Мутационная изменчивость гена TP53 при раке молочной железы

Денисов, Евгений Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мутационная изменчивость гена TP53 при раке молочной железы
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Мутационная изменчивость гена TP53 при раке молочной железы"

На правах рукописи

ДЕНИСОВ Евгений Владимирович

МУТАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНА ТР53 ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 ОКТ 2010

Томск-2010

004610786

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования "Томский государственный университет" и в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте онкологии Сибирского отделения РАМН, г. Томск

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Стегний Владимир Николаевич

доктор биологических наук, профессор Чердынцева Надежда Викторовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Суханова Галина Алексеевна

доктор медицинских наук Любченко Людмила Николаевна

Ведущая организация: Медико-генетический научный центр

РАМН, г. Москва

Защита состоится «. 02 » 2010 года в_час._мин.

на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 001.045.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ медицинской генетики СО РАМН по адресу: 634050, г. Томск, ул. Набережная р. Ушайки, д. Ю

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ медицинской генетики СО РАМН

Автореферат разослан «_»_2010 года

(&Г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук ^—Кучер А.Н.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующие позиции по заболеваемости злокачественными новообразованиями среди женщин, каждая 12-я имеет риск заболеть в течение жизни, смертность составляет 25-40% (Washbrook, 2006; Комарова, 2008; Давыдов, Аксель, 2009; Чиссов, 2009). Генетическая детерминация, обусловленная наследственными нарушениями в высокопенетрантных генах, детектируется лишь в 5-8% случаев РМЖ (Карпухин и др., 2002; Любченко и др., 2007; Bradbury, Olopade, 2007; Коваленко и др., 2008; Foulkes, 2008). Этиология, генетические факторы и молекулярные механизмы спорадического РМЖ до сих пор остаются не до конца изученными (Имянитов, Хансон, 2004; Friedrich et al., 2008). Злокачественная трансформация клеток и опухолевая прогрессия, проявляющаяся клинически инвазией, регионарным и отдаленным метастазированием, связаны с нарушениями нормального функционирования генома и, как следствие, с высокой генетической нестабильностью под влиянием эндогенных и экзогенных канцерогенных факторов, действие которых существенно модифицируется разной индивидуальной генетической предрасположенностью к заболеванию (Egger et al., 2004; Sprague et al., 2007; Копнин, 2007; Заридзе, 2008; Блохин, 2009). Молекулярный патогенез РМЖ, как и многих других онкологических заболеваний, включает множество генетических и эпигенетических событий, ведущих к активации онкогенов и инактивации генов опухолевой супрессии, лежащих в основе опухолевой трансформации (Ляхович и др., 2004; Payne, Kemp, 2005; Croce, 2008; Залетаев, 2008; Лихтенштейн, 2009).

чивые данные о связи определенных генотипов (Ex4+119G>C) с прогрессией РМЖ (Tommiska et al., 2005; Xu et al., 2005; Чердынцева и др., 2006; Damin et al., 2006; Toyama et al., 2007; Costa et al., 2008; Xu et al., 2008; Hrstka et al., 2009). Недостаточная информативность мета-анализов и неоднозначность результатов при оценке ассоциации полиморфизма ТР53 с патогенетическими признаками заболевания могут быть обусловлены недоучетом статуса р53 собственно в опухолевых клетках, поскольку именно его нарушения в виде соматических мутаций, эпигенетических модификаций, аллельного дисбаланса (потеря гетерозиготности) лежат в основе злокачественной трансформации. Генетические изменения, приводящие к дисфункции опухолевых су-прессоров, часто происходят в результате классического «двухударного» механизма: соматические мутации либо метилирование в одном аллеле и утрата другого (Knudson, 1971, 2001). Ген ТР53, как наиболее транскрипционно активный, чья экспрессия индуцируется многими стрессорными стимулами, является высокочувствительной мишенью мутагенеза. При РМЖ до 50% опухолей содержат мутации в гене ТР53, приводящие к частичной либо полной потере функциональности белка, и, более того, часто способствующие приобретению им онкогенных свойств. Такие различия в «функциональной значимости» мутаций, по-видимому, не позволяют получить однозначных результатов об их связи с проявлениями опухолевой прогрессии (Feki, Irminger-Finger, 2004; Petitjean et al., 2007; Brosh, Rotter, 2009). В литературе также есть немногочисленные указания, что метилирование гена ТР53 при РМЖ может выступать в качестве альтернативного механизма инактивации белка р53 и ассоциировано с инвазивностью опухолевого процесса (Kang et al., 2001). Недавно в опухолевой ткани гетерозиготных по Ex4+119G>C полиморфизму больных РМЖ был показан феномен потери определенных аллелей гена ТР53 (Bonafe et al., 2003; Kyndi et al., 2006). Более того, авторы выявили ассоциацию утраты аллелей с показателями выживаемости пациентов, однако плохой прогноз в этих исследованиях был связан с потерей разных аллелей. Неоднозначность полученных этими авторами данных указывает на важность продолжения исследований. Соматические мутации в гене ТР53, метилирование и утрата аллелей могут обуславливать «двухударную» инактивацию гена ТР53, которая вносит вклад в формирование и прогрессию РМЖ. Все вышесказанное указывает на актуальность исследований, учитывающих все возможные варианты изменений в гене ТР53, которые могут определять потенциальные механизмы его участия в опухолевой прогрессии РМЖ.

Цель исследования: Изучить мутационную изменчивость гена ТР53, обусловленную генетическими вариациями, эпигенетическими модификациями, потерей гетерозиготности и соматическими мутациями у больных раком молочной железы, и ее связь с патогенетически значимыми признаками заболевания.

Задачи исследования:

1. Оценить распределение генотипов по полиморфным вариантам гена ТР53 в лейкоцитах периферической крови и в опухолевой ткани больных раком молочной железы.

2. Оценить потерю гетерозиготности на высоко вариабельных участках в локусе гена ТР53 у гетерозиготных больных раком молочной железы с утратой аллелей в опухолевой ткани.

3. Провести анализ генетических и эпигенетических нарушений гена ТР53 у больных раком молочной железы с утратой одного и сохранением другого аллелей в опухоли.

4. Провести анализ связи мутаций и генотипов по полиморфным вариантам гена ТР53 у больных раком молочной железы с патогенетическими характеристиками опухолевого процесса, отражающими проявления опухолевой профессии.

Научная новизна исследования:

Впервые у больных раком молочной железы охарактеризован в сравнительном аспекте полиморфизм гена ТР53 (Ex4+119G>C, IVS3+41insl6bp, IVS6+62G>A) в лейкоцитах периферической крови и в опухоли. Показано, что в опухоли гетерозиготных по Ex4+119G>C полиморфизму больных раком молочной железы утрата одного аллеля обусловлена делецией участка гена ТР53, а инактивация другого - соматическими мутациями, что согласуется с двухударной концепцией канцерогенеза А. Кнудсона. Впервые на территории РФ выявлены новые мутации в гене ТР53 у больных раком молочной железы: три в интронных областях - с.376-57А>С, c.673-20G>C, c.919+26_c.919+27insl и одна в 7-м экзоне - c.697_699del3, не представленные в базе IARC ТР53 Mutation Database R14. Показано, что у больных, носителей аллельного варианта С по Ех4+119G>C полиморфизму гена ТР53, реже отмечаются проявления опухолевой прогрессии по сравнению с пациентками, несущими G аллель. Наличие мутаций в полиморфных сайтах гена ТР53, приводящих к несоответствию генотипов в лейкоцитах периферической крови и в опухолевой ткани больных РМЖ, ассоциировано с экспрессией рецепторов к эстрогенам и прогестерону на опухолевых клетках. Теоретическая и практическая значимость:

Полученные в данном исследовании результаты расширяют представления о молекулярно-генетических механизмах прогрессии рака молочной железы, в частности, о вкладе полиморфизма гена ТР53 в развитие рака данной локализации. Одновременная оценка полиморфизма и соматического статуса гена ТР53 может быть использована как оригинальный дополнительный методологический подход для проведения исследований по изучению патогенеза злокачественных новообразований других локализаций. На основании результатов анализа связи молекулярно-генетических изменений гена ТР53 в опухоли с патогенетическими характеристиками злокачественного процесса могут быть разработаны дополнительные критерии оценки прогноза клинического течения рака молочной железы, которые совместно со стандартными позволят повысить информативность прогноза и оптимизировать тактику ле-

чения, и, как следствие, увеличить эффективность терапии и качество жизни больных раком молочной железы. Новые сведения могут быть использованы в образовательном процессе при подготовке специалистов естественнонаучного профиля.

Положения, выносимые на защиту:

1. Нарушения гена ТР53 в опухоли гетерозиготных больных раком молочной железы могут происходить по принципу концепции двухударной инактивации А. Кнудсона, когда один аллель содержит мутацию, а другой делегирован.

2. Сравнительный анализ полиморфизма гена ТР53 в лейкоцитах периферической крови и в опухолевой ткани может быть использован как дополнительный метод поиска инактивирующих событий данного гена при раке молочной железы.

3. Одновременная оценка полиморфизма и соматического статуса гена ТР53 у больных раком молочной железы объективизирует представления о механизмах участия данного гена в прогрессии рака молочной железы.

Апробация работы: Материалы диссертационной работы были представлены на: 54-57-й научных студенческих конференциях биолого-почвенного факультета (Биологического института) Томского государственного университета "Старт в науку" (Томск, 2004-2008); XLIII-XLV международных научных студенческих конференциях "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2005-2007); I Российско-американской конференции "Биотехнология и онкология" (Санкт-Петербург, 2005); Научно-практической конференции "Достижения современной генетики", посвященной 70-летию Новосибирской Государственной Медицинской Академии (Новосибирск, 2005); X Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской конференции по фундаментальной онкологии "Петровские чтения - 2006, 2008" (Санкт-Петербург, 2006, 2008); XIV международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007); II-IV региональных конференциях молодых ученых имени академика РАМН Н.В. Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии" (Томск, 2007-2009); III международной конференции "Фундаментальные науки медицине" (Новосибирск, 2007); 5-й международной конференции по раку молочной железы "Сердце, душа и наука: это всего лишь маленький мир" (Виннипег, Канада, 2008); Российской научно-практической конференции с международным участием "Современные аспекты диагностики и лечения рака молочной железы" (Томск, 2008); Всероссийской конференции с международным участием "Молекулярная онкология" (Новосибирск, 2008); 13-й Зимней школе "Роль биомолекул в норме и при патологии" (Хельсинки, Финляндия, 2009); Международной конференции по раку молочной железы (Брюссель, Бельгия, 2009); Сибирско-Тайваньском форуме "Опыт научно-

технического и инновационного сотрудничества Томской области и Тайваня" (Томск, 2009).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 34 печатных работы, в том числе 4 статьи в журналах Перечня ведущих рецензируемых научных изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Данные проиллюстрированы 14 таблицами, 16 рисунками. Библиографический список включает 223 источника, из них 30 работ отечественных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве материала исследования использовали образцы опухолевой ткани (п=80) и лейкоцитов периферической крови (п=80) больных спорадическим РМЖ в возрасте от 29 до 76 лет (средний возраст 51,7±1,6), получавших комбинированное лечение в клинике НИИ Онкологии СО РАМН в 20042008 годах. Диагноз был подтвержден морфологически. В исследование включены больные с операбельной формой РМЖ стадии T1.4N0.2Mo. Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288). Было получено разрешение этического комитета НИИ Онкологии СО РАМН. Материалом для исследования послужила ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови и опухолевой ткани больных РМЖ. В качестве негативного и позитивного контролен при секвенировании нуклеотидной последовательности гена ТР53 на участках 5, 7 и 8-го экзонов использовали ДНК опухолевых линий с заведомо известным статусом, любезно предоставленных профессором П.М. Чумаковым (Научно-исследовательский институт Лернера, Кливленд, США).

В ходе работы были изучены 3 полиморфных варианта гена ТР53, мини-и микросателлитные участки в гене ТР53 (VNTR) и в локусе 17р13.1 (D17S796), метилирование промоторной области и 4-го экзона гена ТР53, соматические мутации на участках 5, 7 и 8-го экзонов и в прилежащих к ним интронных областях гена ТР53. В исследовании использована полимеразная цепная реакция и анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, метил-специфическая полимеразная цепная реакция, секвенирование (табл. 1).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0» (StatSoft Inc., США), Fisher's exact test (Khan, 2003). Для проверки гипотезы о значимости различий между исследуемыми группами использовали критерий согласия определяемый

Таблица 1 - Последовательности праймеров, используемые в данной работе

Регион Праймеры П.Н. Та Ссылка

3-й интрон (IVS3+41 ins 16bp) F5'-TGGGACTGACTTTCTGCTCTT-3' R5'-TCAAATCATCCATTGCTTGG-3' 180 196 57°C (Wu et al., 2002)

6-й интрон (IVS6+62G>A) F5'-TGGCCATCTACAAGCAGTCA-3' R5'-TTGCACATCTCATGGGGTTA-3' 404 57°C (Wuet al., 2002)

4-й экзон (Ех4+119G>C) F5'-TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA-3' R5'-TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC-3' 199 63°C (Ara et al., 1990)

VNTR (1-й интрон гена ТР53) F5'-ACTCCAGCCTGGGCAATAAGAGCT-3' R5'-ACAAAACATCCCCTACCAAACAGC-3' 131 64°C (Hahn et al., 1993)

D17S796 F5 '-C A ATGG A ACC A AATGTGGTC-3' R5'-AGTCCGATAATGCCAGGATG-3' 144174 63°C (Grebe et al., 1997)

Промотор (CG повторы) Mt F5 '-CGTCGTATTTCGGATTAGATTTC-3' Mt R5'-AAAAAAACGTAAACGCTTCTCGC-3' 166 55°C (Almeida et al., 2009)

UnMt F5'-GGTTGTTGTATTTTGGATTAGATTTT-3' UnMt R5'-AAAAAAAACATAAACACTTCTCACC-3' 170

4-й экзон (CG повторы) F5'-GTCGTTTTAAGTAATGGATG-3' R5'-AACAACTAACCGTACAAATCAC-3' 281 53°C собственный дизайн

5-й экзон F5'-GCCGTCTTCCAGTTGCTTTATC-3' R5'-GCCAGACCTAAGAGCAATCAGTG-3' 344 63°C

7-й экзон F5'-GGAGAATGGCGTGAACCTGG-3' R5'- GG AAG AAATCGGTAAGAGGTGGG-3' 383

8-й экзон F5 '-GAATCTCCTTACTGCTCCCACTC-3' R5'-GTCTCCTCCACCGCTTCTTG-3' 380

Примечания: F - прямой праймер; R - обратный праймер; Mt, UnMt - праймеры на метилированную и неметилиро-ванную последовательности; Та - температура отжига.

в четырехпольных таблицах (при значении абсолютных частот в анализируемых ячейках больше 10). В том случае, если значение таковых было меньше 10 и 5, использовали критерий х2 с поправкой Йетса и точный критерий Фишера (Ф), соответственно. Файлы секвенирования ДНК обрабатывали с помощью пакета прикладных программ DNADynamo (Blue Tractor Software Ltd., Великобритания). В качестве референсной последовательности использовали вариант гена ТР53 (NC_000017.9), полученный из базы данных Национального института биотехнологии (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Информацию об известных на настоящий момент мутациях в гене ТР53 получали из соответствующей базы данных (IARC ТР53 Mutation Database R14) (Petitjean et al., 2007). При анализе мутаций использована номенклатура (версия октябрь 2007 г.) описания генетических вариаций (den Dünnen, Antonarakis, 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Распределение генотипов по полиморфизму гена ТР53 (Ex4+119G>C, IVS6+62G>A и IVS3+41insl6bp) у больных РМЖ в крови и опухолевой ткани

В опухолевой ткани больных РМЖ по сравнению с лейкоцитами периферической крови нами отмечена тенденция к уменьшению частоты гетерозиготного генотипа по Ех4+119G>C полиморфизму (р=0,09; табл. 2).

Таблица 2 - Распределение генотипов гена ТР53 (полиморфизм Ех4+119С>С, 1У83+41тБ16Ьр и 1УБ6+620>А) у больных РМЖ в лейкоцитах крови и в опухолевой ткани __

Генотипы Парные образцы крови и опухоли РМЖ (п=80)

лейкоциты крови опухоль

N % N %

G/G 42 52,5 39 48,8 0,63

G/C 32 40,0 22 27,5 0,09

Ex4+119G>C С/С 6 7,5 6 7,5 1,00

G/- - - И 13,7 -

-/C - - 2 2,5 -

w/w 65 81,3 61 76,3 0,43

IVS3+41insl6bp w/16bp 14 17,5 15 18,7 0,83

16bp/16bp 1 1,2 2 2,5 0,56

w/- - - 2 2,5 -

G/G 63 78,8 58 72,5 0,35

IVS6+62G>A G/A 16 20,0 21 26,3 0,34

A/A 1 1,2 1 1,2 1,00

Примечанш: * - уровень статистической значимости различий распределения генотипов между лейкоцитами периферической крови и опухолевой тканью; О/-, -/С и w/- - генотипы с утратой одного аллеля.

В 26,3% (21/80) случаев нами идентифицированы мутации в полиморфных сайтах гена ТР53 в опухолевой ткани больных РМЖ, приводящие к несоответствию генотипов в лейкоцитах периферической крови и в опухоли. Большая часть (66,7%; 14/21) таких мутаций обусловлена утратой одного ал-леля у гетерозиготных пациенток, в частности, в 78,6% (11/14) потерей алле-ля С по Ex4+119G>C полиморфизму (табл. 2,3). Следует также отметить, что потеря аллелей гена ТР53 детектировались почти у половины (38,9%; 14/36) гетерозиготных носителей (Ex4+119G>C и IVS3+41insl6bp). В меньшем числе случаев (33,3%; 7/21) были обнаружены различные типы мутаций, представленные точечными заменами c.214G>C и c.672+62G>A либо инсерцией 16 п.н. в полиморфных сайтах гена ТР53 (Ex4+119G>C, IVS6+62G>A и IVS3+41insl6bp) (данные не представлены).

Таблица 3 - Мутации в полиморфных сайтах гена ТР53, обнаруженные в опухолевой ткани больных раком молочной железы

Образец Генотип: кровь —> опухоль LOH

Ex4+119G>C IYS3+41insl6bp IVS6+62G>A VNTR D17S796

1 G/C —» G/- - - - +

2 G/C ->• G/- - - - +

3 G/C G/- - - + +

4 G/C G/- - - + +

5 G/C — G/- - - - -

6 G/C -> G/- - - + +

7 G/C G/- - - + +

8 G/C ->• G/- - - + +

9 G/C — G/- w/16bp —► w/- - + +

10 G/C — G/- - - + -

11 G/C — G/- w/w —> w/16bp G/G — G/A + +

12 G/C -> С/- - - - +

13 G/C — C/- - - - -

14 - w/16bp —> w/- - - +

Примечания: LOH - оценка потери гетерозиготности по мини- и микро-сателлитному локусам; "-" - отсутствие LOH на данном участке; "+" - нали-

чие LOH.

Изучение потери гетерозиготности у больных РМЖ, носителей гетерозиготного генотипа гена ТР53 (Ex4+119G>C и IVS3+41insl6bp) с утратой аллелей в опухоли

Проведенный анализ мини- и микросателлитных локусов показал, что большинство гетерозиготных больных РМЖ (85,7%, 12/14), в опухоли которых отмечалась утрата одного аллеля, характеризуется аллельным дисбалансом на двух локусах, при этом на вариабельном участке 1-го интрона гена ТР53 LOH детектировалась в 57,1% (8/14) случаев (Рис. 1; табл. 3).

Рис. 1 - Пример анализа потери гетерозиготности по участкам VNTR в 1-м интроне гена ТР53 (А) и D17S796 (В). 1 - образец с LOH; 2 - образец без LOH; * - уровень флюоресценции; ** - температура плавления

Изучение метилирования и соматических мутаций гена ТР53 у гетерозиготных больных РМЖ с потерей одного и сохранением другого аллелей

Метилирование CG пар в промоторной области ассоциировано с потерей генной экспрессии и прекращением образования белкового продукта (Agirre et al., 2003; Duffy et al., 2009). Кроме того, эпигенетические модификации эк-зонных областей могут отражаться на компактизации хроматина и снижении интенсивности репликации ДНК (Sharma et al., 2010). В соответствии с этим нами проведен анализ метилирования промотора, а также 4-го экзона гена ТР53 ввиду того, что большинство случаев делеции аллелей детектировалось у гетерозиготных по Ex4+119G>C полиморфизму больных РМЖ (табл. 3). Ни в одном из проанализированных нами опухолевых образцов не установлено метилирование CG пар промоторной области гена ТР53 (Рис. 2А). При анализе статуса метилирования CG повторов 4-го экзона гена ТР53 мы обнаружили, что ДНК лейкоцитов периферической крови здоровых людей, а также опухолевая ДНК пациенток с РМЖ содержали метилированные цитозины (Рис. 2Б). Данный факт весьма интересен, поскольку ранее высокий уровень (до 50%) метилирования 4-го экзона был отмечен в бластоцистах зародышей человека (Magdinier et al., 2002). В связи с этим авторами сделано предположение о значительной роли процесса метилирования гена ТР53 на участке 4-го экзона в предимплантационном развитии организма человека. Однако в настоящее время показано, что метилирование достаточно часто встречается и в отсутствии патологии, т.е в норме (Zhang, Meaney, 2010).

При секвенировании 5,7 и 8-го экзонов и прилежащих к ним интронных областей гена ТР53 (Рис. 2 В,Г) у больных РМЖ с соматическими мутациями данного гена чаще наблюдалась потеря аллеля С (Ех4+119G>C)

: ■■■■■ЗРИ« , у; ■ 242 : • 4 - -**110 ТТТТАТАТТдаТ&&ТТТТТСТА ттттАтжтсбвсеетттттвтА ТТТТАТАТССССССТТТТТСТА НМР НК о

НМ м НМ М НМ М НМ М НМ м дп Образцы ПК НК ММВ т А "Т С в в С С

стттвй.сстссвтст'г'гетосгста'гсстаее^ стттемв^есатет'гтстсжстетсстввб^ аДаАЛАлЛМАДл

с»- с т Ст с д г <; т т г с г а431:с.818с>а г <; I г 1 с т о а с г а г р Образец №14: с.8270а

Рис. 2 - Анализ метилирования промоторной области (А), 4-го экзона (Б) и хроматограммы анализа нуклеотидной последовательности (В, Г) гена ТР53 в опухолевой ткани больных РМЖ. ММВ - маркер молекулярного веса; НК, ПК -негативный и позитивный контроли; М, НМ - праймеры на метилированную и неметилированную последовательности; НМР- неметилированная референсная последовательность; О - опухолевый образец; А431 - опухолевая линия

(табл. 4, табл. 5; точный критерий Фишера: односторонний р=0,02; двусторонний р=0,03).

Таблица 4 - Частота потери аллеля С (Ех4+119С>С) гена ТР53 у больных РМЖ с наличием либо отсутствием соматических мутаций в 5, 7 и 8-м экзонах и прилежащих к ним интронах__

Наличие мутаций гена ТР53

норма (п=19) мутации (п=15) Р

N % N %

Потеря аллеля С - 16 84,2 7 46,7 0,02*

+ 3 15,8 8 53,3 0,03**

Примечания: "-", "+" - отсутствие/наличие потери аллеля С. В таблице приведен уровень статистической значимости точного одностороннего (*) и двустороннего (**) критерия Фишера.

Таблица 5 - Соматические мутации гена ТР53, обнаруженные у больных

РМЖ

Участок Позиция в кДНК и первичной структуре белка р53 Частота в IARC TP53 Mutation Database R14 Тип мутации

Интрон

4 с.376-57А>С * интронная

6 c.673-20G>C * интронная

7 с.782+18А>Т ** интронная

8 с.919+26 c.919+27insl * интронная

Экзон

5 C.3900T, p.Leul30Leu 0,14 сайленс

5 с.466С>Т, p.Argl56Cys 1,24 миссенс

5 c.488A>G, p.Tyrl63Cys 0,17 миссенс

5 c.501G>C, p.Glnl67His 0,04 миссенс

5 c.538G>A, p.Glul80Lys 0,14 миссенс

5 c.541C>T, p.Argl81Cys 1,28 миссенс

5 c.557A>G, p.Aspl86GIy 0,09 миссенс

7 c.697 699del3 * фреймшифт

7 c.697C>T, p.His233Tyr 0,07 миссенс

7 c.743G>A, p.Arg248Gln 1,24 миссенс

7 c.762C>T, p.Ile254Ile 0,14 сайленс

8 c.827C>A, p.Ala276Asp 0,04 миссенс

8 c.856G>A, p.Glu286Lys 0,23 миссенс

Примечания: * - новые мутации в гене ТР53, ранее не представленные в IARC ТР53 Mutation Database R14; ** - частота мутации не приведена в IARC ТР53 Mutation Database R14.

Проведенный анализ соматических мутаций в гене ТР53 у больных РМЖ позволил получить приоритетные сведения, поскольку в настоящее время данный тип нарушений в опухолях молочной железы на территории Российской Федерации охарактеризован плохо. В текущей версии IARC ТР53 Mutation Database R14 информация о мутациях гена ТР53 при РМЖ в РФ не представлена совсем (Petitjean et al., 2007). Однако, в 2008-м году группой российских исследователей охарактеризован спектр соматических мутаций у российских женщин с уни- и билатеральным РМЖ (Suspitsin et al., 2008). В нашем исследовании большинство мутаций ранее были обнаружены при РМЖ другими авторами (табл. 5), однако одна - c.501G>C - идентифицирована при данном заболевании впервые. Четыре мутации (три в интронных областях - с.376-57А>С, c.673-20G>C, с .919+26_с.919+27ins I и одна в 7-м экзоне - c.697_699del3) обнаружены нами впервые (данные нарушения не представлены в IARC ТР53 Mutation Database R14).

Двухударная модель инактивации гена ТР53 при раке молочной железы

Учитывая вышеприведенные результаты, можно заключить, что инактивация гена ТР53 при РМЖ происходит в рамках двухударной концепции А. Кнудсона, когда один аллель содержит мутацию, а второй делетирован. В большинстве случаев мы наблюдаем данную закономерность для гетерозиготных по Ex4+119G>C полиморфизму больных РМЖ, при этом функциональная дифференциация между аллелями может определять инактивирую-щие события в гене ТР53 (Рис. 3). В частности, аллельный вариант С, белок р53Рго которого является ярко выраженной трансактивационной и репарационной молекулой, преимущественно утрачивается посредством делеции (потеря гетерозиготности), а аллель G, кодирующий более слабый в плане защиты от стрессорных воздействий белок p53Arg, инактивируется точечными мутациями в 5,7 и 8-м экзонах гена TP53.

ГЕН TPS3 (Ex4+119G C)

Рис. 3 - Двухударная модель инактивации гена-супрессора опухолевого роста ТР53 при раке молочной железы. Рассмотрен пример инактивации гена ТР53 у гетерозиготных по Ех4+119С>С полиморфизму больных РМЖ

Полиморфизм гена ТР53 (Ex4+119G>C, IVS6+62G>A

и rVS3+41insl6bp) и клиническое течение рака молочной железы

Были изучены частоты различных генотипов и аллелей гена ТР53 у больных РМЖ с различными патогенетическими характеристиками злокачественного процесса. Отмечено, что у больных РМЖ с генотипом С/С (Ex4+119G>C) по сравнению с пациентками с G/G и G/C чаще наблюдался клинически более благоприятный локализованный процесс заболевания (83,3% против 35,7% и 34,4%, соответственно; точный критерий Фишера: односторонний р=0,03; двусторонний р=0,06). Кроме того, у женщин с генотипом С/С отмечался только уницентрический характер роста опухоли, тогда как почти у четверти носителей G/G генотипа обнаружены мультифокальные опухоли, более агрессивные по своей природе (табл. 6). Следует отметить, что и носителей аллеля С было вдвое больше в группе больных с уницентри-ческими опухолями, чем среди больных с мультицентрическим ростом (данные не представлены). Также установлено, что у больных РМЖ с наличием экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону на опухолевых клетках по сравнению с пациентками с рецептор-негативными опухолями чаще встречаются обнаруженные нами мутации в полиморфных сайтах гена ТР53 (данные не представлены).

Таблица 6 - Частота уницентрического (УЦ) и мультицентрического (МЦ) РМЖ, отсутствие (N0) и наличие (N1.;) локорегионарного метастазиро-вания у больных с генотипами по полиморфизму Ех4+119С>С гена ТР53

Генотипы (Ex4+119G>C) G/G G/C с/с

N % N % N %

Характер опухолевого роста УЦ 28 75,7 22 81,5 6 100,0

МЦ 9 24,3 5 18,5 0 0,0

Р 0,80* -

Лимфогенное метастазирование Ne 15 35,7 11 34,4 5 83,3

N,.2 27 64,3 21 65,6 1 16,7

Р 0,90* 0,03** 0,06***

Примечания: * - уровень статистической значимости различий между больными РМЖ с генотипами G/G и G/C; **, *** - уровень статистической значимости точного одностороннего и двустороннего критерия Фишера, соответственно, показывающий различия между группами больных РМЖ с генотипами G/G и С/С, G/C и С/С.

Заключение

В данной работе проведено изучение полиморфизма гена ТР53 (Ex4+119G>C, IVS6+62G>A и IVS3+41insl6bp) в лейкоцитах периферической крови и в опухоли больных РМЖ, выявлены основные события, приводящие к инактивации р53 в опухоли по принципу двухударного механизма. Осуществлена оценка влияния полиморфных вариантов и мутаций гена ТР53

на клиническое течение РМЖ посредством выявления связи с различными проявлениями опухолевой прогрессии.

РМЖ характеризуется чрезвычайной вариабельностью течения злокачественного процесса, молекулярные механизмы которого во многом остаются неясными. Нарушения в гене ТР53, который осуществляет регуляцию генов, вовлеченных в опухолевую прогрессию, могут вносить вклад в клиническое течение РМЖ. По нашим результатам больные РМЖ, носители генотипа С/С (Ex4+119G>C полиморфизм), чаще характеризуются менее агрессивным уницентрическим ростом опухоли и низкой склонностью к лимфогенному метастазированию, что может обеспечивать благоприятный прогноз заболевания для данной категории больных РМЖ. Показанная закономерность косвенно подтверждается данными о пониженном риске регионарного метаста-зирования у пациенток с уницентрическим РМЖ (Керимов, 2006; Вторушин,

2007). Механизм вклада Ex4+119G>C полиморфизма гена ТР53 в указанные проявления опухолевой профессии может объясняться высоким трансакти-вационным потенциалом белка р53Рго, кодируемого аллелем С, в отношении индукции транскрипции антиметастатических генов и генов, ответственных за характер опухолевого роста и другие клинические формы профессии РМЖ (Mashimo et al., 1998; Zou et al„ 2000; van Golen, 2003; Stein et al., 2004; Bertucci et al., 2005; Van Laere et al., 2005; Wallden et al., 2005; Janicke et al.,

2008).

В 26,3% (21/80) случаев у больных РМЖ в опухолевой ткани показаны мутации в полиморфных сайтах (Ex4+119G>C, IVS6+62G>A и IVS3+41insl6bp) гена TP53, обусловленные в большинстве своем (66,7%; 14/21) утратой одного аллеля у гетерозиготных пациенток, среди них в 78,6% (11/14) случаев отмечена потеря аллеля С по Ex4+119G>C полиморфизму. Следует отметить, что утрата аллелей гена ТР53 детектировались почти у половины (38,9%; 14/36) гетерозиготных носителей. Мы показали, что основным механизмом, приводящим к потере аллелей, в частности, аллеля С, является делеция участка гена ТР53. Кроме того, потеря аллеля С и, соответственно, сохранение аллеля G, чаще встречаются у больных с соматическими мутациями гена ТР53 на участках 5, 7 и 8-го экзонов и прилежащих к ним интронах. Среди идентифицированных соматических мутаций гена ТР53 четыре (три в интронных областях - с.376-57А>С, c.673-20G>C, c.919+26_c.919+27insl и одна в 7-м экзоне - c.697_699del3) обнаружены впервые, т.к. они не представлены в базе IARC ТР53 Mutation Database R14 (Petitjean et al., 2007). Закономерность сочетания делеций, приводящих к потере аллеля С, и высокой частоты соматических мутаций, инактивирующих аллель G, позволяет нам рассмотреть данный феномен как подтверждение двухударной инактивации гена ТР53 в течении развития РМЖ (концепция А. Кнудсона). В клиническом ракурсе формирование мутаций в полиморфных сайтах гена ТР53 ассоциировано с экспрессией рецепторов к эстрогенам и прогестерону. Механизм ассоциации, вероятно, заключается в наличии непосредственного генотоксического воздействия метаболитов эстрогенов на ген ТР53 (Joosten et al., 2004; Zoon et al., 2009).

Литературные сведения о наличии высокого трансактивационного и репарационного потенциала для кодируемого белка p53Pro (Thomas et al., 1999; Pirn, Banks, 2004; Siddique, Sabapathy, 2006) наряду с нашими данными о связи кодирующего белок р53Рго аллеля С (Ex4+119G>C) с более благоприятным клиническим течением РМЖ и высокой частоте его потери в опухоли молочной железы, вероятно, придающей опухолевым клеткам селективное преимущество в росте, позволяют характеризовать данную молекулу р53 как наиболее биологически активную по сравнению с p53Arg в плане проявления протективных свойств в отношении прогрессии РМЖ. Таким образом, на основании этого, а также учитывая ранее показанную в другом исследовании связь утраты аллеля С в опухолевой ткани с низкой безрецидивной и общей выживаемостью (Bonafe et al., 2003), мы можем рекомендовать анализ Ех4+1 J9G>C полиморфизма гена ТР53 и его соматического статуса в опухоли как дополнительный метод оценки злокачественности клинического течения в плане прогноза заболевания.

Полученные в исследовании результаты расширяют представления о вкладе гена ТР53 в патогенез рака молочной железы. Данные о связи аллелей и мутаций гена ТР53 с клиническими проявлениями опухолевой прогрессии могут служить основой для разработки дополнительных прогностических критериев заболевания.

ВЫВОДЫ

1. В 26,3% случаев у больных раком молочной железы в опухолевой ткани отмечены мутации в полиморфных сайтах (Ех4+119G>C, IVS6+62G>A и IVS3+41insl6bp) гена ТР53, в большинстве своем (66,7%) обусловленные утратой одного аллеля у гетерозиготных пациенток в 40,0% случаев, при этом в 78,6% выявлена потеря аллеля С (Ex4+119G>C).

2. У больных раком молочной железы, носителей гетерозиготного генотипа (Ex4+119G>C ), утрата одного из аллелей в опухоли объясняется делеци-ей участка гена ТР53, что подтверждается высоким уровнем (85,7%) потери гетерозиготности в локусе VNTR 1-го интрона гена ТР53 и на участке хромосомы 17р13.1 (локус D17S796) у данной категории пациенток.

3. У пациенток с раком молочной железы в случаях утраты одного и сохранения другого аллеля гена ТР53 в опухолевой ткани не обнаружено метилирование промоторной области данного гена.

4. Частота потери аллеля С (Ex4+119G>C) гена ТР53 в опухолевой ткани существенно выше у больных раком молочной железы с мутантным р53 (5,7, 8-й экзоны и смежные интроны) по сравнению с пациентками, не имеющими р53 мутаций (53,3% против 15,8%; точный критерий Фишера: односторонний р=0,02; двусторонний р=0,03).

5. В опухолевой ткани больных раком молочной железы идентифицированы четыре новые мутации гена ТР53 (три в интронных областях - с.376-57А>С, c.673-20G>C, c.919+26_c.919+27insl и одна в 7-м экзоне -c.697_699del3), которые не представлены в последней версии IARC ТР53 Database Mutation R14.

6. У пациенток с генотипом С/С (Ex4+119G>C) чаще наблюдался клинически благоприятный локализованный процесс (83,3%) заболевания по сравнению с носителями G/G (35,7%) и G/C (34,4%; точный критерий Фишера: односторонний р=0,03; двусторонний р=0,06) генотипов.

7. У больных раком молочной железы с экспрессией на клетках опухоли рецепторов к эстрогенам и прогестерону чаще встречаются мутации в полиморфных сайтах гена ТР53 (31,9% и 35,9%), чем у пациенток с отсутствием экспрессии (11,5%; 12,5%; точный критерий Фишера: односторонний р=0,04 и 0,02; двусторонний р=0,08 и 0,03, соответственно).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Чердынцева Н.В., Слонимская Е.М., Белявская В.А., Бабышкина Н.Н., Сметанникова Н.А., Гервас П.А., Денисов Е.В., Стахеева М.Н., Гарбу-ков Е.Ю., Малиновская Е.А., Литвяков Н.В., Воевода М.И. Исследование связи полиморфизма генов онкосупрессора р53, гена хемокинового рецептора CCR5 и их сочетаний с риском развития и прогрессированием рака молочной железы // Молекулярная медицина. 2007. № 1. С. 23-31.

2. Денисов Е.В., Литвяков Н.В., Стахеева М.Н., Гарбуков Е.Ю., Слонимская Е.М., Малиновская Е.А., Бабышкина Н.Н., Стегний В.Н., Чердынцева Н.В. Мутации в гене-супрессоре ТР53 и их связь с особенностями клинического течения рака молочной железы // Сибирский онкологический журнал. 2008. № 2. С. 32-36.

3. Перельмутер В.М., Завьялова М.В., Вторушин С.В., Слонимская Е.М., Крицкая Н.Г., Гарбуков Е.Ю., Литвяков Н.В., Стахеева М.Н., Бабышкина Н.Н., Малиновская ЕЛ., Денисов Е.В., Григорьева Е.С., Назаренко М.С., Сенников С.В., Горева Е.П., Козлов В.А., Воевода М.И., Максимов В.Н., Белявская В.А., Чердынцева Н.В. Генетические и клинико-патологические особенности рака молочной железы у больных с сохраненной менструальной функцией и в менопаузе // Успехи геронтологии. 2008. Т. 21, № 4. С. 643-653.

4. Denisov E.V., Cherdyntseva N.V., Litvjakov N.V., Malinovskaya E.A., Voe-voda M.I., Belyavskaya V.A., Stegniy V.N. TP53 mutations and Arg72Pro polymorphism in breast cancer patients' tumors II Cancer Genetics and Cytogenetics. 2009. Vol. 192. P. 93-95.

5. Чердынцева H.B., Слонимская E.M., Литвяков H.B., Стахеева М.Н., Бабышкина Н.Н., Гарбуков Е.Ю., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Дорошенко А.В., Красулина Н.А. Механизмы опухолевой прогрессии: роль генов апоптоза и цитокинов // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике / Под ред. А.Б. Масленникова. Вып. 11. Новосибирск: Альфа Виста, 2007. С. 28-39.

6. Денисов Е.В., Литвяков Н.В., Слонимская Е.М., Малиновская Е.А., Бабышкина Н.Н., Стегний В.Н., Белявская В.А., Воевода М.И., Чердынцева Н.В. Изучение взаимосвязи Arg72Pro полиморфизма и соматических мутаций гена ТР53 у больных раком молочной железы // Молекулярно-

биологические технологии в медицинской практике / Под ред. А.Б. Масленникова. Вып.13. Новосибирск: Альфа Виста, 2009. С. 66-74.

7. Чердынцева Н.В., Слонимская Е.М., Перельмутер В.М., Завьялова М.В., Вторушин C.B., Гуляева Л.Ф., Пустыльняк В.О., Гарбуков Е.Ю., Литвя-ков Н.В., Стахеева М.Н., Бабышкина H.H., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Григорьева Е.С., Лебедев И.Н., Назаренко М.С., Сенников C.B., Силков А.Н., Жовмер A.C., Горева Е.П., Гришанова А.Ю., Горева О.Б., Середина Т.А., Талабан В.О., Ляхович В.В., Голованова О.В., Шевченко

A.B., Салахутдинова М.Ю., Максимов В.Н., Воевода М.И., Коненков

B.И., Пузырев В.П., Козлов В.А. Генетические полиморфизмы в риске формирования и прогрессии рака молочной железы в сибирском регионе России // Материалы Сибирско-Тайваньского форума. Томск, 2009.

C.19-25.

8. Денисов Е.В., Гервас П.А. Полиморфизм онкосупрессорного гена р53 и гена хемокинового рецептора CCR5 у больных раком молочной железы // Материалы XLIII международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск, 2005. С. 17.

9. Чердынцева Н.В., Белявская В.А., Севостьянова Н.В., Уразова Л.Н., Гервас П.А., Коломиец С.А., Литвяков Н.В., Денисов Е.В., Воевода М.И., Чойнзонов Е.Ц. CCR5 как потенциальный медиатр активности Р53: комбинации аллеальных полиморфизмов CCR5 и Р53 у больных со злокачественными новообразованиями // Тезисы I Российско-американской конференции "Биотехнология и онкология". Санкт-Петербург, 2005. С. 142-143.

10. Гервас П.А., Бабышкина H.H., Денисов Е.В., Слонимская Е.М., Стахеева М.Н., Чердынцева Н.В. Исследование полиморфизма 72 кодона гена р53 у больных раком молочной железы // Материалы итоговой научно-практической конференции с международным участием "Актуальные вопросы здравоохранения регионов Сибири". Красноярск, 2005. С. 299-300.

11. Чердынцева Н.В., Белявская В.А., Севостьянова Н.В., Гервас П.А., Уразова Л.Н., Слонимская Е.М., Коломиец С.А., Литвяков Н.В., Бабышкина H.H., Стахеева М.Н., Денисов Е.В., Воевода М.И., Чойнзонов ЕЛ. Исследование роли комбинаций вариантных аллелей генов апоптоза, ферментов метаболизма и цитокинов в риске возникновения и прогнозе клинического течения злокачественных новообразований // Материалы II мезвдународной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность". Москва, 2005. С. 283-284.

12. Гервас П.А., Денисов Е.В., Бабышкина H.H., Стахеева М.Н., Слонимская Е.М., Белявская В.А., Чердынцева Н.В. Опухолеассоциированный полиморфизм генов р53 и CCR5 у больных раком молочной железы // Тезисы I Съезда терапевтов Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск, 2005. С. 180-182.

13. Денисов Е.В., Гервас П.А., Бабышкина H.H., Савенкова О.В., Глущенко С.А., Малиновская Е.А. Полиморфизм участков генов р53 и хемокино-

вого рецептора CCR5: связь с прогрессией рака молочной железы // Материалы XLIV международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» Новосибирск, 2006. С. 116.

14. Денисов Е.В., Гервас П.А., Бабышкина Н.Н., Савенкова О.В., Глущенко С.А., Малиновская Е.А. Популяционно-генетический анализ связи полиморфизма участков генов р53 и CCR5 с прогрессией рака молочной железы // Материалы LV научной студенческой конференции биолого-почвенного факультета Томского государственного университета "Старт в науку". Томск, 2006. С. 3-4.

15. Cherdyntseva N.V., Belyavskaya V.A., Gervas Р.А., Fleming M.V., Sevos-tyanova N.V., Kolomiets S.A., Denisov E.V., Slonimskaya E.M., Voevoda M.I., Perelmuter V.M., Choinzonov E.L. Cytokine and apoptotic gene polymorphism association with cancer progression and prognosis // The proceedings of З1"1 International conference. Novosibirsk, 2006. P. 23.

16. Бабышкина H.H., Гервас П.А., Денисов Е.В., Сметанникова Н.А., Белявская В.А., Стахеева М.Н., Чердынцева Н.В., Слонимская Е.М. Полиморфизм гена хемокиновго рецептора CCR5 и онкосупрессорного белка р53: взаимосвязь с риском формирования и прогрессированием рака молочной железы // Материалы X Российского онкологического конгресса. Москва, 2006. С. 168.

17. Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Бабышкина Н.Н., Лит-вяков Н.В. Анализ полиморфизма и соматических мутаций гена р53 при раке молочной железы // Материалы XLV международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск, 2007. С. 149-150.

18. Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Бабышкина Н.Н., Лит-вяков Н.В., Чердынцева Н.В. Генетический полиморфизм и мутации онкосупрессорного гена р53 у больных раком молочной железы // Тезисы XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007». Москва, 2007. С. 51-52.

19. Денисов Е.В., Литвяков Н.В., Слонимская Е.М., Малиновская Е.А., Бабышкина Н.Н., Григорьева Е.А., Гарбуков Е.Ю., Чердынцева Н.В. Взаимосвязь Arg72Pro полиморфизма гена р53 с уровнем соматических мутаций того же гена в клетках рака молочной железы // Материалы 3-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения-2007». Санкт-Петербург, 2007. С. 12-13.

20. Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Бабышкина Н.Н., Литвяков Н.В. Мутации и полиморфизм в гене р53 у больных раком молочной железы // Материалы LVI научной студенческой конференции биолого-почвенного факультета Томского государственного университета "Старт в науку" Томск, 2007. С. 8-9.

21. Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Бабышкина Н.Н., Литвяков Н.В. Взаимосвязь соматических мутаций полиморфизма гена р53 у больных раком молочной железы // Материалы региональной конференции молодых ученых им. Академика РАМН Н.В. Васильева "Акту-

альные вопросы экспериментальной и клинической онкологии". Томск, 2007. С. 39-41.

22. Денисов Е.В., Бабышкина H.H., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Лит-вяков Н.В., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Статус гена р53 при раке молочной железы: взаимосвязь мутаций и полиморфизма 72 кодона // Материалы III международной конференции «Фундаментальные науки -медицине». Новосибирск, 2007. С. 23.

23. Чердынцева Н.В., Гервас П.А., Малиновская Е.А., Бабышкина H.H., Литвяков Н.В., Денисов Е.В., Слонимская Е.М., Стахеева М.Н., Тузиков С.А., Белявская В.А., Воевода М.И., Перельмутер В.М. Подходы генетической эпидемиологии: от оценки риска до прогнозирования исхода злокачественных новообразований// Материалы III международной конференции «Фундаментальные науки - медицине». Новосибирск, 2007. С. 81.

24. Денисов Е.В., Бабышкина H.H., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Литвяков Н.В. Полиморфизм и частота соматических мутаций гена р53 у больных раком молочной железы // Научные труды VIII конференции с международным участием "Генетика человека и патология". Томск, 2007. С. 311-312.

25. Чердынцева Н.В., Гервас П.А., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Бабышкина H.H., Литвяков Н.В., Слонимская Е.М., Стахеева М.Н., Тузиков С.А., Гарбуков Е.Ю., Перельмутер В.М., Белявская В.А., Воевода М.И. Полиморфизм гена онкосупрессора р53 и функционально связанных генов в оценке риска и прогноза злокачественных новообразований // Научные труды VIII конференции с международным участием "Генетика человека и патология". Томск, 2007. С. 324-325.

26. Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Бабышкина H.H., Вто-рушин С.В., Глущенко С.А., Литвяков Н.В. Мутации гена TPS3 при раке молочной железы и их взаимосвязь с клинико-патологическими параметрами заболевания // Материалы III региональной конференции молодых ученых им. Академика РАМН Н.В. Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии". Томск, 2008. С. 39-40.

27. Бабышкина H.H., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Стахеева М.Н., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Изучение связи полиморфных вариантов генов CCR5 и Р53 с лимфогенным метастазированием у больных раком молочной железы // Материалы Российской научно-практической конференции "Современные аспекты диагностики и лечения рака молочной железы". Томск, 2008. С. 25-26.

28. Денисов Е.В., Бабышкина H.H., Малиновская Е.А., Литвяков Н.В., Стегний В.Н., Чердынцева Н.В. Селективная инактивация Arg72Pro аллелей гена ТР53 при раке молочной железы // Материалы всероссийской конференции с международным участием "Молекулярная онкология". Новосибирск, 2008. С. 13-14.

29. Бабышкина Н.Н., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Стахеева М.Н., Чер-дынцева Н.В., Слонимская Е.М. Взаимосвязь полиморфных вариантов гена-онкосупрессора р53 и гена хемокинового рецептора CCR5 с риском возникновения и прогрессированием рака молочной железы // Материалы всероссийской конференции с международным участием "Молекулярная онкология". Новосибирск, 2008. С. 77-78.

30. Чердынцева Н.В., Белявская В.А., Гервас ПЛ., Добродеев А.Ю., Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Бабышкина Н.Н., Литвяков Н.В., Тузиков С.А., Слонимская Е.М., Перельмутер В.М. Роль гена р53 в формировании и прогрессии злокачественных новообразований // Материалы всероссийской конференции с международным участием "Молекулярная онкология". Новосибирск, 2008. С. 165-166.

31. Denisov E.V., Babyshkina N.N., Litvjakov N.V., Malinovskaya E.V., Slo-nimskaya E.M., Stegniy V.N., Cherdyntseva N.V. TP53 gene mutations and Pro72Arg polymorphism in breast patient's tumour // Abstract Book of IMPART Breast Cancer Conférence. Brussels, 2009. P. ii38.

32. Денисов E.B., Сухановская T.B., Литвяков H.B., Малиновская Е.А., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Статус гена ТР53 как прогностический маркер рака молочной железы // Материалы С ибирско-Тайваньского форума. Томск, 2009. С. 102-103.

33. Денисов Е.В., Сухановская Т.В., Дульцева Т.С., Малиновская Е.А. Полиморфизм Arg72Pro гена ТР53 в опухолевой ткани: связь с характером опухолевого роста рака молочной железы // Материалы V региональной конференции молодых ученых им. Академика РАМН Н.В. Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии". Томск, 2010. С. 38-39.

34. Дульцева Т.С., Сухановская Т.В., Денисов Е.В. Новые мутации в гене-супрессоре опухолевого роста ТР53 у больных раком молочной железы Н Материалы V региональной конференции молодых ученых им. Академика РАМН Н.В. Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии". Томск, 2010. С. 39-40.

Тираж 110 экз. Заказ 853. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40. Тел.(3822)533018.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Денисов, Евгений Владимирович

Список сокращений.

Введение.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Основные этапы в изучении гена ТР53 (белка р53).

1.2 Ген ТР53, структура.

1.3 Белок р53.

1.3.1 Структура белка р53.

1.3.2 Регуляция транскрипционной активности р53.

1.3.3 Функциональные аспекты белка р53.

1.3.3.1 Участие белка р53 в контроле клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза.

1.3.3.2 Участие белка р53 в регуляции процессов аутофагии, антиоксидантной защиты и метаболизма.

1.4 Вариации и нарушения в структуре гена ТР53: связь с формированием и развитием рака молочной железы.

1.4.1 Полиморфизм Ex4+119G>C.

1.4.2 Полиморфизм IVS3+41insl6bp и IVS6+62G>A.

1.4.3 Аллельный дисбаланс в гене TP53.

1.4.4 Соматические мутации в гене TP53.

1.4.5 Метилирование гена ТР53.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материалы исследования.!.

2.2 Методы исследования.

2.2.1 Выделение ДНК.

2.2.2 Полимеразная цепная реакция.

2.2.3 SNP-анализ.

2.2.4 Мини- и микросателлитный анализ.

2.2.5 Метил-специфическая ПЦР.

2.2.6 Секвенирование.

2.2.7 Статистическая обработка данных.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Характеристика полиморфизма гена TP53.

Ех4+119G>C, IVS6+62G>A и IVS3+41insl6bp) у больных раком молочной железы.

3.2 Изучение потери гетерозиготности у больных РМЖ, носителей гетерозиготного генотипа гена TP53 (Ех4+119G>C и

IVS3+41insl6bp) с утратой аллелей в опухоли.

3.3 Изучение метилирования гена TP53 у гетерозиготных больных раком молочной железы с потерей одного и сохранением другого аллелей в опухолевой ткани.

3.4 Изучение соматических мутаций гена TP53 у гетерозиготных больных раком молочной железы с потерей одного и сохранением другого аллелей в опухолевой ткани.

3.5 Двухударная модель инактивации гена TP 53 при раке молочной железы.

3.6 Полиморфизм, мутации в гене TP 53 и клиническое течение рака молочной железы.

3.6.1 Ех4+119G>C полиморфизм гена TP53 и характер опухолевого роста рака молочной железы.

3.6.2 Ех4+119G>C полиморфизм гена TP53 и лимфогенное метастазирование рака молочной железы.

3.6.3 Мутации в полиморфных сайтах гена TP53 и экспрессия рецепторов к половым гормонам при раке молочной железы.

3.6.4 Соматические мутации в гене TP53 и патогенетические характеристики опухолевого процесса.

3.6.5 Мутации в гене TP53 и наследственная отягощенность по раку молочной железы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мутационная изменчивость гена TP53 при раке молочной железы"

Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующие позиции по заболеваемости злокачественными новообразованиями среди женщин, каждая 12-я имеет риск заболеть в течение жизни, смертность составляет 25-40% (Washbrook, 2006; Комарова, 2008; Давыдов, Аксель, 2009; Чиссов, 2009). Генетическая детерминация, обусловленная наследственно передающимися нарушениями в высокопенетрантных генах, детектируется лишь в 5-8% случаев РМЖ (Карпухин и др., 2002; Любченко и др., 2007; Bradbury, Olopade, 2007; Коваленко и др., 2008; Foulkes, 2008). Изучению этиологии, генетических факторов и молекулярных механизмов спорадического РМЖ посвящено большое количество работ (Fackenthal, Olopade, 2007; Пустыльняк и др., 2008; Соколенко и др., 2008; Голованова и др., 2009; Силков и др., 2009; Campa et al., 2009; Reinholz et al., 2009; Sehl et al., 2009; Tsuda, 2009 и др.), однако до сих пор проблема остается до конца не решенной (Имянитов, Хансон, 2004; Friedrich et al., 2008). Злокачественная трансформация клеток и опухолевая прогрессия, проявляющаяся клинически инвазией, регионарным и отдаленным метастазированием, связаны с нарушениями нормального функционирования генома и, как следствие, с высокой генетической нестабильностью, под влиянием эндогенных и экзогенных канцерогенных факторов, действие которых существенно модифицируется разной индивидуальной генетической предрасположенностью к заболеванию (Egger et al., 2004; Sprague et al., 2007; Копнин, 2007; Заридзе, 2008; Блохин, 2009). Молекулярный патогенез РМЖ, как и многих других онкологических заболеваний, включает множество генетических и эпигенетических событий, ведущих к активации онкогенов и инактивации генов опухолевой супрессии, лежащих в основе опухолевой трансформации (Ляхович и др., 2004; Payne, Kemp, 2005; Croce, 2008; Залетаев и др., 2008; Лихтенштейн, 2009).

Ген ТР53 является одним из ключевых генов-супрессоров опухолевого роста, функция которого направлена на ограничение вероятности возникновения генетически нестабильных клеток. Белок р53 осуществляет регуляцию 5 широкого спектра клеточных процессов, выступая своего рода "молекулярным полисменом", ведущим постоянный надзор за состоянием генома и устраняющим потенциально опасные в плане злокачественной трансформации клетки (Phillips, 1999; Чумаков, 2007; Vousden, Lane, 2007; Копнин и др., 2008). TP 53 является транскрипционным фактором свыше 300 генов, отвечающих за активацию таких жизненно важных процессов, как репликация, репарация ДНК, апоптоз, антиоксидантная защита и др. (Kumar et al., 2007). В человеческих популяциях активность белка р53 в значительной степени модифицирована генетическим полиморфизмом, наиболее значимым является точечная замена гуанина на цитозин в 72-м кодоне 4-го экзона (Ex4+119G>C, Arg72Pro, rs 1042522), при этом G и С аллели кодируют различающиеся по биохимическим и физиологическим свойствам белки, обладающие разной эффективностью в поддержании генетического гомеостаза клетки в условиях влияния генотоксических факторов (Thomas et al., 1999; Wu et al., 2002; Gemignani et al., 2004; Pim, Banks, 2004; Salvioli et al, 2005; Siddique, Sabapathy, 2006). Полиморфизм в 6-м интроне (IVS6+62G>A, rs 1625895), а также инсерция/делеция 16 п.н. в 3-м интроне (INDEL, IVS3+41insl6bp, rs 17878362) могут существенно изменять «дозу» гена, тем самым влияя на активность белка р53 (Whibley et al., 2009). По данным последних мета-анализов, не обнаружено ассоциации формирования РМЖ с тем или иным генотипом (аллелем) по Ex4+119G>C и IVS6+62G>A полиморфизму гена ТР53, тогда как инсерция 16 п.н. (IVS3+41insl6bp) играла роль в развитии данного заболевания (Ни et al., 2010; Ma et al., 2010). При этом в литературе имеются довольно противоречивые данные о связи определенных генотипов (Ex4+119G>C) гена ТР53 с прогрессией РМЖ (Tommiska et al., 2005; Xu et al., 2005; Чердынцева и др., 2006; Damin et al., 2006; Toyama et al., 2007; Costa et al., 2008; Xu et al., 2008; Hrstka et al., 2009). Недостаточная информативность мета-анализов и неоднозначность результатов при оценке ассоциации полиморфизма ТР53 с патогенетическими признаками заболевания могут быть обусловлены недоучетом статуса р53 собст6 венно в опухолевых клетках, поскольку именно его нарушения в виде соматических мутаций, эпигенетических модификаций и аллельного дисбаланса вносят существенный вклад в злокачественную трансформацию. Генетические изменения, приводящие к дисфункции опухолевых супрессоров, часто происходят в результате классического «двухударного» механизма: соматические мутации либо метилирование в одном аллеле и утрата другого (Knudson, 1971, 2001). Ген TP53, как наиболее транскрипционно активный, чья экспрессия индуцируется многими стрессорными стимулами, является высокочувствительной мишенью мутагенеза. При РМЖ до 50% опухолей содержат мутации в гене ТР53, приводящие к частичной либо полной потере функциональности белка, и, более того, часто способствующие приобретению им онкогенных свойств. Такие различия в «функциональной значимости» мутаций, по-видимому, не позволяют получить однозначных результатов об их связи с проявлениями опухолевой прогрессии (Feki, Irminger-Finger, 2004; Petitjean et al., 2007a; Brosh, Rotter, 2009). В литературе есть немногочисленные указания, что метилирование гена ТР53 при РМЖ может выступать в качестве альтернативного механизма инактивации белка р53, и ассоциировано с инвазивностью опухолевого процесса (Kang et al., 2001). Недавно в опухолевой ткани гетерозиготных по Ex4+119G>C полиморфизму больных РМЖ был показан феномен потери определенных аллелей гена ТР53 (Bonafe et al., 2003; Kyndi et al., 2006). Более того, авторы выявили ассоциацию утраты аллелей с показателями выживаемости пациентов, однако плохой прогноз в этих исследованиях был связан с потерей разных аллелей. Неоднозначность полученных этими авторами данных указывает на важность продолжения исследований. Таким образом, соматические мутации в гене ТР53, метилирование и утрата аллелей могут обуславливать «двухудар-ную» инактивацию гена ТР53, которая вносит вклад в формирование и прогрессию РМЖ. Все вышесказанное указывает на актуальность исследований, учитывающих все возможные варианты изменений в гене ТР53, которые могут определять потенциальные механизмы его участия в опухолевой прогрессии РМЖ.

В этой связи целесообразным является сравнительное изучение полиморфизма гена ТР53 (Ex4+119G>C, IVS6+62G>A и IVS3+41insl6bp) у больных РМЖ в лейкоцитах крови и в опухоли, выявление механизма потери аллелей, оценка соматических мутаций и метилирования ТР53 в опухоли и влияния этих изменений на различные проявления опухолевой прогрессии РМЖ. Полученные данные послужат основой для определения дополнительных критериев прогноза клинического течения заболевания.

Задачи исследования:

2. Оценить потерю гетерозиготности на высоко вариабельных участках в локусе гена TP53 у гетерозиготных больных раком молочной железы с утратой аллелей в опухолевой ткани.

3. Провести анализ генетических и эпигенетических нарушений гена TP53 у больных раком молочной железы с утратой одного и сохранением другого аллелей в опухоли.

Научная новизна:

Впервые у больных раком молочной железы охарактеризован в сравнительном аспекте полиморфизм гена ТР53 (Ex4+119G>C, IVS3+41insl6bp, IVS6+62G>A) в лейкоцитах периферической крови и в опухоли. Показано, что в опухоли гетерозиготных по Ех4+119G>C полиморфизму больных раком молочной железы утрата одного аллеля обусловлена делецией участка гена ТР53, а инактивация другого - соматическими мутациями, что согласуется с двухударной концепцией канцерогенеза А. Кнудсона. Впервые на территории РФ выявлены новые мутации в гене ТР53 у больных раком молочной железы: три в интронных областях - с.376-57А>С, c.673-20G>C, c.919+26c.919+27insl и одна в 7-м экзоне - c.697699del3, не представленные в базе IARC TP53 Mutation Database R14. Показано, что у больных, носителей аллельного варианта С по Ех4+119G>C полиморфизму гена ТР53, реже отмечаются проявления опухолевой прогрессии по сравнению с пациентками, несущими G аллель. Наличие мутаций в полиморфных сайтах гена ТР53, приводящих к несоответствию генотипов в лейкоцитах периферической крови и в опухолевой ткани больных РМЖ, ассоциировано с экспрессией рецепторов к эстрогенам и прогестерону на опухолевых клетках.

Теоретическая и практическая значимость: Полученные в данном исследовании результаты расширяют представления о молекулярно-генетических механизмах прогрессии рака молочной железы, в частности, о вкладе полиморфизма гена ТР53 в развитие рака данной локализации. Одновременная оценка полиморфизма и соматического статуса гена ТР53 может быть использована как оригинальный дополнительный методологический подход для проведения исследований по изучению патогенеза злокачественных новообразований других локализаций. На основании результатов анализа связи молекулярно-генетических изменений гена ТР53 в опухоли с патогенетическими характеристиками злокачественного процесса могут быть разработаны дополнительные критерии оценки прогноза клинического течения рака молочной железы, которые совместно со стандартными позволят повы9 сить информативность прогноза и оптимизировать тактику лечения, и, как следствие, увеличить эффективность терапии и качество жизни больных раком молочной железы. Новые сведения могут быть использованы в образовательном процессе при подготовке специалистов естественнонаучного профиля.

Положения, выносимые на защиту:

1. Нарушения гена TP 53 в опухоли гетерозиготных больных раком молочной железы могут происходить по принципу концепции двухударной инактивации А. Кнудсона, когда один аллель содержит мутацию, а другой делетирован.

2. Сравнительный анализ полиморфизма гена TP53 в лейкоцитах периферической крови и в опухолевой ткани может быть использован как дополнительный метод поиска инактивирующих событий данного гена при раке молочной железы.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Денисов, Евгений Владимирович

Выводы

1. В 26,3% случаев у больных раком молочной железы в опухолевой ткани отмечены мутации в полиморфных сайтах (Ex4+119G>C, IVS6+62G>A и IVS3+41insl6bp) гена ТР53, в большинстве своем (66,7%) обусловленные утратой одного аллеля у гетерозиготных пациенток в 40,0% случаев, при этом в 78,6% выявлена потеря аллеля С (Ех4+119G>C).

2. У больных раком молочной железы, носителей гетерозиготного генотипа (Ex4+119G>C), утрата одного из аллелей в опухоли объясняется делецией участка гена ТР53, что подтверждается высоким уровнем (85,7%) потери гетерозиготности в локусе VNTR 1-го интрона гена TP53 и на участке хромосомы 17р 13.1 (локус D17S796) у данной категории пациенток.

4. Частота потери аллеля С (Ex4+119G>C) гена TP53 в опухолевой ткани существенно выше у больных раком молочной железы с мутантным р53 (5,7, 8-й экзоны и смежные интроны) по сравнению с пациентками, не имеющими р53 мутаций (53,3% против 15,8%; точный критерий Фишера: односторонний р=0,02; двусторонний р=0,03).

5. В опухолевой ткани больных раком молочной железы идентифицированы четыре новые мутации гена TP53 (три в интронных областях - с.376-57А>С, c.673-20G>C, c.919+26c.919+27insl и одна в 7-м экзоне -c.697699del3), которые не представлены в последней версии IARC ТР53 Database Mutation R14.

7. У больных раком молочной железы с экспрессией на клетках опухоли рецепторов к эстрогенам и прогестерону чаще встречаются мутации в подиморфных сайтах гена TP53 (31,9% и 35,9%), чем у пациенток с отсутствием экспрессии (11,5%; 12,5%; точный критерий Фишера: односторонний р=0,04 и 0,02; двусторонний р=0,08 и 0,03, соответственно).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Чердынцева Н.В., Слонимская Е.М., Белявская В.А., Бабышкина Н.Н., Сметанникова Н.А., Гервас П.А., Денисов Е.В., Стахеева М.Н., Гарбуков Е.Ю., Малиновская Е.А., Литвяков Н.В., Воевода М.И. Исследование связи полиморфизма генов онкосупрессора р53, гена хемокинового рецептора CCR5 и их сочетаний с риском развития и прогрессированием рака молочной железы // Молекулярная медицина. - 2007. — № 1. — С. 23-31.

2. Денисов Е.В., Литвяков Н.В., Стахеева М.Н., Гарбуков Е.Ю., Слонимская Е.М., Малиновская Е.А., Бабышкина Н.Н., Стегний В.Н., Чердынцева Н.В. Мутации в гене-супрессоре TP 53 и их связь с особенностями клинического течения рака молочной железы // Сибирский онкологический журнал. - 2008. - № 2 - С. 32-36.

3. Перельмутер В.М., Завьялова М.В., Вторушин С.В., Слонимская Е.М., Крицкая Н.Г., Гарбуков Е.Ю., Литвяков Н.В., Стахеева М.Н., Бабышкина Н.Н., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Григорьева Е.С., Назаренко М.С., Сенников С.В., Горева Е.П., Козлов В.А., Воевода М.И., Максимов В.Н., Белявская В.А., Чердынцева Н.В. Генетические и клинико-патологические особенности рака молочной железы у больных с сохраненной менструальной функцией и в менопаузе // Успехи геронтологии. - 2008. - Т. 21, № 4. - С. 643-653.

4. Denisov E.V., Cherdyntseva N.V., Litvjakov N.V., Malinovskaya E.A., Vo-evoda M.I., Belyavskaya V.A., Stegniy V.N. TP53 mutations and Arg72Pro polymorphism in breast cancer patients' tumors // Cancer Genetics and Cytogenetics. - 2009. - Vol. 192. - P. 93-95.

5. Денисов E.B., Гервас П.А. Полиморфизм онкосупрессорного гена р53 и гена хемокинового рецептора CCR5 у больных раком молочной железы // Материалы XLIII международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». - Новосибирск. - 2005. - С. 17.

6. Чердынцева Н. В., Белявская В. А., Севостьянова Н. В., Уразова JI. Н., Гервас П. А., Коломиец С. А., Литвяков Н. В., Денисов Е. В., Воевода М. И., Чойнзонов Е. Ц. CCR5 как потенциальный медиатр активности Р53: комбинации аллеальных полиморфизмов CCR5 и Р53 у больных со злокачественными новообразованиями // Тезисы I Российско-американской конференции "Биотехнология и онкология". - Санкт-Петербург. - 2005. -С. 142-143.

7. Гервас П.А., Бабышкина Н.Н., Денисов Е.В., Слонимская Е.М., Стахеева М.Н., Чердынцева Н.В. Исследование полиморфизма 72 кодона гена р53 у больных раком молочной железы // Материалы итоговой научно-практической конференции с международным участием "Актуальные вопросы здравоохранения регионов Сибири". - Красноярск. - 2005. - С. 299-300.

8. Чердынцева Н.В., Белявская В.А., Севостьянова Н.В., Гервас П.А., Уразова Л.Н., Слонимская Е.М., Коломиец С.А., Литвяков Н.В., Бабышкина Н.Н., Стахеева М.Н., Денисов Е.В., Воевода М.И., Чойнзонов Е.Л. Исследование роли комбинаций вариантных аллелей генов апоптоза, ферментов метаболизма и цитокинов в риске возникновения и прогнозе клинического течения злокачественных новообразований // Материалы II международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность". - Москва. - 2005. - С. 283-284.

9. Гервас П.А., Денисов Е.В., Бабышкина Н.Н., Стахеева М.Н., Слонимская Е.М., Белявская В.А., Чердынцева Н.В. Опухолеассоциированный полиморфизм генов р53 и CCR5 у больных раком молочной железы // Тезисы I Съезда терапевтов Сибири и Дальнего Востока. — Новосибирск. - 2005. -С. 180-182.

10. Денисов Е.В., Гервас П.А., Бабышкина Н.Н., Савенкова О.В., Глущенко С.А., Малиновская Е.А. Полиморфизм участков генов р53 и хемокино-вого рецептора CCR5: связь с прогрессией рака молочной железы // Материалы, XLIV международной студенческой конференции «Студент и научно-технический1прогресс>> - Новосибирск.— 2006: - С. 116:

11. Денисов Е.В., Гервас П.А., Бабышкина Н.Н., Савенкова О.В., Глущенко С.А., Малиновская Е.А. Популяционно-генетический анализ связи полиморфизма участков генов р53 и CCR5 с прогрессией рака молочной железы // Материалы LY научной студенческой конференции биолого-почвенного факультета Томского государственного университета "Старт в науку". - Томск. - 2006. - С. 3-4.

12. Cherdyntseva N.V., Belyavskaya V.A., Gervas P.A., Fleming M. V., Sevost-yanova N.V., Kolomiets , S.A., Denisov E.V., Slonimskaya E.M., Voevoda Mil., Perelmuter V.M., Choinzonov E.L. Cytokine and apoptotic gene polymorphism association with cancer progression arid prognosis 7/ The proceedings of 3 International conference. - Novosibirsk. - 2006. - P. 23.

13. Бабышкина H. Н.,Тервас П. А., Денисов Е. В., Сметанникова Н. А., Белявская В. А., Стахесва М. Н;, Чёрдынцева Н; Bi, Слонимская Е. М; Полиморфизм: гена хемокиновго рецептора CCR5 и онкосупрессорного> белка р53: взаимосвязь с рискм формирования и прогрессированием рака молочной-железы:// Материалы X Российского онкологического конгресса. - Москва. - 2006. - С. 168. ' . '

14. Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Бабышкина Н.Н., Лит-вяков Н.В. Анализ полиморфизма и соматических му таций гена р53; при раке молочной железы // Материалы XLV международной студенческой конференций «Студент и научно-технический прогресс». - Новосибирск.-2007. - С. 149-150.

15. Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Бабышкина Н.Н., Лит-вяков Н.В., Чердынцева Н;В: Генетический полиморфизм и мутации онкосупрессорного гена р53 у больных раком молочной железы // Тезисы XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007». - Москва. - 2007. - С. 51-52. .

16. Денисов Е.В;, Литвяков Н.В., Слонимская Е.М., Малиновская. Е.А., Бабышкина Н.Н:, Григорьева Е.А:, Гарбуков Е.Ю:, Чердынцева Н.В. Взаимосвязь Arg72Pro полиморфизма гена р53 с у уровнем соматических мутаций того же гена в клетках рака молочной железы // Материалы 3-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения-2007». - Санкт-Петербург. - 2007. - С. 12-13.

17. Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Бабышкина Н.Н., Литвяков Н.В. Мутации и полиморфизм в гене р53 у больных раком молочной железы // Материалы LVI научной студенческой конференции биолого-почвенного факультета Томского государственного университета "Старт в науку" - Томск. - 2007. - С. 8-9.

18. Денисов Е.В:, Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю:, Бабышкина Н.Н., Литвяков Н.В. Взаимосвязь соматических мутаций полиморфизма, гена р53 у больных раком молочной железы // Материалы региональной конференции молодых ученых им. Академика РАМН Н.В. Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической, онкологии". — Томск.-2007.-С. 39-41.

19. Чердынцева Н.В., Слонимская Е.М., Литвяков Н.В., Стахеева М.Н:, Бабышкина Н.Н;, Гарбуков Е.Ю., Малиновская, Е.А., Денисов Е.В., Дорошенко А.В., Красулина Н.А. Механизмы опухолевой прогрессии: роль генов апоптоза и цитокинов// Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике /Под ред. А.Б. Масленникова. — Вып. 1 Г. - Новосибирск: Альфа Виста, 2007. - С. 28-39.

20. Денисов Е.В., Бабышкина Н.Н., Малиновская*Е.А., Гарбуков Е.Ю., Литвяков Н.В., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Статус гена р53 при раке молочной железы: взаимосвязь мутаций и полиморфизма- 72 кодона // Материалы III международной конференции «Фундаментальные науки -медицине». — Новосибирск. - 2007. - С. 23.

21. Чердынцева Н.В., Гервас П.А., Малиновская Е.А., Бабышкина Н.Н.,

Литвяков Н.В., Денисов Е.В., Слонимская Е.М., Стахеева М.Н., Тузиков

104

С.А., Белявская В.А., Воевода М.И., Перельмутер В.М. Подходы генетической эпидемиологии: от оценки риска до прогнозирования исхода злокачественных новообразований// Материалы III международной конференции «Фундаментальные науки - медицине». - Новосибирск. - 2007. — С. 81.

22. Денисов Е.В., Бабышкина Н.Н., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Лит-вяков Н.В. Полиморфизм и частота соматических мутаций гена р53 у больных раком молочной железы // Научные труды VIII конференции с международным участием "Генетика человека и патология". - Томск. -2007.-С. 311-312.

23. Чердынцева Н.В., Гервас П.А., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Бабышкина Н.Н., Литвяков Н.В., Слонимская Е.М., Стахеева М.Н., Тузиков С.А., Гарбуков Е.Ю., Перельмутер В.М., Белявская В.А., Воевода М.И. Полиморфизм гена онкосупрессора р53 и функционально связанных генов в оценке риска и прогноза злокачественных новообразований // Научные труды VIII конференции с международным участием "Генетика человека и патология". - Томск. - 2007. - С. 324-325.

24. Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Бабышкина Н.Н., Вто-рушин С.В., Глущенко С.А., Литвяков Н.В. Мутации гена ТР53 при раке молочной железы и их взаимосвязь с клинико-патологическими параметрами заболевания // Материалы III региональной конференции молодых ученых им. Академика РАМН Н.В. Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии". - Томск. - 2008. - С. 39-40.

25. Бабышкина Н.Н., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Стахеева М.Н., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Изучение связи полиморфных вариантов генов CCR5 и Р53 с лимфогенным метастазированием у больных раком молочной железы // Материалы Российской научно-практической конференции "Современные аспекты диагностики и лечения рака молочной железы". - Томск. - 2008. - С. 25-26.

26. Денисов Е.В., Бабышкина Н.Н., Малиновская Е.А., Литвяков Н.В., Стег-ний В.Н., Чердынцева Н.В. Селективная инактивация Arg72Pro аллелей гена ТР53 при раке молочной железы // Материалы всероссийской конференции с международным участием "Молекулярная онкология". — Новосибирск. - 2008. - С. 13-14.

27. Бабышкина Н.Н., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Стахеева М.Н., Чердынцева Н.В., Слонимская Е.М. Взаимосвязь полиморфных вариантов гена-онкосупрессора р53 и гена хемокинового рецептора CCR5 с риском возникновения и прогрессированием рака молочной железы // Материалы всероссийской конференции с международным участием "Молекулярная онкология". - Новосибирск. - 2008. - С. 77-78.

28. Чердынцева Н.В., Белявская В.А., Гервас П.А., Добродеев А.Ю., Денисов Е.В., Малиновская Е.А., Бабышкина Н.Н., Литвяков Н.В., Тузиков С.А., Слонимская Е.М., Перельмутер В.М. Роль гена р53 в формировании и прогрессии злокачественных новообразований // Материалы всероссийской конференции с международным участием "Молекулярная онкология". - Новосибирск. - 2008. - С. 165-166.

29. Denisov E.V., Babyshkina N.N., Litvjakov N.V., Malinovskaya E.V., Slo-nimskaya E.M., Stegniy V.N., Cherdyntseva N.V. TP53 gene mutations and Pro72Arg polymorphism in breast patient's tumour // Abstract Book of IM-PAKT Breast Cancer Conference. - Brussels, Belgium. - 2009. - P. ii38.

30. Денисов E.B., Литвяков H.B., Слонимская E.M., Малиновская Е.А., Бабышкина Н.Н., Стегний В.Н., Белявская В.А., Воевода М.И., Чердынцева Н.В. Изучение взаимосвязи Arg72Pro полиморфизма и соматических мутаций гена ТР53 у больных раком молочной железы // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике / Под ред. А.Б. Масленникова.- Вып. 13.- Новосибирск: Альфа Виста, 2009.- С. 66-74.

31. Чердынцева Н.В., Слонимская Е.М., Перельмутер В.М., Завьялова М.В., Вторушин С.В., Гуляева Л.Ф., Пустыльняк В.О., Гарбуков Е.Ю., Литвяков Н.В., Стахеева М.Н., Бабышкина Н.Н., Малиновская Е.А., Денисов

106

Е.В., Григорьева Е.С., Лебедев И.Н., Назаренко М.С., Сенников С.В., Силков А.Н., Жовмер А.С., Горева Е.П., Гришанова А.Ю., Горева О.Б., Середина Т.А., Талабан В.О., Ляхович В.В., Голованова О.В., Шевченко

A.В., Салахутдинова М.Ю., Максимов В.Н., Воевода М.И., Коненков

C. 19-25.

32. Денисов Е.В., Сухановская Т.В., Литвяков Н.В., Малиновская Е.А., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Статус гена TP 53 как прогностический маркер рака молочной железы // Материалы Сибирско-Тайваньского форума. - Томск. - 2009. - С. 102-103.

34. Дульцева Т.С., Сухановская Т.В., Денисов Е.В. Новые мутации в гене-супрессоре опухолевого роста ТР53 у больных раком молочной железы // Материалы V региональной конференции молодых ученых им. Академика РАМН Н.В. Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии". — 2010. - С. 39-40.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время вклад полиморфных вариантов (Ex4+119G>C, IVS6+62G>A и IVS3+41insl6bp) гена TP 53 в риск формирования РМЖ хорошо изучен. Несмотря на выявленные ассоциации этих полиморфизмов с РМЖ в отдельных популяционных исследованиях, мета-анализами подтверждена значимость только ассоциации IVS3+41 ins 16bp полиморфизма (Ни et al., 2010). При этом в литературе практически отсутствуют данные о влиянии указанных полиморфных вариантов на опухолевую прогрессию РМЖ, а имеющиеся на настоящий момент немногочисленные результаты противоречат друг другу (Tommiska et al., 2005; Xu et al., 2005; Чердынцева и др., 2006; Damin et al., 2006; Toyama et al., 2007; Costa et al., 2008; Xu et al., 2008; Hrstka et al., 2009). Вероятной причиной разночтений может служить малая численность выборок, популяционные особенности, а также недоучет соматического статуса р53, инактивация которого, как одного из ключевых генов опухолевой супрессии, представляет собой частое событие при канцерогенезе. Как классический представитель группы супрессорных генов, ТР53 часто инак-тивируется по "двухударному" механизму А. Кнудсона: соматические мутации в одном аллеле и потеря другого (Knudson, 1971, 2001). При РМЖ более половины опухолей содержат соматические мутации в гене ТР53 и потерю гетерозиготности в районе участка хромосомы 17р (Lacroix et al., 2004; Reinholz et al., 2009). Кроме того, ранее был показан феномен утраты аллелей в опухолевой ткани гетерозиготных по Ex4+119G>C полиморфизму больных РМЖ, вероятно, обусловленный делецией участка гена ТР53, что может, в принципе, отражать второй этап инактивации в рамках двухударной концепции.

В данной работе проведено изучение полиморфизма гена ТР53 (Ех4+119G>C, IVS6+62G>A и IVS3+41insl6bp) в лейкоцитах крови и опухоли больных РМЖ, выявлены основные события инактивации р53 по принципу двухударного механизма. Проведена оценка влияния полиморфизма и мутаций гена ТР53 на клиническое течение РМЖ, которое обусловлено различ

94 ными проявлениями опухолевой прогрессии.' Обобщенные полученные результаты представлены в виде схемы (Рис. 16).

РМЖ характеризуется чрезвычайной вариабельностью течения опухолевого процесса, молекулярные механизмы которого во многом остаются неясными. Нарушения в гене ТР53, ответственные за формирование многих онкологических заболеваний, могут вносить вклад и в клиническое течение РМЖ. По нашим результатам, больные РМЖ, носители генотипа С/С (Ex4+119G>C полиморфизм), чаще характеризуется менее агрессивным уни-центрическим ростом опухоли и низкой склонностью к лимфогенному мета-стазированию, что может обеспечивать благоприятный прогноз заболевания для данной категории больных РМЖ. Полученные результаты согласуются с данными ранее проведенных исследований, показавших низкую злокачественность опухоли и благоприятное течение для носителей генотипа С/С (Чердынцева и др., 2006). Выявленная закономерность косвенно подтверждается данными о более низком риске регионарного метастазирования у пациенток с уницентрическим РМЖ по сравнению с больными, имеющими муль-тифокусный характер роста опухоли (Керимов, 2006; Вторушин и др., 2007). Механизм вклада Ex4+119G>C полиморфизма гена TP53 в указанные проявления опухолевой прогрессии может объясняться высоким трансактивацион-ным потенциалом белка р53Рго, кодируемого аллелем С, в отношении индукции транскрипции антиметастатических генов и генов, ответственных за характер опухолевого роста и другие клинические формы прогрессии РМЖ (Mashimo et al., 1998; Zou et al., 2000; van Golen, 2003; Stein et al., 2004; Bertucci et al., 2005; Van Laere et al., 2005; Wallden et al., 2005; Janicke et al., 2008).

В 26,3% (21/80) случаев у больных РМЖ в опухолевой ткани выявлены мутации в полиморфных сайтах (Ex4+119G>C, IVS6+62G>A и IVS3+41insl6bp) гена TP53, обусловленные в большинстве своем (66,7%; 14/21) утратой одного аллеля у гетерозиготных пациенток, среди них в 78,6%

11/14) случаев отмечена потеря аллеля С по Ex4+119G>C полиморфизму.

Низкий риск лвмфогеввого метастазнровання

Унпцентрическпй характер опухолевого роста

Благоврвятвыв врогвоз рака молочной железы

Рис. 16 - Ex4+119G>C полиморфизм гена TP53 и прогрессия рака молочной железы. РЭ+, РЭ- - наличие/отсутствие экспрессии рецепторов к эстрогенам, соответственно; РП+, РП- - наличие/отсутствие экспрессии рецепторов к прогестерону, соответственно.

Следует отметить, что утрата аллелей гена ТР53 детектировались почти у половины (38,9%; 14/36) гетерозиготных носителей. Мы показали, что основным механизмом, приводящим к потере аллелей, в частности, аллеля С, является делеция участка гена ТР53. Кроме того, потеря аллеля С и, соответственно, сохранение аллеля G, чаще встречаются у больных с соматическими мутациями гена TP53 на участках 5, 7 и 8-го экзонов и прилежащих к ним интронах. Среди идентифицированных соматических мутаций гена ТР53 четыре (три в интронных областях - с.376-57А>С, c.673-20G>C, c.919+26c.919+27insl и одна в 7-м экзоне - c.697699del3) обнаружены впервые, т.к. они не представлены в базе IARC ТР53 Mutation Database R14 (Petitjean et al., 2007b). Закономерность сочетания делеций, приводящих к потере аллеля С, и высокой частоты соматических мутаций, содержащихся в сохранившимся аллеле G, позволяет нам рассмотреть данный феномен как подтверждение двухударной инактивации гена ТР53 в течение развития РМЖ (концепция А. Кнудсона) (Knudson, 1971, 2001; Tucker, Friedman, 2002; Paige, 2003).

В клиническом ракурсе мутации в полиморфных сайтах гена ТР53 ассоциированы с экспрессией рецепторов к эстрогенам и прогестерону, что особенно важно при назначении гормональной терапии. Механизм ассоциации, вероятно, заключается в координированном механизме экспрессии рецепторов к половым гормонам и непосредственном генотоксическом воздействии метаболитов эстрогенов на ген ТР53, а также в отборе опухолевого клона с мутациями на данных участках (Joosten et al., 2004; Zoon et al., 2009).

На протяжении 20 лет изучается прогностическая роль мутаций гена ТР53 при РМЖ, однако данные на настоящий момент неоднозначны, что, по-видимому, связано с неодинаковой функциональной значимостью разных типов мутаций. При сопоставлении наличия соматических мутаций в гене ТР53 с основными патогенетическими характеристиками опухолевого процесса мы показали, что данный тип нарушений чаще встречался у больных

РМЖ с умеренной и высокой степенью злокачественности опухоли, хотя

97 различия не достигают статистической значимости ввиду небольшого объема выборки. Интересно, что мутация c.856G>A (8-й экзон) встречалась тольt ко у больных РМЖ, у которых в ответ на назначение неоадъювантной'химиотерапии наблюдалось прогрессирование злокачественного процесса. Подтверждение ассоциации данной мутации с резистентностью на химиотерапию, а также механизм вклада в устойчивость к лечению требуют дальнейшего изучения.

Литературные сведения о наличии высокого трансактивационного и репарационного потенциала для белка p53Pro (Thomas et al., 1999; Pim, Banks, 2004; Siddique, Sabapathy, 2006) наряду с нашими данными о связи кодирующего эту форму белка аллеля С (Ex4+119G>C) с более благоприятным клиническим течением РМЖ и высокой частоте его потери в опухоли молочной железы, вероятно, придающей опухолевым клеткам селективное преимущество в росте, позволяют характеризовать данную молекулу р53 как более биологически активную по сравнению с p53Arg в плане проявления протек-тивных свойств в отношении прогрессии РМЖ. Таким образом, на основании этого, а также учитывая ранее показанную в другом исследовании связь утраты аллеля С в опухолевой ткани с низкой безрецидивной и общей выживаемостью (Bonafe et al., 2003), мы можем рекомендовать анализ Ex4+119G>C полиморфизма гена ТР53 и его соматического статуса в опухоли как дополнительный метод оценки злокачественности опухолевого процесса в плане прогноза заболевания.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Денисов, Евгений Владимирович, Томск

1. Блохин Д.Ю. «Постгеномный взгляд» на проблемы онкогенеза // Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. 2009. - Т. 2, № 3. - С. 277-282.

2. Васильев Н.В., Чердынцева Н.В., Коляда Т.И. Иммунная система при повышенном онкологическом риске и злокачественном росте / Томск: Изд-во Том. ун-та. 2005. - 308 с.

3. Герштейн Е.С., Овчинникова JI.K., Кушлинский Н.Е. Роль ядерного транскрипционного фактора NF-kB в этиологии, патогенезе и клиническом течении рака молочной железы // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2009. - № 5. - С. 10-13.

4. Голованова О.В., Коненков В.И., Шевченко А.В., Коломейчук М.Ю., Завьялова М.В., Вторушин С.В. Полиморфизм гена TNFA (С-308А, G-308A, G-238A) у больных раком молочной железы // Иммунология. -2009.-№2.-С. 92-95.

5. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Смертность населения России и стран СНГ от злокачественных новообразований в 2007 г. // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. 2009. - Т. 20, № 3. - С. 91-122.

6. Заридзе Д.Г. Молекулярная эпидемиология рака (обзор) // Биохимия. — 2008. Т. 73, № 5. - С. 661-674.

7. Злокачественные новообразования в России в 2007 году-(заболеваемость и смертность) / Под ред: В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой- М: ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий», 2009. 244 с.

8. Имянитов Е.Н., Хансон К.П. Молекулярная генетика в клинической онкологии // Сибирский онкологический журнал. 2004. - № 2-3. - С. 4047.

9. Имянитов Е.Н., Хансон К.П. Молекулярная онкология: клинические аспекты /СПб.: СПбМАПО. 2007. - 211 с.

10. Карпухин А.В., Логинова А.Н., Хомич Е.В., Поспехова Н.И. Наследственная предрасположенность к раку молочной железы.// Медицинская генетика. 2002. - Т. 1, № 6. - С. 254-261'.

11. Керимов Р.И. Мультицентрический рак молочной железы: особенности течения, результаты терапии, прогноз // Маммология. 2006. - Т. 2. — С. 32-36.

12. Комарова Л.Е. Скрининговая маммография рака молочной железы. За и против? // Сибирский онкологический журнал. — 2008. — Приложение № 2. — С.9-14.

13. Копнин Б.П. Нестабильность генома и онкогенез // Молекулярная биология. 2007. - Т. 41, № 2. - С. 369-381.

14. Лихтенштейн А.В. Канцерогенез: эволюция представлений // Биохимия.- 2009. Т. 74, № 4. - С. 437-447.

15. Любченко Л.Н., Портной С.М., Брюзгин В.В., Поспехова Н.И., Лушни-кова А.А., Карпухин А.В., Гарькавцева Р.Ф. Клиникомолекулярные аспекты наследственного рака молочной железы // Молекулярная медицина.-2007.-№ 1.-С. 8-15.

16. Любченко Л.Н. Наследственный рак молочной железы и/или яичников: ДНК-диагностика, индивидуальный прогноз, лечение и профилактика // Автореф. дис. . д-ра. мед. наук. М., 2009. 50 с.

17. Ляхович В.В., Вавилин В.А., Гришанова А.Ю., Гуляева Л.Ф., Коваленко С.П. Геномная медицина и новые подходы к диагностике и лечению онкозаболеваний // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2004. - № 2. - С. 20-26.

18. Моисеенко В.М. "Естественная история" роста рака молочной железы // Практическая онкология. 2002. - № 3. - С. 6-14.

19. Олийниченко Г.П., Захарцева Л.М., Дроздов В.М. и др. Клиническое значение рецепторов эстрогенов, прогестерона и онкобелка Her-2/neu в клетках рака молочной железы // Онкология. 2002. - Т. 4, № 1. - С. 3336.

20. Пустыльняк В.О., Лиясова М.С., Гольдинштейн О.З., Сидоров С.В., Гуляева Л.Ф. Экспрессия генов ангиогенных факторов в злокачественных опухолях молочной железы // Молекулярная медицина. — 2008. — № 2. — С. 60-63.

21. Соколенко А.П., Розанов М.Е., Митюшкина Н.В., Шерина Н.Ю., Иевлева А.Г., Чекмарева Е.В., Буслов К.Г., Шилов Е.С., Того А.В., Бит-Сава Е.М., Воскресенский Д.А., Чагунава О.Л., Трофимов Д.Ю., Коваленко

22. С.П., Devilee P., Cornelisse С., Семиглазов В.Ф., Имянитов Е.Н. Наслед110ственные мутации при ранних, семейных и билатеральных формах рака молочной железы у пациенток из России // Сибирский онкологический журнал. 2008. - № 3. - С. 43-49.

23. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью // Биохимия. 2000. - Т. 65, № 1. - С. 34-47.

24. Чумаков П.М. Белок р53 и его универсальные функции в многоклеточном организме // Успехи биологической химии. — 2007. Т. 47. - С. 3-52.

25. Almeida L.O., Custodio A.C., Pinto G.R., Santos MJ., Almeida J.R., Clara* C.A., Rey J.A., Casartelli C. Polymorphisms and DNA methylation of gene TP53 associated with extra-axial brain tumors // Genet. Mol. Res. 2009. -Vol. 8, № l.-P. 8-18.

26. Amatya V J., Naumann U., Weller M., Ohgaki H. TP53 promoter methylation in human gliomas // Acta Neuropathol. 2005. - Vol. 110, № 2. - P. 178184.

27. Ara S., Lee P.S., Hansen M.F., Saya»H. Codon 72 polymorphism of the TP53 gene //Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18, № 16. - P. 4961.

28. Bai Z., Gust R. Breast cancer, estrogen receptor and ligands // Arch. Pharm. (Weinheim). 2009. - Vol. 342, № 3. - P. 133-149.

29. Beckman G., Birgander R., Sjalander A., Saha N., Holmberg P.A., Kivela A., Beckman L. Is p53 polymorphism maintained by natural selection? // Hum. Hered. 1994. - Vol. 44, № 5. - P. 266-270.

30. Bertheau P., Espie M., Turpin E., Lehmann J., Plassa L.F., Varna M., Janin A., de The H. TP 53 status and response to chemotherapy in breast cancer 11 Pathobiology. 2008. - Vol. 75, № 2. - P. 132-139.

31. Bielas J.H., Venkatesan R.N., Loeb L.A. LOH-proficient embryonic stem cells: a model of cancer progenitor cells? // Trends Genet. 2007. - Vol. 23, №4.-P. 154-157.

32. Biros E., Kalina I., Kohut A., Stubna J., Salagovic J. Germ line polymorphisms of the tumor suppressor gene p53 and lung cancer // Lung Cancer. 2001. - Vol. 31, № 2-3. - P. 157-162.

33. Borresen-Dale A.L. TP53 and breast cancer // Hum. Mutat. 2003; - Vol. 21, № 3. - P. 292-300. ; ;

34. Bradbury A.R., Olopade O.I. Genetic susceptibility to breast cancer // Rev. Endocr. Metab; Disord. 2007. - Vol; 8, № 3. - P.255-267.

35. Brodsky M.H;, Nordstrom W., Tsang G., Kwan E., Rubin G.M., Abrams J.M. Drosophila p53 binds a damage response element at the reaper locus // Cell. -2000;-Vol; 101, №1.-P; 103-113;

36. Brosh R., Rotter V. When mutants gain new powers: news from the mutant p53 field //Nat. Rev. Cancer. 2009- -Vol. 9, № 10.-P. 701-713.

37. Burpo F.J. A critical review of PCR primer design algorithms and crosshybridization case study I I Biochemistry. 2001. - Vol. 218 -P. 1-12.

38. Chen K., Hu Z., Wang L.E., Zhang W., El-Naggar A.K., Sturgis E.M., Wei Q. Polymorphic TP53BP1 and TP53 gene interactions associated with risk of squamous cell carcinoma of the head and neck // Clin. Cancer Res. — 2007. -Vol. 13, № 14. P. 4300-4305.

39. Chumakov P.M., Jenkins J.R. BstNI/Ncil polymorphism of the human p53 gene (TP53) //Nucleic Acids Res. 1991. - Vol. 19, № 24. - P. 6969.

40. Coombs N.J., Boyages J. Multifocal and multicentric breast cancer: does each focus matter? // J. Clin. Oncol. 2005. - Vol. 23, № 30. - P. 7497-7502.

41. Costa S., Pinto D., Pereira D., Rodrigues H., Cameselle-Teijeiro J., Medeiros R., Schmitt F. Importance of TP53 codon 72 and intron 3 duplication 16bp polymorphisms in prediction of susceptibility on breast cancer // BMC Cancer. 2008. - Vol. 8 - P. 32.

42. Coutts A.S., Adams С .J., La Thangue N.B. p53 ubiquitination by Mdm2: a never ending tail? // DNA Repair (Amst.). 2009. - Vol. 8, № 4. p. 483490.

43. Croce C.M. Oncogenes and cancer // N. Engl. J. Med. 2008. - Vol. 358, № 5.-P. 502-511.

44. Deppert W. Mutant p53: from guardian to fallen angel? // Oncogene. 2007. -Vol. 26, № 15.-P. 2142-2144.

45. Duffy M.J., Napieralski R., Martens J.W., Span P.N., Spyratos F., Sweep F.C., Brunner N., Foekens J.A., Schmitt M. Methylated genes as new cancer biomarkers // Eur. J. Cancer. 2009. - Vol. 45, № 3. - P. 335-346.

46. Dumont P., Leu J.I., Delia Pietra A.C., 3rd, George D.L., Murphy M. The codon 72 polymorphic variants of p53 have markedly different apoptotic potential // Nat. Genet. 2003. - Vol. 33, № 3. - P. 357-365.

47. Egger G., Liang G., Aparicio A., Jones P.A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy // Nature. 2004. - Vol. 429, № 6990. - P. 457-463.

48. Esteller M. Epigenetics in cancer // N. Engl. J. Med. 2008. - Vol. 358, № 11.-P. 1148-1159.

49. Evans M.F. The polymerase chain reaction and pathology practice //

50. Diagnostic histopathology. 2009. - Vol. 15, № 7. p. 344-356.116

51. Fackenthal J.D., Olopade O.I. Breast cancer risk associated with BRCA1 and BRCA2 in diverse populations // Nat. Rev. Cancer. 2007. - Vol. 7, № 12. -P. 937-948.

52. Faries M.B., Morton, D.L. The Clinical Significance of Lymph-Node Metastasis // Lymphangiogenesis in Cancer Metastasis Springer Netherlands, 2009. - Vol. 13. - P. 83-117.

53. Feki A., Irminger-Finger I. Mutational spectrum of p53 mutations in primary breast and ovarian tumors // Crit. Rev. Oncol. Hematol. — 2004. Vol. 52, № 2.-P. 103-116.

54. Foulkes W.D. Inherited susceptibility to common cancers // N. Engl. J. Med. 2008. - Vol. 359, №> 20. - P. 2143-2153.

55. Friedrich K., Weber Т., Scheithauer J., Meyer W., Haroske G., Kunze K.D., Baretton G. Chromosomal genotype in breast cancer progression: comparison of primary and secondaiy manifestations // Cell Oncol. 2008. - Vol. 30, № l.-P. 39-50.

56. Fukasawa К. P53, cyclin-dependent kinase and abnormal amplification of centrosomes // Biochim. Biophys. Acta. 2008. - Vol. 1786, № 1. - P. 15-23.

57. Garner I. Isolation of high-molecular-weight DNA from animal cells // Methods Mol. Biol. 1994. - Vol. 28 - P. 17-23.

58. Gatz S.A., Wiesmuller L. p53 in recombination and repair // Cell Death Differ. 2006. - Vol. 13, № 6. - P. 1003-1016.

59. Green D.R., Kroemer G. Cytoplasmic functions of the tumour suppressor p53 // Nature. 2009. - Vol. 458, № 7242. - P. 1127-1130.

60. Greenblatt M.S., Chappuis P.O., Bond J.P., Hamel N., Foulkes W.D. TP53 mutations in breast cancer associated with BRCA1 or BRCA2 germ-line mutations: distinctive spectrum and structural distribution // Cancer Res. — 2001. Vol. 61, № 10. - P. 4092-4097.

61. Hahn M., Matzen S.E., Serth J., Pingoud A. Semiautomated quantitative detection of loss of heterozygosity in the tumor suppressor gene p53 // Biotechniques. 1995. - Vol. 18, № 6. - P. 1040-1047.

62. Hahn M., Serth J., Fislage R., Wolfes H., Allhoff E., Jonas V., Pingoud A. Polymerase chain reaction detection of a highly polymorphic VNTR segment in intron 1 of the human p53 gene // Clin. Chem. 1993. - Vol. 39, № 3. - P. 549-550.

63. Hainaut P., Wiman K.G. 30 years and a long way into p53 research // Lancet Oncol. 2009. - Vol. 10, № 9. - P. 913-919.

64. Harris N., Brill E., Shohat O., Prokocimer M., Wolf D., Arai N., Rotter V. Molecular basis for heterogeneity of the human p53 protein // Mol. Cell Biol. 1986. - Vol. 6, № 12. - P. 4650-4656.

65. Heldring N., Pike A., Andersson S., Matthews J., Cheng G., Hartman J., Tujague M., Strom A., Treuter E., Warner M., Gustafsson J.A. Estrogen receptors: how do they signal and what are their targets // Physiol. Rev. -2007. Vol. 87, № 3. - P. 905-931.

66. Herr I., Debatin K.M. Cellular stress response and apoptosis in cancer therapy // Blood. 2001. - Vol. 98, № 9. - P. 2603-2614.

67. Hofseth L.J., Hussain S.P., Harris C.C. p53: 25 years after its discovery // Trends Pharmacol. Sci. 2004. - Vol. 25, № 4. - P.l 77-181.

68. Hrstka R., Beranek M., Klocova K., Nenutil R., Vojtesek B. Intronic polymorphisms in TP53 indicate lymph node metastasis in breast cancer // Oncol. Rep. 2009. - Vol. 22, № 5. - P. 1205-1211.

69. Hu Z., Li X., Yuan R., Ring B.Z., Su L. Three common TP53 polymorphisms in susceptibility to breast cancer, evidence from meta-analysis // Breast Cancer Res. Treat. 2010. - Vol. 120, № 3. - P. 705-714.

70. Hulka B.S., Moorman P.G. Breast cancer: hormones and other risk factors // Maturitas. 2008. - Vol. 61, № 1-2. - P. 203-213.

71. Ichikawa A., Kinoshita Т., Watanabe Т., Kato H., Nagai H., Tsushita K., Saito H., Hotta T. Mutations of the p53 gene as a prognostic factor in aggressive B-cell lymphoma // N. Engl. J. Med. 1997. - Vol. 337, № 8. - P. 529-534.

72. Janicke R.U., Sohn D., Schulze-Osthoff K. The dark side of a tumor suppressor: anti-apoptotic p53 // Cell Death Differ. 2008. — Vol. 15, № 6. — P. 959-976.

73. Jerry D.J., Dunphy K.A., Hagen M.J. Estrogens, regulation of p53 and breast cancer risk: a balancing act // Cell Mol. Life Sci. 2010. - Vol. 67, № 7 p. 1017-1023.

74. Joerger A.C., Fersht A.R. Structural biology of the tumor suppressor p53 and cancer-associated mutants // Adv. Cancer Res. 2007. - Vol. 97 - P. 1-23.

75. Johnson K.R., Fan W. Reduced expression of p53 and p21WAFl/CIPl sensitizes human breast cancer cells to paclitaxel and its combination with 5-fluorouracil // Anticancer Res. 2002. - Vol 22, № б A. - P. 3197-3204.

76. Joosten H.F., van Acker F.A., van den Dobbelsteen D.J., Horbach G.J., Krajnc E.I. Genotoxicity of hormonal steroids // Toxicol. Lett. 2004. - Vol. 151, № l.-P. 113-134.

77. Keimling M., Wiesmuller L. DNA double-strand break repair activities in mammary epithelial cells—influence of endogenous p53 variants // Carcinogenesis. 2009. - Vol. 30, № 7. - P. 1260-1268.

78. Khan H.A. A visual basic software for computing fisher's exact probability //

79. Journal of Statistical Software. 2003. - Vol. 8, № 21. - P. 1-7.120

80. Knudson A.G. Two genetic hits (more or less) to cancer // Nat. Rev. Cancer. -2001.-Vol. 1, № 2. P. 157-162.

81. Knudson A.G., Jr. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1971. - Vol. 68, № 4. -P. 820-823.

82. Kontorovich Т., Cohen Y., Nir U., Friedman E. Promoter methylation patterns of ATM, ATR, BRCA1, BRCA2 and P53 as putative cancer risk modifiers in Jewish BRCA1/BRCA2 mutation carriers // Breast Cancer Res. Treat.-2009.-Vol. 116, № 1.-P. 195-200.

83. Kouidou S., Malousi A., Kyventidis A., Fragou A., Maglaveras N. G:C > A:T mutations and potential epigenetic regulation of p53 in breast cancer // Breast Cancer Res. Treat. 2007. - Vol. 106, № 3. - P. 351-360.

84. Kruse J.P., Gu W. Modes of p53 regulation // Cell. 2009. - Vol. 137, № 4. -P. 609-622.

85. Kumar S., Walia V., Ray M., Elble R.C. p53 in breast cancer: mutation and countermeasures // Front. Biosci. 2007. - Vol. 12 - P. 4168-4178.

86. Kyndi M., Alsner J., Hansen L.L., Sorensen F.B., Overgaard J. LOH rather than genotypes of TP53 codon 72 is associated with disease-free survival in primary breast cancer // Acta Oncol. 2006. - Vol. 45, № 5. - P. 602-609.

87. Lacroix M., Toillon R.A., Leclercq G. p53 and breast cancer, an update // Endocr. Relat. Cancer. 2006. - Vol. 13, № 2. - P. 293-325.

88. Lacroix M., Toillon R.A., Leclercq G. Stable 'portrait' of breast tumors during progression: data from biology, pathology and genetics // Endocr. Relat. Cancer. 2004. - Vol. 11, № 3. - P. 497-522.

89. Lafkas D., Trimis G., Papavassiliou A.G., Kiaris H. P53 mutations in stromal fibroblasts sensitize tumors against chemotherapy // Int. J. Cancer. 2008. -Vol. 123, №4.-P. 967-971.

90. Lai H., Ma F., Trapido E., Meng L., Lai S. Spectrum of p53 tumor suppressor gene mutations and breast cancer survival // Breast Cancer Res. Treat. 2004. -Vol. 83, № l.-p. 57-66.

91. Lane D.P. Cancer. p53, guardian of the genome // Nature. 1992. - Vol. 358, №6381. -P. 15-16.

92. Lane D.P., Crawford L.V. T antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells // Nature. 1979. - Vol. 278, № 5701. - P. 261-263.

93. Lazar V., Hazard F., Bertin F., Janin N., Bellet D., Bressac B. Simple sequence repeat polymorphism within the p53 gene // Oncogene. 1993. -Vol. 8, №6.-P. 1703-1705.

94. Lee S.H., Kim S.R., Park C.H., Cho S.J., Choi Y.H. Loss of Heterozygosity of Chromosome 17pl3 and p53 Expression in Invasive Ductal Carcinomas // J. Breast Cancer. 2006. - Vol. 9, № 4. - P. 309-316.

95. Lehmann U., Kreipe H. Real-time PCR analysis of DNA and RNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded biopsies // Methods. 2001. -Vol. 25, №4.-P. 409-418.

96. Levine A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division // Cell. -1997.-Vol. 88, №3.-P. 323-331.

97. Lim L.Y., Vidnovic N., Ellisen L.W., Leong C.O. Mutant p53 mediates survival of breast cancer cells // Br. J. Cancer. 2009. - Vol. 101, № 9. - P. 1606-1612.

98. Linzer D.I., Levine A.J. Characterization of a 54K dalton cellular SY40 tumor antigen present in SV40-transformed cells and uninfected embryonal carcinoma cells//Cell.- 1979.-Vol. 17, № l.-P. 43-52.

99. Lonning P.E. Genes causing inherited cancer as beacons to identify the mechanisms of chemoresistance // Trends Mol. Med. 2004. - Vol. 10, № 3. -P. 113-118.

100. Maclaine N., Hupp T. The Regulation of p53 by Phosphorylation: A Model for How Distinct Signals Integrate into the p53 Pathway // Aging. 2009. — Vol. 1, № 5. - P. 490-502.

101. Magdinier F., D'Estaing S.G., Peinado C., Demirci В., Berthet C., Guerin J.F., Dante R. Epigenetic marks at BRCA1 and p53 coding sequences in early human embryogenesis // Mol. Hum. Reprod. 2002. - Vol. 8, № 7. - P. 630635.

102. Mashimo Т., Watabe M., Hirota S., Hosobe S., Miura K., Tegtmeyer P.J.,

103. Rinker-Shaeffer C.W., Watabe K. The expression of the KAI1 gene, a tumor123metastasis suppressor, is directly activated by p53 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998.-Vol. 95, № 19. -P. 11307-11311.

104. Matakidou A., Eisen Т., Houlston R.S. TP53 polymorphisms and liing;cancer risk: a systematic review and meta-analysis // Mutagenesis. 2003. - Vol. 18, № 4. -P. 377-385.

105. Matsumoto N., Yoshida Т., Yamashita К., Numata Y., Okayasu I. Possible alternative carcinogenesis pathway featuring microsatellite instability in colorectal cancer stroma // Br. J; Cancer. 2003. - Vol. 89, № 4. - P. 707712.

106. Millau J.F., Bastien N., Drouin R. P53 transcriptional activities: a general overview and some thoughts // Mutat. Res. 2009. - Vol. 681, № 2-3. - P.118.133.

107. Mills A.A. p53: link to the past, bridge to the future // Genes Dev. 2005. -Vol. 19, № 18. - P. 2091-2099.

108. Mumprecht V., Detmar M. Lymphangiogenesis and cancer metastasis // J. Cell Mol. Med. 2009. - Vol. 13, № 8A. - P. 1405-1416.

109. Murray-Zmijewski F., Lane D.P., Bourdon J;C. p53/p63/p73 isoforms: an orchestra of isoforms to hannonise cell differentiation and response to stress // Cell Death Differ. 2006. - Vol. 13, № 6. - P. 962-972.

110. Nathanson S.D. Insights into the mechanisms of lymph node metastasis // Cancer. 2003. - Vol 98; № 2. - P. 413-423.

111. Okorokov A.L., Sherman M.B., Plisson C., Grinkevich V., Sigmundsson K., Selivanova G., Milner J., Orlova E.V. The structure of p53 tumour suppressor protein reveals the basis for its functional plasticity // EMBO J. 2006. - Vol. 25, №21.-P. 5191-5200.

112. Ozcelik H., Pinnaduwage D., Bull S.B., Andrulis I.L. Type of TP53 mutation and ERBB2 amplification affects survival in node-negative breast cancer // Breast Cancer Res. Treat. 2007. - Vol. 105, № 3. - P. 255-265.

113. Paige A.J. Redefining tumour suppressor genes: exceptions to the two-hit hypothesis // Cell Mol. Life Sci. 2003. - Vol. 60, № 10. - P. 2147-2163.

114. Payne S.R., Kemp C.J. Tumor suppressor genetics // Carcinogenesis. 2005. -Vol. 26, № 12.-P. 2031-2045.

115. Petitjean A., Achatz M., Borresen-Dale A., Hainaut P., Olivier M. TP53 mutations in human cancers: functional selection and impact on cancer prognosis and outcomes // Oncogene. 2007a. - Vol. 26, № 15. - P. 21572165.

116. Phillips H.A. The role of the p53 tumour suppressor gene in human breast cancer // Clin. Oncol. (R. Coll. Radiol.). 1999. - Vol. 11, № 3. - P. 148155.

117. Pim D., Banks L. p53 polymorphic variants at codon 72 exert different effects on cell cycle progression // Int. J. Cancer. 2004. - Vol. 108, № 2. - P. 196199.

118. Pogribny I.P., James S.J. Reduction of p53 gene expression in human primary hepatocellular carcinoma is associated with promoter region methylation without coding region mutation // Cancer Lett. 2002. - Vol. 176, № 2. - P. 169-174.

119. Pogribny I.P., Miller B.J., James S.J. Alterations in hepatic p53 gene methylation patterns during tumor progression with folate/methyl deficiency in the rat // Cancer Lett. 1997. - Vol. 115, № 1. - P. 31-38.

120. Prokocimer M., Rotter V. Structure and function of p53 in normal cells and their aberrations in cancer cells: projection on the hematologic cell lineages // Blood. 1994. - Vol. 84, № 8. - P. 2391-2411.

121. Rae J.M., Skaar T.C., Hilsenbeck S.G., Oesterreich S. The role of single nucleotide polymorphisms in breast cancer metastasis // Breast Cancer Res. — 2008.-Vol. 10, № l.-P. 301.

122. Rahko E., Blanco G., Soini Y., Bloigu R., Jukkola A. A mutant TP 55 gene status is associated with a poor prognosis and anthracycline-resistance in breast cancer patients // Eur. J. Cancer. 2003. - Vol. 39, № 4. - P. 447-453.

123. Rakha E.A., Ellis I.O. Triple-negative/basal-like breast cancer: review // Pathology. 2009. - Vol. 41s, № 1. - P. 40-47.

124. Reinholz M.M., Bruzek A.K., Visscher D.W., Lingle W.L., Schroeder M.J., Perez E.A., Jenkins. R.B. Breast cancer and aneusomy 17: implications for carcinogenesis and therapeutic response // Lancet Oncol. — 2009. Vol. 10, № 3. - P. 267-277.

125. Ripperger Т., Gadzicki D., Meindl A., Schlegelberger B. Breast cancer susceptibility: current knowledge and implications for genetic counselling // Eur. J. Hum. Genet. 2009. - Vol. 17, № 6. - P. 722-731.

126. Royds J.A., Iacopetta B. p53 and disease: when the guardian angel fails // Cell Death Differ.-2006.-Vol. 13, №6.-P. 1017-1026.

127. Ruddell A., Kelly-Spratt K.S., Furuya M., Parghi S.S., Kemp C.J. pl9/Arf and p53 suppress sentinel lymph node lymphangiogenesis and carcinoma metastasis // Oncogene. 2008. - Vol. 27, № 22. - P. 3145-3155.

128. Scarpin K.M., Graham. J.D., Mote P.A., Clarke C.L. Progesterone action in human tissues: regulation by progesterone receptor (PR) isoform expression,nuclear positioning and coregulator expression // Nucl. Recept. Signal. -2009.-Vol. 7-P. e009.

129. Schroeder M., Mass M.J. CpG methylation inactivates the transcriptional activity of the promoter of the human p53 tumor suppressor gene // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. - Vol. 235, №> 2. - P. 403-406.

130. Schumacher В., Hofmann K., Boulton S., Gartner A. The C. elegans homolog of the p53 tumor suppressor is required for DNA damage-induced apoptosis // Curr. Biol.-2001.-Vol. 11, №21.-P. 1722-1727.

131. Sharma S., Kelly Т.К., Jones P.A. Epigenetics in cancer // Carcinogenesis.2010. Vol. 31, № 1. - P. 27-36.

132. Shirley S., Rundhaug J., Tian J., Cullinan-Ammann N., Lambertz I., Conti C., Fuchs-Young R. Transcriptional Regulation of Estrogen Receptor-{alpha} by p53 in Human Breast Cancer Cells // Cancer Research. 2009. - Vol. 69, № 8.-P. 3405.

133. Shu K.X., Li В., Wu L.X. The p53 network: p53 and its downstream genes // Colloids Surf. В Biointerfaces. -2007. Vol. 55, № 1. - P. 10-18.

134. Soussi T. p53 alterations in human cancer: more questions than answers // Oncogene. -2007. Vol. 26, № 15. -P. 2145-2156.

135. Soussi Т., Wiman K.G. Shaping genetic alterations in human cancer: the p53 mutation paradigm // Cancer Cell. 2007. - Vol. 12, № 4. - P. 303-312.

136. Stehmeier P., Muller S. Regulation of p53 family members by the ubiquitin-like SUMO system.// DNA Repair (Amst.). 2009. - Voh 8, №4. -P. 491498. ■ •''.■ ■. ''"' '• '■

137. Carcinogenesis 2001. - Vol-.22; № 3; - PI 515-517.

138. Tang Y., Zhao W., Chen Y., Zhao Y., Gu W. Acetylation is indispensable for, p53;activation//Cell; 2008; - Vol; 133, №:4. - P: 612-626.

139. Thomas M., Kalita A., Labrecque S., Pim D., Banks L., Matlashewski G. Two ро1утофЫс variants of wild-type p53 differ biochemically and biologically// Mol. Cell Biol. 1999. - Vol. 19, № 2. - P. 1092-1100.

140. Toledo F., Wahl G.M. Regulating the p53 pathway: in vitro hypotheses, in vivo Veritas // Nat. Rev. Cancer. 2006. - Vol. 6, № 12. - P. 909-923.

141. Tsuda H. Gene and chromosomal alterations in sporadic breast cancer: correlation with histopathological features and implications for genesis and progression // Breast Cancer. 2009. - Vol. 16, № 3. - P. 186-201.

142. Vousden K.H., Lane D.P. p53 in health and disease // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007. - Vol. 8, № 4. - P. 275-283.

143. Vousden K.H., Ryan K.M. p53 and metabolism // Nat. Rev. Cancer. 2009. -Vol. 9, №10. -P. 691-700.

144. Wallden В., Emond M., Swift M.E., Disis M.L., Swisshelm K. Antimetastatic gene expression profiles mediated by retinoic acid receptor beta 2 in MDA-MB-435 breast cancer cells // BMC Cancer. 2005. - Vol. 5 - P. 140.

145. Wang-Gohrke S., Weikel W., Risch H., Vesprini D., Abrahamson J., Lerman

146. C., Godwin A., Moslehi R., Olipade O., Brunet J.S., Stickeler E., Kieback

147. D.G., Kreienberg R., Weber В., Narod S.A., Runnebaum I.B. Intron variants of the p53 gene are associated with increased risk for ovarian cancer but not in carriers of BRCA1 or BRCA2 germline mutations // Br. J. Cancer. 1999. -Vol. 81, № l.-P. 179-183.

148. Wang W., Spitz M.R., Yang H., Lu C., Stewart D.J., Wu X. Genetic variants in cell cycle control pathway confer susceptibility to lung cancer // Clin. Cancer Res. 2007. - Vol. 13, № 19.-P. 5974-5981.

149. Washbrook E. Risk factors and epidemiology of breast cancer // Women's Health Medicine.-2006.-Vol. 3, № l.-P. 8-14.

150. Weigelt В., Wessels L.F., Bosma A.J., Glas A.M., Nuyten D.S., He Y.D., Dai H., Peterse J.L., van't Veer L.J. No common denominator for breast cancer lymph node metastasis // Br. J. Cancer. 2005. - Vol. 93, № 8, - P. 924-932.

151. Weissenbach J., Gyapay G., Dib C., Vignal A., Morissette J., Millasseau P., Vaysseix G., Lathrop M. A second-generation linkage map of the human genome // Nature. 1992. - Vol. 359, № 6398. - P. 794-801.

152. Whibley C., Pharoah P.D., Hollstein M. p53 polymorphisms: cancer implications // Nat. Rev. Cancer. 2009. - Vol. 9, № 2. - P. 95-107.

153. Wijnhoven S.W., Kool H.J., van Teijlingen C.M., van Zeeland A.A., Vrieling H. Loss of heterozygosity in somatic cells of the mouse. An important step in cancer initiation? // Mutat. Res. 2001. - Vol. 473, № 1. - P. 23-36.

154. Wu X., Zhao H., Amos C.I., Shete S., Makan N., Hong W.IC., Kadlubar F.F., Spitz M.R. p53 Genotypes and Haplotypes Associated With Lung Cancer Susceptibility and Ethnicity // J. Natl. Cancer Inst. 2002. - Vol. 94, № 9. -P. 681-690.

155. Xu Y., Yao L., Ouyang Т., Li; J., Wang Т., Fan Z., Lin В., Lu Y., Xie Y. p53 Codon 72 polymorphism predicts the pathologic response to neoadjuvant chemotherapy in patients with breast cancer // Clin. Cancer Res. 2005. — Vol. 11, № 20. - P. 7328-7333.

156. Xu Y., Yao L., Zhao A., Ouyang Т.,.Li J., Wang Т., Fan Z., Fan Т., Lin В., Lu Y., Xie Y. Effect of p53 codon 72 genotype on breast cancer survival depends on p53 gene status // Int. J. Cancer. 2008. - Vol: 122, № 12. - P. 2761-2766. "'■.;■■ //

157. Zhang T.Y., Meaney M.J. Epigenetics and the enviromnental1 regulation of the genome and its function // Annu. Rev. Psychol. 2010. - Vol. 61 - P; 439. 466,сi-3. ; . '

158. Zhuo W., Zhang Y., Xiang Z., Cai L., Chen Z. Polymorphisms of TP53 codon 72 with breast carcinoma risk: evidence from 12226 cases and 10782 controls // J. Exp. Clin. Canccr Res. 2009. - Vol. 28 - P.115.

159. Zoon C.K., Starker E.Q., Wilson A.M., Emmert-Buck M.R., Libutti S.K., Tangrea M.A. Current molecular diagnostics of breast- cancer and the potential incorporation of microRNA // Expert Rev. Mol; Diagn. 2009. -Vol. 9, № 5.-P. 455-467.

160. Zou Z., Gao C., Nagaich A.K., Connell Т., Saito S., Moul J.W., Seth P., Appella E.,: Srivastava S. p53 regulates the expression of the tumor suppressor gene maspin //J; Bioli Chem. 2000:-VoK 275, № 9. - Pi 6051-6054Г

Информация о работе

Денисов, Евгений Владимирович
кандидата биологических наук
Томск, 2010
ВАК 03.02.07

Диссертация

Мутационная изменчивость гена TP53 при раке молочной железы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы