Неинвазивное определение концентрации каротиноидов β-каротина и ликопина в коже человека и других био-системах методом резонансной спектроскопии комбинационного рассеяния света

Дарвин, Максим Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Неинвазивное определение концентрации каротиноидов β-каротина и ликопина в коже человека и других био-системах методом резонансной спектроскопии комбинационного рассеяния света
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Неинвазивное определение концентрации каротиноидов β-каротина и ликопина в коже человека и других био-системах методом резонансной спектроскопии комбинационного рассеяния света"

На правах рукописи

004614125 ДАРВИН Максим Евгеньевич

НЕИНВАЗИВНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ КАРОТИНОИДОВ р-КАРОТИНА И ЛИКОПИНА В КОЖЕ ЧЕЛОВЕКА И ДРУГИХ БИО-СИСТЕМАХ МЕТОДОМ РЕЗОНАНСНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ СВЕТА

Специальность: 03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

2 5 НОЯ 2010

Берлин -2010

004614125

Работа выполнена на кафедре физиологии кожи отделения дерматологии, венерологии и аллергологии медицинского университета «Шаритэ», г. Берлин, Германия

Научные руководители: кандидат физ.-мат. наук,

профессор Ю. Ладеманн

доктор физ.-мат. наук, профессор С.А. Гончуков

Официальные оппоненты:

кандидат физ.-мат. наук, доцент А.В. Приезжев

доктор физ.-мат. наук, профессор Ю.П. Синичкин

Ведущая организация:

Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН

Защита состоится «14 » декабря 2010 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 212.243.05 в СГУ им. Н. Г. Чернышевского по адресу: 410012, г.Саратов, ул. Астраханская, д.83, 3-й корпус СГУ, аудитория 34 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СГУ. Автореферат разослан " 04 " ¿УМ 2010 г.

<ь

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.243.05 доктор физико-математических наук, старший научный сотрудник

В.Л. Дербов

Актуальность исследования

Лазерная спектроскопия комбинационного рассеяния света (КР) и резонансная спектроскопия комбинационного рассеяния света (РКР) являются одними из эффективных и широко используемых методов регистрации и исследования биологических молекул. К основным преимуществам методов КР и РКР спектроскопии относится их избирательность, быстрота измерений и пригодность для исследования жидкостей, растворов, газов, пленок, поверхностей, волокон, твердых веществ и кристаллов. Кроме того, количества веществ, необходимые для исследования этим методом, ограничены лишь поперечными размерами сфокусированного лазерного луча. Узкая спектральная ширина линии лазерного возбуждения и использование многоканальной системы регистрации позволяет измерять КР спектры в диапазоне от 10 до 4000 см"1. Вместе с тем, высокая плотность мощности лазерного излучения может обеспечить получение информативных спектров даже при небольших концентрациях исследуемого вещества. При работе с биохимическими объектами, методы КР и РКР спектроскопии позволяют получать информацию о переходах между колебательными энергетическими уровнями, т.е. о молекулярных колебаниях молекулы. Таким образом, спектр КР молекулы представляет собой по сути её мгновенный снимок. Интенсивность пика КР при этом прямо пропорциональна концентрации исследуемых молекул.

Свободные радикалы (СР) это атомы или молекулы, имеющие на внешней оболочке один или несколько неспаренных электронов. Это делает СР химически активными, поскольку радикал стремится либо вернуть себе недостающий электрон, отняв его от окружающих молекул, либо избавиться от «лишнего» электрона, отдавая его другим молекулам. В организме человека СР реагируют со всеми биологическими молекулами, встречающимися на их пути, нанося им повреждения. В человеческом организме в норме оксидантные и анти-оксидантные процессы сбалансированы. Это означает, что негативное действие СР на биологические молекулы организма сведено к минимуму. Равновесие может быть нарушено в результате воздействия на организм различных факторов, таких как УФ, ИК и рентгеновское излучения, болезни, стрессы, медикаменты, косметические продукты и образ жизни человека.

Кожа человека, как граничный орган между окружающей средой и организмом, содержит большое количество антиоксидантов, таких

как каротиноиды, витамины, энзимы, и другие. Антиоксид анты играют решающую роль в поддержании окислительно-восстановительного баланса в организме, а также в защите организма от повреждений, вызванных свободнорадикальным окислением. Уменьшение уровня концентрации антиоксидантов в коже приводит к окислительно-восстановительному дисбалансу, что, в конечном счёте, может привести к развитию окислительного стресса и необратимым повреждениям биоткани.

Антиоксидантные свойства каротиноидов известны по т-уИго измерениям. Очевидно, что несомненный интерес представляют т-у/уо измерения концентрации каротиноидов в коже человека в зависимости от воздействия на неё стресс-факторов, которые всегда сопровождаются образованием свободных радикалов. Питание, богатое различными антиоксидантами, наоборот, приводит к увеличению уровня концентрации антиоксидантов в организме человека. Получение информации об усваиваимости каротиноидов организмом, о механизмах их транспорта и накопления в органах человека, особенно в коже, а также о кинетике восстановления антиоксидантов после воздействия стресс-факторов, является чрезвычайно актуальным.

До недавнего времени /и-у/уо измерения каротиноидов в коже не представлялись возможными из-за отсутствия метода, обеспечивающего высокую чувствительность и неинвазивность. Спектроскопия РКР в свою очередь обладает рядом существенных преимуществ среди существующих неинвазивных методов измерения каротиноидов в коже человека.

Представленная работа посвящена разработке и апробации не-инвазивного двухволнового метода, в основе которого лежит спектроскопия РКР света, для определения концентрации каротиноидов (3-каротина и ликопина в коже человека /н-у/Ч'о.

Перспективность этого направления исследований очевидна не только для лучшего понимания физиологических процессов в коже, но и для быстрого определения состояния антиоксидантной системы организма в целом. Помимо прямых измерений на коже, особый интерес представляет определение концентрации каротиноидов в организме при их использовании в медицине, косметологии, в пищевой промышленности, животноводстве, и везде, где возникает вопрос о нарушения окислительно-восстановительного баланса.

Цель и задачи диссертационной работы

Целью диссертационной работы является разработка комплексного подхода для решения задачи определения абсолютной концентрации каротиноидов в коже человека и животных, а также в любых других образцах.

В диссертационной работе решаются следующие задачи:

1. Создание лазерного двухволнового РКР спектрометра с целью проведения быстрых неинвазивных измерений каротиноидов в коже человека и других объектах.

2. Выбор источника излучения, оптимизация оптической схемы РКР спектрометра, размера возбуждающего лазерного пучка на коже, плотности мощности зондирующего лазерного излучения и канала светосбора.

3. Разработка методики измерения каротиноидов в коже человека.

4. Разработка методики обработки спектров РКР.

5. Разработка алгоритма селективного определения каротиноидов Р-каротина и ликопина в коже человека.

6. Использование эффекта фотообесцвечивания («выцветания флуоресценции») для повышения чувствительности регистрации низких концентраций каротиноидов в коже человека.

7. Определение абсолютной концентрации каротиноидов в коже человека.

Научная новизна

1. Предложен, реализован и апробирован неинвазивный метод измерения концентрации каротиноидов Р-каротина и ликопина в коже человека, в основе действия которого лежит резонансная спектроскопия комбинационного рассеяния света при двухволно-вом лазерном возбуждении.

2. Предложен и реализован метод повышения чувствительности регистрации низких концентраций каротиноидов кожи, основанный на использовании эффекта фотообесцвечивания («выцветания флуоресценции»).

3. Впервые подтверждено в /и-у/ус» измерениях, что каротинои-ды, выполняя антиоксидантную функцию в коже человека, разрушаются в результате действия таких факторов как УФ, ИК, рентгеновское излучения, стресс, болезни, употребление больших доз алкоголя, физические упражнения высокой интенсивности. Опре-

делены кинетики реакции каротиноидов на действие соответствующих стресс-факторов.

4. Впервые продемонстрировано косвенно, по деградации каротиноидов, измеренной in-vivo методом резонансной спектроскопии КР, что ИК-А облучение кожи человека, производит в ней свободные радикалы. Показано, что спектр образования свободных радикалов лежит преимущественно в диапазоне длин волн от 780 нм до 1500 нм. Эта гипотеза в дальнейшем была подтверждена прямыми измерениями образования свободных радикалов в коже методом электронного парамагнитного резонанса.

5. Впервые измерено «сезонное возрастание» уровня концентрации каротиноидов в коже, выражающееся в увеличенной концентрации каротиноидов в летние и осенние месяцы по сравнению с зимними и весенними месяцами. Средняя величина «сезонного возрастания» была определена равной 1.26±0.21.

6. Впервые проведены измерения концентрации каротиноидов в поте человека. Этот результат является фундаментальным для дальнейшего понимания кинетики изменения концентрации каротиноидов в коже человека и физиологии кожи.

7. Показано, что метод резонансной спектроскопии КР может использоваться для оптимизации и стабилизации антиоксидантно-го состава кремов, пищевых добавок и продуктов питания.

8. Обобщение полученных результатов даёт право утверждать, что каротиноиды являются веществами-маркерами антиоксида-тивного потенциала кожи человека.

9. Впервые предложен метод устранения ладонно-подошвенного синдрома - побочного эффекта, часто проявляющегося при лечении раковых больных препаратом доксорубицин (doxorubicin), в основе действия которого лежит нейтрализация доксорубицин-индуцированных свободных радикалов на поверхности кожи при помощи крема, содержащего сбалансированный «коктейль» антиоксидантов.

Практическая ценность

Созданная экспериментальная установка, в основе действия которой лежит метод резонансной спектроскопии КР света с двух-волновым лазерным возбуждением, позволяет проводить селективные неинвазивные измерения каротиноидов в коже человека и жи-

вотных ш-у/уо, а также т-хИго измерения в коже, растворах, суспензиях и твёрдых телах.

Измерение кинетики изменения концентрации каротиноидов даёт информацию о количестве образующихся свободных радикалов в исследуемом образце (кожа, медикаменты, косметические средства, продукты питания, и т.д.) и, таким образом, позволяет судить количественно о величине действия стресс-фактора на образец.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Метод спектроскопии РКР является оптимальным среди существующих неинвазивных методов для определения концентрации каротиноидов в коже человека и проведения измерений по определению антиоксидантного потенциала кремов и продуктов питания. Использование двухволнового метода на длинах волн 488 нм и 514.5 нм позволяет раздельно определять содержание каротиноидов р-каротина и ликопина в коже человека. Использование метода фотообесцвечивания («выцветания флуоресценции») повышает чувствительность регистрации низких концентраций каротиноидов в коже человека.

2. В коже человека ш-у/уо каротиноиды нейтрализуют свободные радикалы и разрушаются таким образом, что уменьшение концентрации каротиноидов происходит в течение первых 100 минут в зависимости от действующего стресс-фактора и его интенсивности. Восстановление - более длительный процесс, занимающий 1-3 дня и зависящий от питания и антиоксидантного потенциала кожи человека.

3. Доказано, что, несмотря на незначительную энергию квантов, ИК излучение производит в коже человека свободные радикалы. Спектр образования свободных радикалов лежит преимущественно в диапазоне длин волн от 780 нм до 1500 нм.

4. Концентрация каротиноидов в коже человека распределена неравномерно и имеет максимум в верхнем слое эпидермиса, т.е. в роговом слое. Далее концентрация уменьшается экспоненциально вглубь кожи и достигает постоянного минимального значения на глубине 14-20 мкм. Насыщение рогового слоя кожи каротиноидами обусловлено спецификой процесса потоотделения, при котором каротиноиды выходят на поверхность кожи с потом и, затем, впитываются внутрь.

5. Побочное действие препарата доксорубицин, вызывающего «ладонно-подошвенный синдром» может быть эффективно предотвращено нанесением на кожу крема, содержащего сбалансированный «коктейль» антиоксидантов.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на следующих конференциях: 12-й, 13-й, 14-й, 15-й, 16-й, 17-й, 18-й и 19-й Международной конференции по лазерной физике ("ЬРНУ8'2003", Гамбург, Германия; "ЬРНУ8'2004", Триест, Италия; 'ЪРНУ8'2005", Киото, Япония; "ЬРНУ8'2006", Лазанна, Швейцария; "ЬРНУ8'2007", Леон, Мексика; "ЬРНУ8'2008", Трондхайм, Норвегия; "ЬРНУ8'2009", Барселона, Испания; "ЬРНУ8'2010", Фоц до Игуацу, Бразилия), IX и Х1П Международной конференции по перспективам проникновения веществ через кожу ("РРР 2004", "РРР 2008", Ла Гранде Мотге, Франция), 7-й, 9-й, 10-й, 12-й и 13-й Международной школы для студентов и молодых учёных по оптике, лазерной физике и биофизике ("8РМ'2003", "8РМ'2005", "8РМ'2006", "8РМ'2008", "8РМ'2009", Саратов, Россия), Симпозиуме по неинва-зивным методам в косметологии ("Ь'огеа1-2005", Париж, Франция), Симпозиуме немецкого общества гинекологов и онкологов ("N0000-2005", Берлин, Германия), Симпозиуме по системам визуализации и оптическим технологиям для медицины-2005 (Берлин, Германия), 41-й Международной конференции по клинической онкологии ("А8СО-2005", Орландо, США), Симпозиуме по Недеструктивному определению жизненно-важных веществ-2005 (Потсдам, Германия), Международном симпозиуме «Питание для будущего» ("1НК-2006", Потсдам, Германия), 2-м Международном съезде общества фармакологии и физиологии кожи ("18Р-2006", Рим, Италия), конференции по биомедицинской оптике ("ВЮ8-2007", Сан Хосе, США), Международном конгрессе по использованию ингридиентов в косметике ("НРСГ2009", Варшава, Польша), 12-й Международной конференции по применению лазеров в науке ("ЬАЬ8'2010", Оулу, Финляндия).

Публикации

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 37 работах, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, семи глав и заключения. Работа изложена на 187 страницах, включает 44 рисунка, 2 таблицы и список литературы из 203 наименований.

Содержание диссертации

Во введении обсуждается необходимость решения задачи быстрого и неинвазивного определения уровня концентрации кароти-ноидов в коже человека, как веществ, отвечающих за поддержание окислительно-восстановительного баланса в организме человека. Кратко говорится о доступных технических возможностях для решения поставленной задачи и о перспективности этого направления исследований для лучшего понимания окислительно-восстановительных процессов протекающих в организме и коже человека.

В первой главе говорится о биохимии окислительно-восстановительных процессов, происходящих в организме человека. Приводятся схемы основных процессов, приводящих к образованию «природных» и «чужеродных» свободных радикалов. Говорится о позитивном и негативном действиях свободных радикалов на организм человека. Проводится классификация радикалов по величине их оксидативной активности. Обсуждаются условия, приводящие к окислительному стрессу. Рассказывается о важности действия ан-тиоксидантной системы организма для нейтрализации свободных радикалов и недопущении окисления жизненно важных элементов клетки. Говорится о роли каротиноидов, как веществ, обеспечивающих антиоксидантное равновесие в организме в целом и в коже в частности. Приводится типичная схема стресс-ответа антиокси-дантной системы организма.

Вторая глава посвящена сравнительному обзору физико-химических методов, используемых в мировой практике для определения уровня концентрации каротиноидов в коже человека. К таким методам относятся жидкостная и сверхкритическая флюидная хромотографии, а также спектроскопии резонансного комбинационного рассеяния света и отражения. Говорится о существенных преимуществах неинвазивного метода, в основе которого лежит спектроскопия РКР. Представлены физические основы спектроскопии РКР. Рассказывается об истории открытия и развития спектроскопии КР света для исследования молекул.

В третьей главе подробно рассказывается о резонансной спектроскопии комбинационного рассеяния света применительно к не-инвазивному исследованию каротиноидов Р-каротина и ликопина в коже человека. Описывается принципиальная схема экспериментальной установки для измерения спектров РКР каротиноидов (рис. 1) и рассматриваются особенности выбора источника излучения, оптической схемы и системы регистрации сигналов РКР.

Приводятся данные по оптимизации размера возбуждающего лазерного пучка на поверхности кожи и выбора мощности и длины волны зондирующего лазерного излучения. Решается вопрос выбора калибровочного вещества, в качестве которого использовался а-пинен, имеющий большое количество пиков КР в широком диапазоне волновых чисел.

При использовании раствора Р-каротина в этиловом спирте, определён предел регистрации концентрации каротиноидов, составляющий ~ 0.05 мкг/мл. Представлены методики измерений и обработки полученных спектров.

Для сглаживания РКР спектров каротиноидов использовался метод Савицкого -Голея, а для определения интенсивности линий РКР каротиноидов, после процедуры сглаживания спектра, использовалась аппроксимация кривой Гаусса.

С целью увеличения эффективности регистрации слабых КР сигналов каротиноидов от кожи обсуждается влияние фона флуоресценции на КР измерения и эффект фотообесцвечивания («выцветания флуоресценции») кожи. Так как регистрируемый сигнал флуоресценции пропорционален абсолютному числу молекул флуорофоров в области, из которой собирается рассеянный свет, то процесс «выцветания флуоресценции» кожи т-тю может быть аппроксимирован функцией:

где N(0 - полное число молекул, определяющих регистрируемый сигнал флуоресценции, Л/Ь=ХояИ12 - полное число флуорофоров в начальный момент времени, где х0 - начальная концентрация флуорофоров, Л - радиус цилиндра, из которого собирается рассеянный свет, / - высота рассматриваемого цилиндра,

(1)

х(г,2,о = х0схр\-к10е~(г/г°)\у концентрация флуорофоров, П'^К/п,, где

го - радиус гауссова пучка, имеющий порядок радиуса рассматриваемого цилиндра, Р - количество различных типов флуорофоров.

Рис. 1. Схема экспериментальной установки для неинвазивного определения уровня концентрации каротиноидов в коже. 1 - Аг+ лазер, 2 - линзы, 3 - фильтры для получения желаемой длины волны возбуждения (488 им или 514.5 нм), 4 -волокно канала возбуждения, 5 - «канал возбуждения», 6 - объект исследования, 7 - «канал светосбора», 8 - оптический жгут системы светосбора, 9 - спектрометр, 10 - ПЗС матрица, 11 - компьютер

Функция N(0 монотонно убывает во времени, а представленный интеграл (1) не может быть взят аналитически, но представим в виде ряда Тейлора. Нормированная кинетика фотообесцвечивания для одного типа флуорофоров для значений ^« 1/(к1п), то есть сразу после начала облучения, примет вид:

(2)

Таким образом, модуль тангенса угла наклона нормированной кинетики фотообесцвечивания (2) в начальный момент времени представляет собой функцию:

М = (3)

Выражение (3) показывает, что модуль тангенса угла наклона кинетики в начальный момент времени линейно растёт с интенсив-

ностью возбуждающего излучения. Поэтому для скорейшего подавления флуоресцентного фона в ЬСР спектрах необходимо использовать излучение как можно большей интенсивности, ограничивая его величину деструктивным воздействием на кожу.

При описании кинетики фотообесцвечивания кожи также широко используется более простая биэкспоненциальная затухающая функция:

V« = ехр(-^/) + Ъ■ ехр(-^/) + с, (4)

где первое слагаемое описывает «быстрое» затухание, соответствующее фотообесцвечиванию в роговом слое, а второе слагаемое — «медленное» затухание, соответствующее выцветанию флуорофо-ров в дерме кожи. Результаты аппроксимации измеренных кинетик функцией (1) с двумя типами флуорофоров практически совпадают с результатами аппроксимации биэкспоненциальной функцией (4).

Высокий сигнал флуоресценции надёжно маскирует слабый сигнал РКР каротиноидов, делая тем самым измерения низких концентраций невозможными. После 15-минутного облучения кожи, интенсивность её флуоресценции падает, в то время как интенсивность линий РКР каротиноидов не меняется (Рис.2). Это приводит к тому, что отношение сигнал/шум возрастает примерно в 1.2 раза, что в большинстве случаев даёт возможность беспрепятственной регистрации слабых РКР сигналов каротиноидов. Часто на практике не требуется облучать кожу 15 минут, а достаточно двух- трёх-минутного облучения.

Разработан алгоритм раздельного определения молекул каротина и ликопина в коже человека, основанный на максимальном различии в поглощении этих двух молекул на длинах волн 488 нм и 514.5 нм. Исходя из того, что более 70% каротиноидов в коже человека составляют р-каротин и ликопин, интенсивности соответствующих линий РКР Г(Я4)п = (5Ы) /Рш <Ш), нормированные на величину мощности Р488 <514) лазерного излучения на 488 нм и 514.5 нм и измеренные по величине пика РКР на 1525 см"1, могут быть представлены следующими уравнениями:

Iшn~(SmьcNbc+sшLNL) (5)

1*\~(8**ьсЫк (6)

где Ыьс и N1 - относительные концентрации Р-каротина и ликопина в коже, 5488ьс, 8488ь о5|4ьс, б5'\ - коэффициенты пропорциональности, характеризующие эффективность резонансного КР при возбуждении на длинах волн 488 и 514.5 нм для р-каротина и ликопина соответственно.

0 044 -

5? 0.042 -

ё 0.040 -

§ 0.038 -

ьг

3 0.036-

Ё 0.034 -

О.

Е? 0 032 -

0.030-

0.02 8 -

0.8 £

0.4 В ■о

10 11 12 13 14 15

Время облучения, мин.

Рис. 2. Динамика выцветания фона флуоресценции кожи т-хпо (квадратики, левая ордината) и стабильность сигнала РКР каротиноидов кожи (линия РКР 1525 см"1) со временем (кружки, правая ордината) при облучении синим светом на длине волны 488 нм и плотности мощности 50 мВт/см2. Длина волны регистрации сигналов - 527.2 нм

Решение системы уравнений (5) и (6) с подстановкой экспериментально определённых значений коэффициентов пропорциональности £488(514)г,с(л) даёт следующее выражение:

^с/Иь = (0.95 - 0.44т) / (0.06т - 1), (7)

где г = 1*8Н„ /1514„ - параметр, который измеряется.

Объединение уравнений (5) и (7) приводит к конечному выражению, определяющему относительные концентрации Р-каротина и ликопина в коже:

Мьс ~ 1п488-^ьс/^) / (Чс/]^ +0.95) (8)

^~1п488 /(Чс/Мь+0.95) (9)

Для вычисления абсолютных значений концентрации кароти-ноидов, образцы кожи, полученные из операционной, измерялись неинвазивно методом РКР и затем методом жидкостной хроматографии высокого давления. Коэффициент пропорциональности между относительным и абсолютным значениями концентраций каротиноидов Р-каротина и ликопина определён равным Ка1)5 = Н,с(ь)аЬ5 / = 2000 нМ-с / отсчёты-мВт-г.

В том случае, когда речь идёт об антиоксидативном потенциале кожи, измеряемом по общей концентрации всех каротиноидов, достаточно провести РКР измерение, используя возбуждение в синей области спектра, например, на длине волны 488 нм, соответствующей максимуму поглощения всех каротиноидов. Для измерения только ликопина достаточно провести РКР измерения, используя возбуждение в зелёной области спектра, где отличие в поглощении между ликопином и другими каротиноидами максимально, например, на 514.5 нм, где вклад других каротиноидов минимален и составляет 0.06 (см. уравнение 7).

Четвёртая глава посвящена исследованию действия стресс-факторов, приводящих к уменьшению уровня концентрации каротиноидов в коже человека. К таким стресс-факторам относятся УФ, ИК и рентгеновское излучения, курение, употребление высоких доз алкоголя, стресс, болезни и физические упражнения высокой интенсивности. Описана кинетика изменения уровня концентрации каротиноидов в коже.

Показано, что каротиноиды р-каротин и ликопин имеют различные параметры кинетики в результате действия стресс-факторов на кожу. Например, время отклика каротиноидов на действие УФ излучения варьируется от 30 до 90 минут для Р-каротина и от 0 до 30 минут для ликопина. Величина степени деградации ликопина также выше, чем для Р-каротина. Полученная разница во временах отклика объясняется различием в константах скорости нейтрализации синглетного кислорода и гидроксил радикала для Р-каротина и ликопина, что лишний раз доказывает антиоксидантную активность каротиноидов в коже.

На основе РКР измерений, показывающих падение уровня концентрации каротиноидов в коже в результате ИК облучения, впервые выдвинута гипотеза о том, что ИК излучение приводит к образованию свободных радикалов в коже. В последствие данная гипотеза была подтверждена прямым измерением свободных радикалов

в коже методом электронного парамагнитного резонанса. Показано, что спектр, инициирующий образование свободных радикалов в коже, лежит преимущественно в диапазоне от 780 нм до 1500 нм, т.е. в ИК-А диапазоне ИК спектра.

В пятой главе рассказывается о путях транспорта и степени ус-ваиваимости каротиноидов в организме человека. Исследуются факторы, приводящие к увеличению концентрации каротиноидов в коже человека. К этим факторам относятся, в первую очередь, питание и здоровый образ жизни. Описана кинетика изменения уровня концентрации каротиноидов в коже. Определено так называемое «сезонное возрастание» уровня концентрации каротиноидов в коже человека, составляющее в среднем 1.26±0.21.

Показано, что распределение наиболее распространённых в коже человека каротиноидов (3-каротина и ликопина, носит неравномерный характер, может сильно меняться интраиндивидуально и отличаться для кожи, например, ладони, предплечья, лба и спины. Показано также, что максимальная концентрация каротиноидов в коже здорового человека достигается уже на глубине 4-8 мкм от поверхности кожи. Далее она экспоненциально уменьшается.

Шестая глава посвящена \n-\itro измерениям, проводимым методом РКР. Проведены измерения уровня концентрации каротиноидов в продуктах питания, таких как фрукты, овощи, яйца. Показано, что метод РКР может использоваться для оценки степени деградации каротиноидов, наступающей в результате хранения, термической и других обработок, повсеместно применяемых в пищевой промышленности, а также в животноводстве для определения эффективности влияния кормов на уровень концентрации каротиноидов, например, в яйце птицы.

Исследование пота человека показало наличие в нём каротиноидов, что послужило основой для объяснения распределения каротиноидов в верхних слоях кожи с максимумом концентрации в области рогового слоя.

Показано, что метод РКР может использоваться для определения и повышения стабильности антиоксидантов в кремах при помощи оптимизации состава продукта.

Седьмая глава посвящена описанию современных тенденций в использовании антиоксидантов в медицинской практике. Выдвинута гипотеза, что причиной ладонно-подошвенного синдрома - побочного эффекта, связанного с лечением препаратом доксоруби-

цин, может являться разрушающее действие свободных радикалов, генерируемых доксорубицином на поверхности и внутри кожи. Показано, что применение крема, содержащего сбалансированный «коктейль» антиоксидантов, приводит к нейтрализации доксоруби-цин-индуцированных свободных радикалов, образующихся на поверхности кожи в ходе лечения препаратом (Рис. 3).

Время, минуты

Рис. 3. Зависимость изменения концентрации Р-каротина, нанесённого с кремом на поверхность кожи ладони здорового человека (1) и пациента принимающего доксорубицин (2). Момент времени «О» соответствует времени начала внутривенной инжекции препарата доксорубицин пациенту ,

В заключении сформулированы основные результаты и выводы работы.

1. Разработан неинвазивный метод измерения концентрации каротиноидов в коже человека, в основе действия которого лежит резонансная спектроскопия комбинационного рассеяния света при двухволновом лазерном возбуждении.

2. Используемый расширенный размер возбуждающего лазерного пучка на коже позволяет существенно снизить влияние неодно-родностей и пигментации кожи на величину конечного сигнала КР.

3. Разработаны алгоритмы как селективного определения концентраций каротиноидов р-каротина и ликопина, так и общей концентрации каротиноидов в коже человека.

4. Предложен метод повышения чувствительности регистрации низких концентраций каротиноидов кожи, основанный на ис-

пользовании эффекта фотообесцвечивания («выцветания флуоресценции»).

5. Определены оптимальные диагностические места на коже человека, находящиеся на ладонях рук и на лбу.

6. Впервые подтверждено в /и-у/уо измерениях, что кароти-ноиды, выполняя антиоксидантную функцию в коже человека, разрушаются в результате действия стресс-факторов таких как УФ, ИК и рентгеновское излучения, стресс, болезни, употребление больших доз алкоголя, физические упражнения высокой интенсивности. Определена кинетика реакции каротиноидов на действие стресс-факторов.

7. Впервые продемонстрировано косвенно, по деградации каротиноидов, измеренной ш-у/уо методом резонансной спектроскопии КР, что ИК-А облучение кожи человека, производит в ней свободные радикалы. Показано, что спектр длин волн излучения, приводящий к образованию свободных радикалов в коже, лежит преимущественно в диапазоне от 780 нм до 1500 нм. Эта гипотеза, основанная на косвенных измерениях, в дальнейшем была подтверждена прямыми измерениями образования свободных радикалов в коже методом электронного парамагнитного резонанса.

8. Впервые, при помощи метода конфокальной микроскопии КР показано, что каротиноиды в коже человека распределены неравномерно и имеют градиент вглубь. Максимальная концентрация была найдена в верхнем слое эпидермиса, т.е. в роговом слое. Далее концентрация каротиноидов уменьшается экспоненциально вглубь кожи и достигает постоянного минимального значения на глубине 14-20 мкм, соответствующем границе рогового слоя кожи.

9. Показано, что метод резонансной спектроскопии КР может эффективно применяться для количественного определения концентрации каротиноидов в продуктах питания.

10. Показано, что метод резонансной спектроскопии КР может использоваться для визуализации эффективности влияния различных кормов на уровень концентрации каротиноидов в яичном желтке птицы.

11. Измерена кинетика действия питания богатого антиокси-дантами на уровень концентрации каротиноидов в коже человека.

тиноидов в летние и осенние месяцы по сравнению с зимними и весенними месяцами. Величина «сезонного возрастания» была определена равной 1.26±0.21.

13. Впервые проведены измерения концентрации каротиноидов в поте человека. Этот результат является фундаментальным для дальнейшего понимания кинетики изменения концентрации каротиноидов в коже человека и физиологии кожи.

14. Показано, что метод резонансной спектроскопии KP может использоваться для оптимизации и стабилизации антиоксидантно-го состава кремов, пищевых добавок и продуктов питания.

15. Обобщение полученных результатов даёт право утверждать, что каротиноиды являются веществами-маркерами антиок-сидативного потенциала кожи человека.

16. Впервые предложено объяснение ладонно-подошвенного синдрома - побочного эффекта, часто проявляющегося при лечении раковых больных препаратом доксорубицин, основанное на действии доксорубицин-индуцированных свободных радикалов на поверхности кожи.

17. Впервые предложен метод устранения ладонно-подошвенного синдрома (побочного эффекта, часто проявляющегося при лечении раковых больных препаратом доксорубицин), в основе действия которого лежит нейтрализация доксорубицин-индуцированных свободных радикалов на поверхности кожи при помощи крема, содержащего сбалансированный «коктейль» антиоксидантов.

Личный вклад

Автор внес определяющий вклад в проведенное исследование кинетики каротиноидов в коже человека. Им были созданы экспериментальные установки, получены и обработаны все экспериментальные данные.

Результаты, представленные в диссертации, получены лично соискателем или в соавторстве при его непосредственном участии.

Материалы диссертации отражены в следующих публикациях:

Научные журналы:

1. Darwin М.Е., Gersonde I., Albrecht Н., Jacobi U., Sterry W., Lademann J. Nicht-invasive Bestimmung von ß-Carotin und Lycopin in der menschlichen Haut. // Laborwelt, 2003, v.4, №6, pp.21-22.

2. Darvin M.E., Gerzonde I., Ey S., Brandt N.N., Albrecht H., Gonchukov S.A., Sterry W., Lademann J. Noninvasive Detection of beta-Carotene and Lycopene in Human Skin using Raman Spectroscopy. // Laser Physics, 2004, v.14, №2, pp.231-233.

3. Darvin M.E., Gersonde I, Albrecht H., Gonchukov S.A., Sterry W., Lademann J. Determination of Beta Carotene and Lycopene Concentrations in Human Skin Using Raman Spectroscopy. // Laser Physics, 2005, v. 15, №2, pp.295-299.

4. Darvin M.E., Gersonde I., Meinke M., Steny W., Lademann J. Non-invasive in vivo determination of the carotenoids beta-carotene and lycopene concentrations in the human skin using the Raman spectroscopic method. // Journal of Physics D: Applied physics, 2005, v.38, pp.1-5.

5. Lademann J., Martschick A., Jacobi U., Richter H., Darvin M., Sehouli J., Oskay-Ozcelik G., Blohmer J.-U., Lichtenegger W., Sterry W. Investigation of doxorubicin on the skin: A spectroscopic study to understand the pathogenesis of PPE. // Supplement to Journal of Clinical Oncology, 2005, v.23, p.477S.

6. Darvin M.E., Gersonde I, Albrecht H., Sterry W., Lademann J. In-vivo Raman spectroscopic analysis of the influence of UV radiation on carotenoid antioxidant substance degradation of the human skin. // Laser Physics, 2006, v. 16, №5, pp.833-837.

7. Darwin M., Schanzer S., Teichmann A., Blume-Peitavi U., Sterry W., Lademann J. Functional Food und Bioverfugbarkeit im Zielorgan Haut. // Hautarzt, 2006, v.57, №4, pp.286-290.

8. Darvin M., Zastrow L., Sterry W., Lademann J. Effect of supplemented and topically applied antioxidant substances on human tissue. // Skin Pharmacology and Physiology, 2006, v. 19, pp.238-247.

9. Darvin M.E., Gersonde I., Meinke M., Albrecht H., Sterry W., Lademann J. Non-invasive in vivo detection of the carotenoid antioxidant substance lycopene in the human skin using the resonance Raman spectroscopy. // Laser Physics Letters, 2006, v.3, №9,460-463.

10. Darvin M.E., Gersonde I, Albrecht H., Sterry W., Lademann J. In vivo Raman spectroscopic analysis of the influence of IR radiation on the carotenoid antioxidant substances beta-carotene and lycopene in the human skin. Formation of free radicals. // Laser Physics Letters, 2007, v.4, №4, pp.318-321.

11. Darvin M.E., Gersonde I., Albrecht H., Sterry W., Lademann J. Resonance Raman spectroscopy for the detection of carotenoids in

foodstuffs. Influence of the nutrition on the antioxidative potential of the skin. // Laser Physics Letters, 2007, v.4, №6, pp.452-457.

12. Lademann J., Patzelt A., Darvin M., Richter H., Antoniou C., Sterjy W., Koch S. Application of optical non-invasive methods in skin physiology. // Laser Physics Letters, 2008, v.5, №5, pp.335-346.

13. Darvin M., Patzelt A., Gehse S., Schanzer S., Benderoth C., Sterry W., Lademann J. Cutaneous concentration of lycopene correlates significantly with the roughness of the skin. // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2008, v.69, pp.943-947.

14. Schroeder P., Lademann J., Darvin M.E., Stege H., Marks C., Bruhnke S., Krutmann J. Infrared Radiation-induced Matrix Metallo-proteinase in Human Skin: Implications for Protection. // Journal of Investigative Dermatology, 2008, v. 128, №10, pp.2491-2497.

15. Darvin M.E., Patzelt A., Knorr F., Blume-Peytavi U., Sterry W., Lademann J. One-year study on the variation of carotenoid antioxidant substances in the living human skin: influence of dietary supplementation and stress factors. // Journal of Biomedical Optics, 2008, v. 13, №4, pp.0440281-0440289.

16. Lademann J., Caspers P.J., van der Pol A., Richter H., Patzelt A., Zastrow L., Darvin M., Sterry W., Fluhr J.W. In vivo Raman spectroscopy detects increased epidermal antioxidative potential with topically applied carotenoids. // Laser Physics Letters, 2009, v.6, №1, pp.76-79.

17. Darvin M.E., Patzelt A., Meinke M., Sterry W., Lademann J. Influence of two different IR radiators on the antioxidative potential of the human skin. // Laser Physics Letters, 2009, v.6, №3, pp.229-234.

18. Hesterberg К., Lademann J., Patzelt A., Sterry W., Darvin M.E. Raman spectroscopic analysis of the increase of the carotenoid antioxidant concentration in human skin after a one week diet with ecological eggs. // Journal of Biomedical Optics, 2009, v.14, №2, pp.0240391-0240395.

19. Дарвин M.E., Застров JI., Гончуков С.А., Ладеманн Ю. Резонансная рамановская спектроскопия как эффективный метод исследования окислительно-восстановительных процессов в биотканях. // Оптика и Спектроскопия, 2009, т. 107, №6, стр.967-971.

20. Blume-Peytavi U., Rolland А., Darvin М.Е., Pineau I., Voit С., Zappel К., Schäfer G., Meinke M., Sterry W., Lademann J. Cutaneous lecopene and ß-carotene levels measured by resonance Raman spectroscopy: High reliability and sensitivity to oral lactolycopene deprivation and supplementation. // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2009, v.73, pp. 187-194.

21. Darvin M.E., Haag S., Meinke M., Zastrow L., Steny W., Lademann J. Formation of Free Radicals in Human Skin during Irradiation with Infrared Light. // Journal of Investigative Dermatology, 2010, v.130, №2, pp.629-631.

22. Darvin M.E., Sterry W., Lademann J. Resonance Raman spectroscopy as an effective tool for the determination of antioxidative stability of cosmetic formulations. // Journal of Biophotonics, 2010, v.3, №1-2, pp.82-88.

23. Дарвин M.E., Брандт H.H., Ладеманн Ю. Фотообесцвечивание, как метод повышения точности измерений концентрации ка-ротиноидов в коже человека методом KP спектроскопии. // Оптика и Спектроскопия, 2010, т. 109, №2, стр. 1291-1296.

Тезисы докладов:

1. Darwin М.Е., Gersonde I., Albrecht H., Gonchukov S., Sterry W., Lademann J. Detection of carotenoids in human skin and blood using Raman spectroscopy. // PPP. 9a, STS Publishing Cardiff 2004, v.77.

2. Darvin M.E., Gerzonde I., Ey S., Brandt N.N., Albrecht H., Gonchukov S.A., Sterry W., Lademann J. Raman Spectroscopic measurements of beta-Carotene and Lycopene in Human Skin. // Proceedings of SPIE, 2004, v.5474, pp.20-24.

3. Darvin M.E., Gersonde I., Albrecht H., Hesterberg К., Schanzer S., Sterry W., Lademann J. A non-invasive optical method for the determination of the carotenoids beta-carotene and lycopene in foodstuffs. // ATB Bornimer Agrartechnische Berichte, 2005, v.54, pp.47-53.

4. Darvin M.E., Gersonde I, Albrecht H., Meinke M., Sterry W., Lademann J. Raman-spectroskopische In-vivo-Detektion der Karotinoide Beta-Karotin und Lykopen in der menschlichen Haut. // Jahresbericht Laser- und Medizin-Technologie GmbH Berlin, 2003-2005, v42.

5. Darvin M.E., Gersonde I., Albrecht H., Sterry W., Lademann J. Nicht-invasive Bestimmung von Karotinoiden in Nahrungsmitteln mittels Resonanz-Raman-Spektroskopie. // Jahresbericht Laser- und Medizin-Technologie GmbH Berlin, 2003-2005 v.43.

6. Darvin M.E., Gersonde I., Albrecht H., Sterry W., Lademann J. Raman-spektroskopische In-vivo-Untersuchung der Karotinoide in der menschlichen Haut vor und nach UV-Bestrahlung. // Jahresbericht Laser- und Medizin-Technologie GmbH Berlin, 2003-2005 v.44.

7. Darvin M.E., Gersonde I., Albrecht H., Sterry W., Lademann J. Non-invasive in-vivo Raman spectroscopic measurement of the dynam-

ics of the antioxidant substance lycopene in the human skin after a dietary supplementation. // Proceedings of SPIE, v.6535, 2007.

8. Lademann J., Darvin M., Schanzer S., Richter H., Steny W., Patzelt A. Younger skin by antioxidants? // PPP. 1(11), STS Publishing Cardiff, 2008 v.80.

9. Darvin M.E., Gersonde I., Albrecht H., Zastrow L., Sterry W., Lademann J. Indirect measurements of the free radicals produced subsequent to IR irradiation in the skin with the use of resonance Raman spectroscopy. // Jahresbericht Laser- und Medizin-Technologie GmbH Berlin, 2006-2008.

10. Lademann J., Gehse S., Patzelt A., Schanzer S., Knorr F., Sterry W., Darvin M.E. Ageing and Antioxidants. // SOFW, 2008, v.9. (English edition).

11. Lademann J., Gehse S., Patzelt A., Schanzer S., Knorr F., Steny W., Darvin M.E. Antioxidantien und Hautalterung. // SOFW, 2008, v.9. (Deutsch editions).

Книги:

1. Maxim Darvin and Juergen Lademann. Antioxidants in the skin: dermatological and cosmeceutical aspects. Dermatologic, cosmeceutic, and cosmetic development. Therapeutic and novel approaches. Informa healthcare, edited by Kenneth A. Walters and Michael S. Roberts, Chapter 22: 373-384,2008.

2. Maxim E. Darvin and Juergen Lademann. Resonance Raman spectroscopy of human skin for the in-vivo detection of carotenoid antioxidant substances. "Handbook of Photonics for Biomedical Science". CRC press, Taylor and Francis Group, edited by V.V. Tuchin, Chapter 8: 229-252, 2010.

3. Gerald Lucassen, Peter J. Caspers, Gerwin J. Puppels, Maxim E. Darvin and Juergen Lademann. Infrared and Raman spectroscopy of human skin in vivo. Handbook of Optical Biomedical Diagnostics. SPIE press, edited by Valery V. Tuchin, Chapter 14, in press, 2010.

Подписано в печать 29.10.2010. Заказ № 321. Тираж 100 экз. Типография НИЯУ МИФИ. 115409, г. Москва, Каширское ш., 31

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Дарвин, Максим Евгеньевич

Введение.

Глава 1. Окислительно-восстановительные процессы в организме человека.

§ 1. Образование и роль свободных радикалов.

§ 2. Действие свободных радикалов на организм человека.

§ 3. Антиоксидантная система организма.

3.1. Роль антиоксидантов в процессах окислительно-восстановительной регуляции.

3.2. Основные параметры кинетики изменения концентрации антиоксидантов в коже человека.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Неинвазивное определение концентрации каротиноидов β-каротина и ликопина в коже человека и других био-системах методом резонансной спектроскопии комбинационного рассеяния света"

Потребности современной медицины в быстрых и надёжных методах диагностики диктуют новые требования к разработчикам современной медицинской аппаратуры. На сегодняшний день повышенным вниманием пользуются бесконтактные приборы, действующие быстро и неинвазивно, для диагностики заболеваний, определения различных параметров и лечения широкого спектра заболеваний.

Быстрое развитие лазерной техники и технологий послужило причиной появления огромного количества направлений в физике, химии, биологии и медицине, явившихся базовой основой для развития новых методов на стыке наук в таких областях как биофизика, физическая химия, биохимическая физика и медицинская физика. В настоящее время методы лазерной физики являются объективно незаменимыми при решении широкого круга исследовательских и прикладных задач. На стыке лазерной физики, биологии и медицины, возникло новое направление исследований - лазерная спектроскопия биологических молекул. Спектроскопические методы диагностики имеют целый ряд преимуществ, связанных в первую очередь с их чувствительностью, неинвазивностью и быстротой измерений. Оптические методы исследования все чаще применяются в исследованиях биологических объектов, а также биомедицинской диагностике и терапии [1].

Лазерные источники света характеризуются одновременным сочетанием нескольких уникальных свойств его излучения. К ним относятся: узкая ширина полосы лазерного излучения, высокая плотность мощности излучения и когерентность. Более того, широкий спектр доступных длин волн лазерного излучения и возможность варьирования пятна фокусировки в относительно широких пределах, делают лазерные источники света незаменимыми на практике. Варьирование длины волны лазерного излучения позволяет подбирать оптимальные условия для исследования интересующих молекул.

Сочетание этих свойств лазерного излучения позволяет успешно проводить эксперименты по различным видам спектроскопии биологических молекул [2].

Лазерная спектроскопия комбинационного рассеяния света (КР) и резонансная спектроскопия комбинационного рассеяния света (РКР) являются одними из самых эффективных и широко используемых методов регистрации и исследования биологических молекул [3]. К основным преимуществам методов КР и РКР спектроскопии относится их избирательность, быстрота измерений и пригодность для исследования жидкостей, растворов, газов, пленок, поверхностей, волокон, твердых веществ и кристаллов. Кроме того, количества веществ, необходимые для исследования этим методом ограничены лишь поперечными размерами сфокусированного лазерного луча. Узкая спектральная ширина линии лазерного возбуждения и использование многоканальной системы регистрации позволяет измерять КР спектры в диапазоне от 10 до 4000 см"1 [4]. Вместе с тем, высокая плотность мощности лазерного1 излучения может обеспечить получение информативных спектров даже при небольших концентрациях исследуемого вещества. При работе с биохимическими объектами, методы КР и РКР спектроскопии позволяют получать информацию о переходах между колебательными энергетическими уровнями, т.е. о молекулярных колебаниях молекулы. Таким образом, спектр КР молекулы представляет собой по сути её мгновенный снимок. Интенсивность пика КР при этом прямо пропорциональна концентрации исследуемых молекул [3].

Свободные радикалы, образующиеся по тем или иным причинам в организме человека, это частицы - атомы или молекулы, имеющие на внешней оболочке один или несколько неспаренных электронов. Это делает радикалы химически активными «оксидантами», поскольку радикал стремится либо вернуть себе недостающий электрон, отняв его от окружающих молекул, либо избавиться от «лишнего» электрона, отдавая его другим молекулам [5]. В организме человека свободные радикалы реагируют со всеми биологическими молекулами, встречающимися на их пути, нанося им тем самым повреждения. В человеческом организме в норме оксидантные и антиоксидантные процессы сбалансированы. Это означает, что негативное действие свободных радикалов на биологические молекулы организма сведено к минимуму. Это равновесие может быть нарушено в результате воздействия на организм различных стресс-факторов.

Каротиноиды являются природными веществами, проявляющими мощные антиоксидантные свойства в реакциях нейтрализации свободных радикалов [6]. Биосинтез каротиноидов осуществляется на свету (видимая область спектра) в присутствии кислорода некоторыми бактериями, грибами, дрожжами и высшими фотосинтезирующими организмами [7]. Организм человека не может синтезировать каротиноиды, поэтому единственной возможностью их поступления в организм является питание, включающее эти вещества. В плазме крови человека в различных концентрациях определены следующие каротиноиды: ликопин, р-каротин, а-каротин, у-каротин, [3-криптоксантин, астаксантин, лютеин, зеаксантин, фитоин, фитофлюин и их изомеры [8;9]. В коже человека в разных концентрациях представлены такие каротиноиды как ликопин, Р-каротин, а-каротин, у-каротин, лютеин и их изомеры. При этом на долю а-каротина, Р-каротина, у-каротина и ликопина приходится около 70% всех каротиноидов, представленных в коже [10].

Антиоксидантные свойства каротиноидов известны по т-уИго измерениям [11]. Большой интерес представляют ш-у/уо измерения кинетики изменения концентрации каротиноидов в коже человека в зависимости от воздействия на неё стресс-факторов, которые всегда сопровождаются образованием свободных радикалов. При этом, чем интенсивнее действие стресс фактора, тем большее количество свободных радикалов образуется. К таким стресс-факторам могут относиться УФ, ИК, рентгеновское излучения, болезни, стресс, медикаменты, косметика и образ жизни человека.

Кожа человека, как граничный орган между окружающей средой и организмом, содержит большое количество различных антиоксидантов, играющих решающую роль в поддержании окислительно-восстановительного баланса в организме, а также в защите организма от повреждений, вызванных свободнорадикальным окислением [12]. Уменьшение уровня, концентрации антиоксидантов в коже приводит к окислительно-восстановительному дисбалансу, что, в конечном счёте, может привести к развитию окислительного стресса и необратимым повреждениям биоткани [13]. Таким образом, неинвазивное детектирование влияния различных стресс-факторов на кинетику изменения антиоксидативного потенциала кожи человека, представляет собой важную задачу.

Питание, богатое различными антиоксидантами, наоборот, приводит к увеличению уровня' концентрации антиоксидантов в организме человека. Получение информации об усваиваимости каротиноидов организмом, о механизмах их транспорта и накопления в органах человека, особенно в коже, а также о кинетике восстановления антиоксидантов после действия какого-либо стресс-фактора, является чрезвычайно актуальным на сегодняшний день.

До недавнего времени ш-у/'уо измерения каротиноидов в коже не представлялись возможными из-за отсутствия' измерительного метода, обеспечивающего высокую чувствительность и неинвазивность.

Существующие методы измерения каротиноидов в коже человека разделяются на инвазивные и неинвазивные. Преимущество неинвазивных методов измерения каротиноидов в коже очевидно. Метод РКР в свою очередь обладает рядом существенных преимуществ среди существующих неинвазивных методов измерения каротиноидов в коже человека.

Представленная работа посвящена разработке и апробации неинвазивного двухволнового метода в основе которого лежит резонансная спектроскопия КР света для определения- концентрации каротиноидов р-каротина и ликопина в коже человека.

Перспективность этого направления исследований очевидна не только для лучшего понимания физиологии кожи, но и для быстрой визуализации действия на её антиоксидантную систему стресс-факторов, всегда сопровождающихся образованием' свободных радикалов. Помимо прямых измерений на коже, особый интерес вызывает измерение уровня концентрации каротиноидов и его изменения при использовании каротиноидов в медицине и косметологии в качестве антиоксидантов, в пищевой промышленности, животноводстве, и везде, где стоит задача определения уровня концентрации каротиноидов и его изменения.

Цель и задачи диссертационной работы

Целью диссертационной работы является разработка комплексного подхода для решения задачи по определению абсолютной концентрации каротиноидов в коже человека и животных, а также в любых других образцах. В диссертационной работе решаются следующие задачи:

2. Выбор источника излучения; оптимизация оптической схемы РКР спектрометра, размера возбуждающего лазерного пучка на коже, плотности мощности зондирующего лазерного излучения и канала светосбора.

3. Разработка методики измерения каротиноидов в коже человека.

4. Разработка методики обработки спектров КР.

5. Разработка алгоритма селективного определения каротиноидов р-каротина и ликопина в коже человека.

6. Использование эффекта фотообесцвечивания («выцветания флуоресценции» для повышения чувствительности регистрации низких концентраций каротиноидов в коже человека.

7. Определение абсолютной концентрации каротиноидов в коже человека.

Научная новизна

1. Предложен, реализован и апробирован неинвазивный метод измерения концентрации каротиноидов р-каротина и ликопина в коже человека, в основе которого лежит резонансная спектроскопия комбинационного рассеяния света при двухволновом лазерном возбуждении.

3. Впервые подтверждено в ш-у/'уо измерениях, что каротиноиды, выполняя антиоксидантную функцию в коже человека, разрушаются в результате действия таких факторов как УФ, ИК, рентгеновское излучения, стресс, болезни, употребление больших доз алкоголя, физические упражнения высокой интенсивности. Определены кинетики реакции каротиноидов на действие соответствующих стресс-факторов.

4. Впервые продемонстрировано косвенно, по деградации каротиноидов, измеренной ш-у/уо методом резонансной спектроскопии КР, что ИК-А облучение кожи человека, производит в ней свободные радикалы. Показано, что спектр образования свободных радикалов лежит в диапазоне длин волн от 600 нм до 1500 нм. Эта гипотеза в дальнейшем была подтверждена прямыми измерениями образования свободных радикалов в коже методом электронного парамагнитного резонанса.

7. Показано, что метод резонансной спектроскопии КР может использоваться для оптимизации и стабилизации антиоксидантного состава кремов, пищевых добавок и продуктов питания.

8. Обобщение полученных результатов даёт право утверждать, что каротиноиды являются веществами-маркерами антиоксидативного потенциала кожи человека.

9. Впервые предложен метод устранения ладонно-подошвенного синдрома -побочного эффекта, часто проявляющегося при лечении раковых больных препаратом доксорубицин (doxorubicin), в основе действия которого лежит нейтрализация доксорубицин-индуцированных свободных радикалов на поверхности кожи при помощи крема, содержащего сбалансированный «коктейль» антиоксидантов.

Практическая ценность

Созданная экспериментальная установка, в основе действия которой лежит метод резонансной спектроскопии комбинационного рассеяния света с двухволновым лазерным возбуждением, позволяет проводить селективные неинвазивные измерения каротиноидов в коже человека и животных in-vivo, а также in-vitro измерения в растворах, суспензиях и твёрдых телах.

Принимая во внимание тот факт, что каротиноиды являются мощными природными антиоксидантами, нейтрализующими свободные радикалы, метод резонансной спектроскопии комбинационного рассеяния света позволяет проводить косвенные измерения, дающие информацию о количестве образующихся свободных радикалов в коже человека и, таким образом; судить количественно о величине действия стресс-факторов на организм.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Метод спектроскопии РКР является оптимальным среди существующих неинвазивных методов для определения концентрации каротиноидов в коже человека и проведения измерений по определению антиоксидантного потенциала кремов и продуктов питания. Использование двухволнового метода на длинах волн 488 нм и 514.5 нм позволяет раздельно определять содержание каротиноидов Р-каротина и ликопина в коже человека. Использование метода фотообесцвечивания («выцветания флуоресценции») повышает чувствительность регистрации низких концентраций каротиноидов в коже человека.

2. В коже человека т-уыо каротиноиды нейтрализуют свободные радикалы и разрушаются таким образом, что уменьшение концентрации каротиноидов происходит в течение первых 100 минут в зависимости от действующего стресс-фактора и его интенсивности. Восстановление - более длительный процесс, занимающий 1-3 дня и зависящий от питания и антиоксидантного потенциала кожи человека.

5. Побочное действие препарата доксорубицин, вызывающего «ладонно-подошвенный синдром», может быть эффективно предотвращено нанесением на кожу крема, содержащего сбалансированный «коктейль» антиоксидантов.

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Дарвин, Максим Евгеньевич

Основные результаты работы

2. Используемый расширенный размер возбуждающего лазерного пучка на коже позволяет существенно снизить влияние неоднородностей и пигментации кожи на величину конечного сигнала КР.

4. Предложен метод повышения чувствительности регистрации низких концентраций каротиноидов кожи, основанный на использовании эффекта фотообесцвечивания («выцветания флуоресценции»).

5. Определены оптимальные диагностические места на коже человека, находящиеся на ладонях рук и на лбу.

6. Впервые подтверждено в т-уЬ?о измерениях, что каротиноиды, выполняя антиоксидантную функцию в коже человека, разрушаются в результате действия стресс-факторов таких как УФ, ИК, рентгеновское излучения, стресс, болезни, употребление больших доз алкоголя, физические упражнения высокой интенсивности. Определена кинетика реакции каротиноидов на действие стресс-факторов.

7. Впервые продемонстрировано косвенно, по деградации каротиноидов, измеренной ш-у/уо методом резонансной спектроскопии КР, что ИК-А облучение кожи человека, производит в ней свободные радикалы. Показано, что спектр длин волн излучения, приводящий к образованию свободных радикалов в коже, лежит преимущественно в диапазоне от 600 нм до 1500 нм. Эта гипотеза, основанная на косвенных измерениях, в дальнейшем была подтверждена прямыми измерениями образования свободных радикалов в коже методом электронного парамагнитного резонанса.

11. Измерена кинетика действия питания богатого антиоксидантами на уровень концентрации каротиноидов в коже человека.

12. Впервые измерен физиологический параметр кожи - «сезонное возрастание» уровня концентрации каротиноидов. «Сезонное возрастание» выражается в увеличенной концентрации каротиноидов в летние и осенние месяцы по сравнению с зимними и весенними месяцами. Величина «сезонного возрастания» была определена равной 1.26±0.21.

14. Показано, что метод резонансной спектроскопии КР может использоваться для оптимизации и стабилизации антиоксидантного состава кремов, пищевых добавок и продуктов питания.

15. Обобщение полученных результатов даёт право утверждать, что каротиноиды являются веществами-маркерами антиоксидативного потенциала кожи человека.

16. Впервые предложено объяснение ладонно-подошвенного синдрома -побочного эффекта, часто проявляющегося при лечении раковых больных препаратом доксорубицин, основанное на действии доксорубицин-индуцированных свободных радикалов на поверхности кожи.

17. Впервые предложен метод устранения ладонно-подошвенного синдрома -побочного эффекта, часто проявляющегося при лечении раковых больных препаратом доксорубицин, в основе действия которого лежит нейтрализация доксорубицин-индуцированных свободных радикалов на поверхности кожи при помощи крема, содержащего сбалансированный «коктейль» антиоксидантов.

166 *******

В заключение мне бы хотелось выразить большую признательность и благодарность своему научному руководителю профессору Юргену Ладеману, как организатору выполнения этой работы, за его неугасающее внимание на всех этапах выполнения работы, интерес к проведённым исследованиям, плодотворные дискуссии и помощь в выполнении работы на всех её этапах.

Особенно я бы хотел отметить огромную роль профессора С.А. Гончукова, оказывавшего мне всестороннюю помощь на всех этапах выполнения работы.

Я благодарен H.H. Брандту, И. Герзондэ, Ш. Эю, X. Альбрехту за техническую помощь на разных стадиях выполнения работы, С. Шанцер, X. Рихтер за помощь в подготовке экспериментов, Е.В. Вайблер, Э.С. Панчешниковой, А. Алборовой и А. Патцельт за полезные дискуссии и консультации по медицинской тематике, профессору В.В. Тучину за полезные дискуссии и рекомендации по оптике биотканей.

Заключение

Практически сразу после открытия лазеров, КР спектроскопия стала широко использоваться, как эффективный инструмент для диагностики и определения различных веществ. В силу того, что методы КР и РКР являются быстрыми и неинвазивными, они нашли широкое применение в области биомедицины. Лазерное излучение, возбуждая макромолекулу и рассеиваясь на ней, несет в себе уникальную информацию о всевозможных колебаниях этой системы, что выражается в изменении регистрируемой частоты КР. Таким образом осуществляется избирательное детектирование интересующих молекул.

В настоящей диссертационной работе, на основе лазерной спектроскопии РКР, разработан метод неинвазивного определения и исследования биологических макромолекул каротиноидов, находящимися в различных концентрациях в эпидермисе кожи человека и являющимися мощными антиоксидантами. Предложен метод селективного определения каротиноидов Р-каротина и ликопина в коже человека, основанный на двухволновом резонансном возбуждении КР спектров этих веществ.

Разработанный метод позволяет т-уг\ю исследовать кинетику возрастания каротиноидов в коже, вызванную питанием, богатым антиоксидантами-(фрукты, овощи, яйца и др.), а также исследовать кинетику реакции нейтрализации каротиноидами Р-каротином и ликопином свободных радикалов, образующихся в коже в результате действия стресс-факторов таких, как УФ, ИК, рентгеновское излучения, употребление высоких доз алкоголя и воздействие на организм физических упражнений высокой интенсивности.

Предложенный метод позволяет проводить также т-уЬго измерения концентрации каротиноидов в продуктах питания и косметических средствах. Измерение кинетики является важным аспектом для оценки степени деградации каротиноидов, наступающей в результате хранения, термической и других обработок, применяемых в пищевой промышленности, а также для оптимизации «коктейля» используемых антиоксидантов и их концентраций, добиваясь в конечном итоге его максимальной стабильности, что важно для пищевой, косметической и фармакологической промышленностей. 1

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Дарвин, Максим Евгеньевич, Берлин

1. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. Саратов: Издательство Саратовского университета, 1998.-384 с.

2. Звелто О. Физика лазеров. Москва: Мир, 1979.

3. Carey P.R. Biochemical Applications of Raman and Resonance Raman Spectroscopies. New York: Academic Press, 1982.

4. Брандт H.H. KP спектроскопия и анализ динамики лазерного фотообесцвечивания, как методы исследования функционально-значимых изменений структуры белковых молекул: Дис- к-та физ.-мат. наук. Москва, МГУ, 2001.

5. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine. New York: Oxford University Press, 2007. - 1-74 c.

6. Krinsky N.I. Carotenoids as chemopreventive agents. // Preventive Medicine, 1989, v.18, pp.592-602.

7. Конев C.B., Волотовский И.Д. Фотобиология. Минск: БГУ, 1974.

8. Schweigert F.J., Steinhagen В., Raila J., Siemann A., Peet D., Buscher U. Concentrations of carotenoids, retinol and alpha-tocopherol in plasma and follicular fluid of women undergoing IVF. // Human Reproduction, 2003, v. 18, pp.1259-1264.

9. Ermakov I.V., Ermakova M.R., Gellermann W., Lademann J. Noninvasive selective detection of lycopene and beta-carotene in human skin using Raman spectroscopy. // Journal of Biomedical Optics, 2004, v.9, pp.332-338.

10. Stahl W., Sies H. Antioxidant activity of carotenoids. // Molecular Aspects of Medicine, 2003, v.24, pp.345-351.

11. Thiele J.J. Oxidative targets in the stratum corneum. // Skin Pharmacology and Physiology, 2001, v.14, pp.87-91.

12. Halliwell B. Biochemistry of oxidative stress. // Biochemical Society Transactions, 2007 v.35, pp.1147-1150.

13. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Био-химия для врача. Екатеринбург, 1994.

14. Марголина А.А., Эрнандес Е.И., Сеньоре Ж-М. Клеточная терапия в косметологии. Москва, 1999, с. 85.

15. Frank J., Pompella A., Biesalski Н.К. Histochemical visualization of oxidant stress. // Free Radical Biology and Medicine, 2000, v.29, №11, pp.1096-1105.

16. Wei Y.H. Oxidative stress and mitochondrial DNA mutations in human aging. // Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 1998, v.217, pp.53-63.

17. Cross C.E., van der Vliet A., Louie S., Thiele J.J., Halliwell B. Oxidative stress and antioxidants at biosurfaces: Plants, skin, and respiratory tract surfaces. // Environmental Health Perspectives, 1998, v. 106, pp. 1241-1251.

18. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. Москва: Наука, 1972.

19. Гончуков С.А. Лазерная медицина. Москва: МИФИ, 1997, с. 30.

20. Min D.B., Boff J.M. Chemistry and reaction of singlet oxygen in foods. // Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2002, v.l, pp. 5861.

21. Thiele J. J., Podda M., Packer L. Tropospheric ozone: An emerging environmental stress to skin. // Biological Chemistry, 1997, v.378, pp.12991305.

22. Akaike T. Role of free radicals in viral pathogenesis and mutation. // Reviews in Medical Virology, 2001, v.ll, pp.87-101.

23. Rivero A. Nitric oxide: an antiparasitic molecule of invertebrates. // Trends in Parasitology, 2006, v.22, pp.219-225.

24. Cadenas E., Davies K.J.A. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. // Free Radical Biology and Medicine, 2000, v.29, pp.222230.

25. Тодоров И.Н., Тодоров Г.И. Стресс, старение и их биохимическая коррекция. Москва: Наука, 2003, с. 264-265.

26. Melov S. Mitochondrial oxidative stress. Physiologic consequences and potential for a role in aging. // Annals of the New York Academy of Sciences, 2000, v.908, pp.219-225.

27. Liu J.K., Mori A. Stress, aging, and brain oxidative damage. // Neurochemical Research, 1999, v.24, pp.1479-1497.

28. Барабой B.A., Брехман И.И., Голотин В.Г., Кудряшов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. Санкт Петербург: Наука, 1992, 148 с.

29. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран. // Биофизика, 1987, т.32, №5, стр.830-844.

30. Saretzki G., von Zglinicki Т. Replicative senescence as a model for aging: the role of oxidative stress and telomere shortening. // Zeitschrift fur Gerontologie und Geriatrie, 1999, v.32, pp.69-75.

31. Rudolph K.L., Chang S., Lee H.W., Blasco M., Gottlieb G.J., Greider C., Depinho R.A. Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice. // Cell, 1999, v.96, pp.701-712.

32. Harman D. Aging A Theory Based on Free-Radical and Radiation-Chemistry. // Journals of Gerontology, 1956, v.l 1, pp.298-300.

33. Biesalski H.K. Free radical theory of aging. // Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care, 2002, v.5, pp.5-10.

34. Пассватер P. Свободнорадикальная теория старения. Интервью с Д. Харманом. Часть 1. Как всё начиналось. // Косметика и Медицина, 1998, т.2, стр.7-13.

35. Maillard L.C. The action of amino acids on sugar; The formation of melanoidin by a methodic route. // Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances de 1 Academie des Sciences, 1912, v. 154, pp.66-68.

36. Dyer D.G., Blackledge J. A., Katz B.M., Hull С J., Adkisson H.D., Thorpe S.R., Lyons T.J., Baynes J.W. The Maillard Reaction Invivo. // Zeitschrift fur Ernährungswissenschaft, 1991, v.30, pp.29-45.

37. Kohn R.R., Cerami A., Monnier V.M. Collagen Aging Invitro by Nonenzymatic Glycosylation and Browning. // Diabetes, 1984, v.33, pp.57-59.

38. Masaki H., Okano Y., Sakurai H. Generation of active oxygen species from advanced glycation end-products (AGE) under ultraviolet light a (UVA) irradiation. // Biochemical and Biophysical Research Communications, 1997, v.235, pp.306-310.

39. Kawaguchi Y., Tanaka H., Okada Т., Konishi H., Takahashi M., Ito M., Asai J. Effect of reactive oxygen species on the elastin mRNA expression incultured human dermal fibroblasts. // Free Radical Biology and Medicine, 1997, v.23, pp.162-165.

40. Monboisse J.C., Braquet P., Borel J.P. Oxygen-Free Radicals As Mediators of Collagen Breakage. // Agents and Actions, 1984, v. 15, pp.49-50.

41. Lee J.Y., Kim Y.K., Seo J.Y., Choi C.W., Hwang J.S., Lee B.G., Chang I.S., Chung J.H. Loss of elastic fibers causes skin wrinkles in sun-damaged human skin. // Journal of Dermatological Science, 2008, v.50, pp.99-107.

42. Darvin M., Zastrow L., Sterry W., Lademann J. Effect of supplemented and topically applied antioxidant substances on human tissue. // Skin Pharmacology and Physiology, 2006, v. 19, pp.23 8-247.

43. Wrona M., Korytowski W., Rozanowska M., Sarna T., Truscott T.G. Cooperation of antioxidants in protection against photosensitized oxidation. // Free Radical Biology and Medicine, 2003, v.35, pp.1319-1329.

44. Kiokias S., Varzakas T., Oreopoulou V. In vitro activity of vitamins, flavonoids, and natural phenolic antioxidants against the oxidative deterioration of oil-based systems. // Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2008, v.48, pp.78-93.

45. Biesalski H.K., Hemmes C., Hopfenmuller W., Schmid C., Gollnick H.P. Effects of controlled exposure of sunlight on plasma and skin levels of beta-carotene. // Free Radical Research, 1996, v.24, pp.215-224.

46. Ribaya-Mercado J.D., Garmyn M., Gilchrest B.A., Russell R.M. Skin lycopene is destroyed preferentially over beta-carotene during ultraviolet irradiation in humans. // Journal of Nutrition, 1995, v. 125, pp. 1854-1859.

47. Darvin M.E., Gersonde I., Ey S., Brandt N.N., Albrecht H., Gonchukov S.A., Sterry W., Lademann J. Noninvasive detection of beta-carotene and lycopene in human skin using Raman spectroscopy. // Laser Physics, 2004, v. 14, №2, pp.231-233.

48. Di Mascio P., Kaiser S., Sies H. Lycopene as the Most Efficient Biological Carotenoid Singlet Oxygen Quencher. // Archives of Biochemistry and Biophysics, 1989, v.274, pp.532-538.

49. Talwar D., Ha T.K., Cooney J., Brownlee C., O'Reilly D.S. A routine method for the simultaneous measurement of retinol, alpha-tocopherol and five carotenoids in human plasma by reverse phase HPLC. // Clinica Chimica Acta, 1998, v.270, pp.85-100.

50. Cadoni E., De Giorgi M.R., Medda E., Poma G. Supercritical C02 extraction of lycopene and beta-carotene from ripe tomatoes. // Dyes and Pigments, 1999, v.44, pp.27-32.

51. Macias-Sanchez M.D., Serrano C.M., Rodriguez M.R., de la Ossa E.M.

52. Kinetics of the supercritical fluid extraction of carotenoids from microalgaeiwith C02 and ethanol as cosolvent. // Chemical Engineering Journal, 2009, v.150, pp.104-113.

53. Hata T.R., Scholz Т.A., Ermakov I.V., McClane R.W., Khachik F., Gellermann W., Pershing L.K. Non-invasive raman spectroscopic detection of carotenoids in human skin. // Journal of Investigative Dermatology, 2000, v. 115, pp.441448.

54. Ermakov I.V., McClane R.W., Gellermann W., Bernstein P.S. Resonant Raman detection of macular pigment levels in the living human retina. // Optics Letters, 2001, v.26, pp.202-204.

55. Darwin M.E., Gersonde I., Albrecht H., Jacobi U., Sterry W., Lademann J. Nicht-invasive Bestimmung von ß-Carotin und Lycopin in der menschlichen Haut. // Laborwelt, 2003, v.4, №6, pp.21-22.

56. Фабелинский И.JI. Комбинационному рассеянию света 70 лет. // Успехи физических наук, 1998, т.168, №12, стр.1341-1360.

57. Lommel E.C.J. Theorie der normalen und anomalen dispersion. // Wiedemann's Annalen der Physik und Chemie, 1878, v.3, pp.251-269.

58. Smekal A. Quantentheorie der dispersion. // Naturwissenschaften, 1923, v.ll, pp.873-875.

59. Kramers H.A., Heisenberg W. Über die Streuung von Strahlung durch Atome. // Zeitschrift für Physik, 1925, v.31, pp.681-707.

60. Ландсберг Г.С. Избранные труды, Изд. АН СССР, 1958, стр. 101-110.

61. Мандельштам Л.И. Полное собрание трудов, т.1, Изд. АН СССР, 1947, стр. 293-305.

62. Landsberg G., Mandelstam L. Eine neue Erscheinung bei der Lichtzertreuung. //Naturwissenschaften, 1928, v.16, №28, pp.557-558.

63. Landsherg G.S., Mandelstam L.I. Über die Lichtzerstrenung in Kristallen. Zeitschrift für Physik, 1928, v.50, p.769.73

Информация о работе

Дарвин, Максим Евгеньевич
кандидата физико-математических наук
Берлин, 2010
ВАК 03.01.02

Диссертация

Неинвазивное определение концентрации каротиноидов β-каротина и ликопина в коже человека и других био-системах методом резонансной спектроскопии комбинационного рассеяния света - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы