Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Посттравматические реакции спинного мозга крысы при трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Посттравматические реакции спинного мозга крысы при трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2"

На правах рукописи

с/М

МУХАМЕДШИНА Яна Олеговна

ПОСТТРАВМАТИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ СПИННОГО МОЗГА КРЫСЫ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ ПУПОВИНЫ ЧЕЛОВЕКА, ТРАНСФИЦИРОВАННЫХ ПЛАЗМИДОЙ рВис1-УЕСГ-ГСР2

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Саранск-2013

16 МАЙ Ш

005058476

Работа выполнена на базе ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Челышев Юрий Александрович доктор медицинских наук, профессор Швалев Вадим Николаевич доктор медицинских наук, профессор Инчина Вера Ивановна

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «/%> мая 2013 г. в /Р часов на заседании диссертационного совета Д.212.117.01 при ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва» по адресу: 430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва» (430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68).

Автореферат диссертации опубликован на официальном сайте ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва» www.mrsu.ru; e-mail: dsovet@mrsu.ru

Автореферат разослан «1С» апреля 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного Совета,

доктор биологических наук

профессор

«¿Г-

В.П. Балашов

Актуальность исследования

Травма спинного мозга остаётся одной из актуальных медико-социальных проблем. Эффективных методов её лечения не существует, что является причиной глубокой инвалиди-зацни пострадавших. Возможность преодоления последствий травмы спинного мозга связывают с применением нейротрофических факторов (НТФ), которые поддерживают жизнеспособность нейронов и регенерацию аксонов в спинном мозге (Jones et al., 2001; Lu, Tuszynski, 2008; Hollis, Tuszynski, 2011). Однако в ходе клинических испытаний с системной их доставкой были выявлены неприемлемые побочные реакции и низкая эффективность (Apfel et al., 2002). При непосредственном введении НТФ в область повреждения действие оказалось нестойким вследствие быстрого расщепления протеазами. Эти трудности стимулировали поиск других способов повышения содержания НТФ в повреждённой ткани. Среди них наиболее эффективной оказалась доставка генов НТФ.

Для доставки в область травмы спинного мозга терапевтических генов начато применение вирусных и невирусных векторов (De Laporte et al., 2011; Bo et al., 2011; Hutson et al., 2012). Невирусные векторы, в частности плазмиды, несмотря на низкую трансфекционную активность, считаются более безопасными. Одновременная доставка в повреждённую ткань нескольких генов НТФ кажется наиболее эффективной, а дальнейшее её изучение представляется актуальным. При проведении генной терапии с целью стимулирования нейрорегене-рации особенно перспективна одновременная доставка генов НТФ и ангиогенных факторов. Примером может служить комбинация генов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2) (Islamov et al., 2004; Sabti, 2007), применение которой при травме спинного мозга не исследовано.

Клеточная терапия рассматривается как один из перспективных способов преодоления последствий при травме спинного мозга. С этой целью исследуют эмбриональные и ней-рапьные стволовые клетки, глиальные клетки обонятельных структур, клетки крови пуповины, микроглия-подобные клетки, шванновские клетки и многие другие (Eftekharpour et al., 2008; Xu, Onifer, 2009; Ronaghi et al., 2010). Трансплантируемые клетки поддерживают восстановление матрикса ткани для регенерации нервных волокон, оказывают трофическое влияние на нейроны и глию, обеспечивают рост аксонов и участвуют в их ремиелинизации. Наиболее перспективными представляются клетки крови пуповины, оценке результатов экспериментальной трансплантации которых при травме спинного мозга посвящено достаточное количество работ (Hernandez et al., 2011; Park et al., 2011; Sun, Ma, 2012). Трансплантация клеток крови пуповины человека при травме спинного мозга угнетает воспалительную реакцию, оказывает нейротрофическое влияние, стимулирует неоваскуляризацию (Chen et al.,

2008) и снижает экспрессию проапоптозных генов (Dasari et al., 2009). Трансплантации мо-нонуклеарных клеток крови пуповины (МККП), как известного источника стволовых и про-гениторных клеток, активно исследуют для преодоления последствий травмы и ишемии мозга, а также для лечения нейродегенеративных заболеваний (Kuh et al., 2005; Rizvanov et al., 2008; Rodrigues et al., 2012).

Несмотря на актуальность дальнейших исследований по трансплантации клеток при травме спинного мозга, стало очевидным, что только клеточная терапия в чистом виде приводит лишь к умеренному улучшению структурных показателей и недостаточному восстановлению функции. Именно поэтому для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга внимание исследователей привлекли генетически модифицированные клетки с усиленной экспрессией терапевтических генов НТФ.

При травме спинного мозга для анализа результативности нейрорегенерации в условиях генно-клеточной терапии, наряду с применением общепринятых критериев, таких как степень восстановления функциональных параметров, сохранность ткани, выраженность патологической кавитации, количество регенерирующих миелиновых волокон, представляется важным оценить состояние клеток конкретных популяций. Среди них астроциты как наиболее многочисленные глиальные клетки, которые обеспечивают поддержание гомеостаза в мозге и нарушение функции которых немедленно приводит к развитию нейродегенерации (Rossi, Volterra, 2009; Matyash, Kettenmann, 2010; Allaman et al., 2011).

Другим клеточным типом, на который в нашей работе было обращено особое внимание, явились шванновские клетки. Эти клетки в нормальных условиях не мигрируют в мозг из периферических нервных структур. Но они появляются в ЦНС в очагах демиелинизации и в области травматического повреждения и могут участвовать в миелинизации аксонов в ЦНС (Jasmin et al., 2000; Totoiu, Keirstead, 2005; Oudega, Xu, 2006). Несмотря на пристальный интерес к проблеме миграции шванновских клеток в область повреждения мозга и проведённые исследования в этом направлении, многие вопросы поведения этих клеток требуют изучения. Не определены динамика численности популяции шванновских клеток-мигрантов в области травматического повреждения и количество жизнеспособных клеток, способных участвовать в ремиелинизации центральных аксонов. Применительно к задачам генно-клеточной терапии представляется актуальным оценить возможность поддержания в области травмы спинного мозга популяции шванновских клеток-мигрантов и влияния на их фенотипические характеристики.

Поскольку наша работа предполагает доставку плазмидного вектора с комбинацией генов, продукты которых стимулируют неоваскуляризацию, в качестве объекта исследования

выбраны перициты, экспрессирующие Р-рецептор тромбоцитарного фактора роста (РОСРрК). Определение их количества позволит оценить значение одновременной доставки в область травматического повреждения терапевтических генов УЕОР и РОР2 для реваску-ляризации как фактора поддержания постгравматической нейрорегенерации. Цель исследования - оценить эффективность мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой рВи<1-УЕСР-РОР2, для преодоления последствий контузионной травмы спинного мозга крысы в условиях их однократной трансплантации в область повреждения.

Для достижения цели поставлены следующие задачи, решаемые на модели дозированной контузионной травмы спинного мозга крысы в условиях локальной доставки в область повреждения терапевтических генов на клеточных носителях:

1. Изучить сроки выживания и миграционный потенциал трансплантированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека.

2. Исследовать динамику восстановления двигательной функции в поведенческом тесте ввв.

3. Оценить суммарную площадь патологических полостей, площади сохранённого серого и белого вещества на поперечных срезах спинного мозга и количество миелиновых волокон в фиксированных наружных зонах белого вещества.

4. Определить количество клеток, экспрессирующих белок 8100В, в наружных зонах белого вещества в области повреждения.

5. Установить количество периваскулярных клеток, экспрессирующих РОСРРЯ, в наружных зонах белого вещества в области повреждения.

6. Оценить количество и фенотип шванновских клеток, мигрировавших в область повреждения.

Научная новизна

Впервые показано стимулирующее влияние на процессы нейрорегенерации доставки в область травмы спинного мозга комбинации генов УЕОР и РОР2 при помощи трансфицированных плазмидой рВис!-УЕОР-РОР2 МККП человека, что проявляется в уменьшении площади деструкции серого и белого вещества, патологической кавитации, увеличения количества миелиновых волокон и улучшения восстановления двигательной функции. Получены новые данные по срокам выживания и миграционному потенциалу трансплантированных в спинной мозг крысы МККП человека, трансфицированных плазмидой рВис!-УЕОР-РОР2. Впервые при контузионной травме спинного мозга и трансплантации трансфицированных плазмидой рВи(1-УЕСР-РСР2 МККП в белом веществе области повреждения показано уве-

личение количества S100B+- и PDGFpR+-iuieTOK. Приоритетными являются данные о том, что трансплантация МККП в область травмы спинного мозга оказывает поддерживающее влияние на популяцию мигрирующих в мозг шванновских клеток, а в сочетании с доставкой терапевтических генов VEGF и FGF2 этот эффект усиливается. Впервые обнаружена экспрессия белка теплового шока 25 (HSP25) в шванновских клетках, мигрирующих в белое вещество спинного мозга в пределах области повреждения и экспрессирующих глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и транскрипционный фактор Кгох20. Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты о стимулирующем влиянии на процессы нейрорегенерации МККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, в условиях их доставки в область травмы спинного мозга обосновывают выбор этого способа генно-клеточной терапии для последующего углублённого исследования на доклиническом этапе, что позволит приступить к клиническим испытаниям. Полученные данные подтверждают актуальность и перспективность работ по усовершенствованию и последующему применению разработанной технологической платформы создания генетических конструкций в качестве инструмента для формирования на основе этой же платформы других, возможно более эффективных средств для лечения и реабилитации больных с нейротравмой и тяжёлыми неврологическими заболеваниями.

Положения, выносимые на защиту:

1. Трансплантация в область контузионной травмы спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, стимулирует нейрорегенерацию.

2. Доставка терапевтических генов VEGF и FGF2 в область травматического повреждения спинного мозга при помощи мононуклеарных клеток крови пуповины человека поддерживает в нём популяцию шванновских клеток-мигрантов.

Апробация материалов диссертации

Основные положения и результаты работы доложены на: IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010); Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010); VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010); Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (Москва, 2011); V Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Уфа, 2012); XI Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Самара, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 6 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК. Связь работы с базовыми научными программами

Работа поддерживалась грантами: РФФИ №07-04-00746-а «Стимулирование регенерации аксонов в центральной и периферической нервной системе с помощью гелевых носителей для стволовых клеток, супрамолекулярных систем с самосборкой, сосудистого эндотелиального фактора роста и ксимедона» (2007-2009 гг.), ОПТЭК «Выживание и дифференцировка мигрирующих в спинной мозг эндогенных шванновских клеток под влиянием нейротрофиче-ских факторов» (2012 г.), РФФИ №12-04-31092-мол_а «Сравнение эффективности клеточно-опосредованной и прямой доставки генов нейротрофических факторов на посттравматическую регенерацию спинного мозга» (2012-2013 гг.). Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 34 рисунками, которые включают микрофотографии световой, флуоресцентной и конфокальной микроскопии, схемы. Библиографический список содержит 265 источника, из них 252 иностранных.

Содержание работы Материалы и методы исследования

Эксперименты проведены на 56 белых половозрелых лабораторных крысах, самках и самцах массой 200-250 г (табл. 1). Содержание и работу с лабораторными животными проводили в соответствии с требованиями приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики». Проведение диссертационного исследования одобрено локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета. Животных содержали в отдельных клетках, со стандартным суточным режимом и свободным доступом к воде и корму.

Крыс наркотизировали путём внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (Sigma) (80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г). Разрез кожи производили параллельно позвоночнику, выделяли позвоночный столб и проводили ламинэктомию на уровне Th8. Далее позвоночник крысы жёстко фиксировали металлическими клипсами за остистые отростки позвонков Th7 и Th9. Дозированную контузионную травму осуществляли с помощью вертикально падающего строго на центр (по срединной линии) визуализируемого участка спинного мозга металлического стержня весом 10 г и диаметром 2 мм (метод weight-drop) с высоты 25 мм (Rabchevsky

е1 а1., 2003). Прооперированных животных разделили на три экспериментальные группы (табл. 1).

Таблица 1. Экспериментальные группы животных с дозированной контузионной травмой спинного мозга

Группа Характер эксперимента Количество крыс

Опытная Трансплантация мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой рВи<1-УЕСР-РОР2 (MKKП+pBud-VEGF-FGF2) 21

Контроль 1 Трансплантация мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой рЕСРР-Ы2 (МККП+рЕСРР-Ы2) 21

Контроль 2 Без трансплантации клеток 14

Сразу после нанесения травмы МККП человека, трансфицированные плазмидой pBud-VEGF-FGF2, инъецировали при помощи гамильтоновского шприца (Sigma) по 1 млн в 5 мкл DPBS (фосфатно-солевой буфер Dulbecco, стерильный без ионов Са2+ и Mg2+, БиолоТ) в 2 точки на расстоянии 1 мм ростральнее и каудальнее эпицентра травмы и 0,5 мм латераль-нее срединной линии. Животным 1 -й контрольной группы в тех же условиях и в том же количестве трансплантировали МККП человека, трансфицированные плазмидой pEGFP-N2 (Clontech), содержащей ген усиленного зелёного флюоресцентного белка (EGFP). Животным 2-й контрольной группы трансплантацию клеток не проводили. В течение 7 суток после операции всем животным внутримышечно вводили гентамицин (5 мг/кг) 1 раз в сутки. Животных опытной группы (MKKn+pBud-VEGF-FGF2) выводили из эксперимента через 30 суток после нанесения травмы. Крыс 2-й контрольной (без трансплантации клеток) группы через 2, 14 (по одной крысе в каждый из указанных сроков) и 30 суток. Животных 1-й контрольной группы (MKKn+pEGFP-N2) через 2, 4, 7, 14, 21 (по две крысы в каждый из указанных сроков) и 30 суток. Животных наркотизировали и транскардиально перфузировали 4% раствором параформальдегида (4°С). Фрагмент спинного мозга (по 2,5 см рострально и каудально от Th8) общей длиной 5 см забирали вместе с позвонками. Через 12 ч от начала фиксации выделяли этот фрагмент и разделяли его на 5 равных частей, при этом эпицентр травмы находился в центральной области. Выведение животных из эксперимента проводили в соответствии с «Правилами работы с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минвуза от 13.11.1984 года №724).

Трансфицированные МККП были любезно предоставлены д.б.н. Ризвановым A.A. (кафедра генетики, Институт фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета). Генетическую модификацию выделенных МККП плаз-мидами pBud-VEGF-FGF2 (заявка на патент РФ №2009133970) и pEGFP-N2 проводили методом электропорации (Rizvanov et al., 2008).

Через 12 ч от начала фиксации выделенный и разделённый на пять равных частей спинной мозг помещали в 1% раствор OsC>4 на фосфатном буфере с добавлением сахарозы, обезвоживали и заливали в эгюн-812 (Fluka). Полутонкие поперечные срезы готовили на ультрамикротоме LKB-1I1 (Bromma). На срезах, окрашенных метиленовым синим, измеряли суммарную площадь патологических полостей, площадь сохранённого серого и белого вещества, определяли количество миелиновых волокон на расстоянии 3 и 5 мм от эпицентра травмы в ростральном и каудальном направлении. Все подсчёты проводили с оцифрованных изображений, полученных на световом микроскопе Axio Imager AI (Carl Zeiss). На поперечных срезах спинного мозга подсчитывали площадь сохранённого серого и белого вещества. Морфометрию проводили у всех выживших животных на трёх серийных срезах у каждого в фиксированных зонах белого вещества (рис. 1) площадью Si=0,56 мм2. В произвольной части каждой зоны площадью S2=0,0962 мм" подсчитывали количество миелиновых волокон и суммарную площадь патологических полостей. Подсчёт количества иммунопозитивных клеток производили во всей площади каждой зоны (Si=0,56 мм2).

Рис. 1.1- вентромедиальная часть переднего канатика, прилежащая к срединной щели, правая сторона; 2 - то же, левая сторона; 3 - латеральная часть бокового канатика в пределах фронтальной плоскости, проходящей через центральный канал, правая сторона; 4 - то же, левая сторона.

Иммунофлуоресцентное исследование проводили на поперечных срезах спинного мозга толщиной 20 мкм, полученных на криостате Microm HM 560 (Thermo Scientific). Для идентификации антигена срезы инкубировали с первичными антителами против белка S100В (Dako, 1:1200), GFAP (Santa Cruz, 1:200), маркёра шванновских клеток транскрипционного фактора Krox20 (Santa Cruz, 1:200), белка периферического миелина Р0 (Abeam, 1:100), низкоаффинного рецептора фактора роста нервов р75 (Santa Cruz, 1:100), PDGFßR (Sigma, 1:100), маркёра ядер клеток человека (HNu) (Chemicon, 1:100), VEGF (Sigma, 1:125) и HSP25

(Stressgen, 1:2000) в течение одних суток при 4°С. Затем срезы промывали в фосфатно-солевом буфере и инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями anti-mouse Alexa 647 (Invitrogen, 1:200), anti-goat Alexa 488 (Invitrogen, 1:150), anti-mouse Alexa 488 (Invitrogen, 1:200), anti-rabbit Alexa 555 (Invitrogen, 1:150) в течение 2 часов при комнатной температуре. Для визуализации ядер клеток срезы дополнительно окрашивали в течение 10 минут при комнатной температуре в растворе 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 10 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, Sigma). Окрашенные срезы заключали в глицерин (Галено Фарм) и изучали при помощи конфокального сканирующего микроскопа LSM 510-Meta (Carl Zeiss).

На аналогичных срезах на расстоянии 10 и 15 мм рострально и каудально от эпицентра травмы при помощи непрямой стрептавидин-биотин-пероксидазной реакции с LSAB-kit (DAKO) выявляли экспрессию белка S100B (Millipore, 1:200), PDGFßR (Sigma, 1:100) и транскрипционного фактора Krox20 (Covance, 1:200). Количество иммунопозитивных клеток подсчитывали на оцифрованных изображениях в тех же 4 зонах белого вещества (рис. 1). Для всех иммуногистохимических реакций выполняли отрицательные контроли с исключением из инкубационной среды первичных или вторичных антител путём их замены на 5% сыворотку осла.

Для оценки восстановления двигательной функции применяли поведенческий тест ВВВ в открытом поле (Basso et al., 1995). В тестировании животных участвовали два независимых исследователя.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ Origin7 Pro. Статистическую достоверность различий определяли с помощью t-критерия Стьюдента. Для всех статистических данных уровень достоверности был принят меньше 0,05 (Р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сроки выживаиия и характеристика миграционного потенциала трансплантированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека

В спинном мозге животных 1-й контрольной группы с введением МККП, трансфици-рованных плазмидой pEGFP-N2, специфическое свечение выявлено на расстоянии до 10 мм в ростральном и каудальном направлении от соответствующих точек инъекции. Это свечение наиболее интенсивно на ранних сроках после травмы и введения клеток (2-7 суток), чётко прослеживается на более поздних сроках (14-21 сутки) и постепенно затухает к 30 суткам. Меченые EGFP клетки присутствуют в сохранённой ткани серого и белого вещества и проникают в патологические полости. Если к первым суткам после трансплантации люминесци-

рующие клетки распределены более равномерно и преимущественно в белом веществе, то к 7 суткам они образуют скопления с интенсивной флуоресценцией в вентральной части задних канатиков и особенно в прилегающей к ней дорсальной части серого вещества. К 7 суткам области с характерным свечением ЕвРР занимают больший объём ткани, интенсивность свечения возрастает, что может быть следствием увеличения экспрессии ЕвРР в трансплантированных клетках. К 14 суткам область присутствия ЕСРР+-клеток значительно сужается. К этому сроку специфическая флуоресценция ЕОБР выявлена в компактном скоплении клеток преимущественно в вентральной части задних канатиков на границе с серым веществом. Достаточно длительная экспрессия ЕвРР на фоне отсутствия иммуносупрессии и трансплантации клеток в момент травмы, а не после прохождения пика цитостатического действия провоспапительных цитокинов и клеточных иммунных реакций (12-72 часа), свидетельствует не только о достаточно высокой способности трансплантирумых клеток к выживанию, но и о потенциальной возможности поддерживать экспрессию трансгенов.

Результаты иммуногистохимической реакции с антителами против 1Ши подтверждают полученные данные по экспрессии ЕСБР в МККП. К 14 суткам в области дорсальных канатиков на расстоянии 2 мм в обоих направлениях обнаружено объёмное скопление трансплантированных клеток (110 ШЧи+-клеток в участке площадью 0,03 мм2). К 21 и 30 суткам количество НМи+-ютеток постепенно снижается. К 30 суткам их единичные небольшие скопления присутствуют в участке протяжённостью 11,5 мм в каудальном направлении от эпицентра травмы. При этом наибольшее количество клеток наблюдается в области задних корешков (31 и 14 Н1Чи+-клеток в участке площадью 0,03 мм2) на расстоянии, соответственно, 10 и 11,5 мм от эпицентра травмы. В белом веществе в области боковых канатиков на границе с серым веществом НЫи^-клетки обнаружены в участке протяжённостью 10 мм от эпицентра травмы в каудальном направлении, а на расстоянии 11,5 мм эти клетки уже отсутствуют. В работе Оавап сЧ а1. (2008) установлена возможность выживания в течение пяти недель клеток крови пуповины человека, трансплантированных в область травмы спинного мозга через одну неделю после нанесения повреждения, однако с проведением иммуносупрессии. Выявленные нами сроки выживания МККП при их трансплантации в область травмы спинного мозга крысы сразу после нанесения повреждения и без иммуносупрессии свидетельствуют о достаточно высокой способности трансплантируемых клеток к выживанию.

Для получения значимого терапевтического эффекта трансплантируемые генетически модифицированные клетки должны длительно сохранять жизнеспособность и активно экс-прессировать трансгены. Нашим исследованием установлены не только достаточная продолжительность выживания и выраженный миграционный потенциал трансплантированных

МККП, но и возможность экспрессии ими после трансплантации рекомбинантного гена УЕвР. На 30 сутки после введения в область травмы МККП, трансфицированных плазмидой рВи<1-УЕОР-РСР2, двойная иммуногистохимическая реакция с антителами против НКи и УЕвИ обнаружила присутствие НМи+/УЕОР+-клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что генетически модифицированные МККП, трансплантированные тотчас после нанесения травмы в область повреждения спинного мозга крысы, способны сохранять жизнеспособность до 30 суток. При этом экспрессионный плазмидный вектор, содержащий терапевтические гены, активно функционирует в трансплантированных клетках, а продукты реком-бинантных генов имеют потенциальную возможность секретироваться и воздействовать на клетки-мишени.

2. Восстановление двигательной функции

Наибольшие значения показателя двигательной активности были зарегистрированы в опытной группе животных с трансплантацией МККП+рВи(1-УЕОР-РСР2. Среднее значение показателя теста ВВВ для наблюдений в интервале между 15 и 30 сутками после операции составило для опытной группы (МККП+рВис1-УЕСР-РОР2) - 12,5 баллов, для 1-й контрольной группы (МККП+рЕвРР-Ш) - 9,1 баллов, для 2-й контрольной группы (без трансплантации клеток) - 6 баллов. В интервале между 10 и 25 сутками после нанесения травмы и трансплантации МККП+рВис1-УЕСР-РСР2 средний показатель восстановления двигательной функции в тесте ВВВ увеличивается, соответственно, на 40% и в 2,1 раза по сравнению с тем же показателем у животных 1-й (МККГ1+рЕОРР-Ы2) и 2-й контрольных группы (без трансплантации клеток) (рис. 2).

20 15 10 5

о

........*.......4.........5........г.....1......

9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29

Рис. 2. Восстановление двигательной функции (тест ВВВ). По оси абсцисс -сутки после операции, по оси ординат - показатель теста в баллах. Сплошная линия - опытная группа (МККП+рВис1-УЕОЕ-РСР2), пунктирная линия - 1-я контрольная группа (МККП+рЕСРР-N2), точечная линия - 2-я контрольная группа (без трансплантации клеток). * - Р<0,05 - при сравнении опытной и 1 й контрольной группы.

Результаты восстановления двигательной функции в работе Базап е1 а1. (2008), полученные через пять недель после трансплантации клеток крови пуповины человека в область травмы спинного мозга крысы, соответствуют нашим данным. Однако следует учитывать, что в указанной работе груз падал с высоты 12,5 мм, и сила контузионного повреждения была меньшей. Показано, что удар такой силы приводит к меньшим потерям белого вещества и,

как следствие, лучше восстанавливается двигательная функция (Масгутова и др., 2008). Средний показатель восстановления двигательной функции при трансплантации МККП в область травмы спинного мозга крысы через час после её нанесения составил 17.9±2.9 (Rodrigues et al., 2012). Однако в указанной работе проводили иммуносупрессию, а количество трансплантируемых клеток было в пять раз больше. Наши результаты с транплантацией сразу после нанесения повреждения генетически модифицированных МККП в область травмы спинного мозга свидетельствуют об улучшении восстановления двигательной функции под влиянием терапевтических генов.

3. Посттравматические реакции в белом и сером веществе после трансплантации моно-нуклеарных клеток крови пуповины человека

В раннем периоде после травмы в относительно сохранённом белом веществе развивается отёк, нервные волокна рострапьнее и каудальнее эпицентра травмы дегенерируют, их миелиновая оболочка подвергается деструктивным изменениям. В наибольшей мере повреждение затрагивает серое вещество, в котором наблюдается хроматолиз и гибель нейронов. К 30 суткам в области травмы и прилегающих каудальном и ростральном фрагменте спинного мозга границы между серым и белым веществом не прослеживались. Формируются микрокисты, которые постепенно сливаются в большие полости, окружённые прослойками соединительной ткани с выраженным астроглиозом. Крупные патологические полости доминируют в центральной зоне тканевого дефекта. В дальнейшем здесь образуется глиальный рубец, который рассматривают как основное препятствие для регенерирующих аксонов. Явных различий в морфологии области повреждения при сравнении материала от животных 1 -й контрольной и опытной групп обнаружено не было.

К 30 суткам после трансплантации трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 МККП в спинном мозге животных опытной группы площадь сохранённого серого вещества увеличивается на 66% на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в ростральном направлении, а на том же расстоянии в каудальном направлении - на 61% по сравнению с показателем у животных 1-й контрольной группы (MKKn+pEGFP-N2). На расстоянии 5 мм от эпицентра указанные различия между группами выражены в меньшей степени, но все же с превышением значений в опытной группе по сравнению с 1-й контрольной на 40% в ростральном направлении и на 31% в каудальном (рис. 3). Во 2-й контрольной группе без трансплантации клеток на расстоянии 3 и 5 мм от эпицентра травмы площадь сохранённого серого вещества была минимальна или серое вещество отсутствовало совсем.

Уменьшение площади деструкции ткани при трансплантации МККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, выявлено также в белом веществе. К 30 суткам экспе-

римента на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в каудальном направлении площадь сохранённого белого вещества у животных опытной группы превышает данный показатель у животных 1-й (МККП+рЕСРР-Ш) и 2-й (без трансплантации клеток) контрольных групп соответственно на 56% и 54%, в ростральном направлении на 63% и 64%. На расстоянии 5 мм в ростральном направлении от эпицентра травмы площадь сохранённого белого вещества у животных опытной группы по сравнению с животными 1-й (МККП+рЕОРР-№) и 2-й (без трансплантации клеток) контрольных групп увеличивается соответственно на 45% и 57%, а на том же расстоянии в каудальном направлении - на 43% и 62% (рис. 3). Результаты мор-фометрии свидетельствуют о том, что чем ближе к эпицентру травмы и точкам введения клеток располагается исследуемый участок мозга, тем в большей мере проявляется поддерживающий эффект доставки терапевтических генов на сохранность серого и белого вещества. 0,6 3-1

Рис. 3. Площадь (ось ординат, мм2) сохранённого серого (слева) и белого (справа) вещества на поперечном срезе спинного мозга крысы на уровне ТЪ8 через 30 суток после трансплантации в область контузионной травмы МККП, трансфицированных плазмидой рЕйЕР-Ш (пунктирная линия) и рВис1-УЕОР-РОР2 (сплошная линия). Точечная линия - 2-я контрольная группа (без трансплантации клеток). По оси абсцисс - расстояние от эпицентра травмы в мм слева от 0 - в каудальном, справа - в ростральном направлении. * - Р<0,05.

К 30 суткам после нанесения травмы и трансфицированных клеток в относительно введения сохранённом белом веществе присутствуют многочисленные мелкие полости, которые локализуются преимущественно по периферии. К этому сроку у животных опытной группы (МККП+рВис1-'УЕОР-РОР2) суммарная площадь патологических полостей на поперечном срезе спинного мозга при удалении от эпицентра травмы на расстояние 3 мм в каудальном направлении значительно уменьшается (рис. 4). Так, по сравнению с 1-й (МККП+рЕСРР-М2) и 2-й (без трансплантации клеток) контрольной группой животных в вентромедиальной части переднего канатика справа и слева (зоны 1 и 2) суммарная площадь патологических полостей в опытной группе (МККП+рВис1-\'ЕОР-РОР2) уменьшается в

3 4 5 6

среднем в 2,2 и 6,7 раза (Р<0,05), а в латеральной части бокового канатика справа и слева (зоны 3 и 4) - в 1,8 и 6,1 раза (Р<0,05), соответственно.

0.9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

Рис. 4. Суммарная площадь патологических полостей (ось ординат, мм2) на поперечном срезе спинного мозга крысы на расстоянии 3 мм в каудальном направлении от эпицентра травмы на 30 сутки после операции. Чёрные столбики - МККП+рВис1-УЕОР-РОР2, белые столбики - МККП+рЕОРР-Ш, серые столбики - 2-я контрольная группа (без трансплантации клеток). По оси абсцисс - зоны морфометрии. В каждой зоне при сравнении показателя любой пары столбиков Р<0,05.

12 3 4

У крыс контрольных групп в белом веществе в участках, расположенных на расстоянии 3 и 5 мм от эпицентра травмы, как в ростральном, так и в каудальном направлении, отмечена деструкция миелиновых волокон. Она характеризуется выраженными изменениями миелиновой оболочки, расслоением и дезинтеграцией миелина и образованием крупных вакуолей по периферии волокон большого диаметра. При развитии деструктивного процесса эти вакуоли вызывают значительную деформацию аксонов вплоть до полного их исчезновения. Такие дегенерирующие волокна могут полностью замещаться мелкими полостями, которые при слиянии образуют обширные области деструкции в белом веществе. У животных опытной группы в стандартных зонах наружной части белого вещества на расстоянии 5 мм от эпицентра в ростральном и каудальном направлении выявлено значительное увеличение количества миелиновых волокон с сохранённой структурой, что в среднем на 54% (Р<0,05) и 85% (Р<0,05) больше, чем в 1-й (МККП+рЕОРР-Ш) и 2-й (без трансплантации клеток) контрольной группе, соответственно (рис. 5).

У животных опытной группы в белом веществе на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в каудальном и ростральном направлении во всех зонах морфометрии количество миелиновых волокон увеличивается в среднем на 28% и 77% (Р<0,05) по сравнению с величиной этого показателя в 1-й (МККП+рЕСРР-Ш) и 2-й (без трансплантации клеток) контрольной группе, соответственно.

Таким образом, по критериям выраженности патологической кавитации и сохранности серого и белого вещества эффективность трансплантации в область травмы спинного мозга МККП, трансфицированных плазмидой рВис1-УЕОР-РОР2, оказалась выше, чем при

трансплантации тех же клеток, трансфицированных плазмидой с нетерапевтическим геном ЕОЕР. Полученные результаты можно объяснить действием продуктов экспрессии терапевтических генов нейротрофических и одновременно ангиогенных факторов на клетки-мишени в повреждённой ткани реципиента. Увеличение количества регенерирующих волокон в белом веществе спинного мозга в результате проведения локальной генно-клеточной терапии может быть результатом прямого поддерживающего влияния НТФ, которые продуцируются трансплантированными клетками, на олигодендроциты и процесс ремиелинизации. Усиление регенерации миелиновых волокон может быть также следствием уменьшения объёма патологических полостей и увеличения области сохранённой ткани в белом веществе.

1234 4321

Рис. 5. Количество миелиновых волокон (ось ординат на площади 82=0,0962 мм2) на расстоянии 5 мм в ростральном (справа от оси ординат) и каудальном (слева от оси ординат) направлении в зонах подсчёта к 30 суткам после нанесения травмы. Чёрные столбики — МККП+рВиё-УЕСЕ-ЕОЕ2, белые столбики - МККП+рЕОРР-№ (1-я контрольная группа), серые столбики - 2-я контрольная группа (без трансплантации клеток). По оси абсцисс - зоны морфометрии. В каждой зоне при сравнении показателя любой пары столбиков Р<0,05.

4. Посттравматические изменения в количестве 8100В+- и РП)СР|Ж -клеток-

Белок Б100В специфичен как для астроцитарной глии, так и для шванновских клеток. Количество Э100В+-клеток в наружных зонах белого вещества на расстоянии 15 мм от эпицентра травмы возрастает в случае трансплантации МККП, трансфицированных плазмидой рВис1-УЕОР-РОР2, на 55% (Р<0,05) по сравнению с 1-й контрольной группой (МККП+рЕСРР-К2). Однако достоверная разница по данному показателю отмечена лишь в вентромедиальной части переднего канатика и латеральной части бокового канатика слева (зона 2 и 4). Увеличение экспрессии белка ЭЮОВ при трансплантации МККП, трансфицированных плазмидой рВис!-УЕОР-РОР2, может оказывать положительное влияние на регенера-

цию спинного мозга. Увеличение количества астроцитов, с учётом усиления васкуляризации белого вещества у животных опытной группы, может способствовать восстановлению трофической функции и формированию адекватного матрикса для роста аксонов, а привлечение в область травмы предшественников шванновских клеток - позитивно влиять на их регенерацию. Все это может быть связано с известной способностью МККП сдерживать воспалительную реакцию и оказывать нейротрофическое влияние (ЭИеп й а1., 2008) или с выработкой специфических факторов, поддерживающих выживание и дифференцировку 8100В+-клеток.

РБОР-В через рецепторный вход РВОБрЯ стимулирует дифференцировку перицитов из предшественников, экспрессирующих РБСРрЯ, что оказывает поддерживающее влияние на процесс васкуляризации (Не1к1тот й а!., 2001; Ве18ЬоИ7 е! а1., 2005). Его нарушение показано при дефектах генов РЭСР-В и РБОГрЯ (ЬшёаЫ е1 а1., 1997). Осадок конечного продукта иммуногистохимической реакции с антителами против РЭОРрК выявлен в клетках преимущественно белого вещества в связи с кровеносными сосудами. Длинные РООРрЯ-иммунопозитивные отростки этих периваскулярных клеток ориентированы по ходу кровеносных сосудов, которые проходят в радиальном направлении. Наибольшее количество РООРр11+-клеток присутствует в наружных зонах белого вещества. Различий в характере распределения и интенсивности осадка иммуногистохимической реакции в материале от животных опытной и 1-й контрольной групп выявлено не было. У животных опытной группы (МККП+рВис1УЕОР+РОР2) в наружных зонах белого вещества на расстоянии 15 мм от эпицентра травмы количество периваскулярных клеток, экспрессирующих РООРРЯ, возрастает в среднем на 35% (Р<0,05) по сравнению с 1-й контрольной группой (МККП+рЕСРР-Ш).

Зарегистрированное нами к 30 суткам эксперимента увеличение количества РОСрр11+-клеток отражает усиление васкуляризации белого вещества в области травматического повреждения спинного мозга. Этот эффект, по-видимому, является результатом действия УЕвР и РОР2, продуцируемых трансплантируемыми МККП. Восстановление кровоснабжения в повреждённой ткани может быть причиной выявленной нами позитивной динамики улучшения двигательной функции, уменьшения объёма патологических полостей, увеличения области сохранённой ткани, количества миелиновых волокон, а также положительных сдвигов в популяциях астроцитов и шванновских клеток-мигрантов.

5. Миграция шванновских клеток в область травмы спинного мозга

На 30 сутки после нанесения травмы во всех исследуемых группах животных на расстоянии до 20 мм от эпицентра повреждения в обоих направлениях обнаружены клетки, экс-прессирующие специфические маркёры шванновских клеток. В опытной и контрольных

группах их количество и распределение в белом и сером веществе существенно различается. При помощи непрямого иммунопероксидазного метода с выявлением транскрипционного фактора Кгох20 обнаружено увеличение количества Кгох20+-клеток во всех фиксированных зонах белого вещества на расстоянии 10 мм от эпицентра травмы в опытной группе по сравнению с 1-й (МККП+рЕОРР-Ы2) и 2-й (без трансплантации клеток) контрольными группами соответственно на 38% и в 2,3 раза в ростральном направлении, на 70% и в 2,9 раза в кау-дальном направлении (рис. 6).

1234 4321

Рис. 6. Количество Кгох20+-клеток (ось ординат на площади $1=0,56 мм2) на расстоянии 10 мм в ростральном (справа от оси ординат) и каудальном (слева от оси ординат) направлении в зонах подсчёта к 30 суткам после нанесения травмы. Чёрные столбики - МККП+рВиё-УЕСР-РСР2, белые столбики - МККП+рЕСРР-Ы2 (1-я контрольная группа), серые столбики - 2-я контрольная группа (без трансплантации клеток). По оси абсцисс - зоны морфометрии. В каждой зоне при сравнении показателя любой пары столбиков Р<0,05.

К 30 суткам после нанесения травмы у животных всех групп в белом и сером веществе обнаружены клетки, одновременно экспрессирующие белки ЭЮОВ, вРАР и Кгох20 (в 100В ЛЗРАР /Кгох20 -клетки). Для 2-й контрольной группы (без трансплантации клеток) в области вхождения задних корешков характерно отсутствие Э100В+- и Кгох20+-клеток. Здесь преимущественно присутствуют ОРАР+-, СРАР+/Кгох20+-клетки и единичные Б100В+/СРАР+/Кгох20+-клетки (рис. 7В, Е, И, М). Для опытной (МККП+рВис1-УЕСР-РОР2) и 1-й контрольной (МККП+рЕОРР-Ю) группы в указанной области серого вещества установлено наличие 8100В+-клеток и единичных Кгох20+-клеток, присутствие ОРАР+-, ОРАР+/Кгох20+- и 8100В+/СРАР+/Кгох20+-клеток. При этом в случае трансплантации МККП+рВис1-УЕОР-РОР2 (опытная группа) по сравнению с трансплантацией МККП+рЕСРР-Ш (1-я контрольная группа) популяция Б100В+/СРАР+/Кгох20+-клеток пред-

ставляется наибольшей (рис. 7К). В области вхождения задних корешков в опытной группе особенно выражена популяция ОБАР+/Кгох201-клеток, являющаяся также самой многочисленной в материале всех экспериментальных групп (рис. 7Г, Ж).

опыт контроль 1 контроль 2

БЮО

СРАР

Кгох20

А -•• ' ** '.* V-_ . > • Г; Б В

- < «.у д * > ■ 'V V - ' ** » ^^ У .. -ч

■Ж" .-•л». •• 1 ■ г V ' | 3 ' -V; 0 ■ ■ <• * И «г V * ' Г-.' •'

^^^^^ 'у;, ' 4 ' V-'« ; ¿г: ' »1 . Лч«' /-.г! Л > ✓ ■ • " V ■ ■« ' • -.УЛ' * ■«о . А- ■■■■ т*. ■'"•С - • ••_•. - Л -. V-' ; >' . ■ д я - г ' • . - ' • '-а: . * * ... '

Рис. 7. Экспрессия белков БЮОВ (жёлтый), вРАР (красный) и транскрипционного фактора Кгох20 (зелёный) в области вхождения задних корешков на расстоянии 10 мм каудально от эпицентра травмы в опытной группе животных (МККП+рВи<1-УЕОР-РОР2) (А, Г, Ж, К), 1-й контрольной группе (МККП+рЕОРР-Ю) (Б, Д, 3, Л), 2-й контрольной группе без трансплантации клеток (В, Е, И, М). ЭАР1 (синий) - ядра клеток, К, Л и М - объединение изображений. Конфокальная микроскопия. Ув.400.

У животных опытной группы (МККП+рВш1-УЕОР-РОР2) в белом веществе преимущественно в латеральной части бокового канатика слева и справа на расстоянии 10 мм в кау-

дальном направлении от эпицентра травмы обнаружено значительное количество клеток, одновременно экспрессирующих белок периферического миелина РО и содержащих низкоаффинный рецептор фактора роста нервов р75.

Отмечены различия в размерах тел и отростков S100B+/GFAP+/Krox20+-iaieTOK в белом и сером веществе у животных опытной и контрольных групп. Так, размер шванновских клеток, одновременно экспрессирующих белки S100В, GFAP и транскрипционный фактор Кгох20, в зонах белого вещества в 2 раза больше, чем в сером веществе и задних канатиках. Транскрипционный фактор Кгох20 является надёжным маркёром миелинобразующих шванновских клеток и экспрессируется клетками пограничной шапочки, которые также активно мигрируют в область повреждения (Zujovic et al., 2010). Начало экспрессии Rrox20 приурочено к стадии перехода предшественников в зрелые клетки (Jessen et al., 2005). Наличие белка S100В специфично как для астроцитарной глии, так и для шванновских клеток и их предшественников. Ранее GFAP считался специфичным только для зрелых астроцитов, но последующие исследования показали возможность экспрессии данного белка в миелиннеобра-зующих шванновских клетках (Wang et al., 2010).0бнаружение S100B /GFAP /Кгох20 -клеток в нашем исследовании может свидетельствовать о наличии мигрировавших в спинной мозг шванновских клеток, у которых увеличение экспрессии GFAP может свидетельствовать о перестройке цитоскелета. При этом среди всей популяции мигрировавших шванновских клеток встречаются и зрелые Кгох20+-клетки, по-видимому, способные к миелинизации аксонов. Увеличение количества Кгох20+-клеток в опытной группе по сравнению с остальными группами животных, как в белом веществе, так и в области вхождения задних корешков, свидетельствует о стимулировании процесса миграции и дифференцировки шванновских клеток под влиянием терапевтических генов VEGF и FGF2, доставляемых при помощи МККП.

Сопоставление результатов проведения иммуногистохимических реакций в материале от животных разных экспериментальных групп позволило выделить две популяции клеток с охарактеризованным фенотипом. Первая из них включает клетки, которые избирательно реагируют на фактор трансплантации МККП. Вторая представлена клетками, которые преимущественно откликаются на фактор локальной доставки терапевтических генов VEGF и FGF2 в область повреждения при помощи тех же клеточных носителей. К первой популяции можно отнести S100B+/GFAP+/Krox20+-icueTKH в сером и белом веществе, количество которых под влиянием фактора трансплантации МККП в указанных областях мозга значительно увеличивается. К этой же первой популяции можно причислить GFAP -астроциты, но в этом случае действие фактора трансплантации МККП имеет противоположную направленность,

т.е. подавляет экспрессию GFAP. Большинство клеток с охарактеризованным фенотипом в области повреждения образуют субпопуляции, которые испытывают поддерживающее влияние со стороны фактора локальной доставки терапевтических генов. Преимущественно это шванновские клетки, которые экспрессируют транскрипционный фактор Кгох20 или белок периферического миелина РО.

При проведении тройной иммуногистохимической реакции с помощью антител против HSP25, GFAP и Кгох20 в белом веществе выявлены клетки, экспрессирующие все три указанных маркёра (Н8Р25+ЛЗРАР+УКгох20+-клетки). В сером веществе и в области вхождения задних корешков данные клетки не обнаружены. Наибольшее количество HSP25+/GFAP+/Krox20+-KrieTOK в области задних канатиков характерно для опытной группы с доставкой генов VEGF и FGF2. Для 1-й контрольной группы (MKKn+pEGFP-N2) с доставкой гена зелёного флуоресцентного белка этот показатель снижен в 2 раза. Во 2-й контрольной группе без трансплантации клеток HSP25+/GFAP+/Krox20+-ioieTKH в области задних канатиков отсутствуют. ШР25+-клетки в области вхождения задних корешков обнаружены лишь в опытной группе (MKKn+pBud-VEGF-FGF2). По экспрессии HSP25 в глиальных клетках можно судить о включении цитопротекторного механизма. Нами впервые обнаружена экспрессия HSP25 в СРАР+/Кгох20+-шванновских клетках-мигрантах в белом веществе в пределах области повреждения. Отсутствие HSP257GFAP /Кгох20 -клеток в сером веществе области вхождения задних корешков и их наличие в белом веществе может свидетельствовать о реактивности шванновских клеток после их миграции в область демиелинизации либо о фенотипических сдвигах в связи с изменением микроокружения.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что доставка генов VEGF и FGF2 приводит к увеличению количества шванновских клеток в области повреждения спинного мозга. Данный феномен можно объяснить тем, что под влиянием VEGF и FGF2 повышается жизнеспособность шванновских клеток, или возрастает их способность к миграции в область повреждения, либо, наконец, пролиферативная активность. Последнее предположение согласуется с результатами исследования Haninec et al. (2012), в котором в условиях применения плазмиды с геном VEGF показана возможность усиления пролиферации шванновских клеток и увеличения экспрессии в них белка VEGF. Способность стимулировать пролиферацию шванновских клеток in vitro установлена также и для FGF2 (Shen et al., 2005).

Выводы:

1. Трансфицированные мононуклеарные клетки крови пуповины человека, трансплантированные в область контузионной травмы спинного мозга крысы, до 30 суток сохраняют жизнеспособность с возможностью экспрессии продуктов рекомбинантных генов и способны мигрировать на расстояние не менее 10 мм в ростральном и каудальном направлении от эпицентра травмы.

2. Трансплантация в область травмы спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, улучшает восстановление двигательной функции.

3. Трансфекция мононуклеарных клеток крови пуповины человека плазмидой pBud-VEGF-FGF2 повышает способность этих клеток, трансплантируемых в область повреждения спинного мозга крысы, стимулировать его посттравматическую регенерацию, что установлено по критериям уменьшения патологической кавитации, площади деструкции серого и белого вещества и увеличения количества миелиновых волокон.

4. Трансплантация в область травмы спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, приводит к увеличению количества перицитов, экспрессирующих ß-рецептор тромбоцитарного фактора роста, что свидетельствует о стимулирующем влиянии генно-клеточной терапии на неова-скуляризацию.

5. Трансплантация в область травмы спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, приводит к увеличению численности S100В+-клеток в белом веществе спинного мозга.

6. Трансплантация в область травмы спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, поддерживает в области травмы спинного мозга популяцию шванновских клеток-мигрантов. Субпопуляции этих клеток с фенотипом Р0+- и Р0+/р75+ в белом веществе, S100B+/GFAP+/Krox20+ и GFAP /Кгох20 в области вхождения задних корешков и HSP25+/GFAP /Кгох20 в задних канатиках являются мишенями поддерживающего влияния терапевтических генов, а не фактора трансплантации клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Челышев Ю.А. Клеточные технологии стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга / Ю.А. Челышев, Г.Ф. Шаймарданова, Р.Ф. Масгутов, Г.А. Масгутова, A.A. Ризванов, Я.О. Рубашкина (Мухамедшина) // Морфология. - 2009. - Т. 136, №4. -С.150-151.

2. Шаймарданова Г.Ф. Посттравматическая регенерация спинного мозга крысы в условиях эктопической экспрессии генов VEGF и FGF2 в области повреждения / Г.Ф. Шаймар-

данова, Я.О. Рубашкина (Мухамедшина), И.И. Салафутдинов, A.A. Ризванов, Ю.А. Челышев // Сборник тезисов IV Всероссийского симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии». - Санкт-Петербург, 2010. - С. 136-137.

3. Шаймарданова Г.Ф. Выживание и миграционный потенциал мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных генами EGFP, VEGF и FGF2, при трансплантации в область травмы спинного мозга крысы / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Рубашкина (Мухамедшина), И.М. Газизов, И.И. Салафутдинов, A.A. Ризванов, Ю.А. Челышев // Сборник научных трудов VIII Всероссийской конференции по патологии клетки. - Москва,

2010.-С. 292-294.

4. Мухамедшина Я.О. Посттравматическая регенерация спинного мозга крысы при введении в область повреждения вектора pBud-VEGF+FGF2 / Я.О. Мухамедшина // Сборник тезисов Всероссийской научной школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина». - Москва, 2010.-С. 51.

5. Шаймарданова Г.Ф. Трансплантация клеток обонятельной выстилки и клеток крови пуповины человека в область контузионной травмы спинного мозга крысы (по данным мор-фометрии) / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, A.A. Ризванов, И.И. Салафутдинов, Ю.А. Челышев // Материалы 8-й Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле». - Орел, 2011.-С. 103-105.

6. Шаймарданова Г.Ф. Терапевтический эффект трансплантации VEGF и FGF2 в область травматического повреждения спинного мозга крысы при помощи клеток крови пуповины и путем прямой инъекции / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, A.A. Ризванов, И.И. Салафутдинов, Ю.А. Челышев // Сборник материалов V Российского симпозиума «Белки и пептиды». - Петрозаводск, 2011. - С. 146-147.

7. Шаймарданова Г.Ф. Экспрессия молекулярных детерминант шванновских клеток и периферического миелина в спинном мозге крысы при контузионной травме / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, С.С. Архипова, Ю.А. Челышев // Морфологические ведомости. - 2011. - №2. - С. 73-77.

8. Шаймарданова Г.Ф. Посттравматическая регенерация спинного мозга крысы при введении в область повреждения вектора pBud-VEGF+FGF2 / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, И.И. Салафутдинов, A.A. Ризванов, Ю.А. Челышев // Сборник научных трудов Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина». - Москва,

2011. -С.166-167.

9. Шаймарданова Г.Ф. Посттравматические изменения спинного мозга крысы при трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека, модифицированных генами VEGF и FGF2 / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, С.С. Архипова, И.И. Салафутдинов, A.A. Ризванов, Ю.А. Челышев // Морфология. - 2011. - Т.140, №6. - С. 36-42.

10. Челышев Ю.А. Прямая доставка терапевтических генов для стимулирования посттравматический нейрорегенерации / Ю.А. Челышев, Я.О. Мухамедшина, Г.Ф. Шаймарданова, С.И. Николаев // Неврологический вестник. - 2012. - T.XLIV, №1. - С. 76-83.

11. Шаймарданова Г.Ф. Трансплантация клеток крови пуповины человека в область контузионной травмы спинного мозга крысы / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, А.Р. Мухитов, И.И. Салафутдинов, A.A. Ризванов, Ю.А. Челышев // Сборник тезисов V Всероссийского симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии». - Уфа, 2012. - С. 209-210.

12. Мухамедшина Я.О. Эффекты однократной трансплантация в область контузионной травмы спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой с генами vegf и fgf2 / Я.О. Мухамедшина // Материалы XIX Международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «JIo-

моносов». - Москва, 2012. - [Электронный ресурс]. http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2012/1930/28060_f5ed.pdf

13. Мухамедшина Я.О. Усиление миграции миелинобразующих шванновских клеток в области травмы спинного мозга крысы при генно-клеточной терапии / Я.О. Мухамедшина, Г.Ф. Шаймарданова, Ю.А. Челышев // Материалы Международной конференции «Биология

- наука XXI века». - Москва, 2012. - С. 612-614.

14. Шаймарданова Г.Ф. Эффект трансплантации в область травматического по-вреждепин спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, экспрессирующих рекомбинантные гены VEGF и FGF2 / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, A.A. Ризванов, И.И. Салафутдинов, Ю.А. Челышев // Морфология.

- 2012. - Т.142, №4. - С. 31-36.

15. Челышев Ю.А. Эффекты различных способов доставки терапевтических генов vegf и fgß в область травматического повреждения спинного мозга / Ю.А. Челышев, Я.О. Мухамедшина, И.И. Салафутдинов, Г.Ф. Шаймарданова, A.A. Ризванов // Морфология. — 2012. — Т.141, №3. - С. 169.

16. Мухамедшина Я.О. Выживание и дифференцировка мигрирующих в спинной мозг эндогенных шванновских клеток под влиянием нейротрофическнх факторов / Я.О. Мухамедшина, Г.Ф. Шаймарданова, А.Р. Мухитов, И.И. Салафутдинов, A.A. Ризванов, В.Н. Зарубина, Ю.А. Челышев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2012. - Т.VII, №3. - С. 125-129.

17. Шаймарданова Г.Ф. Применение плазмидного вектора с генами vegf и fgf2 при травматическом повреждении спинного мозга крысы / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, И.И. Салафутдинов, A.A. Ризванов, Ю.А. Челышев // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2012. - №4. - С. 200-204.

Патент

1. Способ стимулирования нейрорегенерации с помощью генетических конструкций. Авторы: Челышев Ю.А., Шаймарданова Г.Ф., Мухамедшина Я.О., Исламов P.P., Ризванов A.A., Салафутдинов И.И. Патент РФ на изобретение №2459630.

Список сокращений

МККП - мононуклеарные клетки крови пуповины

НТФ - нейротрофические факторы

EGFP - усиленный зелёный флуоресцентный белок

FGF2 - фактор роста фибробластов 2

GFAP - глиальный фибриллярный кислый белок

HNu — ядерный антиген человека

HSP25 - белок теплового шока

PDGFßR - бета рецептор тромбоцитарного фактора роста VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста

Подписано в печать 15.04.2013. Бумага офсетная. Печать цифровая. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Times New Roman». Усл. печ. л. 1,5 Уч.-изд. л. 1,35. Тираж 100 экз. Заказ 91/4

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства Казанского университета

420008, г. Казань, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел. (843) 233-73-59, 233-73-28

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Мухамедшина, Яна Олеговна, Саранск

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГБОУ ВПО КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

04201356743

Мухамедшина Яна Олеговна

ПОСТТРАВМАТИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ СПИННОГО МОЗГА КРЫСЫ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ ПУПОВИНЫ ЧЕЛОВЕКА, ТРАНСФИЦИРОВАННЫХ ПЛАЗМИДОЙ

рВис1-УЕОР-РОР2

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Челышев Ю.А.

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

1. Обзор литературы 12

1.1. Патологические реакции при травме спинного мозга 12

1.2. Концепция нейротрофических факторов в приложении к 22 регенерации спинного мозга

1.3. Клеточная терапия при травме спинного мозга 30

1.4. Генетическая модификация клеток 44

1.5. Генно-клеточная терапия при травме спинного мозга 47

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 56

2.1. Методика проведения операции на спинном мозге 57

2.2. Экспериментальные группы 57

2.3. Генетическая модификация клеток 59

2.4. Гистологические методы 59

2.5. Иммуногистохимические методы 61

2.6. Оценка восстановления двигательной функции 62

2.7. Статистическая обработка результатов 63

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 64

3.1. Сроки выживания и характеристика миграционного потен- 64 циала мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансплантированных в область контузионной травмы спинного мозга крысы

3.2. Восстановление двигательной функции 71

3.3. Посттравматические реакции в спинном мозге крысы после 75 трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины

3.4. Посттравматические изменения количества 8100В+- и 85 РБОЕ/З^-клеток

3.5. Миграция шванновских клеток в область травмы спинного 90

мозга

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 108

5. ВЫВОДЫ 113

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 114

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

мккп мононуклеарные клетки крови пуповины человека

НТФ нейротрофический фактор

есп> усиленный зелёный флуоресцентный белок

мозговой нейротрофический фактор

ГС,¥2 фактор роста фибробластов 2

GDNF глиальный нейротрофический фактор

вРАР глиальный фибрилярный кислый белок

HNu ядерный антиген человека

ШР25 белок теплового шока 25

NGF фактор роста нервов

N13 нейротрофин 3

ОЕСб глиальные клетки обонятельных структур

РОСГ/ЗИ /3-рецептор тромбоцитарного фактора роста

р75 низкоаффинный рецептор фактора роста нервов

УЕвГ сосудистый эндотелиальный фактор роста

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Травма спинного мозга остаётся одной из актуальных медико-социальных проблем. Эффективных методов её лечения не существует, что является причиной глубокой инвалидизации пострадавших. Возможность преодоления последствий травмы спинного мозга связывают с применением нейротрофических факторов (НТФ), которые поддерживают жизнеспособность нейронов и регенерацию аксонов в спинном мозге (Jones et al., 2001; Lu, Tuszynski, 2008; Hollis, Tuszynski, 2011). Однако в ходе клинических испытаний с системной их доставкой были выявлены неприемлемые побочные реакции и низкая эффективность (Apfel et al., 2002). При непосредственном введении НТФ в область повреждения действие оказалось нестойким вследствие быстрого расщепления протеазами. Эти трудности стимулировали поиск других способов повышения содержания НТФ в повреждённой ткани. Среди них наиболее эффективной оказалась доставка генов НТФ.

Для доставки в область травмы спинного мозга терапевтических генов начато применение вирусных и невирусных векторов (De Laporte et al., 2011; Во et al., 2011; Hutson et al., 2012). Невирусные векторы, в частности плазми-ды, несмотря на низкую трансфекционную активность, считаются более безопасными. Одновременная доставка в повреждённую ткань нескольких генов НТФ кажется наиболее эффективной, а дальнейшее её изучение пред-став-ляется актуальным. При проведении генной терапии с целью стимулирования нейрорегенерации особенно перспективна одновременная доставка генов НТФ и ангиогенных факторов. Примером может служить комбинация генов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2) (Islamov et al., 2004; Sabti, 2007), применение которой при травме спинного мозга не исследовано.

Клеточная терапия рассматривается как один из перспективных способов преодоления последствий при травме спинного мозга. С этой целью ис-

следуют эмбриональные и нейральные стволовые клетки, глиальные клетки обонятельных структур, клетки крови пуповины, микроглия-подобные клетки, шванновские клетки и многие другие (Eftekharpour et al., 2008; Xu, Onifer, 2009; Ronaghi et al., 2010). Трансплантируемые клетки поддерживают восстановление матрикса ткани для регенерации нервных волокон, оказывают трофическое влияние на нейроны и глию, обеспечивают рост аксонов и участвуют в их ремиелинизации. Наиболее перспективными представляются клетки крови пуповины, оценке результатов экспериментальной трансплантации которых при травме спинного мозга посвящено достаточное количество работ (Hernández et al., 2011; Park et al., 2011; Sun, Ma, 2012). Трансплантация клеток крови пуповины человека при травме спинного мозга угнетает воспалительную реакцию, оказывает нейротрофическое влияние, стимулирует не-оваскуляризацию (Chen et al., 2008) и снижает экспрессию проапоптозных генов (Dasari et al., 2009). Трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины (МККП), как известного источника стволовых и прогениторных клеток, активно исследуют для преодоления последствий травмы и ишемии мозга, а также для лечения нейродегенеративных заболеваний (Kuh et al., 2005; Rizvanov et al., 2008; Rodrigues et al., 2012).

Несмотря на актуальность дальнейших исследований по трансплантации клеток при травме спинного мозга, стало очевидным, что только клеточная терапия в чистом виде приводит лишь к умеренному улучшению структурных показателей и недостаточному восстановлению функции. Именно поэтому для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга внимание исследователей привлекли генетически модифицированные клетки с усиленной экспрессией терапевтических генов НТФ.

При травме спинного мозга для анализа результативности нейрореге-нерации в условиях генно-клеточной терапии, наряду с применением общепринятых критериев, таких как степень восстановления функциональных параметров, сохранность ткани, выраженность патологической кавитации, ко-

личество регенерирующих миелиновых волокон, представляется важным оценить состояние клеток конкретных популяций. Среди них астроциты как наиболее многочисленные глиальные клетки, которые обеспечивают поддержание гомеостаза в мозге и нарушение функции которых немедленно приводит к развитию нейродегенерации (Rossi, Volterra, 2009; Matyash, Kettenmann, 2010; Allaman et al., 2011).

Другим клеточным типом, на который в нашей работе было обращено особое внимание, явились шванновские клетки. Эти клетки в нормальных условиях не мигрируют в мозг из периферических нервных структур. Но они появляются в ЦНС в очагах демиелинизации и в области травматического повреждения и могут участвовать в миелинизации аксонов в ЦНС (Jasmin et al., 2000; Totoiu, Keirstead, 2005; Oudega, Xu, 2006). Несмотря на пристальный интерес к проблеме миграции шванновских клеток в область повреждения мозга и проведённые исследования в этом направлении, многие вопросы поведения этих клеток требуют изучения. Не определены динамика численности популяции шванновских клеток-мигрантов в области травматического повреждения и количество жизнеспособных клеток, способных участвовать в ремиелинизации центральных аксонов. Применительно к задачам генно-клеточной терапии представляется актуальным оценить возможность поддержания в области травмы спинного мозга популяции шванновских клеток-мигрантов и влияния на их фенотипические характеристики.

Поскольку наша работа предполагает доставку плазмидного вектора с комбинацией генов, продукты которых стимулируют неоваскуляризацию, в качестве объекта исследования выбраны перициты, экспрессирующие /3-рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGF/3R). Определение их количества позволит оценить значение одновременной доставки в область травматического повреждения терапевтических генов VEGF и FGF2 для ре-васкуляризации как фактора поддержания посттравматической нейрорегене-рации.

Цель исследования - оценить эффективность мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой рВис!-УЕОР-РОР2, для преодоления последствий контузионной травмы спинного мозга крысы в условиях их однократной трансплантации в область повреждения.

Для достижения цели поставлены следующие задачи, решаемые на модели дозированной контузионной травмы спинного мозга крысы в условиях локальной доставки в область повреждения терапевтических генов на клеточных носителях:

1. Изучить сроки выживания и миграционный потенциал трансплантированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека.

2. Исследовать динамику восстановления двигательной функции в поведенческом тесте ВВВ.

3. Оценить суммарную площадь патологических полостей, площади сохранённого серого и белого вещества на поперечных срезах спинного мозга и количество миелиновых волокон в фиксированных наружных зонах белого вещества.

4. Определить количество клеток, экспрессирующих белок 8100В, в наружных зонах белого вещества в области повреждения.

5. Установить количество периваскулярных клеток, экспрессирующих РООР/ЗЯ, в наружных зонах белого вещества в области повреждения.

6. Оценить количество и фенотип шванновских клеток, мигрировавших в область повреждения.

Научная новизна

Впервые показано стимулирующее влияние на процессы нейрорегене-рации доставки в область травмы спинного мозга комбинации генов УЕвР и РвР2 при помощи трансфицированных плазмидой рВиё-УЕОР-РОР2 МККП человека, что проявляется в уменьшении площади деструкции серого и белого вещества, патологической кавитации, увеличения количества миелиновых

волокон и улучшения восстановления двигательной функции. Получены новые данные по срокам выживания и миграционному потенциалу трансплантированных в спинной мозг крысы МККП человека, трансфицированных плазмидой рВис1-УЕОР-РОР2. Впервые при контузионной травме спинного мозга и трансплантации трансфицированных плазмидой рВис!-УЕОР-РОР2 МККП в белом веществе области повреждения показано увеличение количества 8100В+- и РВОР/Ж.+-клеток. Приоритетными являются данные о том, что трансплантация МККП в область травмы спинного мозга оказывает поддерживающее влияние на популяцию мигрирующих в мозг шванновских клеток, а в сочетании с доставкой терапевтических генов УЕвР и РОР2 этот эффект усиливается. Впервые обнаружена экспрессия белка теплового шока 25 (ШР25) в шванновских клетках, мигрирующих в белое вещество спинного мозга в пределах области повреждения и экспрессирующих глиальный фибриллярный кислый белок (ОРАР) и транскрипционный фактор Кгох20. Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты о стимулирующем влиянии на процессы ней-рорегенерации МККП, трансфицированных плазмидой рВис1-УЕОР-РСР2, в условиях их доставки в область травмы спинного мозга обосновывают выбор этого способа генно-клеточной терапии для последующего углублённого исследования на доклиническом этапе, что позволит приступить к клиническим испытаниям. Полученные данные подтверждают актуальность и перспективность работ по усовершенствованию и последующему применению разработанной технологической платформы создания генетических конструкций в качестве инструмента для формирования на основе этой же платформы других, возможно более эффективных средств для лечения и реабилитации больных с нейротравмой и тяжёлыми неврологическими заболеваниями.

Положения, выносимые на защиту:

1. Трансплантация в область контузионной травмы спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, стимулирует нейрорегенерацию.

2. Доставка терапевтических генов VEGF и FGF2 в область травматического повреждения спинного мозга при помощи мононуклеарных клеток крови пуповины человека поддерживает в нём популяцию шванновских клеток-мигрантов.

Апробация материалов диссертации

Основные положения и результаты работы доложены на: IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010); Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010); VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010); Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (Москва, 2011); V Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Уфа, 2012); XI Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Самара, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 6 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК. Связь работы с базовыми научными программами

Работа поддерживалась грантами: РФФИ №07-04-00746-а «Стимулирование регенерации аксонов в центральной и периферической нервной системе с помощью гелевых носителей для стволовых клеток, супрамолекулярных систем с самосборкой, сосудистого эндотелиального фактора роста и ксиме-дона» (2007-2009 гг.), ОПТЭК «Выживание и дифференцировка мигрирующих в спинной мозг эндогенных шванновских клеток под влиянием нейро-трофических факторов» (2012 г.), РФФИ №12-04-31092-мол_а «Сравнение

эффективности клеточно-опосредованной и прямой доставки генов нейро-трофических факторов на посттравматическую регенерацию спинного мозга» (2012-2013 гг.).

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 34 рисунками, которые включают микрофотографии световой, флуоресцентной и конфокальной микроскопии, схемы. Библиографический список содержит 265 источника, из них 252 иностранных.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Патологические реакции при травме спинного мозга

Травма спинного мозга характеризуется многочисленными патологическими реакциями, в которые вовлечены практически все типы клеток ЦНС. Она приводит к гибели нейронов и глиальных клеток, сопровождается дегенерацией нервных волокон. Наиболее опасным и на сегодняшний день практически необратимым последствием патологических сдвигов является угнетение и выпадение двигательной функции и развитие параличей.

Современная концепция патогенеза травматического повреждения спинного мозга рассматривает два основных взаимосвязанных механизма гибели клеток: некроз и апоптоз. С некрозом связывают первичное повреждение спинного мозга, которое характеризуется развитием патологических сдвигов в результате непосредственного воздействия на ткань повреждающего фактора - механической травмы (контузия или сдавление мозга, дисцир-куляторные сосудистые расстройства).

Первичное повреждение сменяется вторичным, что приводит к наиболее серьёзным патологическим реакциям, к которым можно отнести развитие местного воспалительного ответа с повышением уровня провоспалительных цитокинов [например, фактора некроза опухоли a, (TNFa)], окислительный стресс и эксайтотоксичность (Rabchevsky, Smith, 2001; Ronaghi et al., 2010). Механизмы вторичного повреждения, включают сосудистый и воспалительный ответ. Эти реакции вызывают выраженную гибель нейронов и глиальных клеток, что проявляется распространённым восходящим и нисходящим повреждением нервных проводников, демиелинизацией и гибелью части аксонов (Beattie et al., 2002; Rowland et al., 2008; Xu et al., 2012). Исследования последних лет в качестве основной причины вторичного повреждения рассматривают активацию микроглии, приводящую к выработке многочисленных провоспалительных и нейротоксических молекул (Loane, Byrnes, 2010; Qu et al., 2012; Min et al., 2012).

Вторичное повреждение сопровождается апоптозом, который связывают с эксайтотоксическим действием глутамата (Fujieda et al., 2012), изменением содержания ионов Са (Sullivan et al., 2007), медиаторов воспаления (Pineau, Lacroix, 2007), ишемии и пр. Первым запускается апоптоз нейронов, микро- и олигодендроглии вблизи от некротического очага (этот процесс начинается в первые часы после травмы и может длиться до трех суток). Следующий пик апоптоза глии наблюдается через 7-14 суток на отдалении от эпицентра травмы и сопровождается гибелью олигодендроцитов (Min et al., 2012). Вторичное повреждение аксонов, активация внутриклеточных протеаз, нуклеаз, запуск механизма апоптоза приводит к отсроченной гибели клеток и снижению числа сохранившихся нейронов.

Вторичное повреждение при травме спинного мозга включает демие-линизацию, степень