

К 1 мг/кг 5 мг/кг

возможность его метаболизма !Р450.

Определение влияния ПЭ-240 на проницаемость клеток головного мозга мышей Представленные выше данные по высокой токсичности ПЭ-240 в дозах 60040 мг/кг послужили 'основанием к проведению эксперимента по оценке проницаемости клеток головного мозга с использованием специально синтезированного модельного соединения АС-3 на основе пиридоксина (Иксанова А.Г., 2010).

140

120

100

80

Л

rih

ft

Показано, проницаемость клеток

головного мозга мышей достоверно

увеличивается в малых дозах, а в

"її токсичной дозе 600 мг/кг возрастает

весьма существенно (рис. 17). При этом

к 1мг 5ж 10 мг боомГ между группами, получавших ПЭ-240

Рис. 17, Проницаемость клеток головного Дозами ї мг/кг, 5мг/кг, 10 мг/кг значимые мозга мышей для спектрального маркера различия не обнаружены.

Влияние ПЭ-240 на ДНК-повреждающую активность по отношению к клеткам головного мозга мышей Клеточный электрофорез кроме ДНК-повреждающей активности позволяет определять и целостность мембран клеток. Результаты показывают, что ДНК-повреждающая активность ПЭ-240 в 2бо

ГМ

группах контроля (не получавших ПЭ-240) §2оо

и в опытных группах (получавшие 1 и 5

мг/кг) значимо отличаются от позитивного

контроля с Н202 (рис. 18).

В случае дозы ПЭ-240 10 мг/кг

уровень разрушения ДНК сопоставим с

позитивным контролем. Таким образом,

существует очевидная корреляция между Рис. 18. Значение момента хвоста

«кометы» ТМ клеток головного Мозга

ДНК-повреждающей активностью зависимости от дозы ПЭ-240:

Влияние ПЭ-240 на противовоспалительную активность гелей наружного применения на основе кетопрофена Исследование было проведено на фармакологической 'модели формалинового отека лап у мышей. Установлено, что введение (1-5) % ПЭ-240 в гелевую композицию на основе кетопрофена достоверно приводит к усилению противовоспалительной активности фармацевтической субстанции.

< сч! СО й і

I Q

і I ї|

данными гистологических исследований и

мышей, Получавшим ПЭ-240per os в дозах в 1, 5 или 10 мг/кг

ВЫВОДЫ

1. Олйгоэфирпсйгиол ПЭ-240 не проявляет цитотоксических свойств по отношению к клеткам Линий MCF-7, СаСо-2 РС И М7-2. При этом достоверно увеличивает токсичность противоопухолевых препаратов Ага-С и дОксорубйцина по отношению к культурам клеток СаСо-2 РС и М7-2 и Hela соответственно.

2. ПЭ*240 Не изменяет микровязкости плазматических мембран клеток HeLa и MCF-7; ингибирует P-gp; снижает АТФ-азную активность мебран, гиперэкспрессирующих P-gp и ІМІІР-7; не влияет на уровень АТФ в клетках линий MCF-7, СаСо-2 РС и М7-2.

3. Прй нероральном введении олигоэфирполиол ПЭ-240 в дозах до 10 мг/кг не обладает токсичностью для мышей стока CFW и CD-1. Подострая токсичность сопровождается увеличением проницаемости клеток головного мозйга для хромофора АС-3 и повышением скорости окисления эритромицина в микросомах печени животных.

4. ПЭ-240 при трансдермальном способе применений увеличивает терапевтическую эффективность кетопрофбн содержащих фармацевтических субстанций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Иксанова, А.Г. Новая система доставки биологически активных Веществ в клеткй на Основе олигоэфирполиола / А.Г. Иксанова, А.Н. Фатгахова, Л.Р. ГабиТОВа, Е.В. Малофеева, JI.JL Щербина, И.Й. Салафутдинов, А.Д. Стрейьник, Т.И. АбдуЯдин, Ю.Г. Штырлин // Ученые записки Казанского государственного университета. Серил Естественные науки. - 2010. - Т. 152. -№ 3. -С. 134-142.

2. Иксанова, А.Г. Активность Лекарственных CYP в печени т мозге самцов мышей линии CFW прй воздействии Новой основы для лекарственных мазей «ПЭ-240» в Нодостром опыте in vivo / JI.Jl. Щербина, А.Г. Иксанова И

Итоговая научно-образовательская конференция студентов Казанского государственного университета - 2008. - С.30-32

3. Иксанова, А.Г. Создание систем контролируемой доставки лекарственных средств в клетки с помощью наноструктурных полимерных носителей ) А.Г. Иксанова, А.Н. Фаттахова, Л. Л. Щербина, Ю.Г. Штырлин //Материалы пятого съезда Общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова - Москва, 2-4 декабря 2008г. - С. 339.

4. Иксанова, А.Г. Олигоэфирполиол ПЭ-240 как новая система доставки лекарств в клетки / А.Г. Иксанова, А.Н. Фаттахова, Л.Р. Габитова, Т.И. Абдуллин, Ю.Г. Штырлин // Всероссийская научно-практическая конференция "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии" - Сборник трудов-Санкт-Петербург 2010. - С. 185-186

5. Щербина, Л.Л. Активность лекарственных CYP в печени и мозге самцов мышей линии CFW при воздействии новой основы для лекарственных мазей «ПЭ-240» в подостром опыте in vivo// Л.Л. Щербина, А.Г. Иксанова, А.Н. Фаттахова, Ю.Г. Штырлин // Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии - Материалы научно-практической конференции - Казань, 1516 сентября 2008 г. Труды молодых ученых. - С. 147-148

6. Gabitova, L.R. Development of the drug delivery system for sulfanilamide antibiotics transport to cells. I L.R. Gabitova, A.G. Iksanova, AN. Fattakhova, Yu.G. Shtyirlin ii “SymBioSE 2009-Biology: Expansion of Borders”. Abstracts of the 13 th annual Symposium for Biology Students of Europe. Kazan - 2009. -P.75

7. Щербина, Л.Л. Активность лекарственных CYP в печени и мозге самцов мышей линии CFW при воздействии новой основы для лекарственных мазей «ПЭ-240» в подостром опыте in vivo// Л.Л. Щербина, А.Г. Иксанова, А.Н. Фаттахова, Ю.Г. Штырлин // 12-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых - Пущино 2008, 10-14 ноября 2008 года -С.116.

8. Габитова Л.Р. Разработка новых систем доставки антибиотиков в клетки/ Л.Р. Габитова, А.Г. Иксанова, А.Н. Фаттахова, Ю.Г. Шшрлин // Актуальные

проблемы биологии, нанотехнологий и медицины - Ростов-на-Дону, 2009. Материалы конференции. - С. 183-184

9. Иксанова, А.Г. Блоксополимеры этилен оксида и пропилен оксида в наномедицине / А.Г. Иксанова, Л.Р. Габитова, А.Г. Сабиров, А.Н. Фаггахова, Ю.Г. Штырлин II Материалы Научно-практической конференции «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета», посвященной памяти проф. В.Г. Винтера. 12 ноября, Казань, 2009.-С. 58-61

10. Гильмутдинова, И.И. Влияние синтетического олигоэфирполиола ПЭ-240 на свойства цитоплазматических мембране опухолевых клеток / И.И. Гимльмутдинова, А.Н. Фаггахова, Л.Р. Габитова, А.Г. Иксанова, Ю.Г. Штырлин //IV Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2011» - Материалы конференции -Воронеж, 2011-С. 10-12

11. Егорова, Ю.А. Влияние синтетического олигоэфирполиола ПЭ-240 на проницаемость хлеток линии НеЬа для доксорубицина гидрохлорида / Ю.А. Егорова, А.Н. Фаггахова, ДР. Габитова, А.Г. Иксанова, Ю.Г. Штырлин // IV Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2011» - Материалы конференции - Воронеж, 2011 -С. 15-17

12. Иксанова, А.Г. Разработка систем доставки сульфаниламидных производных пиридоксида в клетки/ А.Г. Иксанова, А.Н, Фаттахова, Л.Л. Щербина, Ю.Г. Штырлин //Синтез и перспективы использования новых биологически активных соединений -Казань, 2009. Тезисы докладов. - С. 121-123

13! Иксанова, АГ. Применение окисей этилена и пропилена в наномедицине/ А.Г. Иксанова, Л.Р. Габитова, А.Н. Фаггахова, Ю.Г. Штырлин //Структура и динамика молекулярных систем - Казань, 2009. Сборник тезисов. - С. 28-29

14. Габитова, Л.Р. Разработка новых систем доставки противоопухолевых препаратов в клетки опухоли / Л.Р. Габитова, Е.В. Малофеева, А.Г. Иксанова, А.Н. Фаттахова, Ю.Г. Штырлин // Ш Всероссийский с международным

участием конгресс студентов и аспирантов-бИологов «Сймбйоз-Россия 2010» -Сборник тезисов - Нижний Новгород 2010. - С. 164

15. Габитова, Л.Р. Воздействие олигозфирполиола ПЭ-240 на опухолевые клетки человека / Л.Р. Габитова, А.Н. Фаттахова, А.Г. Иксанова, Е.В. Малофеева, Ю.Г. Штырлин //1 научно-практическая интернет-конференция «Актуальные проблемы биохимии И биоианотехнологий» - Сборник тезисов - Казань 2010. -С. 38

Ï6. Иксанова, А.Г. Фармакологическая активность нового олигозфирполиола ПЭ-240 в системе in vivo / А.Г. Иксанова, А.Н. Фаттахова, Л.Р. Габитова, В. А. Абдульянов, Ю.Г. Штырлин // I научно-практическая интернет-конференция «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий» - Сборник тезисов -Казань 2010. - С.68

17. Егорова, К).А. Фармакологическая активность полиэфира ПЭ-240 по отношению К клеткам головного мозга мышей Линии С57В16 & подостром опыте invivo / Ю.А. Егорова, А.Г. Иксанова, А.Н. Фаттахова, Ю.Г. Штырлин // Ш Всероссийский с международным участием конгресс студентов й аспирантов-биологов «Симбиоз-Россйя 2010» - Сборник тезисов - Нижний Новгород 2010.-С. 168

Отзывы на автореферат просьба отправлять по адресу 420008, Казань, ул. Кремлевская, д.] 8, КФУ, Отдел аттестации научных кадров* Диссертационный совет Д 212.081.08, Ученому секретарю З.И. Абрамовой, факс: (843)238-76-01

С авторефератом диссертаций также можно ознакомиться На сайте КФУ http://www.ksu.ruAmi/sank/mdex.php?id=7

Бумага офсетная Печать ризоірафическая .тираж 100 экз..3аказ № Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии ЗАО «Альфа-Т» 420029 г. Казань ул. Сибирский тр.34

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иксанова, Альфия Габдулахатовна, Казань

61 12-3/558

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Иксанова Альфия Габдулахатовна

Новая система доставки биологически активных веществ на основе

олигоэфирполиола

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Фаттахова А.Н.

Научный консультант:

кандидат химических наук, доцент Штырлин Ю.Г.

Казань -2012

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6

ВВЕДЕНИЕ 8

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13

1.1 Плазматические мембраны клеток как барьер для 13 транспорта лекарственных соединений

1.2 Множественная лекарственная устойчивость 18

1.3 Лекарственные формы и системы доставки лекарств 20

1.3.1 Полимерные системы доставки лекарственных средств 22

1.3.2 Общая характеристика класса амфифильных блоксополимеров 30 1.3.2.1 Применение амфифильных полимеров в качестве 31 ингибиторов обратных транспортеров опухолевых клеток

1.3.3 Плуроники как пример полимерной системы доставки лекарств 32

1.3.3.1 Влияние Плуроников на биологические мембраны 35 опухолевых клеток

1.3.3.2 Влияние Плуроников на цитотоксичность 40 противоопухолевых препаратов в МЛУ-клетках

1.3.3.3 Влияние Плуроников на ГЭБ 41

1.3.3.4 Клинические испытания препарата SP1049C, содержащего в 42 своем составе доксорубицин и Плуроники

1.3.3.5 Токсичность Плуроников 43 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 45 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 45

2.1 Реактивы и оборудование 45

2.2 Объекты исследований 48 2.2.1 Объекты исследования in vitro 44

2.2.2 Объекты исследования in vivo 49

2.3 Цитотоксичность и транспортные свойства носителей БАВ 50 2.3.1 Исследование цитотоксичности полимеров ПЭ-240, Плуроников 50

L-61 и F-127

2.3.2 Методика определения транспортных свойств носителей БАВ 51

2.3.2.1 Определение цитотоксичности противоопухолевого препарата 51 Ага-С в присутствии полимеров

2.3.2.2 Методика определения внутриклеточного накопления 52 родамина 6Ж и доксорубицина клетками HeLa

23.23 Методика исследования влияния олигоэфирполиола на 53

транспорт флуорофоров в клетки HeLa и MCF-7 in situ

2.3.2.4 Методика определения ДНК-повреждающей активности 54

доксорубицина гидрохлорида по отношению к опухолевым клеткам линии HeLa в тесте «Comet assay»

2Л Исследование механизма действия ПЭ-240 на транспортные 55

системы опухолевых клеток

2.4.1 Методика определения микровязкости плазматических мембран 55 клеток HeLa и MCF-7

2.4.2 Методика определения влияния полимеров на систему обратных 57 переносчиков опухолевых клеток HeLa и MCF-7

2.4.3 Методика определения P-gp и MRP-7 зависимой АТФ-азной 59 активности

2.4.4 Методика определения уровня АТФ в клетках MCF-7 и СаСо-2 61 PC и М7-2

2.5 Токсичность и фармакологическая активность ПЭ-240 в 62

экспериментах in vivo

2.5.1 Методика определения подострой токсичности ПЭ-240 на 62 мышах

2.5.2 Гистологические исследования 63

2.5.3 Методика определения влияния ПЭ-240 на систему Р450 64 печени мышей

2.5.3.1 Выделение микросом печени мышей 64

2.5.3.2 Определение концентрации белка и цитохромов Р450 65

2.5.3.3 Определение скорости С-гидроксилирования эритромицина 66

микросомами печени мышей

2.5.4 Методика определения проницаемости клеток головного мозга 67 мышей

2.5.4.1 Выделение клеток головного мозга 67

2.5.4.2 Определение проницаемости мембран клеток головного 67 мозга

2.5.4.3 Методика определения ДНК-повреждающей активности по 68 отношению к клеткам головного мозга мышей

2.5.5 Методика изучения противовоспалительной активности 68 комплексов субстанций полиэфира ПЭ-240 и НПВС при трансдермальном введении

2.6 Статистический анализ 69

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 70

3.1 Цитотоксичность и транспортные свойства носителей БАВ 70

3.1.1 Цитотоксичность полимеров ПЭ-240, Плуроников L-61, F-127 70

3.2 Транспортные свойства носителей БАВ 72

3.2.1 Влияние олигоэфирполиола на цитотоксичность 72 противоопухолевого препарата Ara-С в сопоставлении с

Плурониками L-61 и F-127

3.2.2 Накопление родамина 6Ж и доксорубицина клетками HeLa в 73 присутствии олигоэфирполиола

3.2.3 Влияние полимеров на ДНК-повреждаюшую активность 76 доксорубицина гидрохлорида по отношению к опухолевым клеткам

линии HeLa в тесте «Comet assay»

3.3 Исследование механизма действия ПЭ-240 на транспортные 79 системы опухолевых клеток

3.3.1 Микровязкость плазматических мембран клеток HeLa и MCF- 7 79 в присутствии олигоэфирполиола

3.3.2 Влияние полимеров на систему обратных переносчиков 81

опухолевых клеток HeLa и MCF-7

3.3.2.1 Внутриклеточное накопление родамина 123 клетками HeLa и 81 MCF-7 в присутствии олигоэфирполиола

3.3.2.2 Сравнительный анализ воздействия синтетических 86 полимеров на внутриклеточное накопление кальцеина клетками

линий HeLa и MCF-7

3.3.3 Влияние полимеров на P-gp и MRP-7 АТФ-азную активность 92

3.3.4 Влияние полимеров на уровень АТФ в клетках MCF- 7 и СаСо-2 94 PC и М7-2

3.4 Токсичность и фармакологическая активность ПЭ-240 в 97

экспериментах in vivo

3.4.1 Подострая токсичность ПЭ-240 на мышах 97

3.4.2 Влияние ПЭ-240 на систему Р450 печени мышей 103

3.4.3 Проницаемость клеток головного мозга мышей в присутствии 104 олигоэфирполиола

3.4.4 Влияние ПЭ-240 на ДНК-повреждающую активность по 104 отношению к клеткам головного мозга мышей

3.4.5 Противовоспалительная активность гелей наружного 105 применения на основе композиции кетопрофена с

олигоэфирполиолом

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 107

ВЫВОДЫ 115

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 116

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЭБ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКИЙ БАРЬЕР

ГЛБ ГИДРОФИЛЬНО-ЛИПОФИЛЬНЫЙ БАЛАНС

МЛУ МНОЖЕСТВЕННАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ

ККМ КРИТИЧЕСКАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ

МИЦЕЛЛООБРАЗОВАНИЯ

PEO ПОЛИЭТИЛЕНОКСИДНЫЕ ЕДИНИЦЫ

РРО ПОЛИПРОПИЛЕНОКСИДНЫЕ ЕДИНИЦЫ

Rhod 123 РОДАМИН 123

DOX ДОКСОРУБИЦИНА ГИДРОХЛОРИД

R6G РОДАМИН 6Ж

ДФГТ 1,6-ДИФЕНИЛ-1,3,5-ГЕКСАТРИЕН

АТФ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТ

АФК АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА

ДНК ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА

ЛПВП ЛИПОПРОТЕИНЫ ВЫСОКОЙ плотности

ЛПНП ЛИПОПРОТЕИНЫ низкой плотности

ЛС ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО

ЛФ ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА

ПМ ПЛАЗМАЛЕММА

ПЭГ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЬ

ФСБ ФОСФАТНО-СОЛЕВОЙ БУФЕР

ЦНС ЦЕНТРАЛЬНАЯ НЕРВНАЯ СИСТЕМА

ЭР ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКИЙ РЕТИКУЛУМ

СУР ЦИТОХРОМ Р450

P-gp Р-ГЛИКОПРОТЕИН

РНРМА N-2-ГИДРОКСИПРОПИЛМЕТАКРИЛАМИД PLGA П0ЛИ-0,Ь-ЛАКТИДС0ГЛИК0ЛИДЫ PMA ПОЛИМЕТАКРИЛОВАЯ КИСЛОТА РРАА ПОЛИ-2-ПРОПИЛАКРИЛОВАЯ КИСЛОТА

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Одной из важнейших задач современной биологии, химии, медицины является разработка технологий внутриклеточной доставки биологически активных веществ (БАВ), основанных на преодолении защитных барьеров организма. Необходимость разработки подобных подходов обусловлена тем, что многие БАВ плохо преодолевают эти барьеры вследствие высокой гидрофильности, которая затрудняет их транспорт через липидные барьеры, например, межклеточный жировой слой кожи и/или мембраны клеток. Накоплению активных веществ в устойчивых к ним (резистентных) клетках, таких как опухолевые клетки и патогенные микроорганизмы, также препятствует высокая активность в этих клетках мембранных транспортных белков, которые осуществляют выброс веществ из цитоплазмы. Для достижения нужной терапевтической концентрации активного вещества в клетках и тканях традиционным подходом является увеличение используемой дозы вещества. В результате увеличиваются побочные эффекты БАВ, которые часто превосходят по последствиям положительный терапевтический эффект.

Перспективным подходом к увеличению проницаемости биологических барьеров для активных веществ является создание эффективных и безопасных систем доставки, которые продлевают действие лекарственного средства, увеличивают его биодоступность, снижают возможные побочные эффекты и обеспечивают направленный транспорт вещества к очагу патологического процесса. Применение систем контролируемой доставки лекарственных средств в клетки позволяет повысить эффективность лекарственных препаратов и уменьшить их побочное действие.

Перспективными носителями для внутриклеточной доставки БАВ являются синтетические полимеры, среди которых важное место

принадлежит группе амфифильных блоксополимеров окисей этилена и пропилена (торговое название фирмы BASF (США) Плуроники). Ряд композиций на основе Плуроников проходит клинические испытания. Механизм действия Плуроников основан, во-первых, на снижении микровязкости плазматической мембраны и, во-вторых, на подавлении АТФ-азной активности обратных транспортеров опухолевых клеток. Несмотря на определенный прогресс, достигнутый в области полимерной терапии на основе Плуроников, следует отметить, что недостатками этих блоксополимеров являются узкий диапазон терапевтических доз и относительно высокая токсичность (максимально переносимая доза для Плуроника L-61 составляет 0.1 г/кг, a LD50 0.8 г/кг). По этой причине поиск высокоэффективных и безопасных систем доставки лекарственных средств остается актуальной задачей полимерной терапии.

В связи с вышеизложенным была поставлена цель - количественно оценить биологические эффекты и выявить механизм действия олигоэфирполиольного носителя (ПЭ-240) биологически активных веществ.

В соответствии с целью решались следующие задачи:

1. Оценить цитотоксичность ПЭ-240 in vitro, подострую токсичность в системе in vivo. Определить влияние ПЭ-240 на цитотоксичность противоопухолевых препаратов доксорубицина и Ага-С.

2. Охарактеризовать влияние ПЭ-240 на микровязкость плазматических мембран клеток HeLa и MCF-7; на АТФ-азную активность мембран, гиперэкспрессирующих P-gp и MRP-7; на внутриклеточный уровень АТФ опухолевых клеток MCF-7, СаСо-2 PC и М7-2.

3. Оценить влияние ПЭ-240 на транспорт флуорофоров родамина 6Ж, родамина 123, кальцеина-АМ и доксорубицина в опухолевые клетки HeLa и MCF-7.

4. Оценить влияние ПЭ-240 на проницаемость клеток головного мозга и активность микросом печени мышей при пероральном введении;

5. Определить влияние ПЭ-240 на противовоспалительную активность

гелей наружного применения на основе кетопрофена.

Научная новизна

В работе впервые исследованы биологические свойства системы доставки БАВ на основе олигоэфирполиола ПЭ-240. Показано, что олигоэфирполиол увеличивает проницаемость плазматических мембран эукариотических клеток для широкого ряда биологически активных веществ, в том числе противоопухолевых и противовоспалительных препаратов. При этом ПЭ-240 является более активным носителем БАВ по сравнению с Плурониками марок Ь-61 и Б-127. Механизм действия олигоэфирполиола ПЭ-240 на опухолевые клетки заключается в ингибировании АТФ-азной активности обратных переносчиков, таких как Р^р (Р-гликопротеин).

Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты представляют интерес для разработки новых и усовершенствования известных противовоспалительных и противоопухолевых препаратов, в том числе за счет снижения побочных эффектов и увеличения терапевтической эффективности.

Количественные результаты исследования также представляют интерес в качестве справочных данных для таких областей науки, как биохимия, молекулярная фармакология, клеточная биология, медицина и могут быть использованы в учебном процессе на биологических, химических и медицинских факультетах.

Положения, выносимые на защиту:

1. Олигоэфирполиол ПЭ-240 влияет на транспорт БАВ через плазматическую мембрану клеток в зависимости от биологических условий.

2. ПЭ-240 увеличивает эффективность некоторых противоопухолевых и

противовоспалительных препаратов.

3. ПЭ-240 в экспериментах ш vivo обладает тропностью к ткани головного мозга мышей.

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского (Приволжского) федерального университета (2008-2011 гг.), на V съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008), на II международной научно-практической конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2008), на XII Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2008), на 2-й Региональной научно-практической конференции «Синтез и перспективы использования новых биологическиактивных соединений» (Казань, 2009), на XIII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем (Казань, 2009), на III международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009), на XIII европейском симпозиуме студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз 2009» (Казань, 2009), на III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010), на I Всероссийской виртуальной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий» (Казань, 2010), на Всероссийской научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии" (Санкт-Петербург, 2010). Работа была поддержана Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса» («УМНИК») (№ Т-90-1-08).

Публикации_____

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, среди которых 1 публикация в рецензируемом журнале, включенном в перечень ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, включает 40 рисунков и 2 таблицы. Библиография включает 180 наименований.

-----ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Плазматические мембраны клеток как барьер для транспорта

лекарственных соединений

Проблема доставки биологически активных соединений включает в себя несколько фундаментальных проблем биохимии и молекулярной биологии. Основная из этих проблем - это защитные барьеры организма, преодоление которых для БАВ зачастую не представляется возможным. Физиологическая роль таких барьеров заключается в защите клеток от чужеродных соединений и сохранению гомеостаза.

В первую очередь, таким барьером являются мембраны клеток. Плохая проницаемость БАВ может быть обусловлена как строением самого соединения (к примеру, гидрофильного), так и особенностями строения мембран клеток - мишеней. Мембраны организуют пространство и образуют различные компартменты клетки, обеспечивая уникальность их сред, а также позволяют клетке сохранять целостность и функциональность. Кроме того, мембраны являются фабрикой синтеза сигнальных молекул. Большое количество сигнальных систем в ее составе приводит к формированию протяженного упорядоченного слоя различных молекул, своеобразной микросреды.

Молекулы липидов мембран состоят из гидрофобных «хвостов» и полярных головок, при этом «хвосты» ориентированы к центру мембраны (Glick et al., 1998). Важно отметить, что компоненты обсуждаемых структур связаны друг с другом не ковалентно, а за счет гидрофобных и электростатических сил, и потому мембраны являются весьма гибкими и способны к активному обмену своими элементами с окружающей средой. За 2 секунды один липид может пройти расстояние в 1/40 диаметра средней клетки вдоль бислоя. Однако ввиду гидрофобности центральной части мембраны вероятность пройти ее насквозь ощутимо ниже: такое событие происходит не чаще, чем раз в 100 секунд (Vance et al, 2008).

Стоит отметить, что латеральные зоны плазмалеммы, отличающие по многим параметрам, образуют мембранные домены. Мембранные домены являются динамическими образованиями, чей состав во многом зависит от внешних сигналов. Легче всего поддаются выделению и изучению макродомены плазмалеммы. Они были обнаружены, прежде всего, в эпителиальных клетках печени, кишечника и почек. Например, в гепатоцитах выделяют три макродомена: зона контакта с кровью, промежуточный участок и зона контакта с желчью. Все макродомены обладают ассиметричным распределением липидов между цитоплазматической и внешней сторонами: первая, как правило, богата анионными липидами и холестерином, а вторая преимущественно содержит фосфатидилхолин, сфинголипиды и гликолипиды. Домены различаются между собой по доминирующему классу липидов, набору белков и способны независимо регулировать свою проницаемость.

Следующий по размеру тип доменов - это липидные рафты. Они представляют собой плоские или вогнутые участки высокоупорядоченной мембраны, обогащенные гликосфинголипидами и холестерином. По профильному липиду рафты подразделяются на полифосфоинозитид-обогащенные и гликосфинголипид-обогащенные (Sorice et al., 2004; Laux et al., 2000). Предложены как минимум три модели плоских рафтов. Наиболее простая из них предполагает существования мелких доменов, включающих одну-две молекулы белка. Более сложные модели подразумевают формирование рафтов диаметром 100 или даже