Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфологические и нейроиммунные взаимодействия в Пейеровой бляшке тонкой кишки крыс

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Штылик, Анастасия Владимировна, Санкт-Петербург

р / - Ск',

> «-., /Г ,

г •> "/ <

Санкт-Петербургский Государственный Университет

На правах рукописи

ШТЫЛИК Анастасия Владимировна

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ НЕЙРОИММУННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ПЕЙЕРОВОЙ БЛЯШКЕ ТОНКОЙ КИШКИ КРЫС

Специальности: 03.00.13 - физиология человека и животных 14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители академик А.Д.Ноздрачев (зав.каф.общей физиологии СПбГУ)

проф. В.А.Отеллин (зав. отд. морфологии НИИЭМ РАМН)

Санкт-Петербург 1999

Оглавление

Список сокращений.............................................................................................4

Введение..............................................................................................................5

Научная значимость и новизна работы.............................................................11

Глава I. Структура нервного аппарата Пейеровой бляшки...............................14

1.1. Иннервация лимфоидных органов...................................................14

1.2. Строение и функции лимфоидного органа тонкой

кишки - Пейеровой бляшки........................................................19

1.3. Метасимпатическая нервная система, ее энтеральный

отдел............................................................................................30

1.4. Материал и методы исследования...................................................36

1.5. Результаты и их обсуждение............................................................37

Глава II. Связи нервных элементов в пределах Пейеровых бляшек

тонкой кишки Крыс....................................................................55

• * £ г"»* •* *

2.1. Методы, использующие ретроградный аксональный,'

транспорт, в изучении центральной и периферической нервной системы...........................................................................56

2.2. Установление связей нервных элементов в пределах

Пейеровой бляшки с помощью ретроградного флюоресцентного маркера примулина.

Материал и методы исследования...............................................59

2.3. Результаты исследований и их обсуждение.....................................59

Глава Ш. Влияние ацетилхолина на иммуноглобулинсекретирующую функцию Пейеровых бляшек.............................................................................70

3.1. Взаимодействия нервной и иммунной систем.................................70

3.2. Влияние ацетилхолина на секрецию иммуноглобулинов

Пейеровыми бляшками интактных и

иммунизированных крыс.............................................................82

3.3. Материал и методы исследования....................................................86

3.4. Результаты и обсуждение.................................................................89

Глава IV. Влияние ацетилхолина на миграцию лимфоцитов

в слизистой оболочке тонкой кишки и участие в этом процессе

тучных клеток...................................................................................................100

4.1. Интраэпителиальные лимфоциты...................................................100

4.2. Собственная пластинка слизистой оболочки

(lamina propria)........................................................................103

4.3. Пути миграции лимфоцитов пищеварительного тракта.................105

4.4. Влияние ацетилхолина на миграцию лимфоцитов

в слизистой оболочке тонкой кишки.........................................120

4.4.1 .Материал и методы исследования.....................................121

4.4.2. Результаты и обсуждение.................................................122

4.5. Участие тучных клеток в холинергической регуляции

миграции лимфоцитов в слизистой оболочке

тонкой кишки.............................................................................134

4.5.1 .Материал и методы исследования.....................................136

4.5.2.Результаты и обсуждение..................................................137

Общее заключение............................................................................................150

Выводы.............................................................................................................153

Литература........................................................................................................155

Список сокращений АКТГ - адренокортикотропный гормон АОК - антител ообразующ ие клетки Атр - атропин АХ - ацегилхолин БОК - бляшкобразующие клетки ВПСП - возбуждающий постсинаптический потенциал ГАМ К - гамма-аминомасляная кислота ЖКТ - желудочно-кишечный тракт ИЛ - интерлейкин ИФ - интерферон

МНС - метасимпатическая нервная система

ПБ - Пейерова бляшка

РОК - розеткообразующие клетки

ФАЭ - фолликул-ассоциированный эпителий

ФНО - фактор некроза опухолей

ДНС - центральная нервная система

AChE - ацегилхолинэстераза

BS А - бычий сывороточный альбумин

ССК - холецистокинин

CGRP - кальцитонин-ген-связанный пептид

clg - цитоплазматический иммуноглобулин

CRH - кортикотропин-рилизнг-гормон

GALT - (gut-associated lymphoid tissue) лимфоидная ткань, связанная со

слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта

GHRH - соматолиберин

GRP - гастрин-связанный пептид

IEL -интраэпителиальные лимфоциты

IFN - интерферон

EL - интерлейкин

Ig - иммуноглобулин

MALT - (mucosal-associated lymphoid tissue) лимфоидная ткань, связанная со слизистыми оболочками

МНС - главный комплекс гистосовместимости

NA - норадреналин

NGF - фактор роста нервов

NPY - нейропептид Y

NT - нейротензин

OVA - овальбумин

РШ - пептид гистидин-изолейцин

Pg - простагландин

РОМС - проопиомеланокортин

slg - секреторный иммуноглобулин

sP - субстанция Р, вещество Р

SST - соматостатин

TGF - трансформирующий фактор роста

TNF - фактор некроза опухолей

VIP - вазоинтестинальный полипептид

Введение

К числу новых научных направлений, интенсивно развивающихся в мире, относится иммунофизиология. В последние годы она получила новый толчок к развитию. В настоящее время получены многочисленные доказательства функционального взаимодейств ия нервной и иммунной систем (Castro, 1989; Jankovic, 1989; Javed et al, 1992; McKay et al, 1994; Wood, 1994). Сложные двусторонние взаимоотношения этих двух интегративных образований организма опосредуются гормональными и паракринными сигналами, а также прямыми контактами между нервными окончаниями и клетками лимфоидной природы (Гордон и соавт., 1982; Feiten et al, 1985; Javed et al, 1992). Известно, что тимус, селезенка, лимфатические узлы и другие лимфоидные органы иннервируются холинергическими, адренергическими и пептидергическими волокнами (Гордон и соавг, 1982; Feiten et al, 1985; Ackerman et al, 1986, Banovska et al, 1994). В ткани лимфатических узлов обнаруживали даже собственные нервные ганглии (Feiten et al, 1985). Как известно, нервные окончания и нейромедиаторы оказывают влияние на различные функции иммунных клеток: их пролиферацию, дифференцировку, цитотоксическую и секреторную активность и прочие функции (Landberg et al, 1985; Feiten et al, 1985; Ackerman et al, 1986; Kendal et al, 1988; Jankovic, 1989, Madden et al, 1989).

Слизистая оболочка органов пищеварения испытывает сложные и разнообразные воздействия внешней среды, подвергаясь влиянию огромного числа получаемых с пищей антигенов. С этим влиянием связывают тот факт, что слизистая оболочка, а также подслизисгый слой органов пищеварения, наряду с разветвленной сетью лимфатических капилляров, имеют и собственные лимфоидные образования (Сапин, 1987; Сапроненков, 1987). Лимфоидные органы желудочно-кишечного тракта (небные миндалины, Пейеровы бляшки и отдельные лимфоидные фолликулы тонкой кишки, аппендикс и иммунная система толстой кишки) занимают в ряду лимфоидных органов особое место. Они находятся "на переднем крае" защиты организма от различных антигенов, токсинов, вирусов и бактерий, попадающих в желудочно-кишечный тракт с пищей. Часто эти органы рассматривают как

аналог фабрициевой сумки птиц, поскольку они осуществляют ту же функцию - антигензависимую дифференцировку B-лимфоцитов и формирование клонов клеток иммунной памяти (MacDonald, Spenser, 1994).

Иннервация пищеварительного тракта также сильно отличается от других органов. Функции желудка и кишки регулируются собственной интрамуральной (метасимпатической) нервной системой, которая является относительно независимой от центральной и осуществляет довольно сложные местные висцеральные рефлексы, поскольку имеет в своем составе различные типы нейронов, необходимые для получения, обработки информации и отдачи команды эффектору (Ноздрачев, 1980, 1987, 1988, 1989, 1996; Gershen, Erde, 1981). Находящиеся в стенке желудочно-кишечного тракта интрамуральные нервные ганглии, клетки и их отростки рассматриваются в настоящее время как энтеральная часть метасимпатической нервной системы, работающая относительно независимо от остальной части автономной нервной системы (Ноздрачев, 1987, 1988, 1989, 1996). Энтеральная часть автономной нервной системы, насчитывающая такое же число нервных клеток, как весь спинной мозг, является интегративной системой низшего уровня, максимально приближенной к эффектору. Ансамбли нейронов интрамуральных ганглиев составляют нервные цепи, способные самостоятельно получать и обрабатывать информацию, программировать довольно сложные паттерны «поведения» данного органа и таким образом осуществлять местные рефлексы без вмешательства вышележащих нервных центров.

Наличие в желудочно-кишечном тракте двух таких сложных интегративных систем - нервной и иммунной - делают его удобной моделью и объектом для изучения взаимодействия этих систем. Включение энтеральной части метасимпатической нервной системы в регуляцию иммунной системы желудочно-кишечного тракта изучено лишь частично, хотя мощная иммунная система, несомненно, нуждается в строгой регуляции, в частности, и нервной. В организации регуляции иммунологических и воспалительных реакций, происходящих в желудочно-кишечном тракте, как было установлено в ряде исследований, нервные окончания играют немалую роль (Cooke, 1994).

Желудочно-кишечный тракт как объект и модель изучения нейро-иммунных взаимодействий ныне используется в работах исследователей

довольно широко (Castro, 1989; Cooke, 1994; McKay et al, 1994; Payan et al, 1987; Wood, 1993, 1994), так как, помимо самостоятельного фундаментального значения, изучение нейроиммунных взаимодействий может иметь применение в клинике. Однако исследователи предпочитали находить нейроиммунные связи при иммунном ответе в слизистой оболочке кишки, не затрагивая при этом оформленного лимфоидного органа тонкой кишки - Пейерову бляшку, играющую большую роль в местном (локальном) энтеральном иммунном ответе, как первичном, так и вторичном. К тому же, хотя и существуют сведения об иннервации иммунных органов пищеварительного тракта, таких как небные миндалины и аппендикс (Гордон и соавт., 1973, 1982), тем не менее, физиологическое значение и функции нервных окончаний в них во многом не ясны. Хотя в литературе имеются отдельные сведения о топографической связи Пейеровой бляшки с подслизистым нервным сплетением, конкретные механизмы взаимодействия нервных волокон и эффекторных структур лимфоидного органа тонкой кишки остаются невыясненными. По этой причине знание морфологических связей энтеральной нервной системы и клеток иммунной системы в составе Пейеровой бляшки имеет базовое значение.

В литературе были обнаружены сведения о наличии в Пейеровых бляшках богатой ацетилхолинэстеразной (AChE) активности нервного происхождения (Feiten et al, 1985). А ацетилхолин, как было показано множеством экспериментов (Фролов, 1975; Забродский, 1996 и др.), имеет иммуномодулирующее влияние на организм человека и животных.

Мускариновые холинергические рецепторы были обнаружены на лимфоцитах мышей (Gordon et al, 1978). На Т-лимфоцитах также есть холинергические рецепторы (Hadden, 1987). Активация холинорецепторов может приводить к усилению пролиферации лимфоцитов. Цитотоксичность и секреторная активность Т-клеток также регулируется (увеличивается) с участием холинорецепторов. В эпителиальных клетках тимуса человека также обнаруживалась мРНК рецептора к ацетилхолину (Wakkach et al, 1996).

Помимо приведенных фактов, есть и другие доказательства влияния ацетилхолина на функции иммунных клеток. Однако исследования, проведенные в культуре клеток селезенки, давали весьма противоречивые

результаты (Абрамов, 1988, 1991), хотя и нет никаких сомнений, что ацетилхолин оказывает модулирующее влияние на иммунные процессы, происходящие в организме. При этом необходимо отметить, что задачи иммунной системы кишки и иммунные процессы, проиходящие в слизистой оболочке кишечной стенки, весьма своеобразны и отличаются от системных иммунных ответов. Поэтому вполне вероятны и различия в регуляции этих процессов.

Ацетилхолин является одним из основных, наиболее распространенных нейромедиаторов в метасимпатической нервной системе кишки (Gershen,Erde, 1981), он активирует деятельность гладких мышц кишечника и его концентрация повышается в кишке в процессе пищеварения. При этом давно известно, что при пищеварении в слизистой оболочке кишки увеличивается число лимфоцитов, они даже выходят в просвет (Сапин и др. 1978), а также происходит разрыхление слизистой оболочки и ее отек, появляется ярко выраженная лейкоцитарная инфильтрация, т.е. налицо все признаки воспаления, которое, однако, вполне физиологично и было названо «пищеварительным» (Успенский, 1982). Следовательно, процесс пищеварения тесно связан с миграцией лимфоцитов и лейкоцитов в слизистую оболочку кишки и желудка.

Пейерова бляшка, выполняя свою основную функцию в стенке кишки и иммунной защите организма, осуществляет антигензависимую дифференцировку лимфоцитов. После антигенной стимуляции, следом за активацией и дифференциацией фракции В- и Т-лимфоцитов из Пейеровой бляшки мигрируют в собственную пластинку остальной части кишки (Cebra et al, 1974; Guy-Grand et al, 1978). Сигнальные же процессы, вызывающие эту миграцию, пока остаются мало понятными. Вполне вероятно, что на лимфоцит и его миграционную способность, а также на пропускную способность эндотелия могут воздействовать большое количество самых разнообразных факторов, часть из них может быть эндокринной или нейрональной природы.

В организации регуляции иммунологических и воспалительных реакций, происходящих в желудочно-кишечном тракте, как было установлено в ряде исследований, нервные окончания играют немалую роль (Wood, 1992,

1993, 1994; Cooke, 1994). С другой стороны, тучные клетки, относящиеся к иммунной системе, в стенке кишки могут оказывать влияние не только на иммунные, но и на многие другие процессы, как то: ионный транспорт, сокращение гладких мышц слизистой оболочки, .микроциркуляция, секреция эпителиальных клеток, выделение слизи мукоцитами (Cooke, 1994; Payan et al, 1987). Отмечено также влияние тучных клеток и биологически активных веществ их везикул на нейрональную активность ганглиев и сплетений кишки (Wood, 1992, 1993, 1994). В ряде исследований обнаружилась тесная связь -тучных клеток слизистой оболочки с нервными волокнами и терминалями (Stead et al, 1987; Cooke, 1994 и др.).

Многими исследователями тучные клетки и их основной медиатор гистамин считаются основным звеном, обеспечивающим нейроиммунные взаимодействия, особенно в слизистой оболочке кишки (Wood, 1992, 1993, 1994; Cooke, 1994). Поэтому следующей целью нашего исследования стало изучение и определение роли тучных клеток, а точнее, их основного медиатора гистамина в опосредовании ацетилхолинергических влияний на миграцию лимфоидных клеток в слизистой оболочке кишки.

В связи с вышеизложенным основная цель настоящей работы заключалась в изучении структурно-функциональных характеристик взаимодействия между элементами метасимпатической нервной системы (МНС) и иммунокомпетентных клеток в пределах стенки тонкой кишки, включая ее лимфоидный орган - Пейерову бляшку, причем предполагалось исследовать эти взимодействия, с одной стороны как морфологическую, анатомическую связь, а с другой - как функциональное нейроиммунное взаимодействие.

В работе ставились следующие задачи:

1. Выявление непосредственных анатомических нейроиммунных связей в пределах Пейеровой бляшки тонкой кишки.

2. Установление наличия связей МНС в пределах Пейеровой бляшки с другими отделами автономной нервной системы: с МНС остальной части кишки, а

также вышележащими автономными центрами, экстрамуральными ганглиями.

3. Изучение влияния ацетилхолина на интенсивность секреции иммуноглобулинов в Пейеровых бляшках интактных крыс и животных, подверженных парентеральной и оральной иммунизации.

4. Изучение влияния ацетилхолина на миграцию лимфоцитов в слизистой оболочке Пейеровой бляшки и за ее пределами.

5. Определение роли основного медиатора тучных клеток гистамина в опосредовании ацетилхолинергических влияний на миграцию лимфоидных клеток в слизистой оболочке кишки.

Научная значимость и новизна работы

Научная новизна работы. Хотя в последние годы исследователи посвящают большое количество научных работ изучению нейроиммунных взаимодействий (Wood, 1993, 1994; Cooke, 1994 и др.), в частности, в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, однако лимфоидный орган кишки -Пейерова бляшка - до сих пор оставался за пределами их поля зрения, хотя нет никаких сомнений в чрезвычайной важности этого лимфоидного органа в организации локального иммунного ответа слизистой оболочки и связи иммунной системы кишки с иммунокомпетентными клетками и органами остального организма. В данной работе впервые основное внимание было уделено нейроиммунным взаимоотношениям именно в Пейеровой бляшке.

Впервые было проведено комплексное исследование взаимоотношений элементов нервной системы и иммунокомпетентных клеток в пределах