Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Наноконструкции на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Наноконструкции на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

ЗАХАРОВ Михаил Александрович

НАНОКОНСТРУКЦИИ НА ОСНОВЕ ДВУХЦЕПОЧЕЧНЫХ МОЛЕКУЛ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва

Работа выполнена в лаборатории "Конденсированное состояние нуклеиновых кислот" Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Ю.М. Евдокимов

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН, С.Н. Кочетков заведующий лабораторией Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

доктор химических наук, профессор, В.Я. Рочев заведующий отделом Института химической физики им. H.H. Семенова РАН

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита диссертации состоится "_"_2006 г. "_" часов на заседании

диссертационного Совета Д 002.235.01 по присуждению ученой степени доктора наук в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (119991, г Москва, ул. Вавилова, д. 32.)

Автореферат разослан "_"_2006 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

кандидат химических наук А.М. Крицын

Актуальность проблемы: Успехи в области молекулярной биологии, физической химии биополимеров, микроэлектроники и оптики лежат в основе формирования двух новых направлений нанотехнологии: наномедицины и нанобиотехнологии. Наноконструирование на основе молекул биополимеров является одним из важных научных направлений нанотехнологии (нанобиотехнологии). Возрастающий интерес к биологическим макромолекулам, как объектам нанотехнологии, является вполне оправданным. В процессе эволюции биологические молекулы приобрели целый ряд таких свойств, которые делают их крайне привлекательными для применения в нанотехнологии. Во-первых, нужно отметить химическое многообразие "строительных блоков", таких как аминокислоты, липиды и нуклеотиды (нуклеозиды), несравнимое по своей численности со строительными блоками на неорганической основе. Во-вторых, сами строительные блоки склонны к спонтанному, но регулируемому на молекулярном уровне образованию сложных пространственных структур. В-третьих, существует множество путей, по которым происходит сборка (полимеризация) строительных блоков, что открывает возможность создания большого числа наноструктур. Иерархия самособирающихся биологических структур начинается с мономеров (нуклеотидов и нуклеозидов, аминокислот, Сахаров), которые образуют полимеры (такие как ДНК, РНК, белки, полисахариды), затем их ансамбли (мембраны, органеллы) и, наконец, клетки, органы и даже организмы. Следует добавить, что наноматериалы, зачастую получаемые в результате самосборки, могут иметь не только улучшенные свойства, но и уникальные области применения. Сочетание химической реакционной способности биополимеров с их склонностью к созданию иерархических наноконструкций и возможность промышленного получения биополимеров делает эти молекулы удобным объектом для применения в | нанотехнологии. Поэтому использование биологических молекул для создания

искусственных наноструктур на основе принципов, предлагаемых природой, выглядит вполне естественным и является актуальной проблемой нанотехнологии.

Более того, успехи в химическом синтезе и биотехнологии, позволяющие сочетать строительные блоки разной природы, т е. создавать «химерные» молекулы, содержащие в своем составе, например, аминокислоты и синтетические органические цепи, открывают фантастическую возможность - они позволят создавать нанобиоматериалы и наноконструкции, которые, в принципе, отсутствуют в природе.

Большой интерес в последние годы вызывает исследование возможности построения наноконструкций с регулируемыми свойствами на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот.

Настоящая диссертация посвящена исследованию возможности создания наноконструкций на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот, фиксированных в пространственной структуре частиц их жидкокристаллических дисперсий. Стратегия этого подхода принципиально отличается от стратегии известного подхода к созданию наноструктур, основанного на последовательной модификации молекул нуклеиновых кислот.

Дель работы. Цель настоящей работы состояла в исследовании возможности создания наноконструкций на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот, фиксированных в пространственной структуре частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии.

В основные задачи исследования входило'

1 Разработать стратегию создания наноконструкций на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот, фиксированных в пространственной структуре частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии.

2. При помощи метода наноконструирования, реализуемого в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля, содержащем жидкокристаллическую дисперсию ДНК, молекулы дауномицина и ионы меди, отработать условия формирования наноконструций, исследовать их морфологические характеристики, а также определить оптические, рентгенографические и магнитные свойства.

3. Изучить температурную стабильность наноконструкций и оценить эффективные термодинамические характеристики процесса их разрушения.

4. Предложить гипотетическую модель наноконструкции и проанализировать ее свойства.

5 Продемонстрировать возможность использования наноконструкции в качестве основы для создания интегральных биодатчиков, предназначенных для определения биологически активных соединений, "мишенью" которых являются структурные элементы наноконструкции.

Научная новизна. При выполнении настоящей работы получен ряд новых и приоритетных результатов.

1 Впервые теоретически разработана и практически реализована стратегия создания наноконструкций на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот, фиксированных в пространственной структуре частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии.

2 При помощи атомной силовой микроскопии исследованы морфологические особенности наноконструкций Показано, что частицы наноконструкций имеют форму близкую к цилиндрической, а их средний размер составляет 0,5 мкм

3. Показано, что наноконструкция представляет собой ансамбль, состоящий из молекул нуклеиновых кислот низкой молекулярной массы (1 < 106 Да), фиксированных в пространственной структуре частиц ЖКД и сшитых наномостиками, состоящими из чередующихся молекул дауномицина и ионов меди В состав наномостика входит шесть ионов меди и пять молекул дауномицина.

4 Впервые определена стабильность наноконструкций в широком интервале условий. Установлено, что наноконструкция представляет собой стабильную структуру, существующую за пределами "граничных" условий формирования жидкокристаллической дисперсии ДНК

5. Впервые показано, что наноконструкцию можно использовать в практических целях для создания на ее основе нового типа интегральных жидкокристаллических микрочипов, предназначенных для определения разных классов биологически активных соединений, различающихся по своей природе.

Практическая ценность работы.

1. Установленные в работе факторы, определяющие эффективность образования наноконструкций, следует учитывать при создании наноконструкций на основе молекул других биополимеров, в частности, на основе комплексов двухцепочечных нуклеиновых кислот с белками и полиаминосахарами.

2. Наноконструкцию можно рассматривать в качестве модельной системы, позволяющей исследовать роль факторов и природу движущих сил, определяющих

особенности организации третичной структуры двухцепочечных молекул ДНК in vivo Это обстоятельство необходимо учитывать при формировании представления о жидкокристаллической упаковке молекул (или сегментов) ДНК не только в головках бактериофагов и хромосомах простейших, но и в хромосомах эукариот.

3 Обнаруженная в настоящей работе высокая стабильность наноконструкции на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот в сочетании с высокой концентрацией антибиотика, входящего в ее состав, открывает возможность для использования частиц наноконструкции для адресной доставки лекарственных веществ в пораженные органы и ткани.

4. "Отклик" пространственной структуры наноконструкции в ответ на действие химических агентов и физических факторов использован при конструировании интегрального жидкокристаллического микрочипа Тем самым сделаны первые практические шаги в области аналитической биотехнологии, а именно, в области создания интегральных биодатчиков на основе наноконструкций двухцепочечных нуклеиновых кислот.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на международных и всероссийских съездах, конференциях и семинарах, в том числе, на: 7-ой школе-конференции молодых ученых (Россия, Пущино, 2003 г), V-ой международной конференции по лиотропным жидким кристаллам (Россия, Иваново, 2003 г), 8-ой и 9-ой международной школах-конференциях молодых ученых (Россия, Пущино, 2004, 2005 г), IIT семинаре "Нанотехнологии в онкологии" (Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П А. Герцена, 2005 г ), ХХП1 съезде по спектроскопии (Россия, Звенигород, 2005 г.) и конференции по нанотехнологии (США, Анахайм, 2005 г.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей в ведущих международных и отечественных научных журналах.

Объем диссертации. Диссертация изложена на _ страницах, включающих

рисунков,_таблиц и список цитированной литературы, содержащий_ссылки.

Глава 1. Наноконструнрование на освове двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот.

В этой главе описаны стратегии создания наноструктур (суперструктур наноконструкций), которые можно условно назвать последовательным конструированием или конструированием "шаг-за-шагом", основанным на последовательной модификации исходной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты или синтетического полинуклеотида, Кроме того, рассмотрено создание наноструктур на основе наночастиц металлов, на поверхности которых иммобилизированы одноцепочечные ДНК или олигонуклеотиды. В результате наноконструирования получаются сложные пространственные структуры из молекул нуклеиновых кислот, имеющих форму кубов, октаэдров, многолучевых звезд и т.д.

Ответ на вопрос о практическом применении наноконструкций, создаваемых из единичных молекул НК по технологии "шаг-за шагом", определяется, по-видимому, теми задачами, которые приходится решать исследователям. В частности, наноконструкции могут быть использованы в качестве чувствительных элементов сенсорных устройств.

Глава 2. Жидкокристаллические дисперсии двухцепочечных нуклеиновых кислот -основа для новой стратегии наноконструирования.

В этой главе дано представление о жидкокристаллических дисперсиях (ЖКД) (рис. 1) молекул нуклеиновых кислот (нематики, смектики, холестерики), их структуре, способах образования (конденсация молекул в водно-солевых или водно-полимерных растворах) и условиях существования (рН, ионная сила, критическая концентрация полимера, молекулярная масса ДНК и ее длина). Важные структурные особенности ЖКД дц НК состоят в следующем: во-первых, ЖКД существует в "граничных" условиях, определяемых величиной осмотического давления водно-полимерного раствора, его ионной силой и т.д. (молекулы полимера не входят в состав образующихся частиц дисперсии НК). Осмотическое давление раствора определяет расстояние между молекулами НК в частицах дисперсии, регулируемое в пределах от 25 до 50 А. Во-вторых, при фазовом исключении диффузионные степени свободы молекул Ж ограничиваются. В-третьих, в определенных условиях возникает пространственно закрученная (холестерическая) структура частиц ЖКД. В-четвертых, образующийся

холестерик является "окрашенным", поскольку в составе молекул НК присутствуют хромофоры (азотистые основания, поглощающие УФ-излучение). В этом случае теория предсказывает появление аномальной полосы в спектре КД в УФ-области (рис. 1). Можно также ожидать появления аномальных полос в спектрах КД соединений, интеркалирующих между парами оснований молекул НК, образующих холестерик. И,

Ркмммошеда маажця ДНК и «к. Ракш *япмт, что от

ттюм дмллли»

* (Л*1

ДНК в мяао-солсмш растре

Дми«л> числят ~ Л,

М~Ш<м»лдоДЯК

Р- таг спиральмЯ шсрртт

При «фвкнкагояк поляртдеатюго Ж» вдоль шкприеоо! осе ■метаны ДНК • «тпк КЗ

(шамлш^ ямм ■ авнпв ■огммсяж «отпеты! всповяиий.

I. Смктр КДлшиейной В- фермы ДНК.

^.СамгрЬ-ДЖКшпчКнаДЫК. 3 Пвастр КД яникаго крнгтмл* ДИК

Рис. 1 Основные свойства ЖК частиц, наконец, при образовании частиц ЖКД химическая реакционная способность молекул НК не меняется, что открывает возможность для направленного изменения свойств этих молекул.

Таким образом, сохранение химической реакционной способности структурных элементов НК (азотистых оснований и т.д.) в сочетании с высокой (в пределах от 160 до 400 мг/мл!) локальной концентрацией НК в составе частиц ЖКД и упорядоченным расположением соседних молекул НК в частицах ЖКД, не ограничивающим диффузию внутрь частиц разных биологически активных или химических соединений, может обеспечить высокую скорость проникновения этих соединений внутрь частиц и, следовательно, высокую скорость их взаимодействия с молекулами НК. В случае

использования частиц холестерических ЖКД НК, аномальная оптическая активность позволит следить за тончайшими изменениями не только вторичной структуры молекул НК, но и пространственной структуры образующихся частиц дисперсии. Сказанное означает, что, в принципе, существует теоретическая возможность для "сшивания" соседних, близкорасположенных молекул НК в частицах ЖКД. Учитывая тот факт, что молекулы НК расположены на регулируемом в пределах 2,5 - 5,0 нм расстоянии, "сшивку" можно назвать наномостиком, а возникающую при этом конструкцию -"наноконструкцией на основе молекул дц НК". Такой подход к созданию пространственных структур НК можно назвать наноконструированием, идеология которого отличается от всех рассмотренных ранее подходов к созданию наноконструкций по типу "шаг-за-шагом".

Глава 3. Свойства антибиотиков антрациклиновой группы и их комплексов с нуклеиновыми кислотами.

В этом разделе приведены литературные данные о химическом строении и свойствах противоопухолевых антибиотиков антрациклиновой группы. Показано, что антрациклиновые антибиотики (рис. 2), в частности, молекулы дауномицина (ДАУ), интеркалируют между парами оснований НК и синтетических полинуклеотидов только В-семейства При интеркаляции реакционно-способные группы ДАУ (кето-кислород, пери-ОН-группы) недоступны для химических реакций. Однако, ДАУ и его аналоги могут образовать с нуклеиновыми кислотами В- и А- семейства, так называемые "внешние" комплексы. При образовании "внешнего" комплекса реакционно-способные группы ДАУ оказываются доступными для химических реакций Можно предположить, что в этом случае реакционноспособные группы антибиотика могут быть использованы для реакций хелатообразования, позволяющих осуществить пространственную фиксацию соседних молекул ДНК.

/К9 он

Я4 о ОН о

и?

Рис 2. Общая структурная формула антрациклиновых антибиотиков

(К|.Кц.Н,.К1в -заместители; Я7- амииосахар).

Глава 4. Комплексы переходных металлов с ДНК, антрациклиновымн антибиотиками.

В этой главе изложены некоторые представления о структурной химии переходных металлов на примере иона меди. Для иона меди в степени окисления 2+ характерно многообразие координационных структур, которое не встречается ни у какого-либо другого элемента. Большое внимание уделено данным о взаимодействии иона меди 2+ с двухцепочечными молекулами ДНК. Показано, что существует много гипотетических моделей взаимодействия ионов Си2+ с ДНК, которое вызвано тем, что в связывании этих ионов может принимать участие ряд функциональных групп ДНК (фосфатные группы, азотистые основания), которые сильно отличаются по стерическому положению и структуре. Рассмотрены литературные данные о взаимодействии переходных металлов с антрациклиновымн антибиотиками, которые, в частности, в силу своей химической структуры могут образовывать хелатные комплексы с ионами двухвалентных металлов Особый интерес вызывают хелатные комплексы, в образовании которых участвуют ионы Си2+, которые в силу специфической электронной структуры иона Си2+ и пространст венной структуры агликона антрациклинов, образуют планарные хелатные комплексы, в состав которых может входить до 10 повторяющихся субъединиц.

В диссертации предпринята попытка "сшить" соседние молекулы НК, фиксированные в структуре частиц ЖКД, образующихся при фазовом исключении, при помощи плоских хелатных комплексов, состоящих из молекул антрациклинов и ионов металла. Учитывая тот факт, что молекулы НК расположены на расстоянии 2,5 - 5,0 нм, образующуюся "сшивку" можно назвать "наномостиком", а возникающую при этом конструкцию - "наноконструкцией на основе молекул двухцепочечных ДНК".

Глава 5. Материалы и методы.

В этой главе дана характеристика препаратов ДНК и других реагентов, а также описаны использованные в работе методики.

Глава 6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Комплексы антрациклинового антибиотика дауномицина с жидкокристаллической дисперсией НК.

В этом разделе представлены данные изучения взаимодействия ДАУ с ЖКД как ДНК, так и поли(И)-поли(Ц). Показано, что добавление молекул ДАУ к ЖКД ДНК сопровождается появлением и ростом амплитуды полосы в спектре КД, расположенной в области поглощения, соответствующей одному из электронных переходов ДАУ. Анализ показывает, что ориентация молекул ДАУ по отношению к длинной оси спирали ДНК совпадает с ориентацией пар азотистых оснований ДНК. Эти результаты соответствуют представлению об интеркаляции молекул ДАУ между парами оснований молекул ДНК, фиксированных на определенном расстоянии в частице ЖКД за счет осмотического давления полимер-содержащего растворителя.

В случае ЖКД поли(И) • поли(Ц), использованной в качестве структурной модели А-формы дц РЖ, добавление молекул ДАУ не сопровождается какими-либо изменениями в спектре КД. Этот результат является очевидным, поскольку интеркаляционные комплексы ДАУ с полинуклеотидами А-семейства не образуются.

2. Спектры КД жидкокристаллических дисперсий комплекса [ДНК-ДАУ], обработанных раствором СиСЬ.

Добавление СиСТг к холестерической ЖКД ДНК, обработанной ДАУ и имеющей равновесное значение отрицательной (или положительной) амплитуды полосы в спектр

КД при X = 500 нм, сопровождается не только многократной амплификацией этой полосы, но и полосы, расположенной в УФ- области спектра (рис 3, кривая 3). Добавление ДАУ и СиСЬ к холестерической ЖКД поли(И) ■ поли(Ц), также приводит к амплификации полос в видимой и ультрафиолетовых областях.

о

-1000

-2000 -3000

-4000 -<000

300 400 500 МО 700

X , ни

Рис 3 Спектр КД ЖКД ДНК (Сднк ~ 5.5 мкг/мл, кривая 1) и ЖКД ДНК, последовательно обработанной ДАУ (кривая 2) и СиС12 (кривая 3) Сдду = 27 3 х КГ6 М, ССи2+= 9.9 х КГ4 М, Спэг= 170 мг/мл, 0 3 М №С1, 2 х 10'3 N8*- фосфатный буфер, рН = 6,7 ДА = Аь - Ац, (х 1С6 опт ед) ДДА - прирост амплитуды полосы за вычетом величины ДА, характерной для исходной ЖКД ДНК

Амплификации полос в спектрах КД ЖКД как ДНК, так и поли (И) • поли (Ц) в видимой и ультрафиолетовой областях свидетельствует об анизотропном расположении молекул ДАУ относительно поверхности молекул НК в составе частиц ЖКД. Это возможно только в том случае, если молекулы ДАУ образуют так называемый "внешний" неинтеркаляционный комплекс, в котором молекулы ДАУ доступны для химических реакций, в частности, для реакций хелатообразования с различными ионами металлов, и, следовательно, комплекс [ДАУ-Си2+] пространственно фиксирован относительно молекул НК в составе частиц ЖКД.

Существование такого комплекса можно объяснить в рамках двух гипотетических моделей. Согласно первой модели, молекулы ДАУ образуют за счет стэкинг-взаимодействия вертикальные структуры (п - меры), фиксированные на поверхностях молекул НК, расположенных на расстоянии "<1" в составе частиц их ЖКД таким способом, при котором вокруг молекул НК образуется "стопка" из молекул ДАУ, сшитых ионами меди (II) (рис 4). Ориентация вертикальных осей образующихся п • меров комплекса [ДАУ- Си2+] совпадает с направлением длинных осей молекул НК.

\п

и

Рис 4 Первая гипотетическая модель комплекса [антрациклин - Си2+] в составе ЖКД НК. Буква я означает осмотическое давление растворителя, • - ион меди; <1 - расстояние между молекулами НК

Согласно второй модели (рис 5), комплекс [ДАУ- Си2+] состоит из чередуюпдахся молекул ДАУ и ионов Си2+, однако эти комплексы расположены между молекулами НК. Такой комплекс соединяет близлежащие молекулы НК в составе частиц ЖКД, те комплекс выполняет функцию "наномостика". Направление длинной оси образующихся наномостиков перпендикулярно длинным осям молекул НК. Анализ показал, что предпочтительной является вторая модель, в которой наномостики из чередующихся молекул ДАУ и ионов Си2+ соединяют близлежащие молекулы НК.

3. Факторы, влияющие на эффективность образования наномостиков.

Для выяснения особенностей механизма образования и уточнения модели структуры наномостиков представлял интерес анализ факторов, влияющих на эффективность их образования.

А1 Природа молекул НК. Анализ полинуклеотидов А- и В- семейств показал, что наномостики строятся с одинаковой степенью эффективности в случае использования полинулеотидов обоих семейств. Таким образом, образование наномостиков не зависит от вторичной структуры молекул НК.

Б1 Структура антрациклиновых антибиотиков. Анализ исследованных аналогов молекул ДАУ (адриамицин, 4'деоксидоксорубицин, 41деокси-4'иододоксоруб1щин, иремицин, синерубин А, ногаламицин), отличающихся друг от друга наличием и положением заместителей у агликона, показал, что одним из обязательных условий амплификации аномальной оптической активности является наличие реакционно-способных атомов кислорода в положениях 5,6 и 11,12 структуры антрациклинов (рис. 2). Следовательно, каждый атом меди в мостике образует четыре связи с атомами кислорода, лежащими в одной плоскости. Отсутствие такой комбинации атомов кислорода приводит к тому, что антрациклины не образуют комплекс с медью с такой пространственной структурой, которая обеспечивает амплификацию полосы в спектре КД.

В1 Природа ионов металлов. Результаты исследования оптической активности в случае использования для реакции с ДАУ ионов Cu2+, Fe2+, Pd2+, ZnJ+, Cd2+ и Hg2* показали, что добавление только Си2+ к ЖКД комплекса [ДНК-ДАУ] сопровождается амплификацией полосы в спектре КД в видимой и ультрафиолетовой областях.

П Концентрация структурных элементов наномостиков. На рис. 6 приведена зависимость амплитуд полос в спектре КД при X = 505 нм (А) и 310 нм (Б) от

концентрации СиСЬ, соответственно Несмотря на различные значения амплитуд полос в УФ- и видимой областях спектра КД, кривые носят 5- образный характер с высокой степенью соответствия, причем амплификация полос начинается при достижении "критической" концентрации ионов меди в растворе Наличие "критической" концентрации свидетельствует в пользу предположения, согласно которому интеркалируюшие между парами оснований ДНК молекулы ДАУ недоступны для химических реакций.

С^МхЮ*

Рис 6. Зависимость прироста амплитуд полос в спектрах КД ЖКД ДНК, содержащих наномостики (X =505 нм, А) и (Х=310 нм, Б) от концентрации СиС12. Кривая 1' СДАУ( х Ю^М) = 12, кривая 2. Сдду = 15,6, кривая 3- Сдду = 27,3 Сднк - 5,5 мкг/мл; Сгог= 170 мг/мл; 0 3 М ЫаС1; 2 х 10'3 Ш4- фосфатный буфер, рН = 6,7. ДА = А^ - А» в опт ед. (1 х 106)

Д) Температурная стабильность наномостиков. Для выяснения вопроса о стабильности наномостиков была изучена температурная зависимость амплитуды полос в спектрах КД от разных факторов (рис 7) Увеличение концентрации компонентов наномостиков, а, следовательно, и их числа в составе структуры частицы ЖКД, приводит к нескольким эффектам: во-первых, амплитуда аномальной полосы в спектре КД увеличивается (ср кривые 1 и 3), во-вторых, меняется форма кривой, отражающей температурное поведение наномостиков. Действительно, при низкой концентрации компонентов наномостиков (кривая 1) температурная кривая имеет "экспоненциальную" форму, тогда как при их высокой концентрации кривая имеет четко выраженную "в -образную форму". Наконец, по мере увеличения концентрации наномостиков наблюдается увеличение температуры, при которой наномостики разрушаются, т.е. по мере увеличения концентрации наномостиков структура частиц ЖКД ДНК стабилизируется.

Стабильность холестерических ЖКД ДНК характеризовали величиной т„л, условно принимая за величину т„л температуру, при которой амплитуда аномальной (отрицательной) полосы в спектре КД уменьшается на 50%.

Рис. 7 Зависимость амплитуды полосы (X ~ 310 им) в спектрах КД ЖКД ДНК, содержащих наномостики (кривые 1,2,3), от температуры при разных концентрациях ДАУ и СиС12

Кривая 1 СМУ( х 10*М) = 15 Cc„2*(x 10"6 М) = 5; кривая 2 CMy = 27 3 , С.Сп2*= 9,9; кривая 3 Сдду - 64, С(а2*= 20; Сгог~ 170 мг/мл; 0 3 М NaC!, 2 х i О"3 Na*- фосфатный буфер - рН =6,7

Холестерическая ЖКД ДНК «плавится» в узком интервале температур (~ 5°С) и величина т„„ составляет ~ 75°С "КД-плавление" холестерической ЖКД ДНК означает исчезновение пространственной спиральной структуры частиц ЖКД ДНК, а именно, переход соседних молекул ДНК в составе частиц ЖКД из холестерического состояния в нематическое Энтальпия (ДН) перехода жидкокристаллической дисперсии ДНК из холестерического в нематическое состояние лежит в пределах 120 - 170 ккал/моль.

Изменение аномальной оптической активности в случае холестерической ЖКД ДНК. содержащей разное количество наномостиков, носит следующий характер: амплитуда полосы в спектре КД также уменьшается с ростом температуры, но ход кривых заметно отличается от кривой "плавления" ЖКД ДНК.

Кривые зависимости величины т™ от концентрации ионов Си2+ и т„л от концентрации молекул ДАУ носят аналогичный характер. Если предположить, что наномостики между молекулами ДНК имеют структуру, показанную ранее (рис 5), то совпадение хода кривых зависимости Тщ, от концентрации компонентов, можно рассматривать как свидетельство в пользу примерно равного количества ионов Си2+ и молекул ДАУ в структуре наномостиков.

Процесс "плавления" как исходной ЖКД ДНК, так и ЖКД ДНК, сшитой наномостиками, характеризовали константой равновесия К:

К = 1 - ХуП / Хул = ДАо - ДАт / ДАТ - ДАмах , где: Хул - доля "наномостиков" в частицах ЖКД; ДАт, ДАо, ДАмах - значения интенсивности отрицательной полосы в спектре КД ЖКД ДНК, сшитой наномостиками, при температуре г„п, а также в начале и в конце плавления, соответственно.

На рис. 8 в качестве примера приведена зависимость (1пК) - f (1/Т) для различных концентраций Сс„2+ и Сдду, измеренная при X = 505 нм (была получена также аналогичная зависимость при X = 310 нм). На основании этих зависимостей для каждого значения Сси2+ и Сдду была вычислена величина ДН - энтальпия "плавления" и AS -энтропия плавления (AS = АН/ Тпл ) Рассчитанные значения величин ДН лежат в пределах от 25 до 38 ккал/моль, а ДБ от 76 до Ш кал/моль и следует рассматривать как "эффективные".

Рис. 8. Зависимость величины К от температуры (X. = 505 нм) Кривая 1 СдЛу(х10"6М) = 15, Сс„г*(х Ю^М) - 5; кривая 2. CMy - 27 3, Сс„2+ = 9 9, кривая 3 CMy = 64, CCl2"= 20 Сдж -55 мкг/мл; Crol ~ 170 мг/мл, 0 3 М NaCl, 2 х 10"3 Na*- фосфатный буфер; рН =6,7

4. Рентгенографический анализ структуры частиц ЖКД ДНК, содержащих наномостнки.

Для вьмснения вопроса о возможных изменениях в характере упаковки молекул НК в составе ЖКД после образования наномостиков проведен рентгенографический анализ Кривые рассеяния рентгеновских лучей ЖКД ДНК, последовательно обработанной раствором ДАУ и затем СиСЪ, содержат только один максимум в области углов 1°<20<5°, который соответствует среднему расстоянию между молекулами ДНК в составе их частиц ЖКД. Величина dbprr, в случае частиц ЖКД, сформированных из комплекса (ДНК-ДАУ), обработанного раствором CuCh (т.е между молекулами ДНК, сшитыми наномостиками) составляет 30,1 А. При образовании наномостиков амплитуда максимума на кривой рассеяния рентгеновых лучей увеличивается, что свидетельствует о повышении "кристалличности" образующейся структуры.

Таким образом, расстояние между молекулами ДНК в частицах ЖКД, обработанных ДАУ и СиСЬ, практически не меняется при образовании наномостиков

5. Визуализация ЖКД ДНК после сшивания их наномостиками.

Если наномостики стабилизируют структуру частиц ЖКД, открывается возможность для визуализации частиц, образующихся при сшивании соседних молекул НК в составе частиц ЖКД. На рис. 9, в качестве примера, показаны иммобилизированные на ядерном мембранном фильтре частицы ЖКД дц ДНК после обработки этих частиц растворами ДАУ и СиСЬ Рис. 9 показывает, что частицы по форме близки к вытянутым цилиндрам. Хотя размер частиц меняется в пределах от 0.4 до 0.8 мкм, средняя величина составляет около 0.5 мкм.

Следовательно, в результате образования наномостиков между соседними молекулами ДНК, фиксированными в пространственной структуре частиц ЖКД ДНК, возникает трехмерная пространственная структура частиц ЖКД.

Рис 9 Вид частиц ЖКД ДНК, сшитых наномостиками и иммобилизованных на ядерном мембранном

фильтре

6. Магнитные свойства ионов меди в составе наномостиков

Для определения точной структуры наномостика были проведены магнитометрические исследования для определения количества ионов Си2+ в его составе, а именно, была определена зависимость числа квантов магнитного потока М от

температуры Математическая обработка показала, что в состав наномостика может входить до 6 ионов меди (П).

7. Гипотетическая структура наноконструкций на основе дц ДНК.

Принимая во внимание полученные выше данные, а именно: расстояние между молекулами ДНК в структуре частиц ЖКД; положение, согласно которому наномостик представляет собой чередующиеся молекулы ДАУ и ионов меди; а также тот факт, что в состав наномостика входят 6 ионов меди, можно предположить, что наномостик состоит из 6 ионов меди и 5 молекул ДАУ и имеет структуру, показанную на рис 10.

дико) да®

Расстояние между молекуламн ДНК - 25-50А

Рис 10 Наномостики между двумя молекулами ДНК в составе частиц ЖКД (для удобства восприятия мостики повернуты на 90° по отношению к парам оснований)

Существование такой структуры наномосгиков (рис. 10) согласуется с приведенными выше экспериментальными данными. Во-первых, образование наномосгиков между соседними молекулами НК сопровождается увеличением концентрации анизотропно расположенных молекул ДАУ и, следовательно, ростом амплитуды аномальной полосы в спектре КД в области поглощения ДАУ (рис. 3). Во-

вторых, для образования наномостика нужна определенная концентрация молекул ДАУ и ионов меди, что соответствует представлению о "критической" концентрации (Скрит) этих компонентов наномостика (рис. 6) В-третьих, при образовании наномостика расстояние между молекулами НК не меняется, что соответствует рентгенографическим данным. Наконец, чем выше концентрация наномостиков, тем выше должна быть стабильность системы, и тем выше величина температуры ее разрушения (плавления), что и наблюдается на опыте (рис. 7).

Факт существования структуры, свойства которой в значительной степени не зависят от свойств водно-полимерного раствора, позволил предложить гипотетическую структуру наноконструкции (НаК) на основе ЖКД ДНК (рис. 11).

Рис. 11 Гипотетическая структура НаК на основе дц НК

В этой структуре соседние молекулы ДНК образуют слои, внутри которых и между которыми располагаются наномостики из чередующихся молекул антибиотика и ионов двухвалентной меди. Полученная НаК обладает уникальными свойствами. Во-первых, НаК является трехмерным образованием, диффузионная подвижность соседних молекул ДНК в ней резко уменьшается, поэтому структура не имеет многих свойств, характерных для ЖКД НК. Во-вторых, НаК не только сохраняет аномальную оптическую активность,

характерную для холестерических ЖКД ДНК (в полосе поглощения ДНК), но для нее характерна дополнительная аномальная оптическая активность в полосе поглощения ДАУ. В-третьих, не исключено, что в структуре НаК сочетаются свойства двух холестериков -один холестерик образован молекулами ДНК, другой - наномостиками. В-четвертых, стабильность НаК определяется не осмотическим давлением раствора, а числом наномостиков между соседними молекулами ДНК. Наконец, характер теплового разрушения НаК ("плавления") меняется по мере увеличения числа наномостиков между молекулами ДНК.

8. Пу1и практического применения наноконструкций.

В диссертационной работе рассмотрены несколько путей применения НаК: в области молекулярной биологии - в качестве носителя генетической информации; в области молекулярной фармакологии - в качестве носителя высокой концентрации антибиотика; в области аналитической биотехнологии - в качестве биодатчика, а также в других направлениях науки и техники. В работе проиллюстрирована одна из этих возможностей, а именно, использование НаК в качестве интегрального биодатчика для определения биологически активных соединений. В силу специфической конформации наномостика, этот мостик может разрушаться под действием разных факторов.

Рис 12 Калибровочные прямые для определения концентрации деметона в при помощи НаК

Примером, представляющим определенный практический интерес, являются фосфорорганические соединения, такие как малатион и деметон Б, которые в присутствии платинового катализатора образуют потенциальный хелатирующий лиганд, содержащий свободную ЭН- группу, последняя, как известно, образует прочный комплекс с ионами двухвалентной меди. Образование более прочных комплексов ионов Си2+ с БН-содержащим хелатирующим лигандом приводит к "уходу" ионов Си2+ из состава наномостиков, т е. к разрушению наномостиков и исчезновению аномальной оптической активности НаК (X = 505нм), т.е. будет свидетельствовать о наличии в растворе фосфорорганических соединений. В определенных условиях величина уменьшения амплитуды аномальной полосы в спектре КД прямо связана с концентрацией фосфорорганического соединения, разрушающего наномостик, и может быть использована для построения калибровочной прямой (рис. 12) Такие калибровочные прямые для деметона Б и малатиона позволяют определять малую концентрацию фосфорорганических соединений.

Выводы:

1. Исходя из молекулярно-биологических представлений о структуре молекул нуклеиновых кислот и особенностях их жидкокристаллического состояния, предложена новая стратегия создания наноконструкций на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот, фиксированных в пространственной структуре частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии.

2 Пользуясь предложенной стратегией наноконструирования, на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот созданы наноконструкции, определены их морфологические и рентгенографические параметры.

3. Определены факторы (рН, ц, структрурные особенности нуклеиновых кислот и т.д.), влияющие на эффективность формирования наноконструкций нуклеиновых кислот.

4. Впервые получены кривые "плавления" наноконструкций, показана специфическая зависимость формы кривых "плавления" и величины температуры "плавления" от числа наномостиков в структуре наноконструкции.

5. Предложена гипотетическая модель наноконструкции на основе молекул двухцепочечных нуклеиновых кислот, фиксированных в структуре частиц их

жидкокристаллических дисперсий. Отмечен уникальный характер созданной наноконструкции.

6. Предпринята попытка использовать наноконструкцию на основе двухцепочечной ДНК в качестве интегрального биодатчика для определения химических соединений.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Ycvdokimov Yu.M., Salyanov V.I., Zakharov M.A. A novel type of microscopic size chip based on double-stranded nucleic acids. // Lab on a Chip, 2001, v. l,No l,p. 35-41.

2 Нечипуренко Ю.Д., Захаров M.A., Сапянов В.И., и Евдокимов Ю.М. "Мостиковые" структуры между молекулами нуклеиновых кислот, фиксированными в структуре жидкого кристалла // Биофизика, 2002, т. 47, № 4, с. 600-606.

3. Евдокимов Ю М, Салянов В.И., Нечипуренко Ю.Д., Скуридин С.Г., Захаров М.А., Спенер Ф, Палумбо М Молекулярные конструкции (суперструктуры) с регулируемыми свойствами на основе молекул нуклеиновых кислот. // Молекуляр биология, 2003, т. 37, № 2, с. 340-355.

4 Захаров М.А., Соколовская JI Г., Нечипуренко Ю.Д, Лоркипанидзе Г Б , Евдокимов Ю М Формирование наноконструкпий на основе двухцепочечных ДНК. // Биофизика, 2005, т. 50, № 5, с. 824-832.

6. Захаров М.А., Нечипуренко Ю.Д., Лорткипанидзе Г.В., Евдокимов Ю.М. Термодинамическая стабильность наноструктур, созданных на основе двухцепочечной ДНК. //Биофизика, 2005, т. 50, № 6, с. 1036-1041.

7. Yevdokimov Yu.M., Skuridm S.G., Nechipurenko Yu.D., Zakharov M.A, Salyanov V1, Kurnosov A.A., Kuznetsov V.D., Nikiforov V.N.. Nanoconstructions based on double-stranded nucleic acids. // Int. J. Biol. Macromol., 2005, v. 36, No 1-2, p. 103-115.

>

1

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 07.02.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 067 Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

л

О

100 G к IFvso"

- 5 4 5 о

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Захаров, Михаил Александрович

Введение: Нанотехнология и биологические молекулы.5 стр.

Глава 1: Наноконструирование на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот.10 стр.

Глава 2: Жидкокристаллические дисперсии двухцепочечных нуклеиновых кислот основа для новой стратегии наноконструирования. 1. Жидкие кристаллы (жидкокристаллические фазы); их свойства.22 стр.

2. Конденсированное состояние высокомолекулярных двухцепочечных ДНК.26 стр.

3. Жидкокристаллическое состояние низкомолекулярных двухцепочечных ДНК в водно-солевых растворах.29 стр.

4. Жидкокристаллические дисперсии низкомолекулярных двухцепочечных ДНК в водно-полимерных растворах.33 стр.

Глава 3: Свойства антибиотиков антрациклиновой группы и их комплексов с нуклеиновыми кислотами.

1. Химическое строение антрациклиновых антибиотиков.38 стр.

2. Физико-химические свойства антрациклиновых антибиотиков и их комплексов с нуклеиновыми кислотами.39 стр.

Глава 4: Комплексы переходных металлов с ДНК, антрациклиновыми антибиотиками.

1. Структурная химия переходных металлов на примере меди.50 стр.

2. Особеннности комплексов переходных металлов с двухцепочечными ДНК.55 стр.

3. Комплексы переходных металлов с антибиотиками антрациклиновой группы.58 стр.

Глава 5: Материалы и методы.

1. Характеристика препаратов.64 стр.

2. Приготовление растворов.'.65 стр.

3. Спектры поглощения и кругового дихроизма.66 стр.

4. Формирование жидкокристаллических дисперсий ДНК и поли(И) • поли(Ц) в водно-солевых растворах, содержащих ПЭГ.66 стр.

5. Создание наноконструкций на основе жидкокристаллических дисперсий нуклеиновых кислот.66 стр.

6. Температурная стабильность холестерической ЖКД ДНК и наноконструкций.67 стр.

7. Визуализация частиц наноконструкций.67 стр.

8. Рентгенографический анализ жидкокристаллических фаз ДНК, сформированных из дисперсий комплекса ДНК-антибиотик и

ДНК-антибиотик-Си2+.69 стр.

9. Измерение магнитных свойств меди (II) в составе наномостиков.70 стр.

Глава 6: Результаты и их обсуждение.

1. Комплексы антрациклинового антибиотика дауномицина (ДАУ) с жидкокристаллической дисперсией НК.71 стр.

2. Спектры КД жидкокристаллических дисперсий комплекса [ДНК-ДАУ], обработанных раствором СиСЬ.75 стр.

3. Факторы, влияющие на эффективность образования и свойства наномостиков.86 стр.

4. Рентгенографический анализ жидкокристаллических фаз ДНК и ЖКД ДНК, содержащх наномостики.107 стр.

5. Визуализация ЖКД ДНК после сшивания их наномостиками.109 стр.

6. Магнитные свойства ионов меди в составе наномостиков.112 стр.

7. Гипотетическая структура наноконструкций на основе дц ДНК.115 стр.

8. Пути практического применения наноконструкций.121 стр.

Выводы.132 стр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Наноконструкции на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот"

На рубеже 20 и 21 веков стало очевидно, что отдельные атомы или единичные молекулы могут быть использованы в качестве "строительных блоков" для f направленного создания структур по методу "атом за атомом". При этом оказалось, что в структурах, состоящих из ограниченного числа строительных блоков, проявляются и доминируют принципиально новые физические явления такие, как квантовые эффекты, временные вариации свойств и их масштабирование в зависимости от размеров самих структур, преобладающее влияние поверхностных свойств, отсутствие дефектов в объеме, значительная энерго-насыщенность, определяющая высокую химическую реакционную способность создаваемых структур, и т.д. Новые явления приводят к тому, что у создаваемых структур появляются уникальные механические, электрические, магнитные, оптические, химические и другие свойства, которые открывают дорогу для таких манипуляций с этими структурами, которые трудно представить в обычных условиях.

Фундаментальные исследования явлений, происходящих в структурах, имеющих размеры от 1 до 1000 нм, лежат в основе развития новой области науки и техники, называемой нанотехнологией.

Нано - от греческого "Nanos"- "карлик", - величина, составляющая 10"9м (нанометр), масштаб размеров единичных атомов. Нанотехнология возникла из современных достижений и открытий в области визуализации, анализа и манипуляций со структурами, имеющими нанометровые размеры, контролируемого синтеза новых функциональных материалов и создания наноразмерных устройств.

Нанотехнологию можно определить как науку о создании и использовании "структурированных" материалов, устройств и систем с такими функциями, которые связаны с геометрическими размерами или специфическими особенностями наноструктур.

Приципиальную схему "составных частей" классической нанотехнологии, сложившейся к концу 20 века, иллюстрирует табл.1.

Табл. 1. Схема "составных частей" классической нанотехнологии. "Строительные блоки"

Наноструктуры

ТГ\

Дисперсии и покрытия Материалы с развитой поверхностью Функциональные наноструктуры Композитные материалы

Комментируя приведенную схему, можно сказать, что "инженерная техническая" нанотехнология ориентирована на решение таких задач, как: а) создание твердых тел и поверхностей с управляемой молекулярной структурой; б) конструирование новых типов химических соединений с управляемыми свойствами (наноконструирование); в) создание наноразмерных самоорганизующихся (самореплицирующихся) структур; г) разработка устройств различного назначения (компоненты наноэлектроники, нанооптики, наноэнергетики и т.д.); д) сопряжение наноразмерных устройств с электронными системами.

Если говорить о наноматериалах на неорганической (в частности, кремниевой) основе, то можно выделить такие свойства, как механическая прочность, сверхпроводимость, развитая поверхность и т.д. Создание таких материалов и устройств, имеющих малый размер, низкую стоимость, низкое энергопотребление и т.д., открывает возможность их применения в различных областях науки и техники.

Таким образом, нанотехнологии должны обеспечивать высокий потенциал экономического роста: определять качество жизни населения, технологическую и оборонную безопасность, ресурсо- и энергосбережение, т.е. полностью соответствовать социальным запросам любого общества.

Следует добавить, что в табл. 1 не показана область нанотехнологии, которая возникла сравнительно недавно и которая называется наномедициной. Доказательством важности этой области нанотехнологии служит EuroNanoForum 2005, программа которого сконцентрирована на связи между нанотехнологией и здоровьем граждан стран ЕС. Идея о том, что нанотехнология поможет сделать лечение многих заболеваний более направленным, целевым, соответствует интересам как врачей-практиков, так и их пациентов. Действительно, можно изменить распределение лекарств в теле данного пациента таким образом, чтобы они достигали только места своего "действия". Эта задача может быть решена в случае применения "наноструктурных носителей", называемых также "наночастицами (наносистемами) для доставки лекарств". Поскольку уникальная особенность наночастиц состоит в их крайне развитой поверхности, по сравнению с традиционными материалами, наносистемы для доставки лекарств позволяют преодолеть плохую растворимость и плохие абсорбционные свойства (всасываемость) новейших поколений лекарств. В этой связи большое значение приобретает создание новых нанобиоматериалов на основе молекул биополимеров, совместимых с живыми организмами.

Действительно, материалы ряда семинаров и симпозиумов, проведенных в различных странах в последнее время (см. например [1]) показывают, что число исследований в областях нанотехнологии, в которых используются материалы не только на неорганической основе, но и биологические макромолекулы, стремительно увеличивается. Такой интерес к биологическим макромолекулам является вполне оправданным. В процессе эволюции биологические молекулы приобрели целый ряд таких свойств, которые делают их крайне привлекательными для применения в нанотехнологии. Среди них следует отметить следующие. Во-первых, химическое многообразие "строительных блоков", таких как аминокислоты, липиды и нуклеотиды (нуклеозиды), несравнимое по своей численности со строительными блоками на неорганической основе. Во-вторых, сами строительные блоки склонны к спонтанному, но регулируемому на молекулярном уровне, образованию сложных пространственных структур. В-третьих, существует множество путей, по которым происходит сборка (полимеризация) строительных блоков, что открывает возможность создания большого числа наноструктур. Иерархия самособирающихся биологических структур начинается с мономеров (нуклеотидов и нуклеозидов, аминокислот, Сахаров), которые образуют полимеры (такие как ДНК, РНК, белки, полисахариды), затем их ансамбли (мембраны, органеллы) и, наконец, клетки, органы и даже организмы. Можно сказать, что биология - это наука, в которой нанотехнология действительно "работает". Следует добавить, что наноматериалы, зачастую получаемые в результате самосборки, могут иметь не только улучшенные свойства, но и уникальные области применения. Сочетание химической реакционной способности биополимеров с их склонностью к созданию иерархических наноконструкций и возможность промышленного получения биополимеров делает эти молекулы удобным объектом для применения в нанотехнологии. Поэтому использование биологических молекул для создания искусственных наноструктур, на основе принципов, предлагаемых природой, выглядит вполне естественным. Более того, успехи в химическом синтезе и биотехнологии, позволяющие сочетать строительные блоки разной природы, т.е. создавать "химерные" молекулы, содержащие в своем составе, например, аминокислоты и синтетические органические цепи, открывают фантастическую возможность - они позволят создавать нанобиоматериалы и наноконструкции, которые, в принципе, отсутствуют в природе. Таким образом, можно ожидать, что по мере развития нанотехнологии будет происходить "перенос" биополимеров из мира биологии в мир техники.

Настоящая диссертация посвящена исследованию возможности создания напоконструкций на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот, фиксированных в пространственной структуре частиц их жидкокристалличесих дисперсий. Стратегия этого подхода принципиально отличается от стратегии известного подхода к созданию наноструктур, основанного на последовательной модификации исходных молекул нуклеиновых кислот. Для решения поставленной задачи необходимо было определить основные параметры и условия, характеризующие процесс образования наноконструкций (НаК) (природа молекул НК, антибиотиков, ионов металлов, а также температура и т.д.).

Диссертация состоит из двух частей. В первой из них (литературной) дан обзор литературы, касающейся известной стратегии наноконструирования, описаны некоторые свойства жидких кристаллов и жидкокристаллических дисперсий нуклеиновых кислот и сформулированы основные положения, лежащие в основе новой стратегии наноконструирования. В главах 3 и 4 рассмотрено строение антибиотиков антрациклиновой группы, их комплексов с дц НК и ионами металлов. Во второй части (экспериментальной) описаны использованные в работе препараты и методы, а также изложены и обсуждены результаты формирования наноконструкций на основе дц НК.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Захаров, Михаил Александрович

Выводы:

1. Исходя из молекулярно-биологических представлений о структуре молекул нуклеиновых кислот и особенностях их жидкокристаллического состояния, предложена новая стратегия создания наноконструкций на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот, фиксированных в пространственной структуре частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии.

2. Пользуясь предложенной стратегией наноконструирования, на основе двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот созданы наноконструкции, определены их морфологические и рентгенографические параметры.

3. Определены факторы (рН, ц, Т°С, структрурные особенности нуклеиновых кислот и т.д.), влияющие на эффективность формирования наноконструкций нуклеиновых кислот.

4. Впервые получены кривые "плавления" наноконструкций и показана специфическая зависимость формы кривых "плавления" и величины температуры "плавления" от числа наномостиков в структуре наноконструкции.

5. Предложена гипотетическая модель наноконструкции на основе молекул двухцепочечных нуклеиновых кислот, фиксированных в структуре частиц их жидкокристаллических дисперсий. Отмечен уникальный характер созданной наноконструкции.

6. Предпринята попытка использовать наноконструкцию на основе двухцепочечной ДНК в качестве интегрального биодатчика для определения химических соединений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Захаров, Михаил Александрович, Москва

1. NST1.Nanotech 2005 Conference. - 2005. - Vol. 1 ,2, 3

2. N. C. Seeman. DNA in a material world // Nature. 2003. - Vol. 421. - P. 427-431

3. A. A. Podtelezhnikov, С. Mao, N. C. Seeman and A. Vologodskii. Multimerisation-cyclization of DNA fragments as a method of conformational analysis // Biophysical Journal. 2000'. - Vol. 79. - P. 2692-2704

4. J. Chen & N. C. Seeman. The synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube // Nature. 1991. - Vol. 350. - P. 631-633

5. N. C. Seeman. Nucleic acid junctions and lattices // J. Theor. Biol. 1982. - Vol. 99. -P. 237-247

6. J. Shi, D. E. Bergstrom. Assembly of novel DNA cycles with rigid tetrahedral linkers // Angew. Chem., Int. Ed. 2003. - Vol. 36. - P. 111-113

7. D. Bethell and D. J. Schiffrin. Nanotechnology and nucleotides //Nature. 1996. -Vol. 382.-P. 581

8. D.B. Lukatsky and D. Frenkel. Phase behaviour and selectivity of DNA-linked nanoparticle assemblies // Phys. Rev. Lett. 2004. - Vol. 92. - No. 6 - P. 302-305

9. R.L. Lestinger, R. Elghanian, G.Viswanadham, C.A. Mirkin Use of a Steroid Cyclic Disulfide Anchor in Constructing Gold Nanoparticle-Oligonucleotide Conjugates // Bioconjugate Chem. 2000. - Vol. 11 - P. 289-291

10. C.M. Niemeyer. Progress in "engineering up" nanotechnology devices utilizing DNA as a construction material // Appl. Phys. 1999. - Vol. 68. - P. 119-124

11. R. F. Service. DNA ventures into the world of designer materials // Science. 1997. -Vol. 277.-P. 1036-1037

12. C.B. Murray, C.R. Kagan, M.G. Bawendi Self-Organization of CdSe Nanocrystallites into Three-Dimensional Quantum Dot Superlattices // Science. 1995. - Vol. 270. -P.1335-1338

13. T. Vossmeyer, G. Reck, L. Katsikas, E.T.K. Haupt, B. Schulz, H. Weller A "Double Diamond Superlattice" Built Up of CdiyS^SCfkCfbOH^ Clusters // Science. -1995.-Vol. 267.-P. 1476-1479

14. A. Sashchiuk, E. Lifshitz, R. Reisfeld, T. Saraidarov, M. Zelner, A. Willenz // J. Sol-Gel Sci. Technol. 2002. - Vol. 24. - P. 31-38

15. S.A. Davis, M. Breulmann, K.H. Rhodes, B. Zhang, S. Mann // Chem. Mater. 2001. -Vol. 13.-P. 3218-3226

16. E. Winfree. On the computational power of DNA annealing and ligation. // DIMACS Series in Discrete Mathematics and Theoretical Computer Science. 1996. - Vol. 27. -P. 199-221

17. K. A. Williams, P.T.M. Veenhuizen, B. G. De la Torre, R. Eritja, C. Dekker. Carbon nanotubes with DNA recognition // Nature. 2002. - Vol. 420. - P. 761

18. M. J. Heller, B. Sullivan, D. Dehlinger. Fabrication of photonic transfer DNA-quantum dot nanostructures // NSTI-Nanotech 2005. 2005. - Vol. 1

19. Ю.М. Евдокимов, В.И. Саляиов, С.Г. Скуридин. Молекулярное конструирование для усиления оптического сигнала, генерируемого жидкокристаллической дисперсией ДНК. // Доклады академии наук. 1994. - Т. 338. - №6. - С. 827-829

20. D. Demus, Н. Demus, Н. Zaschke. Flissige Kristalle in Tabellen. // VEB Deutscher Verlag fir Grundstoffindustrie. Leipzig 1974. - Vol. 2. - P. 1984

21. N.A. Plate, V.G. Kulichikhin and R.V. Talroze. Mesophase polymers in the coming decade: problems and trends // Pure & Appl. Chem. 1991. - Vol. 63. - No. 7. - P. 925-940

22. С. Чандрасекар. Жидкие кристаллы // Мир. 1980. - С. 10-22

23. В.А. Беляков, А.С. Сонин. Оптика холестерических жидких кристаллов // М. Наука. 1982. - С. 13-121

24. Е. Iizuka, S.T. Yang. Formation of the liquid crystals of polyribonucleotide complexes. // Liquid crystals and oredered fluids. 1977. - Plenum Press. - P. 187207

25. C. Robinson. Liquid crystalline structures in polypeptide solutions // Tetrahedron. -1961.-Vol. 13.-No. 1-3.-P. 219-234

26. H. Torumi, K. Yahagi, I. Uematsu. Cholesteric structure of liotropic Poly (-benzyl-L-glutamate) liquid crystals. // Mol. Cryst. Liq. Cryst. 1983. - Vol. 94. No. 2. - P. 267284

27. К. M. McGrath, P. Kekicheff and M. Kleman. Spiral textures in lyotropic liquid crystals : first order transition between normal hexagonal and lamellar gel phases // J. Phys. II France. 1993. Vol. 3. - P. 903-926

28. L. Lerman. A transition of DNA condensates induced by poly(ethylene oxide) and polylysine. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1971. - Vol. 68. - P. 1886 - 1890

29. Yu.M. Evdokimov, A.L. Platonov, A.S. Tikhonenko et al. A compact form of double-stranded DNA in solution // FEBS Letters. Vol. 23. - P. 180-184

30. V.V. Vasilevskaya, A.R. Khokhlov, Y. Matsuwaza et al. Collapse of single DNA molecule in poly(ethylene glycol) solutions // J.Chem.Phys. 1995. - Vol. 102. - P. 6595-6602

31. K.van Holde. Structure and function of DNA. A physical approach. // Internatl. Interdisciplinary Workshop, Abbay du Sainte-Odile, Elsace (France). Sept. 30,1996.

32. Yu. M. Yevdokimov, S.G. Skuridin, V.I. Salyanov. The liquid-crystalline phases of double-stranded nucleic acids in vitro and in vivo // Liquid Crystals. 1988. - Vol. 3. -No. 11.-P. 1443-1459

33. R. Holyst, M. Blazejczyk, K. Burdzy, G. Goralsky, L. Bocquet. Reduction of dimensionality in a diffusion search process and kinetics of gene expression // Physica A. 2000. - Vol. 277. - P. 71-82

34. D. Grasso, S. Fasone, V.I. Salyanov. A calorimetric study of the different thermal behaviour of DNA in the isotropic and liquid-crystalline states. // Liquid Cryst. -1991. Vol. 9. - No. 2. - P. 299-305t

35. Ю.М.Евдокимов. Жидкокристаллические формы ДНК и их биологическая роль // Жидкие кристаллы и их практическое применение. 2003.- Вып. - 3. - С. 10 -47

36. Yu. M. Yevdokimov, V.I. Salyanov, S.V. Semenov. Analytical capacity of the DNA liquid crystalline dispersions as biosensing units // Biosensors & Bioelectronics. Vol. 11.-No. 9.-P. 889-901

37. Y. Ichiba, K. Yoshikawa. Single Chain Observation on Collapse Transition in Giant DNA Induced by Negatively-Charged Polymer // Biochem. Biophys. Res. Communs.- 1998.-Vol. 242.-P. 441-445

38. R. Podgornik, H.H. Strey, D.C. Rau, V.A. Parsegian. Watching molecules crowd: DNA double helices under osmotic stress // Biophys. Chem. 1995. - Vol. 57. - P. 111-121

39. G. Giannini. Fluorinated Anthracyclines: Synthesis and biological Activity // Medical chemistry reviews online. - 2004. - Vol. 1. - P. 47-71

40. D. Marco, F. Arcamone, F. Zunino. Daunomycin and Adriamycin and structural analogues: Biological Activity and Mechanism of action // Antibiotics. Berlin-New-York: Springer Verlag. 1975. - Vol. 3. - P. 101 - 128

41. W. Fleck, D. Straub, H. Prauser. Violamycin, a New Red -Pigment Antibiotic. // Zeitscrift fur Allg. Microbiologic.- 1974. Vol. 14.-No. 7.-P. 551-558

42. T. Oki, Yu. Matsuzawa, A. Yoshimoto. New Antitumor Antibiotics Aclacinomycin A and B. // J. Antibiot. 1975. - Vol. 28. - No. 10. - P. 830-834

43. S. Neidle, G. Taylor. The crystal Structure of the Anticancer Agent Daunomycin. // Biochim. Biophys. Acta. 1977. - Vol. 479. - No. 4. - P. 450-459

44. G. Lober, V. Kleinwachter, Z. Balzarova, H. Fritzche, D.G. Strauss. Spectroscopic Properties of Violamycin BI. //Biophys. 1978. - Vol. 71. - No. 3. - P. 203-204

45. A. Walter, H. Schutz, E. Stutter. Interaction of Anthracycline Antibiotics with Biopolymers. Equilibrium Binding Studies on the Interaction of Iremycin and DNA. // Int. J. Biol. Macromol. 1983. - Vol. 5. - No.12. - P. 351-355

46. E.J. Gabbay, D. Grier, R.E. Fingerle, R. Remier, R. Lewy, S.W. Pearce, W.D. Wilson. Interactiom specificity of the Anthracyclines with Deoxyribonucleic acid. // Biochemistry. 1976. - Vol. 15. - No. 10. - P. 2062-2070.

47. D.J. Patel, L.L. Canuel. Anthracycline Antitumor Antibiotic Nucleic Acid Interactions. Structural aspects of the Daunomycin-Poly(dA-dT) Complex in Solution. // Eur. J. Biochem. - 1978. - Vol. 90. - No. 2. - P. 274-254

48. A.K. Krey, F.E. Hahn. Studies on the complex of Distamycin A with calf Thymus DNA.//FEBS lett.- 1970.-Vol. I0.-No.3.-P. 175-178

49. E. Calendi, A. Di Marko, M. Reggiani, В. Scarpinato and L. Valentini. On physico-chemical interactions between daunomycin and nucleic acids. // Biochemica et biophysica acta. 1965. - Vol. 103. - P. 25-49

50. F. Quadrifoglio and V. Crescenzi. On the binding of actinomycin and daunomycin to DNA: a calorimetric and spectroscopic investigation. // Biophysical chemistry. 1974. -Vol. 2.-P. 64-69

51. M. Misumi, H. Yamaki, T. Akiyama, N. Tanaka. Mechanism of Action of Aclacinomycin A. The Interaction with DNA and with Tubulin. // J. Antibiot. 1979. -Vol. 32.-No. l.-P. 48-52

52. K.E. Reinert. Anthracycline Binding induced DNA Stiffening, Bending and elongation; Stereochemical Implication from Viscometric Invesigations.// Nucleic Acids Res. - 1983. - Vol. 11. - P. 3411-3430

53. J.M. Saucier, B. Festy, J. Le Pecq. I. The Change of the Torsion of the DNA Helix Caused by Intercalation. II. Measurement of the Relative Change of Torsion Induced by Various Intercalating drugs. // Biochimie. 1971. - Vol. 53. - No. 11. - P. 973-980

54. J.C. Wang. The Degree of Unwinding of the DNA Helix by Ethidium // J. Mol. Biol. -1974.-Vol. 89.-P. 783-801

55. H. Triebel, K.E. Reinert, H. Bar, H. Shutz, M. Hartmann. DNA Conformational Change Induced by the Strongly Bindning Anthracycline Antibiotic Violamycin Bl; Hydrodinamic studies. // Stud. Biophys. 1980. - Vol. 81. - No. 2/3. P. 79-80

56. L. F. Lin, J.C. Wang. On the Degree of unwinding of the DNAHelix by Ethidium. II. Studies by Electron Microscopy. // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - Vol. 395. - No. 4.-P. 405-412

57. H. Berg, G. Horn, U. Luthardt. Interaction of Anthracycline Antibiotics with Biopolymers. V. Polarographic Behavior and Complexes with DNA. // J. Electroanal. Chem. 1981. - Vol. 128. - No. 8. - P. 537-553

58. F. Dall'acqua, D. Vedaldi, A. Gennaro. Studies on the Interaction Between Steffimycin and DNA // Chem. Biol. Interact. 1979. - Vol. 25. - No. 1. - P. 59-70,

59. G.J. Quigley, A.H.-J. Wang, G. Ugnetto, G. Van der Marel, J.H. Boom, A. Rich. Molecular Structure of Anticancer Drug-DNA Complex: daunomycin Plus d(CpGpTpApCpG). // Proc. Nat. Acad. Sci. 1980. - Vol. 77. - No. 12. - P. 72047208

60. H. Fritzsche, M. Richter, A. Rupprecht. Restriction of Conformational transition of DNA in Films Induced by Intercalating and Non-intercalating Antibiotics.//X Jena Symposium on Biophysical Chemistry. 1984. - P. 21

61. С. C. Wan, R.H. Knop, J.S. Cohen. Adriamycin Inhibits the В to Z transition of Poly(dGm5 dC) poly(dGm5 dC). // Biochemistry. 1983. - Vol. 22. - No. 24. - P. 5468-5471

62. D.C. Ward, E. Reich, I.H. Goldberg. Base Specificity in the Interaction of Polynucleotides with Antibiotic Drugs. // Science. 1965. - Vol. 149. - No. 3689. -P. 1259- 1263

63. V. Barthalemey-Clavay, J.C. Maurizot, P.J. Sicard. Etude spectrophotometrique du Complexe DNA-Daunorubicine. // Biochemie. 1973. - Vol. 55. - No. 10. - P. 859868

64. T.W. Plumbridge, L.J. Aarons and J.R. Brown. Problems, associated with analysis and interpretation of small molecule/macromolecule binding data // J. Pharm. Pharmac. -1978.-Vol. 30.-P. 69

65. A.R. Peacocke and J.H.N. Skerret. The interaction of aminoacridines with nucleic acids // Trans. Faraday Soc. 1956. - Vol. 52. - P. 261

66. A. Blake and A.R. Peacocke. The interaction of aminoacridines with nucleic acids. // Biopolymers. 1968. - Vol. 6. - P. 1225

67. T.W. Plumbridge and J.R. Brown. Spectrophotometric and flourescence polarization studies of the binding of ethidium, daunomycin and mepacrine to DNA and poli (I.C.) // Biochim. Biophys. Acta. 1977. - Vol. 479. - P. 441

68. J. Doscocil and I. Fric. Complex formation of daunomycin with double stranded RNA. // FEBS letters. 1973. Vol. 37. - P. 55-58

69. T.W. Plumbridge and J.R. Brown. The interaction of adriamycin and adriamycin analogues with nucleic acids in the A and В conformation. // Biochim. Biophys. Acta. 1979.-Vol. 563.-P. 181

70. Химическая энциклопедия. // Изд-во Советская энциклопедия, М., Т. 3. С. 479

71. Ф. Басоло, Р. Пирсон. Механизмы неорганических реакций // Издательство Мир, Москва. 1971

72. С. Chabers, А. К. Holiday. Modern inorganic chemistry. // Butterworth & Co (Publishers), Ltd. 1975. - P. 1-447

73. H. Scouloudi. The crystal structure of mercury tetrathiocyanate-copper diethylenediamine // Acta cryst. 1953. - Vol. 6. - P. 651-656

74. С. Chabers, А. К. Holiday. Modern inorganic chemistry. // Butterworth & Co (Publishers), Ltd. 1975. - P. 1-447

75. А. Уэллс. Структурная неорганическая химия // Изд-во "МИР, М. 1988. - Т. 3

76. P. G. Jones, Н. Rumpel, Е. Schwarzmann, G. М. Sheldrick and Н. Paulus. Gold(III) oxide // Acta cryst. 1979. - Vol. 35. - P. 1435-1437

77. J. Granot, D.R. Kearns. Interactions of DNA with divalent metal ions. // Biopolymers.- 1982. Vol. 21. - No. 1. - P. 203-232

78. C.Jl. Давыдова. Природные макромолекулы в комплексообразовании. Ионы металлов в биологических системах. // Под ред. X. Зигеля. М. Мир. - 1982. - С. 147-165

79. P.I. Hagerman. Investigation of the flexibility of DNA using transient electric birefringence. // Ibid. 1981. - Vol. 20. - No. 7. - P. 1503-1535

80. S.V. Kornilova, Yu.P. Blagoi, I.P. Moskalenko et. al. Effect of metal ions on DNA conformation and their biological action on genetic structures of cells // Stud. Biophys.- 1988. Vol. 123. - No. 2. - P. 77-84

81. В.Г. Брегадзе. Интерпретация ультрафиолетовых дифференциальных спектров в комплексе с некоторыми ионами первого переходного ряда. // Биофизика. -1974.-Т. 19.-№ 1.-С. 179-181

82. S. Hanlon, В. Wolf, S. Berman et al. The conformational sensitivity of DNA to ionic interactions in aqueous solutions. Metal-ligand interactions in Organic chemistry and biochemistry. // Dordrecht: Holland D. Reidel Publ. 1977. - Vol. 1. - P. 77-106

83. Л. И. Тихонова, Русак А.Ф. Изучение взаимодействия дезоксирибонуклеиновой кислоты с некоторыми ионами металлов методом кругового дихроизма. // Журн. физ. Химии. 1978. Т. 52.-№ 10.-С. 2683-2685.

84. Petri, W. Foster, G. Lober. Application of matrix rank analysis to the binding of copper (II) ions with DNA and acridine orange with a polyphosphate. // Stud. Biophys. 1974. - Vol. 43. - No. 1. - P. 61-74

85. H. Fritzsche. New results about the copper (II) DNA complex. // Ibid. - 1970. - Vol. 5.-P. 315-320

86. Ю.П. Благой, B.JI. Галкин и др. Металлокомплексы нуклеиновых кислот в растворах, // Киев, Наук. Думка. 1991. - С. 200-234

87. V.A. Sorokin, Yu.P. Blagoi, V.A. Valeev et. al. Studies of formation of bivalent copper complexes with native and denatured DNA. // J. Inorg. Biochem. 1987. Vol. 30.-No. 2.-P. 87-101

88. N. Shirai, Y. Iton, A. Kurose et al. Formation of complexes of deoxyribonucleic acid (DNA) with copper (II) and other bivalent metal ions. // Polym. J. 1984. - Vol. 16. -No. 3.-P. 207-215

89. H. Richard, I.P. Screiber, M. Daune. Interactions of metallic ions with DNA. V. DNA renaturation mechanism in the presence of Cu2+. // Biopolymers. 1973. - Vol. 12. -No. l.-P. 1-10

90. W. Forster, E. Bauer, H. Schutz et al. Thermodynamics and kinetics of the interaction of copper (II) ions with native DNA. // Biopolymers. 1979. - Vol. 18. - No. 3. - P. 625-661

91. K.K. Deb. Ultraviolet spectroscopic study of Cu2+ induced DNA melting at room temperature. // Spectroscop. Lett. 1981. - Vol. 14. - No. 5. - C. 385-393

92. H. Beraldo, A. Garnier-Suillerot, L. Tosi and F. Lavelle. Iron (III)- adriamycin and Iron (Ill)-daunorubicin copmlexes. Physicochemical Characteristics, interaction with DNA, and antitumor activity. // Biochemistry. 1985. - Vol. 24. - P. 284-289

93. F.T. Greenaway and J.C. Dabrowiak. The bindning of copper ions to daunomycin and adriamycin. // J. Inorg. Biochem. 1986. - Vol. 16. - P. 91-107.

94. H. D. Coble and H. F. Holtzclaw Jr. Chelate polymers of copper (II) with various dihydroxyquinoid ligands. // J. Inorg. Nucl. Chem. 1974. - Vol. 36. - P. 1049-1053

95. E. Hodgson, J. R. Bend. Reviews in Biochemical toxicology. 1983. - Vol. 5. - P. 179

96. T. Maniatis, J. Sambrock, F. Fritsche // Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor; N.Y., Cold Spring Harbor Press. 1989. - P. 133-138

97. Ю.М. Евдокимов, С.Г. Скуридин, H.M. Акименко. Жидкокристаллические микрофазы низкомолекулярных двухцепочечных нуклеиновых кислот и синтетических полинуклеотидов. // Высокомол. Соед. 1984. - Т. 26. - № 2. - С. 2403-2410

98. В. Samori, М.А. Osipov, I. Domini, A. Bartolini. Transverse dipole added to DNA chains by drug binding can induce inversion of the long-range chirality of DNA condenstates. // Int. J. Biol. Macromol. 1993. - Vol. 15. - P. 353-359

99. M. Spinelli, J.C. Dabrowiak. Interaction of copper(II) ions with the daunomycin-calf thymus deoxyribonucleic acid complex. // Biochemistry. 1982. - Vol. 23. - P. 5862-5870.

100. V. Malatesta, A.Gervasini, F. Morazzoni. Chelation of copper (II) ions by doxorubicin and 4'-epidoxorubicin: ESR evidence for a few complex at high anthacycline/ copper molar ratios. // Inorg. Chim. Acta. 1987. - Vol. 136. - P. 81-85

101. Ю.Д. Нечипуренко, В.Ф. Рябоконь, С.В. Семенов, Ю.М. Евдокимов Термодинамические модели, описывающие образование «мостиков» между молекулами нуклеиновых кислот в жидких кристаллах.// Биофизика. 2003. - Т. 48. - С. 635-643

102. Yu. М. Yevdokimov, S.G. Skuridin, V.I. Salyanov. Effect of platinum (II) chmotherapeutic agents on properties of DNA liquid crystals. // Biophysical Chemistry. 1990. - Vol. 35. - P. 143-153

103. М. Рит. "Наноконструирование в науке и технике". Москва. - 2005. с. 159

104. В. Зенгер. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. Москва "Мир" 1987,584 с

105. F. Livolant, A. Leforestier. Condensed phases of DNA: structures and phase transitions//Prog. Polym. Sci.- 1996.-Vol. 21. P. 1115-1164

106. Yu. M. Yevdokimov, S. G. Skuridin, G. B. Lortkipanidze. Liquid-crystalline dispertions of nucleic acids.// Liquid crystals. 1992. - Vol. 12. - No. 1. - P. 1-16

107. Yu.M. Yevdokimov, V.I. Salyanov & M.A. Zakharov. A novel type of microscopic size chip based on double-stranded nucleic acids // Lab on a Chip. -2001. Vol. l.-P. 35-41

108. B. Mattiasson and B. Danielson. Calorimetric analysis of sugars and sugar derivatives with aid of an enzyme transistor. // Carbohydr. Res. 1982. - Vol. 102. -P. 273-282

109. Искренне благодарен В.И. Салянову и С.Г. Скуридину за помощь в выполнении диссертационной работы, а также за готовность оказать как физическую, так и моральную поддержку.

110. Весьма признателен В.В. Петухову за помощь в технической поддержке и ремонте научного оборудования.

111. Отдельные слова благодарности В.А. Боковому и А.И. Клещу за помощь в решении информационных проблем и задач.

112. Благодарю всех сотрудников лаборатории Конденсированного состояния нуклеиновых кислот за интерес к работе и полезное обсуждение полученных результатов.