Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

NG2-клетки - особый тип нейроглиальных элементов ЦНС млекопитающих животных и человека

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "NG2-клетки - особый тип нейроглиальных элементов ЦНС млекопитающих животных и человека"

На правах рукописи

ПОДРЕЗОВА ЕЛЕНА ПАВЛОВНА

^2-КЛЕТКИ - ОСОБЫЙ ТИП НЕЙРОГЛИАЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ЦНС МЛЕКОПИТАЮЩИХ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА (иммуногнстохнмнческое и электрониомнкроскопнческое исследование)

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 14.03.01 - анатомия человека

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на сонскаиие ученон степени кандидата медицинских наук

САРАНСК-2011

2 3 (!ЮН 2011

4850758

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» и в ГОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова».

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Сосунов Александр Алексеевич

доктор медицинских наук, профессор Ннколенко Владимир Николаевич

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Боголепов Николай Николаевич

Заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, профессор Ямщиков Николай Васильевич

Ведущая организация - ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова»

Защита диссертации состоится » _2011 г. в/-^ часов

на заседании Диссертационного Совета Д 212. 117. 01 при ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» по адресу: 430005, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

Автореферат диссертации опубликован на официальном сайте ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» www.mrsu.ru; E-mail:dsovet@mrsu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева.

Автореферат разослан «_»_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, ^ доктор биологических наук, профессор

алашов В.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы.

Прогресс в познании деятельности мозга привел к пересмотру значимости нейроглиальных клеток, которые стали рассматриваться не только как клетки «поддерживающие» функцию нейронов, но и как равноправные партнеры, участвующие в функциональной деятельности нейронов, а также регулирующие их развитие и дифференцировку. (Theodosis et al., 2008; Gibbs et al., 2008; Wetherington et al., 2008; Wang et al., 2009; Krawczyk et al., 2010; Haberlandt et al., 2011).

Особое значение для клинической практики, в частности для клеточной терапии, имеет доказательство того, что клетки с иммунным фенотипом нейроглиальных являются стволовыми и могут давать начало нейронам (Belachew et al., 2003; Aguirre, Gallo, 2004; Emsley et al., 2005; Goldman, 2005 Trotter et al., 2010).

Идентификация и характеристика новых белков в нервной ткани позволили установить особый тип нейроглиальных клеток, отличных от астроцитов, олигодендроцитов, эпендимоцитов и микроглни, характеризующийся экспрессией гликопротеина семейства хондроитин сульфат протеогликанов NG2, а также а субъединицы рецептора к ростовому фактору кровяных пластинок (PDGF a R) и транскрипционного фактора 01ig2, специфичного для олигодендроцитарного ростка (Chang et al., 2000; Dawson et al., 2003; Wigley et al., 2009; Kondo T., 2009; Kukley et al., 2010). Наиболее распространенное название этих клеток - NG2 клетки. Другое часто используемое название - ОРС (oligodendrocytes precursor cells -предшественники олигодендроцитов), поскольку в антенатальном периоде и культуре клеток они являются стволовыми клетками для олигодендроцитов (Wigley el al., 2009;. Shen et al., 2010

Основные сведения о NG2 клетках получены на мышах и крысах, где было показано, что они являются мультиотростчатыми клетками, широко распространенны в белом и сером веществе головного мозга, их плазмалемма содержит большое количество рецепторов и ионных каналов, клетки не связаны друг с другом и с соседними клетками нексусами (низкомолекулярные красители Lycifer Yellow, Texas Red не проникают в другие клетки при их введении в NG2 клетки), аксоны нейронов образуют синапсы на NG2 клетках (Bergles et al., 2010), возбуждение которых способно вызывать постсинаптические потенциалы, регистрируемые при пэтч клампе целой клетки (Levine et al., 2001; Lin, Berges, 2002; Nishiyama et al., 2002, 2007; 2009; Ziskin et al., 2007; Bergles et al., 2010). Как было показано в экспериментах с броомдезоксиуридином (BrdU) NG2 клетки имеют высокий митотический потенциал, превосходящий аналогичный у других клеток макронейроглии (Zai, Wrathall, 2005; Tatsumi et al., 2005).

Функциональное значение клеток в зрелом мозге неизвестно и наиболее принятой является концепция, что они являются стволовыми предшественниками для олигодендроцитов и, возможно, нейронов. Так, на

мыигах показано, что клетки, экспрессирующие NG2, при особых условиях культивирования могут давать начало не только олигодендроцитам, но и интернейронам (Belachew et al., 2003; Àguirrc, Gallo, 2004; Trotter et al., 2010).

Большое внимание уделяется возможности пшкопротеина NG2 ингибировать рост аксонов, что, как полагают, имеет значение для регенерации нервной ткани (de Castro et al., 2005; Sandvig et al., 2005; Giger et al., 2010).

Данные о наличии и роли NG2 клеток в мозге человека немногочисленны (Staugaitis et al., 2009) и в основном касаются рассеянного склероза и некоторых видов опухолей (Chang et al., 2000; Chekenya et al., 2002; Chekenya, Pilkington, 2002; Stallcup et al., 2008; Wang et al., 2009).

Цель и задачи исследовании:

Целью настоящей работы являлась идентификация и анализ NG2 клеток в головном мозге человека на операционном и аутопсийном материале, а также в мозге экспериментальных животных.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:

1) иммуногистохимически определить фенотип NG2 клеток и провести сравнительный анализ с другими клетками нейроглии (астроцитами, олигодецяроцитами и микроглией);

2) провести ультраструктурный анализ NG2 клеток;

3) исследовать NG2 клетки в разных областях мозга (зоны гиппокампа, неокортекс);

4) проанализировать регенерационный потенциал NG2 клеток;

5) изучить морфофункциональное состояние NG2 клеток у экспериментальных животных в пилокаршшовой модели эпилепсии.

Научная повизна исследования.

В результате выполненных исследований получены следующие новые данные:

• Впервые установлено, что NG2 клетки составляют особую популяцию нейроглии в мозге человека и экспериментальных животных, поскольку не экспрессиругот белки типичные:

- для астроцитов - глиалытый кислый фибриллярный белок (ГКФБ) и глутамин сиптетазу (ГК);

- для зрелых олигодендроцитов: CNP и МБР, но экспрессируют транскрипционный фактор 01ig2;

- для микроглии: CD68 и LN-3;

• В отличие от других клеток нейроглии NG2 клетки экспрессиругот трансмембранный протеин NG2 и PDGF a R.

• NG2 клетки зкспрессируют кальций связывающий белок SlOOfi, уровень иммунореактивности выше в сером веществе в сравнении с белым (р< 0.05);

• N02 клетки отличаются по форме тела от астроцитон (не имеют маленьких филаподие-подобных отростков) и от олигодендроцитов (имеют разветвленные, извитые отростки, не контактирующие с миелиновыми волокнами).

• Приоритетными являются установленные закономерности локализации N02 клеток и их межклеточные взаимоотношения с нейронами и другими клетками нейроглии.

• В работе впервые показано, что аксоны нейронов образуют синаптические контакты на телах и отростках N02 клеток.

• Установлено, что реактивные N02 клетки отличаются усиленной иммунореативностью на N02, экспрессируют высокий уровень нести на и виментина, а часть из них экспрессирует низко-аффинный рецептор к нервному фактору роста р75"(;к.

• Впервые идентифицирована субпопуляция биполярных малоотростчатых N02 клеток конститутивно экспрессирующих нестин и виментин, находящихся преимущественно в белом веществе, которые вследствие высокой степени включения Вг(Ш в культуре, можно рассматривать как стволовые предшественники.

Результаты, полученные в данном исследовании, являются одним из подтверждений гипотезы о возможности участия N02-^0X014 в процессах нейрогенеза н регенерации нервной ткани.

Научно-практическая значимость работы.

Новые сведения о структурно-функциональной организации N02 клеток позволят определить пути их использования как стволовых клеток для олигодендроцитов и, возможно, нейронов в клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний головного мозга. Кроме того, полученные данные будут способствовать разработке целенаправленного медикаментозного воздействия на N02 клетки с целью их последующей дифференцировки в зрелые нейральные и нейроглиальные клеточные типы.

Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс кафедры цитологии, гистологии и эмбриологии и кафедры нервных болезней и психиатрии с курсом нейрохирургии Мордовского государственного универаггета и служат обоснованием для продолжения исследований патогенетических звеньев заболеваний органов ЦНС, с целью разработки комплексных мероприятий по их лечению и профилактике.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. N02 клетки являются особым типом нейроглиальных клеток головного мозга млекопитающих животных и человека, отличных от астроцитов, олигодендроцитов и микроглии.

2. N02 клетки находятся в тесных взаимоотношениях с нейронами. Аксонные терминал» образуют синаптические контакты на телах и отростках N02 клеток.

3. N02 клетки различаются в сером, где они преобладают в перинейрональной позиции в сравнении с астроцитами и олигодендроцитами, и в белом веществе. При патологии они приобретают признаки реактивных клеток, что проявляется в усилении экспрессии гликопротеина N02 и экспрессии белков промежуточных филаментов - виментина и нестина.

Апробация работы.

Основные положения и результаты работы доложены на: Всероссийской научной конференции «Гистологическая наука России в начале XXI века: итога, задачи, перспективы» (Москва, 2003); научной конференции «Фундаментальные прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей» (Санкт-Петербург, 2004, 2006); научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2004-2007); IX научной конференции молодых ученых (Саранск, 2004); V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004); V международной конференции по функциональной иейроморфолопш «Колосовские чтения» (С.Петербург,

2006); научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003, 2005,

2007); Всероссийской конференции «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 2006); Всероссийском научном конгрессе «В.М. Бехтерев -основоположник нейронаук: творческое наследие, история и современность» (Казань, 2007); IX конгресс международной ассоциации морфологов (Бухара,

2008); Всероссийской конференции «Актуальные вопросы функциональной межполушарной ассиметрии и нейропластичности» (Москва, 2008); VI Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Саратов, 2009); X Конгрессе Международной Ассоциации Морфологов (Ярославль, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 9 публикации в рецензируемых журналах перечня ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 1.28 страницах машинописного текста и состоит из «Введения», «Обзора литературы», «Материала и методов исследования», «Результатов собственных исследований» «Обсуждения полученных результатов», «Выводов» и «Списка литературы», включающего 35 отечественных 143 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 60 рисунками (микрофотографии, электроняограммы) и документирована 4 таблицами и 2 графиками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Работа выполнена на материале, полученном при операциях по поводу медикаментозно-неизлечиммой эпилепсии в медицинском центре Колумбийского университета (Договор о научном сотрудничестве

Мордовского государственного университета и Колумбийского университета). Во всех случаях пациенты были согласны на использование ткани мозга в научных целях. Исследовали гиппокамп и неокортекс височной доли. Всею исследовано 42 случая. В зависимости от патологии гшшокампа выделяли гиппокамп со склерозом (29 случаев) и без склероза (13 случаев). Неокортекс изучен в 28 случаях (8 без склероза гиппокампа, 20 - со склерозом). Возраст пациентов 30.5 ± 18.6 лет (9 - 72 года). Аутопсийный материал (6 случаев) получен в моргах г.Саранска и г.Москвы.

Экспериментальная часть работы была выполнена на крысах самцах Sprague Davvley массой 100 - 200 гр. Для моделирования повреждения, аналогичного наблюдающегося при височной эпилепсии, использовали пилокарпиновую модель. Животным вводили пилокарпин (320мг/кг, интраперитопиалыго) и после 2 часов status epilepticus для остановки судорог вводили диазепам в дозе 5мг/кг интраперитониалыш. Животных забивали на 2, 3, 4 и 5 сугки иод наркозом. Материал фиксировали в 4 % параформальдешде и 0.05% глугаровом альдегиде на 0.1 М фосфатном буфере. Срезы толщиной 40 мкм готовили на вибратоме и хранили в криопротектнвном растворе при -20 С.

Для иммуногистохимического исследования использовали: Первичные антитела против:

• NG2 - монокяональное (1:250, clone 9.2.27, BD PharMingen) и поликлональное (кролик, 1:200, АВ5320, Chemieon);

• PDGF Ra - поликлональное (коза, 1:100; AF-307-NA, R&D Systems);

• ГКФБ - моноклоиальное (1:1000; clone G-A-5. Sigma-Aldrich) и поликлональные (кролик, 1:1000; Z 0334, Dako) и курица (1:250, РСК-51Р, Со vanee);

• глугамин синтетазы (ГК) - моноклоиальное (1:1000, МАВ302, Chemieon) и поликлональное (кролик, 1:200, sc-9067, Santa Cruz);

• кальций-связывающего белка SI00 ß - поликлональное (кролик, 1:600, А 5110, Dako);

• виментииа — моноклоиальное (1:500; М 0725, Dako) и поликлональное (овца, 1:1000, SAVM-AP, Affinity Biologicals Ine);

• нестина - моноклоиальное (1:500; МАВ5326, Chemieon) и поликлональное (кролик, 1:1500, АВ5922, Chemieon);

• CNP - моноклоиальное (1:1000; SMI91, Sternberger Monoclonals Inc.);

• МВР (основного беяка миелина) - поликлональное (кролик, 1: 400, А0623, Dako);

• микротрубочко-ассоциировашгого белка (МАР2) - моноклоналыюе (1:1000, clone НМ-2, Sigma-Aldrich) и поликлональное (кролик, 1:300, АВ5622, Chemieon);

• транскрипционного фактора 01ig2 поликлональное (коза, 1: 100; АГ2418, R&D Systems);

• низко-аффинного нейротротшго рецептора р75'чТК - поликлональное (кролик, 1:500; Promega);

• маркера делящихся клеток К1-67 - моноклональное (1:500, BD PharMingen);

• МСМ2 (mini-chromosome maintainance protein, ответственный за однократное удвоение ДНК в S периоде) - поликлональное (коза, 1: 100; sc-9839, Santa Cruz); Lucifer Yellow - поликлональное (кролик, 1:400, AB 154, Chemicon).

Вторичные антитела:

• биотинизированные: против кролика и мыши (осел, 1:1000, Jackson ImmunoResearch);

• кошлогированиые с флюорохромами: против мыши - Alexa Fluor 488, 594, and 633; против кролика, овцы, козла - Alexa Fluor 488 и 594 (козел или осел, 1:300, Molecular Probes).

Для светомикроскопического исследования использовали ABC метод и визуализацию реакции с диаминобепзидином.

При двойном или тройном окрашивании для конфокальной микроскопии использовали первичные антитела, полученные из разных видов, и соответствующие им вторичные антитела. При двойном окрашивание использовали подкраску с флюоресцентным NISSL реагентом (1:150, Molecular Probes).

Для всех растворов, за исключением промывочных, использовали 0.2 % Triton (при использовании антител против PDGF aR использовали 10 % Triton в солевом фосфатном буфере (0.1 М). В качестве контроля применяли преинкубированные антитела (при наличии антигена) или инкубацию без первичных антител.

Срезы исследовались в конфокальном микроскопе Nikon Е800, BioRad 2000. Количественная оценка числа клеток проводилась на изображениях, полученных при разрешении 1024 х 1024 пиксель (размер изображения 295 х 295 мкм) с толщины 5 мкм с шагом 1 мкм. Для оценки оптической плотности использовали программу Scion Image.

Для иммуноцитохимического электронно-микроскопического исследования использовали вибратомные срезы и ABC метод. Для улучшения проникновения антител использовали метод замораживания-размораживания. Тритон использовали в концентрации 0.01 %. После завершения реакции срезы осмировали, заливали в эпон - аралдит. Ультратонкие срезы окрашивали уранилацетатом. Для рутинной электронной микроскопии использовали также вибратомные срезы и традиционную методику.

Для культивирования срезов мозга и заполнения клеток красителем операционную ткань помещали в холодный раствор исскуственной церебро спиналыюй жидкости (в мМ: 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 СаС12, 1.5 MgCl2, 1.25 NaH2P04, 26 NaHC03, 10 декстрозы). Вибратомные срезы 150 - 250 мкм толщиной культивировали в Neurobasal A/pen-strep/glutamax/B27 supplement (Gibco). Через сутки культивирования добавляли BrdU (5 цМ) на 24 часа.

Срезы использованы для иммуногистохимического исследования, как описано выше, на 5 - 6 сутки.

Для анализа формы клеток и поиска межклеточных связей посредством щелевидных контактов использовали вибратомные срезы толщиной 150 -170 мкм. Клетки заполняли Lucifer Yellow (LY) через стандартные электроды, используемые для пэтч-клампа. После фиксации в 4 % параформальдегиде срезы использовали для иммуногистохимического анализа.

Для статистического анализа применяли t-тест'и 1-way ANOVA для многих сравниваемых групп. При р<0.05 разлитое считалось достоверным.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Морфофункциональиая характеристика NG2-iaieTOk

Наилучшие результаты при иммуношстохимическом выявлении NG2 эишона были получены при использовании антител фирмы BD Pharmingen и коротком времени фиксации (до 6 часов) вне зависимости от наличия или отсутствия глутарового альдегида.

NG2 клетки определялись во всех nca^OBámiux областях мозга (Табл. 1). Следует отметить, %ó в белом веществе интенсивность иммуннореактивностн (ИР) по визуальной оценке было выше в сравнении с серым веществом.

Табл № 1. Распределение N02 клеток в разных отделах гиппокампа и височной коры головного мозга.

Область мозга JSG2 клегки/ 1mm2 Общее число клегок*/1тт2 ING2-клетки/общее число клеток* (%) Перииецро- нальиме NG2/bcc NG2 (%) Перицейро -пальные NG2/ueüpo иы (%)

CAI 63.3+4.0 519.8±41.1 12.2 49.3 13.3

гиннокамна 3

Зубчатая 81.9±5.4 768.9±40.3 10.7 21.5 13.3

извилина

Серое 67.7±2.6 422.3±15.18 16.01 51.53 14.54

вещество 7

неокортекс

Белое 90.7+6.9 1148.6±38.б 7.98

вещество

неокортекс

*- общее число клеток определяли по ядрам при окраске по Нисслю, нейроны не учитывали >

Полученные в настоящем исследовании данные по количеству клеток отличаются от представленных раннее A.Chan et al. (2000) (напр. в белом веществе авторы указывают 140 - 150 клеток/мм"). Это может быть связано с тем, что в работе A.Chan et al. анализ числа клеток проводился по фото, полученным при "слиянии" 30 первичных изображений с шагом 1 мкм (т.е. с

толщины 30 мкм), мы использовали только 5 фото (срезов) при таком же шаге. Перерасчет плотности клеток показывает, что наши данные по плотности клеток даже несколько выше и соответствуют 160 - 170 клеток/мм2, что может быть связано с разными использованными первичными антителами и отличиями в процессе приготовления препаратов.

При иммуногистохимическом исследовании было обнаружено, что N02 клетки имеют маленькое тело и много тонких, слабо разветвленных отростков. В отличие от протоплазм этических астроцитов, что особенно наглядно было показано при наполнении клеток ЬУ, отростки N(12 клеток не содержали маленьких филлаподио-подобных выростов и имели одинаковую толщину на значительном протяжении (Рис. 1). Арборизация отростков клеток во многом зависала от локализации клеток и взаимоотношений с соседними клетками, так в белом веществе отростки были вытянуты вдоль миелииовых волокон, в сером же веществе они чаще имели радиальное направление. Ядра клеток обычно веретеновидной, изогнутой формы.

ЯШШШк!Щ!ШШШШшш щ 'ШШШлш^ЯШШЛ

Рис, !. Различия в морфологии NG2 клеток (а), олигодеыдроцтов (б) и астроцитов (в), выявляемые при заполнении клеток Lucifer Yellow, x34Q.

Представляет интерес, что в сером веществе многие N02 клетки постоянно находились около тел нейронов в качестве клеток-сателлитов. Известно, что олигодендроциты в сером веществе являются также типичными клетками-сателлитами нейронов и при сателлитозе, когда число перинейронаяыгых клеток увеличивается, именно олигодендроциты находятся около нейронов (Ууауап е1 а!., 1993). Сравнение числа N02 клеток и олигодендроцитов, лежащих около нейронов в неокортексе показало, что в наружных отделах (II -Ш слои) неокортекса перинейронально преобладают N02 клетки, а в глубоких (У-У1 слой) - олигодендроциты, однако число олигодендроцитов в нижних отделах значительно выше, в то время как число N02 клеток статистически не различается (Табл. 2).

Табл № 2. Распределение основных гиков нейро!лиальимх клеток в сером веществе неокортекса височной доли головного мезга

Слои NG2 Перинейро Олигодеид Периненрон Астроци Перинейро

серого клетки иальные рпциты альные ты иальные

вевдест (всею NG2 (всего) олигодеидро (веяв) астроцнты

ва мм2) клетки цигы

Н-Ш слои 71.58±4.6 4 39.48±2.89 (55.2%) 46.9i-4.0S 19.33±2.!4 (41.2%) 144,78±19 .73 17.22±1.88 (ТТ.9%)

V-V1 слои Г63.77±3.6 5 30.03±1.64 (47.1%) 126.74А21.1 7 34.56±9.02 (27.3%) 146.86±12 .77 24.68±2.48 (16.8%)

В целом 67.68±4.1 5 34.76i2.27 (51.36%) 86.82±15Л7 26.95±7.!) (31.04%) 145.83±16 .25 20.95±2.18 (14.4%)

Типичной иммуногистохимической реакцией для отростчагых NG2 клеток является постоянная экспрессия PDGF aR (Рис.2), Oligl и S100 р (S300). В сером веществе экспрессия S100 была выше, чем в белом (р<0.05, по оптической плотности интенсивности иммунореактмвности в ядрах) и определялась как в ядре, а также в перикарионе и в отростках NG2 клеток. Следует отметить, что если NG2 и PDGF aR, экспрессируются только в NG2 клетках, то S100 постоянно экспрессируется также в астрогдитах и олигодендроцитах (причем уровень экспрессии может различаться в зависимости от патологических изменений), но отсутствует в микроглии.

Отростчатые NG2 клетки отличаются от других зрелых клеток нейроглии отсутствием экспрессии типичных белков, используемых как маркеры определенных типов нейроглии. Они не экпрессиругот маркеры типичные для астроцитов (белок промежуточных филаментов ГКФБ и глутамин ситетазу (ГС) - фермент, ответственный за превращение глутамата в глутамин, имеющий огромное значение в метаболизме глутамата. Они также не экспрессируют астроцит специфичные глутаматные транспортеры ЕААТ2 (GLT-1) и ЕААТ1 (GLAST) (Hamilton et al„ 2010). Кроме того они не экспрессируют плазмалеммальный белок CD44 и аВ-кристаллин (Crystalline), типичные для фиброзных и реактивных астроцитов.

Рис. 2. Иммуногистохимическая реакция на N02 (а) и РООР аИ (б). Серое вещество неокортекса. Эндотелий капилляра экспрессирует N02. Конфокальная микроскопия, х 340.

N02 клетки не экспрессируют маркеры зрелых олигодендроцитов СЫР, Р1..Р и МВР. В отличие от зрелых олигодендроцитов, N02 клетки также не экспрессируют аВ-кристаллин, белок, впервые идентифицированный в хрусталике и относящийся к семейству низкомолекулярных белков теплового шока. В нормальной ткани мозга аВ-кристаялин экспресеируется в олигодендроцитах и фиброзных астроцитах.

Сближает N02 клетки зрелого мозга с олигодендроцитарным нейроглиальным ростком конститутивная экпрессия транскрипционного фактора 01ig2, характерного для охшгодендрацитарной глии, а также их перинейрональная локализация.

N02 клетки отличаются от микроглми отсутствием экспрессии характерных маркеров С068 и £N-3. Следует отметить, что до форме тела и арборизации отростков N02 клетки похожи на микроглию. У грызунов (мьши и крысы) при нейротоксическом поражении нейронов (введение каиновой кислоты) активированная микроглия способна экспрессировать N02 (Ви е! а!., 2001). Таким образом, в мозге человека, также как и в мозге грызунов, N02 клетки принципиально отличаются от других типов нейроглии по морфологии и иммунному статусу.

Следует отметить, что N02 клетки часто определялись около кровеносных сосудов. В отличие от перицитов, которые также экспрессируют N02, N02 клетки имеют многочисленные отростки и экспрессируют РВО.Р аЛ (для перицитов характерна экспрессия РООР |Ж).

При электронно-микроскопическом исследовании показано, что N02 клетки имеют характерную ультраструктуру ядра и цитоплазмы. Ядра -вытянутой формы с дисперсно распределенным хроматином, малый объем цитоплазмы иерикариона с обычными органеллами. Иммуинореактивный элек'гронно-шютный материал определялся преимущественно на поверхности плазмалеммы (Рис.3).

Рис.З. Иммуиоцитохимическая реакция на N02. Иммунопозитивные N02 клетки, расположенные в нейроииле. Продукт реакции локализуется на поверхности плазмалеммы. а) х 12500, б) х 36000.

Я

Перинейронально расположенные NG2 клетки, как правило, контактируют на значительном протяжении с нейронами, с помощью простых соединений без участков специализации мембран, за исключением небольшого числа коротких контактов типа fascia adherence с отложением осмиофильного материала на контактирующих мембранах. Отростки NG2 клеток часто находились в контакте с прс- и постсинаптическими отделами синапсов.

Необходимо отметить, что идентификация №С2-клеток. при рутинной электронной микроскопии практически безошибочна именно тогда, когда эти клетки занимают перинейрональную позицию. Данные факты согласуются с данными, полученными Peters (2004). Идентификация клеток, лежащих в нейропиле вне контакта с нейронами, во многих случаях затруднительна и требует использования нммуниогистохимического контроля.

В работе впервые показано, что на телах и на отростках NG2 клеток в мозге человека имеются синалтические контакты с типичной улыраструктурой пресинантических отделов (Рис. 4).

- , а

.' . Ж f

• JI

mmf Z " ' ' t

ш 7 . *

. "

111 „- У

* » Ш ' V

таШ' ■III'

I я

Рис.4, Локализация синаптических контактов на отростке (а) и теле (б) NG2 клетки, (а) иммуногистохнмическая реакция на NG2. (б) рутинная электронная микроскопия, (а) х 26000; (б) х 18000.

Подобные синаитические контакты на отростках NG2 клеток были показаны ранее только в мозге крысы (Bergles et al., 2000; Lin, Bergles, 2004; Jabs et ai., 2005; Lin et al., 2005); по мнению авторов, они имеют значение для регуляции диффереяцировки NG2 клеток в направлении олигодендроцитов. Следует отметить, что NG2 клетки - единственный вид нейроглиалышх клеток, находящихся в синашическом контакте с нейронами, что и определило их название как еинаптоциты и синантоциты.

В отличие от астроцитов и олигодендроцитов, имеющих большое число щелевидных контактов, связывающих их друг с другом и с соседними клеетками, NG2 клетки не связаны этими каналами с соседними клетками. В

и

частности заполнение NG2 клеток LY не приводило к проникновению красителя в соседние клетки.

В белом веществе (неокортекса и гиппокампа) и в зубчатой извилине гиппокампа постоянно обнаруживались небольшие вытянутые биполярные клетки с высокой иммунореактивиостью на белки промежуточных филаментов - нестин и виментии. Более 60 % этих клеток экспрессировали NG2 (Рис.5). Такие биполярные NG2 клетки, в отличие от о'фостчатых клеток, не экспрессировали PDGF aR и S100, также как и ГКФБ и низко аффинный нейротропный рецептор p75NTR (р75).

Следует отметить, что ранее, при исследовании рассеянного склероза, были выявлены две популяции NG2 клеток — многоотростчатъге и биполярные (Chang et al., 2000), последние идентифицировались по форме тела (при окраске на NG2) и экспрессии р75. По нашим данным биполярные виментинЬ'нестин-1/К02+ клетки не экснрессируют р75, различие в результатах может быть связано как с разной патологией изученной в работах, так и с использованными первичными антителами.

Рис.5. Биполярная неетин+ и NG2+ клетка в белом веществе вблизи гиппокампа. (а) нестин, (б) NG2. Два канала: (а) красный и (б) зеленый цветного фото, полученного в RGB формате. Конфокальная микроскопия, х 340.

Полученные в работе дашше и известные сведения: о динамике дифференцировки олигодендроцитов позволяют рассматривать биполярные М02+/нестин+/виментин+ клетки как перинатальные предшественники, которые еохранаются и в зрелом мозге. Интересно, что области, где находятся биполярные К!С2+/нестин17виментин) клетки, содержат большое число стволовых клеток, которые выделятся с помощью FACS (флюоресцентная сортировка клеток) при маркировании на шмзмалеммальный гликопротеяд А2В5 (Nîmes et ai., 2003). Имеющиеся в настоящее время коммерческие и оригинальные антитела против А2В5 не

дают удовлетворительные результаты на срезах ткани, что не позволяет провести идентификацию А2.В5+ стволовых предшественников в in situ.

Инкубация срезов коры и гишюкампа в условиях культуры, ткани с добавлением маркера делящихся клеток BrdU показала, что биполярные Ж}2-клетки обладают высокой активностью включать BrdU (Рис.6). Это может свидетельствовать, что эти клетки являются стволовыми предшественниками. Прямое доказательство этого может быть получено с использованием ретровнрусов и постоянным, моииторированием клеток в культуре срезов.

Рис. 6. Включение ВгсШ (б) в нестин+ (а) клетки. Переживающий срез неокортекса в культуре ткани. Конфокальная микроскопия, х 340.

Наличие нескольких видов клеток, экспрессирующих NG2, не позволяет использовать данные western blotting для количественного сравнения протеина в разных областях мозга. Так, несмотря на явные различия в иммуногистохимических результатах в белом и сером веществе (также как и в скяерозированных участках гнгшокампа) результаты western blotting не показали различий в сравниваемых областях.

2. Реактивные МС2-клетки при патологии.

В некоторых случаях в гипнокампе без склероза (4 из 13 - 30 %) и со склерозом (9 из 29 -31 %) были обнаружены NG2 клетки экснрессирующие высокий уровень виментина и нестина (Рис. 7). Такие NG2 ¡слетки были обнаружены и в неокортексе (8 из 28 случаев - 28.7 %) вне зависимости от патологии (склерозированный или несклерозированньш) гишюкампа.

Виментин и нестин, представители семейства промежуточных филаментов, типичны для незрелых нейральных предшественников. Экспрессия виментина и нестина является характерным признаком реактивных астроцитов и является наряду с другими маркерами значимым критерием состояния астроцитов при патологии. По аналогии с астроцитами N02 клетки бьши условно названы реактивными.

Рис. 7. Реактивные N02 клетки в хилусе экспрессируют нестин.

Конфокальная микроскопия. (а) N02, (б) нестин. х 340.

В гиппокампе наиболее типичной локализацией реактивных N02 клеток является зубчатая извилина, где в 20 % случаев они наблюдались без сопуствующей явной реакции со стороны астроцитов (отсутствие экспрессии несшна, виментина, обычная экспрессия Г'КФБ). Следует отметить, что у молодых больных (до 15 лег) в зубчатой извилине кроме отростчатых N02 клеток постоянно обнаруживалось много биполярных N02 клеток значительно утолщенных и удлиненных. Обычно такие клетки определялись в несклерозированном гиппокампе с незначительной редукцией числа нейронов. Явной патологии со стороны олягодендроцитов не отмечалось, число их но визуальной полуколичественной оценке не было снижено.

Кроме экспрессии нестина и виментина реактивные N02 клетки отличались высокой иммунореактивностью на N02 и РООР аИ. антитела к которым хорошо контрастировали и выявляли большое число разветвленных отростков клеток. Многие (90 %) реактивные N02 клетки экспрессировали МСМ2, экспрессия данного бежа в реактивных астроцитах не была обнаружена. Экспрессия 8100 р была несколько снижена.

При ультраструктурном исследовании реактивные N02 клетки отличались набухшими отростками с просветленным матрикеом и пучками филаментов.

Экспериментальные данные свидетельствуют, что NG2 обладают высокой способностью включать BrdU во многих моделях патологии мозга (Zai, Wrathall, 2005; Tatsumi et al., 2005). Поэтому представляло интерес определить способность реактивных NG2 клеток к митотическому делению. При этом в работе использовали два подхода: анализ препаратов с окраской по Нисслю (что позволяло идентифицировать митотические хромосомы) и с использованием KÍ67 - маркера, характерного для клеток, находящихся в постсинтетическом периоде жизненного цикла. Действительно, в зубчатой извилине наряду с реактивными NG2 клетками были обнаружены митогически делящиеся NG2+/hccthh+ клетки и NG2+ клетки, иммунопозитивные на KÍ67. Одиночные митотические NG2 клетки были обнаружены также и в неокортексе, в основном в участках, где находились реактивные клетки.

Интересно, что все обнаруженные митотические NG2 клетки имели достаточно длинные отростки. В этой связи следует- отметить, что, но крайней мере, в части NG2 клеток, возможно, происходит только деление ядер, без цитокинеза. Косвенным подверждением этому являются обнаруженные двуядерные NG2 клетки, часто встречающиеся в зубчатой извилине и неокортексе.

Некоторые отростчатые и биполярные реактивные NG2 клетки эксирессировали р75. Установить различие в иммунном статусе между клетками эксирессирующими и неэкспрессирующими р75 не удалось. Можно отметить, что низко-аффинный рецептор нервного фактора роста р75 привлекает большое внимание в последнее время и, как полагают, имеет большое значение как в развитии и росте клегок нервной системы, так и в их гибели (Sandvig el al., 2004; Nykjaer, Willnow, 2005; Yamashila et al., 2005).

Реактивные NG2 клетки определялись не только в хилусе гигшокампа, но и в других отделах височной доли (некортекс, аммонов рог (зоны CAI — САЗ) и субикулум) однако только в локальных участках они обнаруживались одновременно с реактивными астроцитами. Причины появления реактивных астроцитов и NG2 клеток в локальных областях мозга не установлены, но они не связаны с использованием поверхностных или глубоких электродов в предоперационном периоде. Можно предполагать, что ишемическое повреждение или фокальное перевозбуждение нейронов в результате эпилептического приступа может являться причиной локальных изменений нейроглни.

Следует отметить, что в мозге грызунов (мышей и крыс - традиционных экспериментальных видов животных современной нейробиологии) NG2 клетки не зкспрессируют белки промежуточных филаментов в контроле. При патологии в использованной нами пилокарпиновой модели эпилепсии NG2 клетки экспрессировали белки виментина, нестина и даже ГКФБ. Экспрессия этих белков рассматривается некторыми авторами как свидетельство возможности транеднфференцировки NG2 клеток в астроциты (Alonso, 2006). По аналогии с реактивными астроцитами, мы полагаем, что такие изменения в фенотипе клеток отражают их реакцию на стрессовые повреждения.

Интересно, что многие активированные NG2 клетки проявляли митотическую активность.

Ультраструктурный анализ NG2 клеток в мозге обезьян «Макака резус» также не выявил наличие филаментов, что даже позволило считать отсутствие филаментов как один из характерных признаков этого типа нейроглии (Peters, 2004). Данное обстоятельство определяет сложности анализа регуляции экспрессии генов в NG2 клетках при патологии. В связи с этим в настоящем исследовании был использован операционный материал для выяснения закономерностей экспрессии промежуточных филаментов в NG2 клетках.

В исследованном материале было изучено несколько случаев с использованием методики наложения поверхностных электродов (среднее время наложения одна неделя) и с глубокими электродами, проникающими в гиппокамп (операция в среднем через месяц после введения электродов). В первом случае при легкой травматизации и коротком времени после нее (5 и 7 дней) в неокортексе были обнаружены реактивные астроциты с повышенной иммунореактивностью на ГКФБ, S100 р и экспрессирующие виментин, однако экспрессии нестина не отмечалось. NG2 клетки, напротив, экспрессировали высокий уровень нестина и в значительно меньшей степени, чем астроциты экспрессировали виментин.

При использовании метода применения глубоких электродов, проникающих в ткань гиппокампа, в месте их введения отмечалась выраженная реакция со стороны астроцитов - большинство клеток соответствовало большим гемистоцитическим астроцитам,

экспрессирующим высокий уровень ГКФБ, киментииа, нестина, S100 (5, кристаллита и Hsp27. При этом NG2 клетки экспрессировали высокий уровень нестина и виментина одновременно.

Таким образом, сравнение полученных при этом результатов позволяет сделать предварительное заключение, что NG2 клетки являются высокореактивными и закономерности активации генов для синтеза промежуточных филаментов в астроцитах и NG2 клетках отличаются. Следует' отметить, что, несмотря на большое число генетических конструкций, использующих экспрессию определенных генов под промоуторами нестина и ГКФБ, конкретные механизмы, регулирующие экспрессию промежуточных филаментов в нейроглии пока не известны. Нельзя не отметить и значительно более высокую степень иммунореактивности на NG2 клеток, расположенных в области глиоза в случаях со склерозом гиппокампа. Интересно, что NG2 клетки в областях склероза в зонах CAI - САЗ не экспрессировали нестин/виментин. Это может свидетельствовать о транзиторном характере экспрессии этих промежуточных филаментов в реактивных NG2 клетках.

В настоящее время мы не смогли получить однозначные результаты при western blotting, по-видимому, вследствие того, что трансмембранный гликопротеин NG2 экспрессируется также многим периваскулярньши

перицитами и это нивелирует разницу в количестве протеина в склерозированной и несклсрозированной областях.

3. Заключение.

Проведенное исследование впервые показало, что популяция NG2 клеток в мозге человека является самостоятельной группой нейропган, которую можно определить как пятый клеточный элемент нервной ткани. Вместе с тем представители этой клеточной популяции имеют много характерных признаков, свойственных представителям

олигодендроцитарного ростка. Следует отметить, что, несмотря на огромные успехи в познании закономерностей развития нервной системы, вопрос о природе и потенциях стволовых или полусгволовых нейралышх клеток остается довольно спорным (Morshead, 2004; Chipperfield et al., 2005; Götz, Barde, 2005; Lorber В., 2006). Тем не менее, накопленные данные позволяют рассматривать NG2 клетки как "близкие родствешгики" олигодеидроцитов. Какова функция NG2 клеток в зрелом мозге окончательно не выяснено, являются ли они только "дремлющими" предшественниками зрелых форм клеток или выполняют неизвестную еще функцию? В этой связи следут отметить различия между NG2 клетками в сером и белом веществе. Как показано в проведенном исследовании NG2 клепси в сером и белом веществе различаются по иммунному статусу и только в белом веществе находятся биполярные клетки. По электрофизиологическим данным клетки серого и белого вещества также отличаются друг от друга, в частности только NG2 клетки серого вещества способны к генерации небольших потенциалов действия (Chittajallu et al., 2004).

Стволовые/полустволовые потенции NG2 клеток показаны только для клеток белого вещества (Belachew el al., 2003; Aguirre, Gallo, 2004; Emsley et al., 2005). Таким образом, имеющиеся в настоящее время данные позволяют считать, что только NG2 клетки белого вещества сохраняют стволовые потенции.

'Грансгениые (knockout) мыши, не экспрессирующие трансмембранный гликопротеид NG2, не имеют явных признаков нарушений в развитии и в строении органов (Grako et al., 1999), детальный анализ нейроглии в нервной ткани данных животных пока не был проведен.

В работе впервые показано, что NG2 клетки являются высоко реактивными и отвечают даже на механическую травму во многом аналогично асгроцитам. Сравнительный анализ NG2 клеток в склерознрованных и несклерозированных областях гишгокампа свидетельствует, что реактивные изменения NG2 клеток являются временным! событиями в судьбе клеток.

Выводы.

1. Имму но гистохимическое исследование показало, что NG2 клетки составляют особую популяцию нейроглии, отличную от зрелых астроцитов, олигодеидроцитов и микроглии и относятся к олигодендроцитариому ростку

нейроглии. NG2 клетки экспрессируют плазмалемальные белки NG2 и PDGF aR специфичные только для этого вида клеток. Они не экспрессируют типичные маркеры астроцитов: Г'КФБ, глутамин ситетазу и белки глутаматных транспортеров ЕААТ1 (GLAST) и ЕААЕ2 (GLT-1), а также маркеры зрелых олигодепдроцитов CNP, МВР, PLP. Одновремегшо наряду с олигодендроцитами они экспрессируют транскрипционный фактор олигодендцитарного ростка OHg2. Они отличаются ог микроглии отсутствием экспрессии специфических маркеров этих клеток LN-3, CD68.

2. NG2 клетки наряду с астроцитами и олигодендроцитами экспрессируют кальций-связывагощий белок S100 ß, степень экспрессии которого достоверно различна в сером и белом веществе.

3. Выделено две популяции NG2 клеток - многоогростчатые, экспрессирующие PDGF Ra и S10Ü ß. и биполярные NG2 клетки конститутивно экспрессирующие нестин и виментин. Биполярные NG2 клетки находятся только в белом веществе и хилусе гиппокампа и отличаются высокой степенью включения BrdU в культуре ткани.

4. NG2 клетки отличаются ио морфологии на свето-и электронно-микроскопическом уровнях от других клеток нейроглии и являются основными перинейрональньгми клетками в сером веществе головного мозга.

5. NG2 клетки являются единственным типом нейроглии, находящейся в синаптической связи с нейронами, аксоны которых образуют синапсы на телах и отростках клеток.

6. NG2 клетки являются высокореактивными клетками, что проявляется в экспрессии нестина и виментина, часть реактивных клеток экспрессирует низко-аффинный нейротропный рецептор p75NTR. Кроме того, NG2 клетки отличаются высокой мптотической активностью.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Результаты работы являются теоретическим обоснованием возможного использования NG2 клеток в качестве стволовых или полустволовых клеточных элементов для олигодепдроцитов и, возможно, нейронов в клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний головного мозга.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Сосунов С.А., Кругляков H.H., Ховряков A.B., Шиханов Н.П., Круглякова Е.П., Ихсан Ваэль. Иммуногнстохимические особенности распределения маркеров нейронов головного мозга млекопитающих в онтогенезе//Морфология. -2003. -Т. 124, № 5. -С. 73.

2. Круглякова Е.П., Ихсан Ваэль, Ховряков A.B., Шиханов H.H., Сосунов С.А., Сосунов A.A. Характеристика NG2-iaieTOK в гиппокампе человека//Морфология. -2004. -Т. 126. № 4. -С. 63-64.

3. Круглякова ЕЛ., Сосунов A.A., Шиханов Н.П., Ховряков A.B., Ихсан Ваэль. Экспрессии коннексинов 43 и 30 при реактивных

изменениях астронитов//Морфологические ведомости (приложение). -2004. -№ 1-2. -С. 56.

4. Круглякова Е.П., МакКхан Г. II, Шиханов Н.П., Ихсан Ваэль, Ховряков A.B., Сосунов A.A. Иммуногистохимическая идентификация нейральных предшественников в гишюкампе зрелого мозга//Материалы научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гис тологии. Гистогенез и регенерация тканей». -Санкт-Петербург. -2004. -С.33-34.

5. Круглякова Е.П., Ховряков A.B., Шиханов Н.П., МакКханн Г.М. II Ихсан Ваэль, Сосунов A.A. Нестин-экспрессирующие клетки в пшнокампе человекаУ/Морфология. -2004. -Т. 126. ЛЬ 6. -С. 19-25.

6. Круглякова Е.П., МакКханн Г., Сосунов С.А., Шиханов H.H., Ховряков A.B. NG-2 клетки в головном мозге человека/Материалы научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» -Москва, 2005.-. Альманах. -Выпуск 21С. 70-72.

7. Kruglyakova Е.Р., Khovryakov A.V., Shikhanov N.P., Mckhann G II., Vael Ikhsan, Rruglyakov P.P., Sosunov A.A., Nestin-expressing cells in the human hippocampus//Neuroscience and Behavioral Physiology. -2005. -V. 35, № 9. -3. 891-897 (7).

8. Круглякова Е.П., МакКхан Г.-II, Медведев Д.И., Ховряков A.B., Шиханов Н.П., Сосунов A.A. NG 2-клетки и их роль в процессах нейрогенеза в головном мозге человека. Материалы научного совещания «Актуальные проблемы учения о тканях». Санкт-Петербург. 2006. С. 54.

9. Подрезов М.А., Круглякова Е.П., Сосунов С.А., МакКхан Г.-П, Шиханов И.П., Ховряков A.B., Сосунов A.A. Исследование уровня экспрессии транспортеров глутамата в протоилазматических астроцитах головного мозга человека в зависимости от степени их глиоза. Материалы Всероссийской конф. «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга-2006». Изд-во «Информкнига». Москва. 2006. С. 240-244.

10. Ховряков A.B., Круглякова Е.П., Подрезов М.А., Ерёмина И.З., Саврова О.Б., Шиханов Н.П., Сосунов A.A. Нестин-экспрессирующие клетки в головном молу (иммуногистохимическое исследование). Морфология. 2006. Т. 130. № 5. С. 89.

11. Сосунов A.A., МакКханн Г-П, Подрезов М.А., Ерёмина И.З., Ховряков A.B., Шиханов Н.П., Наумова И.Н., Подрезова Е.П., Кругляков ПЛ. Иммуногистохимическое исследование деления реактивных астроцитов с помощью аномальных митозов. Неврологический вестник. 2007. Том XXXIX. Вып. 1. С. 237-238.

12. Ховряков A.B., Балашов В.П., Подрезова E.IL, Гущина C.B., Семибратова Н.В. Шиханов Н.П., Сосунов A.A. Ультраструктурные изменения ненроглиальных клеток некоторых отделов головного мозга экспериментальных животных при стрессе. Морфология. 2008. Т. 133. № 3. С. 59-60.

13. Подрезова Е.П., Сосунов A.A., МакКханн Г-Н, Майкелл Ч.Б., Ховряков A.B., Гущина C.B., Шиханов Н.П., Карпова A.B., Кругляков ПЛ. Активация mTOR-ферментного каскада в нейронах и нейроглни характерна для стрессорных поражений головного мозга. Морфология. 2008. Т. 133. № 4. С. 88-89.

14. Кругляков П.П., Подрезова Е.П., Сосунов С.А.,Ховряков A.B., Шиханов Н.П., Гущина C.B., Нуянзина В.А., МакКханн Г.-Н, Сосунов A.A. NG2-KJieTKii - особый тип макроглиальных элементов как возможный источник нейральных предшественников в головном мозге человека. Морфология. 2009. Т. 136. № 4. С. 84.

15. Сосунов A.A. МакКханп Г.-II, Кругляков П.П., Подрезова Е.П., Ховряков A.B., Шиханов Н.П., Утквяа-Сосуиова И.В., Подрезов М.А., Балашов В.П., Кругляков П.П. Патологические митозы астроцитов при развитии глиоза. Морфология. 2009. Т. 136. № 4. С. 129.

16. Кругляков П.П., Сосунов A.A., МакКхан Г.-И., Кузнецов C.JL, Балашов ВН., Уткина-Сосунова И.В., Ву Ш., Шиханов H.H., Ховряков A.B., Подрезова Е.П. Аномалии митоза и полиплоидия типичны для реактивных астроцитов. Вопросы морфологии XXI века. С.-Петербург. 2010. С. 204-207.

17. Кругляков П.П., Сосунов A.A., Мак-Кхан Г.-Н, Кузнецов СЛ., Подрезова Е.П., Шиханов Н.П., Гущина C.B., Подрезов М.А. Нарушении глутамат-глутаминового астроцит-нейронного цикла в склеротических/глиотяческнх астроцитах головного мозга человека - одна из возможных причин перевозбуждения и гибели нейронов. Морфология. 2010. Т. 137. № 4. С. 106-107.

Типография «Принта» Заказ № 28902 от 25.05.2011 Тираж 100 шт.