Морфологические изменения межпозвонковых дисков крыс в условиях асимметричной статичной компрессии

Волков, Алексей Вадимович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфологические изменения межпозвонковых дисков крыс в условиях асимметричной статичной компрессии
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Морфологические изменения межпозвонковых дисков крыс в условиях асимметричной статичной компрессии"

На правах рукописи

Волков Алексей Вадимович

Морфологические изменения межпозвонковых дисков крыс в условиях асимметричной статичной

компрессии

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□0344790Э

Москва 2008

003447909

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте морфологаи человека РАМН и ЗАО «Реабилитационные медицинские технологии»

Научный руководитель: доктор биологических наук

Гольдштейн Дмитрий Вадимович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Яглов Валентин Васильевич

доктор медицинских наук, профессор Раденска-Лоповок Стефка Господиновна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава

Защита состоится 23 октября 2008 года в 1400 часов на заседании диссертационного совета (Д 001. 004.01) ГУ НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3

Автореферат разослан 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л.П. Михайлова

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Изучение процессов, протекающих в межпозвонковых дисках при их дегенеративных изменениях, и разработка новых эффективных методов лечения невозможны без экспериментальных исследований на лабораторных животных. Однако в настоящее время в отечественной и зарубежной литературе отсутствуют публикации результатов экспериментальных работ, в которых изучался патогенез дегенеративных заболеваний позвоночника с одновременным использованием комплекса лабораторно-инструментальных методов, охватывающий максимальное количество патогенетических звеньев. Представленные в литературе экспериментальные модели дегенеративных изменений межпозвонковых дисков можно подразделить на четыре основные группы. Первая группа моделей основана на разрушении пульпозного ядра химическими реагентами, такими, как протеолитические ферменты, например хемотрипсин (Norcross J.P., 2003; Lötz J.C., 2004). Вторая - на механическом разрушении пульпозного ядра или фиброзного кольца (Kim K.S., 2005; Masuda К., 2005). В экспериментальных моделях, объединенных в третью группу, повреждение межпозвонкового диска вызывали компрессией с помощью металлических фиксаторов, подобных аппарату Илизарова, или путем сгибания хвостового отдела позвоночника. По физическим и биомеханическим характеристикам эти модели имитируют прямохождение человека (Ching С.Т., 2004; Lötz J.C., 2004; Stokes I.A., 2004). Среди моделей имитирующих прямохождение, стоит выделить работу Pazzaglia et al. (1997), в которой повреждение достигается сгибанием хвостового отдела позвоночника и фиксации его металлической проволокой. Однако недостатком этой модели является отсутствие стабильной и надежной фиксации, а также возможное нарушение кровоснабжения в тканях хвоста в результате давления проволоки, что может послужить причиной недостоверных результатов. У некоторых животных, как, например, у песчанок, дегенеративно-дистрофические процессы возникают спонтанно (Gruber Н.Е., 2005). Однако эта модель еще недостаточно изучена, но ее можно выделить в отдельную четвертую группу.

В большинстве экспериментальных исследований, в которых моделируется остеохондроз позвоночника, использован метод компрессии хвостового отдела позвоночника крыс. При работе с этим объектом нет необходимости в применении сложных внешних устройств или создания особых, нередко тягостных для животных, условий содержания для имитации прямохождения человека, которые несовместимы с принципами биоэтики.

Цель и задачи исследования

Изучить морфологические изменения тканей межпозвонкового диска в условиях асимметричной статичной компрессии позвоночника у крыс.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

:' ' j

i , '

1 ! ь

f "W'

1. Разработать адекватную экспериментальную модель дегенеративных заболеваний позвоночника у крыс.

2. Оценить влияние статичной асимметричной компрессии на ткани межпозвонковых дисков и дать сравнительную характеристику их патологических изменений в динамике.

3. Исследовать восстановительные процессы и оценить возможность репарации теаней межпозвонковых дисков в условиях статичной асимметричной компрессии.

4. Исследовать влияние ассиметричной статичной компрессии на нотохордальные клетки пульпозного ядра в динамике.

Научная новизна

Разработана новая воспроизводимая адекватная модель дегенеративных заболеваний позвоночника.

Впервые было проведено сравнительное комплексное исследование дегенеративных изменений и регенераторного потенциала межпозвонкового диска с применением рентгенологических, иммуногистохимических и морфологических методов в условиях статичной асимметричной компрессии межпозвонкового диска.

Установлено, что нотохордальные клетки пульпозного ядра экспрессируют эпителиальные (цитокератин 8) и мезенхимальными маркеры (аггреканан, металлопротеиназы). Показано участие нотохордальных клеток в ремоделировании внеклеточного матрикса пульпозного ядра путем синтеза, как компонентов внеклеточного матрикса, так и ферментов его разрушающих (аггреканазы).

Установлено, что асимметричная статичная компрессия приводит к развитию каскада дегенеративных изменений в тканях межпозвонковых дисков. Пульпозное ядро и фиброзное кольцо не способны к регенерации в условиях статичной осевой нагрузки. Выявленные морфологические и патологические изменения сопоставимы с таковыми у человека, страдающего остеохондрозом позвоночника. Практическая значимость

Разработана новая воспроизводимая экспериментальная модель остеохондроза позвоночника у крыс (заявка №2006135141/14(0382522) приоритет установлен 05.06.2006). Полученные экспериментальные данные о морфологических изменениях в межпозвонковом диске на модели остеохондроза послужат основой для разработки новых методов лечения данных заболеваний позвоночника.

Разработана оригинальная методика быстрой декальцинации тканевых образцов, позволяющая проводить иммуногистохимические исследования.

Апробация работы

Основные положения работы доложены на: Конференции "Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» РГМУ 2006 год, Москва; Европейском конгрессе нейрохирургов в 2006, во Франции; Annual TERMIS-EU Meeting (formerly ETES meeting). October 8-11, 2006, Rotterdam, The Netherlands; Конференции "Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении», Москва, РГМУ 2007 год; III Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» 25-26 апреля 2007, Москва, ФГУП «ЦИТО» Росздрава; Межлабораторной конференции в ГУ НИИ морфологии человека РАМН (сентябрь, 2007г.)

Внедрение полученных результатов. Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе на кафедре гистологии, эмбриологии, цитологии лечебного факультета ГОУ ВПО Российского государственного медицинского университета.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 2 в журналах, представленных в списке ВАК, получены 1 патента.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Литературный указатель включает 76 источников, из них 2 - отечественных, 74 - иностранных. Работа иллюстрирована 63 фотографиями, 2 таблицами.

Материалы и методы исследования

Экспериментальная модель. Принцип повреждения межпозвонкового диска в экспериментальной модели основан на асимметричной статичной компрессии межпозвонковых дисков хвостового отдела позвоночника без использования внешних или внутренних фиксирующих элементов.

Лабораторные животные - половозрелые крысы-самцы Вистар, массой тела 450-550 гг. в возрасте 11-15 месяцев. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977. На проведение экспериментального исследования было получено разрешение Комиссии по биоэтике ГУ НИИ морфологии человека РАМН (Протокол №3 от 26 сентября 2005г.).

Анестезиологическое пособие. Животных вводили в наркоз путем внутримышечной инъекции раствора препарата «Золетил-50» в дозе 5 мг/кг или путем ингаляции этилового эфира. Уровень резекции определяли путем

сгибания хвоста без дополнительного усилия и прикладывания к крестцу на уровне LIV - SI - месту предполагаемой фиксации, что соответствовало уровню Сс XTV-XV.

Методика повреждения. Под наркозом производили циркулярный разрез кожи хвоста на уровне CcXIII-XTV позвонков хвостового отдела позвоночника и еще один, отступив 1 см краниальнее. Участок кожи между двумя разрезами иссекали, обнажая тем самым позвонки и сухожилия. Резекцию 2/5 дистальной части хвостового отдела позвоночника проводили по межпозвонковому диску, обнаруживаемому в центре операционной раны. Производили наложение фиксирующей лигатуры Prolen (Jonson&Jonson, USA), которая также играла роль кровоостанавливающей после пересечения крупных сосудов. После этого резиновый жгут снимали для проверки отсутствия кровотечения из культи. Затем производили разрез кожи на 1,5 см краниальнее остистых отростков последних позвонков поясничного отдела. Тупым путем формировали подкожный туннель. После этого хвостовой отдел подшивали к кожной ране нитью Vicril 3/0 (Jonson&Jonson,USA).

Группы исследования В эксперимент были включены следующие группы: I. Контрольные группы:

1 Интактные животные, на которых не производили вмешательств (группа N).

2 Ложнооперированные животные, которым производили резекцию хвостового отдела позвоночника на том же уровне, что и экспериментальным животным, но без формирования компрессии. Животных забивали через 2 месяца после резекции (группа К-1).

И. Экспериментальные группы:

1 Группа М-1. Животные, которым производили оперативное формирование асимметричной компрессии на межпозвонковые диски сроком на 1 месяц.

2 Группа М-2. Животные, которым производили оперативное формирование асимметричной компрессии на межпозвонковые диски сроком на 2 месяца.

3 Группа М-3. Животные, которым производили оперативное формирование асимметричной компрессии на межпозвонковые диски сроком на 3 месяца.

Исследование патологических изменений, протекающих в межпозвонковых дисках у экспериментальных животных, проводили с помощью рентгенологических, гистологических, морфологических и иммуногистохимических методов исследования.

Рентгенологические методы исследования

Рентгенологические исследования крыс проводили на базе отделения нейрорентгенологии ГУ «НИИ нейрохирургии им. Н. Н. Бурденко РАМН» (руководитель отдела рентгенологи, профессор, Корниенко В.Н.). Спиральная компьютерная томография, а и затем магнитно-резонансная томография в проводилась в состоянии наркоза (раствор «Золетила-50» в дозе 5 мг/кг), в

специальном фиксаторе из полужесткого пенополиуретана. Магнитно-резонансную томографию проводили на 1,5-тесловом аппарате фирмы GE Fast Spin Echo XL/90. Была использована импульсная последовательность со следующими параметрами: TR5420, ТЕ94, толщина среза 3 мм, расстояние между срезами 0,7 мм, матрица 320*256, FOV 20/20. Спиральная компьютерная томография проводилась на 6-детекторном спиральном компьютерном томографе (Phillips), толщина среза 0,75 мм, FOV 500, с использованием матрицы 512. Рентгенологические методы исследования проводили 2 животным из контрольной группы и 2 животным из группы М-3 по прошествии 1 и 3 месяцев после операции.

Гистологические методы исследования

Гистологическое исследование образцов ткани проводили непосредственно после выведения животных из эксперимента. Исследовали межпозвонковые диски CcVI-VII, CcVII-VIII, CcVIII-IX, на которые приходилось максимальное воздействие. В качестве контрольных образцов использовали межпозвонковые диски того же уровня интактных животных и интактные межпозвонковые диски экспериментальных животных, лежащие выше уровня СсХД и ниже СсГУ. Межпозвонковые диски выделяли путем сечения по центру крайних позвонков.

Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина на фосфатном буфере по Лилли на 72 часа, после чего в течение 24 часов образцы ткани промывали в проточной воде. Декальцинацию проводили по оригинальной и впервые применяемой методике в перенасыщенном растворе ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) с добавлением хлорида натрия (9 граммов на литр раствора). Суть метода заключается в ускорении декальцинации путем электролиза (силу тока до 50 тА) при температуре 37 DC, постоянном перемешивании воздушной помпой в течение 72 часов. После стандартной гистологической проводки образцы тканей заливали в парафин («Гистомикс», Биовитрум), используя гистологические заливочные кольца (Биовитрум).

Срезы получали на микротомах Reichert (7 мкм для светооптического исследования) и Leica (4 мкм для иммуногистохимического исследования). Для изучения срезов тканей межпозвонковых дисков использовали следующие методы: обзорные окраски - гематоксилином и эозином, по Маллори; для хрящевой ткани - окраска сафранином О с докраской световым зеленым, окраска по Моури при pH 1,0; селективная окраска ядер галлоцианином.

Иммуногистохимическое исследование

Иммуногистохимическое исследование образцов ткани проводили для того, чтобы выявить изменения, как компонентов внеклеточного матрикса, так и клеточного состава тканей межпозвонковых дисков.В работе использовали наборы антител к следующим компонентам внеклеточного матрикса: коллагену

I типа, аггрекану и металлопротеиназам - аггреканазам (ADAMTS-1, -4 и -5, Abcam, USA). Клеточную популяцию тканей межпозвонкового диска определяли по эпителиальным маркерам нотохордальных клеток (цитокератин 8, Abcam, USA); антитела к мембранному протеину CD68 (Abcam, USA) позволяют выявить клетки макрофагального ряда, антитела к Ki67 (Daco, USA) выявляли клетки в S-фазе. Ki67+ клетки в пульпозном ядре подсчитывали при общем увеличении Х900 и выражали в процентах от общего числа нотохордальных клеток.

Методика постановки иммуногистохимической реакции. Иммуноморфологическое исследование гистологических срезов выполняли по стандартной методике. После проведения иммунопероксидазной реакции гистологические препараты докрашивали гематоксилином, изучали и фотографировали, используя световой микроскоп DM-LB (Leica, Germany) с видеокамерой JVC компьютером Pentium 4.

Морфометрическое исследование

В работе были использованы следующие параметры, характеризующие основные этапы дегенеративных изменений межпозвонкового диска: высота межпозвонкового диска, площадь среза пульпозного ядра, в центральной части диска, угол между замыкательными пластинками, количество ядросодержащих клеток в пульпозном ядре в центральной части диска. Для морфометрии использовали продольные срезы позвонка, полученные из центральной части блока. Высоту межпозвонкового диска определяли на уровне наиболее приближенных друг к другу поверхностей эпифизов выше- и нижележащих позвонков в месте компрессии и наиболее удаленных поверхностей эпифизов выше- и нижележащих позвонков в месте декомпрессии. Площадь среза определяли полуавтоматически путем обведения контура пульпозного ядра на препарате. Угол между замыкательными пластинками определялся полуавтоматически путем размещения сторон угла по касательной к выступающим частям эпифизов, прилегающих к межпозвонковому диску. Определяли ядросодержащие клетки на срезе пульпозного ядра центральной части диска.

Статистические методы исследования. Статистическая обработка данных выполнялась в программе STATISTICA 6.0. Поскольку распределение данных отличалось от нормального, для сравнения был применен ранговый дисперсионный анализ Краскала-Уоллеса и непараметрический тест Данна. Результаты выражали как среднее ± стандартное отклонение. Был выбран пороговый уровень достоверности р^),05.

Результаты исследования и их обсуждение 1. Контрольная группа, интактные животные (14)

1.1. Рентгенологическое исследование. При выполнении магнитно-резонансной томографии в режиме Т2 у животных из контрольной группы обнаружено, что ткани межпозвонкового диска гидрофильны неодинаково, и большая часть жидкости сконцентрирована в пульпозном ядре. Интенсивность свечения сопоставима с таковой у человека с неизмененными пульпозными ядрами межпозвонковых дисков - симптом белого диска. Пульпозное ядро расположено симметрично и заполняет большую часть межпозвонкового диска.

Спиральная компьютерная томография продемонстрировала, что позвонки по структуре больше напоминают по строению короткие трубчатые кости, остистые отростки представлены циркулярно-расположенными звездчатыми разрастаниями в проксимальном отделе позвонков. В мягких тканях около фиброзного кольца располагаются костные образования - сесамовидные косточки.

1.2 Гистологическое исследование. Между волокнами видны единичные веретенообразные хондроциты. При окрашивании сафранином О или альциановым синим по Моури заметно, что клетки окружены студенистым внеклеточным матриксом, богатым гликозаминогликанами. В центральной части межпозвонкового диска расположено овальное пульпозное ядро, заполняющее большую по площади часть диска. Нотохордальные клетки располагаются кластерами по 4-8 клеток, которые в свою очередь образуют скопления неправильной формы. Внеклеточный матрикс занимает большую часть пульпозного ядра. Цитоплазма нотохордальных клеток в незначительной степени окрашивается сафранином О и альциановым синим. Замыкательная пластинка представляет собой 1-2 слоя округлых или веретенообразных базофильных клеток в центральной части диска столбиков клеток в месте фиксации волокон пульпозного ядра. С латеральных сторон прилегает рыхлая волокнистая соединительная ткань, в которой прослеживаются крупные сосуды и пучки сухожилий в сухожильных влагалищах. Костная часть позвонков, прилегающих к межпозвонковому диску, представлена эпифизом и зоной роста, контактирующей с костномозговой полостью тела позвонка.

1.3. Иммуногистохимическое исследование. При

иммуногистохимическом исследовании межпозвонковых дисков интактных животных оказалось, что больше всего аггрекана содержится во внеклеточном матриксе пульпозного ядра. Значительно меньше его в фиброзном кольце и внутри нотохордальных клеток. Аггреканазы и клетки макрофагального ряда (СБ68+), в пульпозном ядре и фиброзном кольце не были выявлены. В фиброзном кольце присутствовали волокна коллагена I типа. Нотохордальные клетки экспрессируют цитокератин 8. Количество К167+ клеток 15,8% от всех нотохордальных клеток пульпозного ядра.

2. Группа М-1.1 месяц воздействия.

2.1. Гистологическое исследование. Хорошо видны зона компрессии фиброзного кольца со сближающимеся эпифизами и зона декомпрессии с противоположной стороны. В области декомпрессии волокна фиброзного кольца натянуты, сохраняют свой продольный ход и отчетливо окрашиваются сафранином О и альциановым синим по Моури. Хондроциты распластаны по волокнам. В зоне компрессии волокна фиброзного кольца становятся более извилистыми, их пучки расслоены. Хондроциты располагаются вдоль хода волокон. Некоторые пучки волокон фиброзного кольца устремляются кнаружи, другие кнутри межпозвонкового диска, сдавливая и оттесняя пульпозное ядро. Содержание гликозаминогликанов больше в пучках, устремленных к пульпозному ядру, однако между волокнами, располагающимися кнутри, вокруг хондроцитов обнаруживаются участки, богатые гликозаминогликанами. В области сдавления волокон увеличения количества гликозаминогликанов не происходит. Пульпозное ядро децентрализовано. Внеклеточный матрикс имеет гелеобразное строение с некоторой тенденцией к образованию тяжей. Внеклеточный матрикс густо окрашивается сафранином О и альциановым синим по Моури. Окраска гематоксилином выявляет дистрофические изменения в больших группах кластеров нотохордальных клеток с оксифилией кариоплазмы. Костная часть эпифизов несколько утолщена, особенно в месте компрессии, костные балки утолщены, укорочены. Костномозговые полости несколько уменьшаются. В отдельных полях зрения определяются места повреждения зон роста.

2.2. Иммуногистохимическое исследование. При проведении иммуногистохимических реакций для выявления основных маркеров дегенеративных процессов в хрящевой ткани межпозвонкового диска и клеточных маркеров нотохордальных клеток было установлено, что через 30 дней компрессии: нотохордальные клетки экспрессируют эпителиальный маркер цитокератин 8; коллаген I в пульпозном ядре не выявлен, в фиброзном кольце и эпифизах отчетливо определяестя; аггрекан выявляется как внутриклеточно в нотохордальных клетках, так и во внеклеточном матриксе пульпозного ядра; наибольшее содержание аггреканаз выявлено как во внеклеточном матриксе пульпозного ядра и фиброзного кольца, так и в виде каемки вокруг нотохордальных клеток; клетки макрофагального ряда (СБ68+) определялись только в областях перестройки костной ткани; при выявлении нотохордальных клеток, находящихся в 8-фазе клеточного цикла, обнаружено, что 82,4% клеток экспрессируют Ш67.

3. Группа М-2.2 месяца воздействия.

3.1. Гистологическое исследование. Морфологические изменения аналогичны тем, что наблюдали в группе М-1, но повреждение фиброзного кольца, децентрализация пульпозного ядра и изменения в эпифизах были выражены в большей степени.

3.2 Иммуногистохимическое исследование

Аггрекан в пульпозном ядре выявлялся как внутриклеточно, так и внеклеточно, но меньшими полями, чем в группе М-1. Значительно меньшее количество его обнаружено в фиброзном кольце, причем распределение не было равномерным с большим содержанием в области компрессии. Также высокие концентрации аггрекана выявлены в перестраивающейся кости эпифизов и костных балках тела позвонков. Отмечается низкая экспрессия аггреканазы в виде тонких каемок по периферии нотохордальных клеток. Клетки макрофагального ряда (СБ68+) в пульпозном ядре и фиброзном кольце отсутствуют. Волокна коллагена I типа в пульпозном ядре не обнаружены. Найдено большое количество клеток (29,7%) в Б-фазе клеточного цикла. 4. Группа М-3.3 месяца воздействия.

4.1. Рентгенологическое исследование. При выполнении магнитно-резонансной томографии в режиме Т2 у животных в этой группе до операции выявлено, что ткани межпозвонкового диска гидрофильны неодинаково, и большая часть жидкости с концентрирована в пульпозном ядре. Спиральная компьютерная томография выявила, что позвонки по структуре своей больше напоминают короткие трубчатые кости, остистые отростки представлены циркулярно расположенными звездчатыми разрастаниями в проксимальном отделе позвонков.

Выполненная в первые часы после операции, магнитно-резонансная томография в режиме Т2, не выявила изменение в гидрофильности тканей межпозвонкового диска. Интенсивность сигнала оставалась сопоставимой с нормальной в межпозвонковых дисках интактных животных. После трехмерной реконструкции изображений, полученных от спиральной компьютерной томографии, выполненной в это же время, обнаружено изменение утла наклона между замыкательными пластинками СсУ1-Сс1Х. Величина угла между замыкательными пластинками составляла 34°, аналогичный показатель выявляется у человека при лордозе поясничного отдела позвоночника. Костных повреждений не выявлено.

Магнитно-резонансной томография, выполненное в межпозвонковых дисках уровня СсУ1-Сс1Х через 1 месяц воздействия, показало снижение сигнала от пульпозного ядра в 2 раза. Спиральная компьютерная томография этой области костной патологии не выявила, угол между замыкательными пластинками сохранялся на прежнем уровне.

Сгибание хвоста приводило к расположению терминальных пластинок позвонков хвоста крысы под углом друг к другу и асимметричной нагрузке на межпозвонковые диски, создавая тем самым модель поясничного лордоза у человека.

Спиральная компьютерная томография, выполненная после 1 месяца компрессии у той же крысы, выявила асимметричное снижение высоты межпозвонковых дисков, наиболее выраженное в области Сс У1-1Х

межпозвонковых дисков. Плотность межпозвонковых дисков измеряли в единицах Хаунсфилда и сравнивали ее значения в области максимального перегиба, минимального перегиба и интактной.

При магнитно-резонансной томографии, выполненной у того же животного после 1 месяца компрессии, выявляется снижение сигнала от пульпозного ядра в Т2-режиме. Данные изменения напоминают "черный диск", наблюдающийся у пациентов с дегенерацией межпозвонкового диска. 4.2. Гистологическое исследование.

Морфологические изменения в межпозвонковом диске имели прогрессирующий характер. Обращает на себя внимание конденсация соединительной ткани и увеличивающееся количество мелких сосудов. В толще соединительнотканных образований вне фиброзного кольца присутствуют фибробластоподобные клетки. Гликозаминогликанов выявлено больше в пучках, сдавливающих пульпозное ядро, между волокнами, располагающимися кнаружи, от зоны максимальной компрессии обнаруживаются участки, богатые гликозаминогликанами вокруг хондроцитов. В непосредственной области сдавления волокон фиброзного кольца гликозаминогликанов не определяются. Пульпозное ядро децентрализовано, резко уменьшено в размере. Волокна фиброзного кольца в области декомпрессии как бы провисают. Костная часть эпифизов утолщается. В некоторых образцах напротив эпифизарная кость в месте компрессии истончается до полного исчезновения, латеральнее таких областей определяются участки разрастания хрящевой ткани, которая сменяется костной с образованием шипоподобных выростов. Выявлены значительные, до 1-2 мм, смещения суставных поверхностей (листез). 4.2 Иммуногистохимическое исследование

На этом сроке исследования внеклеточный матрикс конденсирован, разволокнен. Окраска на аггрекан в отдельных полях интенсивна, внутриклеточно отсутствует. Аггреканазы слабо экспрессируется в виде тонких каемок по периферии нотохордальных клеток, секреторных гранул в единичных клетках. Клетки макрофагального ряда (СБ68+) в пульпозном ядре и фиброзном кольце отсутствуют, а в ремоделируемой костной ткани обнаружены только остеокласты. Волокна коллагена I типа в пульпозном ядре не выявлены. Клетки, находящиеся в в-фазе в пульпозном ядре, составляют 5,2% общего числа нотохордальных клеток.

5. Группа К-1. Резекция хвоста, срок 2 месяца.

5.1. Гистологическое исследование. Волокна фиброзного кольца имеют продольное направление и соединяются в области замыкательной пластинки с эпифизами выше- и нижележащего позвонка. Между волокнами распластаны единичные веретенообразные хондроциты. При окрашивании сафранином О или альциановым синим по Моури клетки окружены студенистым внеклеточным матриксом, богатым гликозаминогликанами. В центральной части межпозвонкового диска расположено веретенообразной формы

пульпозное ядро, заполняющее большую часть диска. Нотохордальные клетки располагаются кластерами по 4-8 клеток, которые в свою очередь образуют неправильной формы скопления большего размера. Клеточные скопления расположены диффузно в виде сети в рыхлом гелеобразном внеклеточном матриксе, окрашиваемым сафранином О в ярко-красный цвет, а альциановым синим по Моури - в ярко синий цвет. Внеклеточный матрикс занимает большую часть пульпозного ядра. Цитоплазма нотохордальных клеток в незначительной степени окрашивается сафранином О и альциановым синим. Гистологическое строение костных структур не отличаются от таковых в интактном диске. 5.2 Иммуногистохимическое исследование

Выявляется повышенная экспрессия аггрекана во внеклеточном матриксе пульпозного ядра, а в фиброзном кольце и внутри нотохордальных клеток более низкая. Аггреканазы не выявлены. Клетки макрофагального ряда (CD68+) в пульпозном ядре и фиброзном кольце отсутствуют. Волокна коллагена I типа в пульпозном ядре не обнаружены. 6. Статистический анализ данных

Высота диска в месте компрессии и декомпрессии статистически значимо различалась во всех группах и снижалась с увеличением срока воздействия (табл. 1). Прослеживается отчетливая динамика снижения высоты межпозвонкового диска в целом, причем убывание высоты происходит как в области компрессии, так и декомпрессии (рис. 1). Площадь среза пульпозного ядра в центральной части диска достоверно снижалась во всех экспериментальных группах, в то время как контрольные группы (К-1 и N) между собой не различались (рис. 2). Статистически значимых различий между контрольной группой и интактными животными не было выявлено ни по одному параметру. Угол между замыкательными пластинками был равен нулю в контрольных группах и прогрессивно увеличивался во всех экспериментальных группах, достигая 34 градусов в группе М-3. Несмотря на убывание объема пульпозного ядра, количество ядросодержащих клеток пульпозного ядра стремительно уменьшалось только в первый месяц воздействия (почти в три раза), тогда как в дальнейшем уменьшение не было статистически значимым (рис. 3).

Эмбриональное развитие межпозвонковых дисков и позвоночника в целом связано с взаимодействием клеток хорды с эктодеремальным и энтодермальным зародышевыми листками (Голиченков В.А., 2006). Поэтому впервые обнаруженные эпителиальные маркеры в опухолях, исходящих из пульпозного ядра свидетельствуют об эпителиальной природе нотохордальных клеток (Maiorano Е., 1992). Впоследствии были обнаружены цитокератины 8 и 19 в нотохордальных клетках интактных межпозвонковых дисках мышей (Tamai Y., 2000) и кроликов (Kim K.W., 2003). Однако их участие в синтезе и ремоделировании внеклеточного матрикса оставалось мало изученным.

В нашем исследовании с помощью иммуногистохимических методов было установлено, что нотохордальные клетки межпозвонкового диска хвостового отдела позвоночника крысы экспрессируют цитокератин 8, как в нормальных условиях, так и во время компрессии. Исследование внеклеточного матрикса на предмет главного компонента его - аггрекана и разрушающих его металлопротеиназ, выявило, что в нормальных условиях аггрекан располагается преимущественно внеклеточно, а аггреканазы данным методом не определяются. Создание компрессии в первый же месяц приводит к усилению синтеза аггрекана нотохордальыми клетками и появлением аггреканаз как внутри-, так и внеклеточно. С течением времени нотохордальные клетки снижают синтетическую активность до низкого уровня, что проявляется в незначительных концентрациях аггрекана и аггреканаз внутриклеточно. Это может свидетельствовать об активном участии нотохордальных клеток в ремоделировании внеклеточного матрикса пульпозного ядра под влиянием компрессии и снижении этой способности с течением времени.

Среди большого числа исследований, посвященных экспериментальным моделям дегенеративных заболеваний позвоночника, отсутствуют работы, в которых были бы использованы комплексные методы для верификации патологических изменений с использованием как малоинвазивных методик прижизненной идентификации, так и аутопсийного материала. Большинство из них основываются на сочетании таких методов, как магнитно-резонансная томография - светооптическое исследование, а другие на комплексе -светооптическое и иммуногистохимическое исследование (Pazzaglia U.E. 1997; Ching J.C. 1999; Kroeber M.W. 2002; Phillips F.M., 2002; MacLean J.J., 2003; Ching C.T., 2003). Встречаются лишь единичные работы, использующие морфометрию и методы молекулярной диагностики. В литературе также отсутствуют данные о механизмах гибели пульпозного ядра, способности его к регенерации. Неясным остается источник возможной регенерации тканей межпозвонкового диска. Анализ работ показал отсутствие единого мнения о природе и цитологической характеристике нотохордальных клеток, причинах их гибели при проникновении в область пульпозного ядра сосудистой сети.

Имеющиеся в арсенале исследователей экспериментальные модели в большинстве своем не способны в целом проследить динамику патологических изменений, протекающих в гибнущих межпозвонковых дисках. Одни из них не воспроизводят в полной мере каскад дегенеративных процессов в межпозвонковом диске, другие же имеют ряд недостатков, не позволяющих провести корректные мультифокальные исследования, не повреждая межпозвонкового диска. Так, например, аппарат Илизарова или иные металлические конструкции не позволяют провести магнитно-резонансную томографию и могут вызвать местные реакции на инородное тело, что может привести к погрешностям и неточностям при оценке результата.

Предложенная модель дегенеративных заболеваний позвоночника имеет

ряд преимуществ, позволяющих использовать одновременно любые инструментальные методы исследования, как прижизненные, так и с использованием аутопсийного материала. В представленном исследовании был охвачен максимально полный объем как инструментальных, так и гистологических методов исследования, включающий в себя как рентгенологические методы (магнитно-резонансная томография, спиральная компьютерная томография), гистологические методы, морфометрия, иммуногистохимическое исследование.

Нами был разработан новый метод щадящей декальцинации образцов тканей, позволяющий в кратчайшие сроки подготовить образцы к иммуногистохимическому и гистологическому исследованию.

В работе показано, что даже при физиологическом сгибании и фиксации хвостового отдела позвоночника развивающаяся нагрузка достаточна, чтобы вызвать массовую гибель нотохордальных клеток в пульпозном ядре (табл.1) Так, количество нотохордальных клеток в пульпозном ядре к 30 суткам снизилось в 3 раза от исходного. Имеющаяся популяция клеток активно синтезирует аггрекан и металлопротеиназы, перестраивая, таким образом, внеклеточный матрикс в ответ на компрессию. В фиброзном кольце по такому же принципу активизируются хондроциты. Иммуногистохимическое исследование клеток, находящихся в Б-фазе клеточного цикла, выявило резкое увеличение их количества, что может свидетельствовать о регенеративном процессе в пульпозном ядре. Однако в фиброзном кольце на этот срок в месте компрессии клетки в Б-фазе практически отсутствуют и выявляются только вне зоны максимальной компрессии. В области декомпрессии фиброзного кольца они присутствовали только в областях около замыкательной пластинки. Клеток макрофагального ряда в фиброзном кольце и пульпозном ядре обнаружено не было.

Полученные данные согласуются с данными МасЬеап (2003) и СЫп% (2003), которые выявили катаболические изменения в пульпозном ядре в первые сутки и через месяц компрессии. Однако ими не указана преимущественная локализация аггрекана и аггреканаз, которые, по нашим данным, оказались как внутри-, так и внеклеточной для аггрекана и преимущественно внеклеточной для металлопротеиназ.

Патологические процессы в течение следующих 30 дней развивались в сторону снижения количества хондроцитов и разрушения волокон в фиброзном кольце в зоне максимальной компрессии, конденсации внеклеточного матрикса, уменьшения количества аггрекана, выраженной перестройки костной ткани под действием нагрузки. Отмечалась децентрализация пульпозного ядра. Количество нотохордальных клеток незначительно увеличивалось. Количество клеток в Б-фазе клеточного цикла оставалось на высоком уровне - порядка 82% от общего числа клеток (рис. 4). В этот период также выявлена конденсация соединительной ткани в месте компрессии, появление множества мелких

сосудов, не прорастающих в поврежденное фиброзное кольцо. Клеток макрофагального ряда в фиброзном кольце и пульпозном ядре выявлено не было.

Полученные данные свидетельствуют о смещении баланса катаболическо-анаболических и дегенеративно-регенеративных процессов в сторону катаболизма и дегенерации пульпозного ядра и фиброзного кольца. Очевидно, происходит снижение синтеза аггрекана и металлопротеиназ, поскольку внутри клеточная их концентрация остается на низком уровне.

В отличие от наблюдений Е. Каара (1994), К. Masuda (2005) в представленном исследовании не было обнаружено синтеза нотохордальными клетками коллагена I типа. Этот факт может быть объяснен только тем, что выраженный фиброз в пульпозном ядре в ранние сроки (до 30 дней) возникал только в моделях с воздействием ферментов и повреждением фиброзного кольца, через которое вполне могли проникать сосуды и мигрировать нерезидентные клетки пульпозного ядра - хондроциты волокнистого хряща и фибробласты. Данная теория находит подтверждение при анализе компрессионных моделей, в которых столь быстрое развитие фиброза не наблюдается (Pazzaglia U.E., 1997; Iatridis J.C., 1999; Kroeber M.W., 2002; Phillips F.M., 2002; Ching C.T., 2003). Несмотря на то, что экспрессия мРНК коллагена I типа все же происходит в первые часы компрессии (MacLean J.J., 2003), она, возможно, затухает или остается на низком уровне и не определяется иммуногистохимическими методами.

К 90 суткам асимметричной компрессии патологические процессы носят в основном дегенеративно-дистрофический характер. Пульпозное ядро уменьшено в размере, децентрализовано, в его волокнистом веществе определяются свободнолежащие фрагменты - секвестры фиброзного кольца, не содержащие клеток. В области максимальной компрессии определяется бесклеточная зона с поврежденными, разорванными и фрагментированными волокнами. Гликозаминогликаны в этой зоне отсутствуют. Зоны фиброзного кольца, непосредственно примыкающие к области максимальной компрессии, напротив, содержат клетки, которые активно синтезируют как аггрекан, так и коллаген I типа и аггреканазы. При исследовании клеток в S-фазе клеточного цикла в пульпозном ядре их обнаружено не более 5%, в фиброзном кольце они присутствовали только вне зоны максимальной компрессии, но большее их количество обнаруживалось в конденсированной соединительной ткани около фиброзного кольца. Это были, как правило, эндотелиальные клетки сосудов разного калибра, что свидетельствует о разрастании сосудистой сети. Несмотря на это, клеток макрофагального ряда и сосудов в самом фиброзном кольце не было выявлено. В ряде случаев, как и в наблюдениях Pazzaglia (1997), наблюдали разрастания костной ткани в латеральных областях метафиза позвонков, причем рост их происходил как из зон роста, так и при активном участии периоста. Эпифизы в местах компрессии истончались до полного их

исчезновения, обнажая зону роста, откуда в некоторых случаях и наступал рост остеофитов. Патологические изменения в этот период касались также и фиброзного кольца в месте декомпрессии, где наблюдались места разрывов волокон и отрыва их от места фиксации.

Интересен факт реактивной конденсации соединительной ткани в месте компрессии и отсутствие проникновения сосудов и макрофагов, как со стороны фиброзного кольца, так и через замыкательную пластинку со стороны костного мозга эпифизов, что может быть связано с сохранением баланса ангиогенных и антиангиогенных факторов в данной локализации (Bertram Н., 1975; Götz W., 1995.).

Полученные данные свидетельствуют о значительной роли осевой асимметричной статичной нагрузки на межпозвонковый диск в развитии дегенеративных процессов, поскольку уже через 1 месяц после начала воздействия могут быть обнаружены как катаболические признаки, такие, как синтез металлопротеиназ, так и признаки анаболического характера - синтез аггрекана. Интересным фактом, выявленным в исследовании, оказалось способность некоторое время - первые 2 месяца - нотоходальных клеток к поддержанию клеточного пула в ответ на их массовую гибель в первый месяц воздействия, о чем свидетельствует значительное количество (до 82%) нотохордальных клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла (Ki67+). Обнаруженный всплеск регенеративной активности пульпозного ядра в итоге завершился истощением резервных возможностей и практически полным снижением пролиферативной активности нотохордальных клеток к 90 суткам (рис. 4).

Проведенное экспериментальное исследование моделирования дегенеративных заболеваний позвоночника выявило, что каскад патологических изменений запускается в скором времени после начала компрессии на межпозвонковый диск и приводит к прогрессивным необратимым изменениям в тканях. Процесс начинается с гибели нотохордальных клеток, количество которых в течение первого месяца сокращается в три раза. В ответ на такое повреждение запускаются механизмы регенерации пульпозного ядра -пролиферация и реорганизация внеклеточного матрикса, которые, однако, не завершаются его восстановлением. Вероятно, это обусловлено быстрым истощением регенераторного потенциала пульпозного ядра, уменьшение его размера и отсутствие синтеза главных компонентов внеклеточного матрикса. Это приводит к уменьшению объема пульпозного ядра и снижению высоты диска. Выявленные в эксперименте изменения в межпозвонковом диске сходны с таковыми, выявляемыми у человека при спиральной компьютерной и магнитно-резонансной томографии - синдром «черного диска».

В месте максимальной компрессии происходит гибель хондроцитов фиброзного кольца, его разволокнение, разрушение волокон и отсутствие

каких-либо регенеративных процессов, миграции клеток как миелоидного, так и лимфоцитарного ряда. В условиях компрессии также не выявлено признаков прорастания сосудов и развития воспаления в поврежденной ткани. Данное наблюдение может быть объяснено не только синтезом хрящевой тканью антиангиогенных факторов, но и самой компрессией.

Немаловажные изменения претерпевают и костные структуры. Спустя три месяца статичной компрессии происходит уменьшение в объеме эпифизов позвонков вплоть до полного их исчезновения. В месте обнажения зоны роста пролиферирующая хрящевая ткань в совокупности с надкостницей дают начало остеофитам. Костная ткань тел позвонков также претерпевает ряд изменений, выражающихся в утолщении костных балок в месте компрессии и появлении признаков остеопороза с противоположной стороны.

Таким образом, данные, полученные в экспериментальном исследовании, свидетельствуют о повреждающем действии осевой нагрузки на межпозвонковый диск, приводящей к запуску основных патологических механизмов, приводящих к дегенеративным изменениям в межпозвонковом диске у крыс, которые не сопровождаются регенерацией тканей в целом в условиях продолжающейся компрессии и характеризуется быстрым истощением пролиферативного потенциала нотохордальных клеток пульпозного ядра.

Табл. 1. Основные параметры морфометрии межпозвонковых дисков крыс в экспериментальных и контрольных группах (среднее ± стандартное отклонение)

Группы наблюдения Параметры Контрольная N Группа сравнения К-1 Различные сроки компрессии межпозвонковых дисков (мес.)

1 мес. М-1 2 мес. М-2 3 мес. М-3

Высота диска в месте компрессии (мм) 2,26 ±0,09 р = <0,001 2,20±0,08 р = <0,001 2,12 ±0,12 р = <0,001 1,27±0,24 р = 0,005 0,58±0,1 р = <0,001

Высота диска в месте декомпрессии (мм) 2,29±0,07 р = <0,001 2,24±0,08 р = <0,001 3,37±0,36 <0,001 2,84±0,42 <0,001 1,92±0,36 Р = <0,001

Площадь среза пульпозного ядра в центральной части диска (мм2) 4,78±0,16 Р = <0,001 4,87±0,15 Р = <0,001 4,17±0,22 <0,001 2,51±0,53 <0,001 1,18±0,44 Р = <0,001

Угол между замыкательными пластинками (градусы) «0 р = <0,001 =0 р = <0,001 13,94±1,45 р = 0,048 25,43±1,41 р = 0,188 34,13±1,66 р = <0,001

Количество клеточных ядер на срезе пульпозного ядра в центральной части межпозвонкового диска 1060±88 р = <0,001 1029±73 р = <0,001 387±15 р = <0,001 380±64 р = 0,002 365±41 р = <0,001

Рис. 1. Динамика изменений высоты межпозвонкового диска в группах Ы, К-1, М-1, М-2, М-3.

Площадь среза пульпозного ядра в центральной части диска

¡¡щ Ш

3 -2 — ИИ ■■Л.;-,,.. .. - ■:■ г Ё1 - ---

1 0 шарада с^у;;;::.' N К-1 щш М-1 М-2

Е! Площадь 4,779 4,866 4,174 2,514 1,185

Рис. 2. Динамика уменьшения площади среза пульпозного ядра центральной части диска в группах N. К-1, М-1, М-2, М-3.

Количество ядросодержащий клеток на срезе центральной части пульпозного ядра

Рис. 3. Динамика изменения абсолютного количества нотохордальных клеток в гистологическом срезе пульпозного ядра в центральной части диска в группах Н К-1, М-1, М-2, М-3.

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

§88

ЩЦ

/ пидаг» «¿¡ей»

' ______ ГС^"** -^нЯ—Ш пШЙШ

— -

1Ю67+ (%)

N 1 мес. 2 мес. 3 мес.

Рис. 4. Динамика изменения абсолютного количества Кл67 положительных нотохордальных клеток в гистологическом срезе пульпозного ядра в центральной части диска в группах >1, М-1, М-2, М-3.

выводы

1. Разработана адекватная асимметричная статичная компрессионная экспериментальная модель дегенеративных заболеваний позвоночника у крыс, соответствующая основным патогенетическим звеньям остеохондроза позвоночника человека;

2. Нотохордальные клетки пульпозного ядра одновременно демонстрируют свойства как эпителиальных, так и мезенхимальных клеток, активно участвуют в ремоделировании внеклеточного матрикса путем синтеза его компонентов (аггреканы) и разрушающих их металлопротеиназ (аггреканаз);

3. Получены иммуношстохимические, морфологические и рентгенологические данные характерные для дегенеративных процессов в межпозвонковом диске сравнимые с таковыми у человека.

4. Статичная асимметричная компрессия в течение одного месяца компрессии приводит к гибели 63,8% нотохордальных клеток пульпозного ядра. Нотохордальные клетки снижают пролиферативный потенциал с 82,4% до 5,2% к 90 дням и не могут обеспечить полноценной регенерации пульпозного ядра;

5. Повреждение и гибель тканей межпозвонкового диска крыс в условиях продолжающейся компрессии приводит к общему снижению высоты межпозвонкового диска, уменьшению пульпозного ядра, разрушению фиброзного кольца, образованию остеофитов. Повреждение не приводит к развитию воспалительных реакций на повреждающий фактор в самом диске и прорастанию в очаг повреждения сосудов в условиях компрессии;

6. Разработан оригинальный метод быстрой декальцинации образцов костной ткани щадящим способом, пригодный для иммуногистохимических исследований.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. А.В.Волков, Д.В.Гольдштейн, И.Н.Шевелев, Н.А.Коновалов, Г.Б.Большакова, Т.Х.Фагхудинов, Н.В.Арутюнов, П.В.Зеленков. Компрессионная асимметричная статичная экспериментальная модель дегенеративно-дистрофических заболеваний межпозвонковых дисков. Методика повреждения. // Клеточные технологии в биологии и медицине.- 2007. -4, -С. 139-142.

2. А.В.Волков, Г.Б.Большакова, Д.В.Гольдштейн, Морфологические изменения тканей межпозвонковых дисков в статичной асимметричной компрессионной модели дегенеративно-дистрофических заболеваний межпозвонковых дисков. // БЭБИМ, -2008 г., -том 145, -№ 9, -С. 336-340.

3. AV Volkov, DV Goldshtein, АА Rzhaninova, IV Arutunjan, ТН Fathudinov, PV Zelenkov, AG Nazarenko, NV Arutunov, IN, Shevelev, NA Konovalov, AN Konovalov. Autologous chondrocytes transplantation in treatment of degenerative disk disease in rat model. Annual TERMIS-EU Meeting (formerly ETES meeting). October 8-11,2006, Rotterdam, The Netherlands.

4. Volkov A.V., Goldshtein D.V., Konovalov A.N., Konovalov N.A., Shevelev I.N., Rzhaninova A.A., Arutunjan I.V., Arutunov N.V., Fathudinov T.A., Nazarenko A.G., Zelenkov P.V. Autologous chondrocytes transplantation in treatment of degenerative disk disease. ECM VII: Cartilage & Joint Repair ECM VII: Cartilage & Joint Repair June 26 - 29, 2006, Congress Centre, Davos, CH., pp. 38-39.

5. Volkov A. V., Goldshtein D.V., Konovalov A.N., Konovalov N. A., Shevelev I.N., Rzhaninova A.A., Arutunjan I. V., Arutunov N.V., Fathudinov T.A., Nazarenko A.G., Zelenkov P.V. Autologous chondrocytes transplantation in

treatment of degenerative disk disease. Reunion annuelle de la Societe Francalise de Neurochirurgie. Joint Meeting of the French and Russian Societes of Neurosurgery, March 29 —April 1,2006, Caen, France, p. 125.

6. Коновалов А., Коновалов H., Шевелев И., Ржанинова А., Арутюнян И., Арутюнов Н., Гольдштейн Д., Волков А., Назаренко А., Зеленков П. Клеточные технологии в лечении дегенеративных заболеваний позвоночника. Сборник тезисов, IV съезд нейрохирургов России, РФ, Москва, 18-22 июня 2006 г.

7. Гольдштейн Д.В., Коновалов Н. А., Ржанинова А.А., Фатхудинов Т.А., Назаренко А.Г., Арутюнян И.В., Волков А.В., Макаров А.В., Пулин А.А., Зеленков П.В. Новая экспериментальная модель дегенеративных заболеваний межпозвонковых дисков и новых подход и их лечению с помощью тканеинженерной конструкции. Международная конференция «Фундаментальные науки- биотехнологии и медицине». 2006 г. Новосибирск, Россия, с. 37

Соискатель /А.В. Волков/

Для заметок

Подписано в печать 18.0 ?. 08 г- Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ ff6 Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Волков, Алексей Вадимович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность темы.

1.2. Цель и задачи исследования.

1.5. Положения, выносимые на защиту.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Экспериментальные модели дегенеративных заболеваний позвоночника.

2.1 .Нотохордальные клетки.

2.2. Внеклеточный матрикс.

2.3. Экспериментальные модели.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Экспериментальная модель.

3.1.1. Методика повреждения.

3.2. Группы исследования.

3.3. Рентгенологические методы исследования.

3.4. Гистологические методы исследования.

3.5. Иммуногистохимическое исследование.

Морфом етрия.

3.6.1. Измерение высоты межпозвонкового диска.

3.6.2 Измерение площади среза.

3.6.3 Угол между замыкательными пластинками.

3.6.4. Определение ядросодержащих клеток на срезе пульпозного ядра центральной части диска. мм. Подсчет осуществлялся ручным способом с использованием гематологического счетчика (Рис. 3.9).

3.8. Статистические методы исследования.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Контрольная группа, интактные животные (N).

4.1.1. Рентгенологическое исследование.

4.1.2 Гистологическое исследование.

4.1.3. Иммуногистохимическое исследование.

4.2. Группа М-1. 1 месяц воздействия.

4.2.1. Гистологическое исследование.

4.2.2. Иммуногистохимическое исследование.

4.3. Группа М-2. 2 месяца воздействия.

4.3.1. Гистологическое исследование.

4.3.2 Иммуногистохимическое исследование.

4.4. Группа М-3. 3 месяца воздействия.

4.4.1. Рентгенологическое исследование.

4.4.2. Гистологическое исследование.

4.4.2 Иммуногистохимическое исследование.

4.5. Группа К-1. Резекция хвоста, срок 2 месяца.

4.5.1. Гистологическое исследование.

4.5.2 Иммуногистохимическое исследование.

4.5. Статистический анализ данных.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфологические изменения межпозвонковых дисков крыс в условиях асимметричной статичной компрессии"

1.1. Актуальность темы

В последние десятилетия у врачей различных специальностей значительно вырос интерес к проблеме боли в спине, способам профилактики, к новым методам лечения, а также биомоделированию дегенеративных заболеваний позвоночника - дорсопатий (МКБ-Х) [2]. Это вызвано широкой распространенностью таких патологических состояний позвоночника, как остеохондроз, спондилез, спондилоартроз и др. Патологоанатомические исследования свидетельствуют о том, что дегенеративные изменения в межпозвонковых дисках имеются практически у всех взрослых людей и детей старших возрастных групп, а у детей с нарушением осанки - еще в более раннем возрасте. По данным Национального центра статистики здоровья США (NCHS), ежегодно 14,3 % первичных обращений к врачу происходит из-за впервые возникших болей в поясничном отделе позвоночника. Из числа обратившихся к врачу около 50% больных с заболеваниями позвоночника были госпитализированы, 22 % из них лечились хирургически. Как правило, пациенты, страдающие болями в спине - это активно работающие люди.

1.2. Цель и задачи исследования

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать адекватную воспроизводимую экспериментальную модель дегенеративных заболеваний позвоночника у крыс.

2. Оценить влияние статичной асимметричной компрессии на ткани межпозвонковых дисков и дать сравнительную характеристику их патологических изменений динамике.

3. Исследовать восстановительные процессы и оценить возможность репарации тканей межпозвонковых дисков в условиях статичной асимметричной компрессии.

1.3. Научная новизна

Разработана новая воспроизводимая адекватная модель дегенеративных заболеваний позвоночника.

Установлено, что нотохордальные клетки пульпозного ядра экспрессируют эпителиальные (цитокератин 8) и мезенхимальными маркеры (аггреканан, металл опротеиназы). Показано участие нотохордальных клеток в ремоделировании внеклеточного матрикса пульпозного ядра путем синтеза, как компонентов внеклеточного матрикса, так и ферментов его разрушающих (аггреканазы).

Установлено, что:

1. Асимметричная статичная компрессия приводит к развитию каскада дегенеративных изменений в тканях межпозвонковых дисков;

2. Пульпозное ядро и фиброзное кольцо не способны к регенерации в условиях статичной осевой нагрузки;

3. Выявленные морфологические и патологические изменения в межпозвонковом диске сопоставимы с таковыми у человека, страдающего остеохондрозом позвоночника;

4. Нотохордальные клетки проявляют экспрессию эпителиальных маркеров (цитокератин 8) и мезенхимальных маркеров (аггрекан, аггреканазы) и тем самым активно участвуют в ремоделировании внеклеточного матрикса пульпозного ядра.

1.4. Научно-практическая значимость

Анализ полученных экспериментальных результатов позволяет в дальнейшем исследовать патофизиологические механизмы остеохондроза позвоночника, разрабатывать новые методы лечения и изучать эффективность фармацевтических препаратов. Определено, что нотохордальные клетки проявляют свойства как мезенхимальных, так и эпителиальных клеток.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Волков, Алексей Вадимович

выводы

3. Получены иммуногистохимические, морфологические и рентгенологические данные характерные для дегенеративных процессов в межпозвонковом диске сравнимые с таковыми у человека.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное экспериментальное исследование моделирования дегенеративных заболеваний позвоночника выявило, что каскад патологических изменений запускается в скором времени после начала компрессии на межпозвонковый диск и приводит к прогрессивным необратимым изменениям в тканях. Процесс начинается с гибели нотохордальных клеток, количество которых в течение первого месяца сокращается в три раза. В ответ на такое повреждение запускаются механизмы регенерации пульпозного ядра - пролиферация и реорганизация внеклеточного матрикса, которые, однако, не завершаются его восстановлением. Вероятно, это обусловлено быстрым истощением регенераторного потенциала пульпозного ядра, уменьшение его размера и отсутствие синтеза главных компонентов внеклеточного матрикса. Это приводит к уменьшению объема пульпозного ядра и снижению высоты диска. Выявленные в эксперименте изменения в межпозвонковом диске сходны с таковыми, выявляемыми у человека при спиральной компьютерной и магнитно-резонансной томографии — синдром «черного диска».

В месте максимальной компрессии происходит гибель хондроцитов фиброзного кольца, его разволокнение, разрушение волокон и отсутствие каких-либо регенеративных процессов, миграции клеток как миелоидного, так и лимфоцитарного ряда. В условиях компрессии также не выявлено признаков прорастания сосудов и развития воспаления в поврежденной ткани. Данное наблюдение может быть объяснено не только синтезом хрящевой тканью антиангиогенных факторов, но и самой компрессией.

Немаловажные изменения претерпевают и костные структуры. Спустя три месяца статичной компрессии происходит уменьшение в объеме эпифизов позвонков вплоть до полного их исчезновения. В месте обнажения зоны роста пролиферирующая хрящевая ткань в совокупности с надкостницей дают начало остеофитам. Костная ткань тел позвонков также претерпевает ряд изменений, выражающиеся в утолщении костных балок в месте компрессии и появление признаков остеопороза с противоположной стороны.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Волков, Алексей Вадимович, Москва

1. Команденко Н.И, Рыжов А.И., Жураковский И.П. Экспериментальная модель остеохондроза позвоночника. // БЭБИМ, -1996. -том 126.- №6. С. 706-708.

2. Мендель О.И., Никифоров А.С. Дегенеративные заболевания позвоночника, их осложнения и лечения. // РМЖ. -2006. -№4. -С. 247.

3. Adams М.А., et al. Mechanical initiation of intervertebral disc degeneration. // Spine. -2000.- V. 25, P. 1625-1636.

4. Anderson D.G., et al. Comparative gene expression profiling of normal and degenerative discs: analysis of a rabbit annular laceration model. // Spine. -2002. V. 27, P. 1291-1296.

5. Ando Т., et al. Effects of chondroitinase ABC on degenerative intervertebral discs. // Clin Orthop 1995.- V. 318, P. 214-221.

6. Ariga K., et al. The relationship between apoptosis of endplate chondrocytes and aging and degeneration of the intervertebral disc. // Spine 2001,- V. 26, P. 2414 2420.

7. Bailey AS, Adler F, Min Lai S, Asher MA. A comparison between bipedal and quadrupedal rats: do bipedal rats actually assume an upright posture? // Spine. 2001.- V. 26, P. 14-15.

8. Bradford D.S., Cooper K.M., Oegema T.R. Chymopapain, chemonucleolysis and nucleus pulposus regeneration. // J Bone Joint Surg Am 1983.- V. 65, P. 1220.

9. Brem H., Folkman J. Inhibition of tumor angiogenesis mediated by cartilage. // J Exp Med. 1975 Feb 1.- V. 141, N 2, P. 427-439.

10. Boden S.D., et al. Abnormal magnetic-resonance scans of the cervical spine in asymptomatic subjects: a prospective investigation. // J Bone Joint Surg Am 1990.-V. 72:1178-1184

11. Boos N., Weissbach S., Rohrbach H., Weiler C., Spratt K.F., Nerlich A.G.: Classification of age-related changes in lumbar intervertebral discs: 2002 Volvo Award in basic science. // Spine 2002,- V. 27, P. 2631-2644.

12. Cassidy JD, Yong-Hing K, Kirkaldy-Willis WH, Wilkinson AA. A study of the effects of bipedism and upright posture on the lumbosacral spine and paravertebral muscles of the Wistar rat. // Spine. 1988.- V. 13, N 3, P. 301-308.

13. Ching C.T. ,Chow D.H., Yao F.Y., Holmes A.D. Changes in nuclear composition following cyclic compression of the intervertebral disc in an in vivo rat-tail model. // Med Eng Phys. 2004 V. 26, N 7, P. 587-594.

14. Ching C.T., et al. The effect of cyclic compression on the mechanical properties of the inter-vertebral disc: an in vivo study in a rat tail model. // Clin Biomech (Bristol, Avon) 2003,- V. 18, P. 182-189.

15. Cole Т., et al. The proteoglycans of the canine intervertebral disc. // Biochim Biophys Acta 1985.- V. 839, P. 127-138.

16. Ford J.L., Downes S. Cellularity of human annulus tissue: an investigation into the cellularity of tissue of different pathologies. // Histopathology. 2002.- V. 41, N 6, P. 531-537.

17. Ghosh P., et al. The collagenous and non-collagenous protein of the canine intervertebral disc and their variation with age, spinal level and breed. // Gerontology 1976.- V. 22, P. 124-134.

18. Goff C.W., Landmesser W. Bipedal rats and mice: laboratory animals for orthopaedic research. J Bone Joint Surg Am 1957.- V. 39, P. 616-622.

19. Gotz W., Osmers R., Herken R. Localisation of extracellular matrix components in the embryonic human notochord and axial mesenchyme. // JAnat. 1995.-V. 186, N1, P. 111-121.

20. Gruber H.E., Hanley E.N. Jr. Human disc cells in monolayer vs 3D culture: cell shape, division and matrix formation. BMC Musculoskelet Disord. // 2000.- V. 23, N 1, P. 1-7.

21. Gruber H.E., Gordon В., Williams C., James-Norton H., Hanley E.N. Jr. Bone mineral density of lumbar vertebral end plates in the aging male sand rat spine. // Spine. 2003.- V. 28, N 16, P. 1766-1772.

22. Hamrick M.W., Pennington C., Byron C.D. Bone architecture and disc degeneration in the lumbar spine of mice lacking GDF-8 (myostatin). // J Orthop Res 2003.- V. 21, P. 1025-1032.

23. Каара E., et al. Collagens in the injured porcine intervertebral disc. J // Orthop Res 1994.- V. 12, P. 93-102.

24. Kaapa E., et al. Collagen synthesis and types I, III, IV, and VI collagens in an animal model of disc degeneration. // Spine 1995.- V. 20, P. 59-66; discussion 66-67.

25. Kaigle A.M., Holm S.H., Hansson Т.Н. 1997 Volvo Award winner in biome chanical studies. Kinematic behavior of the porcine lumbar spine: a chronic lesion model. // Spine 1997.- V. 22, P. 2796-2806.

26. Kiester D.P., et al. The dose-related effect of intradiscal chymopapain on rabbit intervertebral discs. // Spine 1994.- V. 19, P. 747-751.

27. Kim J.S., et al. Successful in vivo gene transfer to intervertebral discs in a slowly progressive and reproducible animal model of disc degeneration. // 50th Annual Meeting о f the Orthopaedic Research Society, San Francisco, 2004.

28. Kimura Т., et al. Progressive degeneration of articular cartilage and intervertebral discs: an experimental study in transgenic mice bearing a type IX collagen mutation. // Int Orthop 1996.- V. 20, P. 177-181.

29. Kluba Т., Niemeyer Т., Gaissmaier C., Grunder T. Human anulus fibrosis and nucleus pulposus cells of the intervertebral disc: effect ofdegeneration and culture system on cell phenotype. // Spine. 2005.- V.30, N 24, P. 2743-2748.

30. Koike Y., Uzuki M., Kokubun S., Sawai T. Angiogenesis and inflammatory cell infiltration in lumbar disc herniation. // Spine. 2003 .V. 28, N 17, P. 1928-1933.

31. Kroeber M.W., et al. New in vivo animal model to create intervertebral disc degeneration and to investigate the effects of therapeutic strategies to stimulate disc regeneration. // Spine 2002.- V. 27, P. 2684-2690.

32. Lindblom K. Intervertebral disc degeneration considered as a pressure atrophy. // J Bone Joint Surg Am 1957.- V. 39, P. 933-945.

33. Lipson S.J., Muir H. Proteoglycans in experimental intervertebral disc degeneration. // Spine 1981.-V. 6, P. 194-210.

34. Lotz J.C. Animal models of intervertebral disc degeneration: lessons learned. // Spine. 2004.- V. 29, N 23, P. 2742-2750.

35. Lotz J.C., et al. Compression-induced degeneration of the intervertebral disc: an in vivo mouse model and finite-element study. // Spine 1998.- V. 23, P. 2493-2506.

36. Lotz J.C., Hsieh A.H., Walsh A.L., Palmer E.I., Chin J.R. Mechanobiology of the intervertebral disc. // Biochem Soc Trans. 2002 .V. 30, N6, P. 853-858.

37. MacLean J.J., et al. Effects of immobilization and dynamic compression on intervertebral disc cell gene expression in vivo. // Spine 2003.- V. 28, P. 973-981.

38. Maiorano E, Renzulli G, Favia G, Ricco R. Expression of intermediate filaments in chordomas. An immunocytochemical study of five cases. // Pathol Res Pract. 1992.- V. 188, N 7, P. 901-907.

39. Marlcolf K.L., Morris J.M. The structural components of the intervertebral disc: a study of their contributions to the ability of the disc to withstand compressive forces. // J Bone Joint Surg Am 1974.- V. 56, P. 675-687.

40. Mason R.M., Palfrey A.J. Intervertebral disc degeneration in adult mice with hereditary kyphoscoliosis. // J Orthop Res 1984.- V. 2, P. 333-338.

41. Melrose J., et al. Increased nerve and blood vessel ingrowth associated with proteoglycan depletion in an ovine anular lesion model of experimental disc degeneration. // Spine 2002.- V. 27, P. 1278-1285.

42. Miyamoto S., Yonenobu К., Ono K. Experimental cervical spondylosis in the mouse. // Spine 1991.- V. 16(suppl), P. 495-500.

43. Moskowitz R.W., et al. Spondylosis in sand rats: a model of intervertebral disc degeneration and hyperostosis. // J Orthop Res 1990.-V. 8, P. 401-411.

44. Muehleman C., et al. Histological assessment of a novel needle puncture model: a mild, progressive intervertebral disc degeneration. // 49th Annual Meeting о f the Orthopaedic Research Society, New Orleans, 2003.

45. Nagano Т., et al. Distribution of the basic fibroblast growth factor and its receptor gene expression in normal and degenerated rat intervertebral discs. // Spine 1995.- V. 20, P. 1972-1978.

46. Nerlich A.G., Weiler C., Zipperer J., Narozny M., Boos N. Immunolocalization of phagocytic cells in normal and degenerated intervertebral discs. // Spine. 2002.- V. 27, N 22, P. 2484-2490.

47. Nerlich A.G., et al. Immunolocalization of major interstitial collagen types in human lumbar intervertebral discs of various ages. // Virchows Arch 1998.- V. 432, P. 67-76.

48. Palmer E.I., Lotz J.C. The compressive creep properties of normal and degenerated murine intervertebral discs. // J Orthop Res. 2004.- V. 22, N 1,P. 164-169.

49. Palmer E.I., Lotz J.C. The time dependent role of cytokines in mechanically induced intervertebral disc degeneration. // Transactions of the 50th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society, San Francisco, CA.2004.

50. Pazzaglia U.E, Andrini L, Di Nucci A. The effects of mechanical forces on bones and joints. Experimental study on the rat tail. // J Bone Joint Surg Br. 1997.- V. 79, N 6, P. 1024-1030.

51. Phillips F.M., Reuben J., Wetzel F.T. Intervertebral disc degeneration adjacent to a lumbar fusion: an experimental rabbit model. // J Bone Joint Surg Br 2002.- V. 84, P. 289-294.

52. Roughley P.J. Biology of intervertebral disc aging and degeneration: involvement of the extracellular matrix. // Spine. 2004.- V.29, N 23, P. 2691-2699.

53. Sahlman J., et al. Premature vertebral endplate ossification and mild disc degeneration in mice after inactivation of one allele belonging to the Col2al gene for Type II collagen. // Spine 2001.- V. 26, P. 2558-2565.

54. Sakuma M., et al. Effect of chondroitinase ABC on matrix metalloproteinases and inflammatory mediators produced by intervertebral disc of rabbit in vitro. // Spine 2002.- V.27, P. 576-580.

55. Silberberg R. Histologic and morphometric observations on vertebral bone of aging sand rats. // Spine 1988.- V. 13, P. 202-208.

56. Sive J.I., Baird P., Jeziorsk M., Watkins A., Hoyland J.A., Freemont A.J. Expression of chondrocyte markers by cells of normal and degenerate intervertebral discs. // Mol Pathol. 2002.- V. 55, N 2, P. 91-97.

57. Stokes I.A., Iatridis J.C. Mechanical conditions that accelerate intervertebral disc degeneration: overload versus immobilization. // Spine. 2004.- V. 29, N 23, P. 2724-2732.

58. Takahashi Т., et al. Chemonucleolytic effects of chondroitinase ABC on normal rabbit intervertebral discs: course of action up to 10 days postinjection and minimum effective dose. // Spine 1996.- V. 21, P. 2405-2411.

59. Tamai Y, Ishikawa T, Bosl MR, Mori M, Nozaki M, Baribault H, Oshima RG, Taketo MM. Cytokeratins 8 and 19 in the mouse placental development. // J Cell Biol. 2000.- V. 151, N 3, P. 563-572.

60. Venn G., Mason R.M. Changes in mouse intervertebral-disc proteoglycan synthesis with age: hereditary kyphoscoliosis is associated with elevated synthesis. // Biochem J 1986.- V. 234, P. 475-479.

61. Yamada K., et al. Investigation of the short-term effect of chemonucleolysis with chondroitinase ABC. // J Vet Med Sci 2001.- V. 63, P. 521-522.

62. Walsh A.J., Lotz J.C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. // J Biomech 2004.- V. 37, P. 329-337.

63. Ziv I., et al. Physicochemical properties of the aging and diabetic sand rat intervertebral disc. // J Orthop Res 1992.- V. 10, P. 205-210.

Информация о работе

Волков, Алексей Вадимович
кандидата медицинских наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.25

Диссертация

Морфологические изменения межпозвонковых дисков крыс в условиях асимметричной статичной компрессии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы