Морфофункциональное состояние опухолевых и неопухолевых клеток под влиянием хорионического гонадотропина и эмбихина

Горшков, Антон Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфофункциональное состояние опухолевых и неопухолевых клеток под влиянием хорионического гонадотропина и эмбихина
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональное состояние опухолевых и неопухолевых клеток под влиянием хорионического гонадотропина и эмбихина"

ГОРШКОВ АНТОН СЕРГЕЕВИЧ

На правах рукописи

00505891Ь

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ОПУХОЛЕВЫХ И НЕОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ПОД ВЛИЯНИЕМ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА И ЭМБИХИНА

03.03.04. - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 6 МАП 2013

Киров-2013

005058916

Работа выполнена на кафедре биологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кировская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Косых Александр Александрович

Официальные оппоненты:

Профессор, д.м.н., зав. кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии, Челышев Юрий Александрович

(Казанский государственный медицинский университет, г. Казань)

Профессор, д.м.н., профессор кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, Гансбургский Андрей Николаевич

(Ярославская государственная медицинская академия, г. Ярославль)

Ведущая организация: Российский национальный исследовательский

медицинский университет имени Н. И. Пирогова

Защита состоится « /7- » мая 2013 г. в « » часов на заседании

Диссертационного Совета Д 212.117.01 в ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» по адресу: 430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» по адресу: 430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

Объявление о защите и автореферат диссертации размещены на официальном сайте Мордовского государственного университета им. Н. П. Огарёва www.mrsu.ru и интернет-сайте ВАК http://vak2.ed.gov.ru

Автореферат разослан « 'Т » _2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

В.П.Балашов

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Тенденцией современной клеточной биологии является повышенный интерес к вопросам регенерации, включения резервов собственных клеток организма. Однако до сих пор не решена проблема управления дифференцировкой и пролиферацией клеток. Стимуляция пролиферации чревата запуском анаплазии, а подавление отдельных клеточных популяций при цитостатической терапии неизбежно сказывается не только на опухолевых, но и на нормальных клетках, что приводит к тяжелым побочным эффектам. Манипуляции с геномом эукариотических клеток могут приводить к его нестабильности, что может проявиться в злокачественной трансформации. Так, революционное создание iPS-cells (Takahashi К., Yamanaka S., 2006) было сопряжено с генетическими нарушениями и склонностью к малигнизации репрограммированных клеток (Laurent et al., 2011). В эмбриональном периоде развития действует большое количество модуляторов пролиферации и дифференцировки, и их использование является перспективным направлением исследований, не освещенным в полной мере. В этом плане определенный интерес представляет хорионический гонадотропин (ХГч), известный как стимулятор регенерации патологически изменённых органов и тканей. Специфичность действия ХГч не ограничивается гонадами и эмбриональными тканями. Он способен повышать митотическую активность гепатоцитов при циррозе и после резекции печени (Косых A.A., 1992), стимулировать липолиз, регулировать уровень трансаминаз (Солопаева И.М., 2010). Впоследствии выяснилось, что данный гормон способен не только стимулировать, но и подавлять деление некоторых типов клеток, например лейкоза HL-60, рака молочной железы MCF-7 (Валуйских А.Н. и др., 1997; Солопаева И.М. и др., 2004; Feldman E.J. et al., 1998). Некоторые авторы приводят данные о том, что хорионический гонадотропин способен действовать на многие клетки и ткани, в том числе и ткани взрослого организма (Солопаева И.М., 2007; Pond-Tor S. et al., 2002; Rao Ch.V. et al., 2005).

Таким образом, ХГч стимулирует некоторые нормальные клетки, при этом есть данные о его супрессорном действии на ряд опухолевых линий, что позволяет рассматривать ХГч с точки зрения не изолированного ингибитора/стимулятора, а регулятора пролиферации и дифференцировки клеток (Солопаева И.М., 2010; Филатова E.H., 2010). Большинство исследований, противопоставляющих эффекты ХГч на опухолевые и неопухолевые клетки, выполнено на модели in vivo, что обладает рядом недостатков. Например, in vivo невозможно устранить вероятность косвенных

эффектов ХГч через другие гормональные пути и иммунную систему. Чтобы ответить на вопросы, какую роль играет ХГч в дифференцировке и пролиферации опухолевых и неопухолевых клеток и можно ли его использовать для лечения опухолей, необходимо исследовать его действие на эти клетки в условиях in vitro.

Говоря о противоопухолевых эффектах веществ, необходимо опираться на уже известные методы борьбы с процессом опухолевого роста. На сегодняшний день ведущую роль в схемах лечения опухолей занимают цитостатики, и разработка новых противоопухолевых средств предполагает их использование в первую очередь в адъювантной терапии. Поэтому, рассматривая противоопухолевые свойства ХГч, необходимо установить его влияние на опухолевые и неопухолевые клетки не только в чистом виде, но и в комплексе с цитостатиком. Одной из групп цитостатиков являются алкилирующие агенты, селективно повреждающие ДНК клеток-мишеней (например, эмбихин). Данный препарат наиболее удобен для комбинирования с ХГч, поскольку предполагаемые эффекты ХГч связаны с запуском апоптоза и возможно влиянием на ДНК клеток.

Цель исследования: оценить морфофункциональные показатели опухолевых и неопухолевых клеток под влиянием хорионического гонадотропина и эмбихина в условиях in vitro.

Задачи исследования

1. Изучить структурно-функциональные особенности и морфометрические показатели культур неопухолевых клеток L20B и фибробластов легкого крысы в норме и при воздействии хорионического гонадотропина в концентрациях 1,2 и 4 МЕ/мл.

2. Изучить структурно-функциональные особенности и морфометрические показатели культур опухолевых клеток Нер-2 и RD в норме и при воздействии хорионического гонадотропина в концентрациях 1, 2 и 4 МЕ/мл.

3. Установить закономерности морфологических и функциональных изменений в культурах опухолевых и неопухолевых клеток при комбинированном воздействии хорионического гонадотропина и эмбихина.

4. Провести анализ митотической активности клеток карциномы гортани Нер-2 при воздействии сверхвысоких концентраций хорионического гонадотропина 50,100 и 150 МЕ/мл.

Научная новизна исследования

В работе впервые проведено исследование влияния хорионического гонадотропина в различных концентрациях на опухолевые и неопухолевые клетки млекопитающих как в чистом виде, так и в комплексе с эмбихином. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ХГч способен воздействовать на клетки, происходящие из тканей, не имеющих специфических рецепторов к половым гормонам и гонадотропинам, стимулировать апоптоз и дифференцировку опухолевых клеток Нер-2. При этом действие ХГч не опосредовано иными гормональными путями и лимфоцитами, поскольку все эксперименты проведены в условиях in vitro.

Научно-практическая значимость.

Результаты данного исследования имеют фундаментальное и прикладное значение. Показано, что механизм реализации действия хорионического гонадотропина на опухолевые и неопухолевые клетки может быть обусловлен иными рецепторами, нежели рецепторы к гонадотропинам и половым гормонам.

Результаты работы позволяют рассматривать хорионический гонадотропин не только как маркер неоплазий, но как индуктор апоптоза опухолевых клеток в условиях in vitro, что позволяет предложить ХГч в качестве противоопухолевого средства. Показано, что в комбинации с эмбихином в низких концентрациях хорионический гонадотропин проявляет преимущественно супресорное действие, в высоких концентрациях -преимущественно протективное действие в отношении опухолевых клеток, что необходимо учитывать при составлении схем противоопухолевой терапии. Теоретические положения включены в учебный процесс кафедр биологии, патологической физиологии, гистологии, цитологии и эмбриологии и онкологии Кировской ГМА и используются при чтении лекций, проведении занятий со студентами по темам «Эмбриология» и «Основы опухолевого роста», включены в учебно-методические пособия «Биология клетки» и «Проблемы клеточной пролиферации. Клеточный цикл» по предмету «Медицинская генетика», на основании полученных данных разработан и запатентован метод подавления карциномы гортани Нер-2.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1. Выявлены морфологические и функциональные изменения, происходящие в опухолевых и неопухолевых клетках под воздействием хорионического гонадотропина, заключающиеся в стимуляции апоптоза, снижении митотической активности клеток и дифференцировке опухолевых клеток Нер-2.

2. Установлено, что супрессорный эффект хорионического гонадотропина в отношении опухолевых клеток выражен сильнее, чем в отношении неопухолевых клеток.

3. Показано, что в комбинации с цитостатиком эмбихином хорионический гонадотропин в зависимости от концентрации проявляет как супрессорное, так и протективное действие.

Степень достоверности и апробация результатов работы

Материалы исследований доложены на научно-практической конференции «Молодежь и медицинская наука в XXI веке» 14-15 мая 2007 года (г. Киров), 81-й Всероссийской студенческой научной конференции, посвященной 150-летию В.М. Бехтерева 10-12 апреля 2007 года (г.Казань), XI научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке» 1-2 апреля 2009 года (г. Киров), II Всероссийской конференции «Студенческая наука и медицина XXI века: традиции, инновации и приоритеты», 15-16 апреля 2008 года (г. Самара), заочной электронной конференции (научный электронный архив академии естествознания), XII научно-практической конференции «Молодежь и медицинская наука в XXI веке», 31 марта -1 апреля 2011 года (г. Киров), на конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», 1417 ноября 2012 года (г.Москва), а также обсуждены на расширенном межкафедральном заседании ГБОУ ВПО Кировская ГМА 21 декабря 2012г. Материалы исследований опубликованы в 14 печатных работах, в том числе 2 статьи опубликованы в журналах, включенных в перечень ведущих рецензируемых изданий ВАК, получен 1 патент на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 131 странице машинописного текста, включает 12 таблиц и 35 рисунков (микрофотографии, графики, диаграммы). Диссертация состоит из введения, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, библиографического указателя. Список литературы включает 192 источника, в том числе 93 отечественных и 99 иностранных авторов.

Личное участие автора

Автором выполнено планирование и проведение экспериментов в культуральной (культивирование клеток, МТТ и апоптозный тесты) и морфологической лабораториях (окраска и анализ микропрснаратов), обработаны и расшифрованы результаты экспериментов, написаны научные работы.

Содержание рабсил

Материалы и методы. В работе использованы опухолевые клетки карцинома гортани человека Нер-2, эмбриональная рабдомиосаркома человека ГШ. неопухолевые клетки - фибробласты мыши 1.201! и фибробласты легкого белых беспородных крыс (Рис.1).

А ' . Б

В Г

Рис.1. Культуры клеток, использованные в работе. Л фибробласты легкого крысы; Б - фибробласты 1,20В; В — карцинома гортани Пер-2; Г рабдомиосаркома 1Ш. Фазово-контрастная микроскопия, ув.х200.

Для исследования изолированного влияния гормона на культуры опухолевых и неопухолевых клеток использовали ХГч в концентрациях 1, 2 и 4 МЕ/мл питательной среды. Были определены: митотичеекий индекс культивируемых клеток, морфометрические (площадь ядер, периметр ядер, ядерно-клеточное отношение), а также функциональные (оптическая плотность

н M I T-тесте, доля аионтозных клеток в апоптозном тесте) показатели жизнедеятельности клеток. Для исследования совместного влияния ХГч и эмбихииа (цитостатик алкилирующего ряда) использовали только МТТ-тест и апоптозный тесты, которые позволяют определить путь реализации токсических эффектов используемых препаратов (некроз, апоптоз, цитонротекция/супрессия). Влияние эмбихииа и его комбинаций с ХГч на пролиферативную активность клеток не оценивали, поскольку при выборочном морфологическом исследовании препаратов культур клеток с эмбихипом фигур деления не отмечалось. ХГч тестировали в концентрациях 1, 2 и 4 ME/мл, а эмбихип в концентрациях 2 и 4 мкг/мл.

Работы с культурами проводили в блоке для работы с культурами эукариотичсских клеток но общепринятым методам работы с монослойными культурами (Фрешни Р.Я., 2010; Cancer Cell Culture 2003; Basic Cell Culture Protocols 2004).

Для исследования пролиферативной активности культур клетки засевали па покровные стекла. В питательную среду вносили ХГч до конечных концентраций 1, 2 и 4 ME/мл. Через 48 часов инкубации культуры фиксировали в жидкости Карнуа, окрашивали гематоксилином Вейгарта и заключали в глицерин - желатин. Участки монослоя изучали при помощи светового микроскопа «Микмед-2» (увеличение микрообъекта в 1000 раз, масляная иммерсия). Число митозов в препаратах подсчитывали на 1000 клеток, рассчитывали митотический индекс (МИ) как отношение делящихся клеток к общему количеству клеток в препарате и выражали в промилле (%о). Для культуры Пер-2 ХГч использовали также в концентрациях 50, 100 и 150 МК/мл. В этих препаратах подсчитывали МИ, выделяли патологические формы митозов, рассчитывали метафазно-профазный индекс и долю поликариоцитов в популяции проанализированных клеток. Патологические митозы оценивали в соответствии с рекомендациями И.А. Алова (Алов И.А., 1972; Блюмкин В.Н., Жданов В.М., 1973). Препараты культур клеток, окрашенные по Паппенгейму, исследовали при помощи программно-аппаратного комплекса для морфометрии па базе микроскопа «Axiostar» с программным обеспечением «Морфология 5.0». Оценивали площадь ядра, периметр ядра, ядерно-клеточное отношение (ЯКО). Анализу подвергались одноядерные неделящиеся клетки, в каждом препарате изучали не менее 10 полей зрения.

Для проведения цитотоксического МТТ - теста использовали реактив М'Г'Г (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yI)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide). По истечении 48 часов инкубации с ХГч и эмбихином в среду вносили 10 мкл раствора М'Г'Г (5 мг/мл) и термостатировали 60 минут. Краситель и среду удаляли, в лунки вносили по 100 мкл ДМСО и растворяли образовавшиеся

соли формазана встряхиванием. Считывание оптической плотности проводили на ИФА-ридере при длине волны 492 нм. Результат выражали в единицах оптической плотности (ЕД.ОП.) Для оценки доли погибших клеток в популяции под воздействием тестируемых препаратов использовали апоптозный тест с использованием красителей акридинового оранжевого и бромистого этидия (Крамаренко И.И., 2006; Apoptosis: Methods and Protocols, 2004; Ribble D„ et al., 2005).

Статистическая обработка проведена с использованием программ «MS Office Excell 2007» и «Statistika 6.0». Поскольку количественные показатели для биологических объектов не подчиняются закону нормального распределения, а выборки в эксперименте не превышали 10 наблюдений, для сравнения достоверности различий между группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, позволяющий оценить различия между двумя независимыми группами. Различия считали достоверными при р<0,05.

Собственные результаты исследования.

Полученные данные свидетельствуют о том, что ХГч влияет на митотическую активность культивируемых фибробластов Ь20В и легочных фибробластов (Рис.2).

30,00

S 2500

I 20,00 а

В 15,00

Ц 10,00 й а

$ 5.00

Р.

0,00

14,00

а 12,00

S 10,00

'Ü 8.00

Г*

контроль 1 МЕ/мл 2 МЕ/мл 4МЕ/мл

Концентрация ХГч

6,00 4,00 2,00 0,00

контроль 1 МЕ/мл 2 МЕ/мл 4МЕ/мл

Концентрация ХГч

А Б

Рис. 2. Влияние ХГч на митотическую активность фибробластов. А - Культура Ь20В; Б - Культура легочных фибробластов. * - р<0,05; ** - р<0,005 в сравнении с серией «контроль»

В обоих случаях снижение МИ наблюдается при воздействии ХГч в концентрации 2 и 4 МЕ/мл, причем для клеток Ь20В снижение МИ было статистически недостоверно. В концентрации 1 МЕ/мл ХГч либо не оказывает влияния на МИ (легочные фибробласты), либо действует как стимулятор пролиферации (Ь20В). Повышение концентрации ХГч либо не оказывает влияния на МИ (Ь20В), либо тормозит МИ (легочные фибробласты) на 10-11%. Аналогичная картина выявлена и в МТТ-тесте.

Исследование апоптоза показало, что ХГч не влияет на долю апоптозных клеток в популяции легочных фибробластов, но стимулирует апоптоз фибробластов линии Ь20В (Табл. 1).

Таблица 1

Влияние ХГч на долю апоптозных клеток в культурах неопухолевых

клеток

Концентрация ХГч, МЕ/мл Доля апоптозных клеток (%) в культурах

легочных фибробластов фибробластов линии Ь20В

контроль 2,50±1,16 3,94±1,09

1 2,47±0,84 р=0,667 6,81±0,90; р=0,034

2 1,66±0,98 р=0,601 7,29±1,13; р=0,052

4 1,96±0,78 р=0,926 6,46±2,50; р=0,895

При этом изменения площадей ядер, периметров ядер и ядерно-клеточного отношения культивируемых фибробластов носят статистически недостоверный характер. Таким образом, в отношении неопухолевых клеток - фибробластов легкого и фибробластов Ь20В ХГч проявляет как слабый стимулирующий, так и слабый супрессорный эффект и не приводит к серьезным морфофункциональным изменениям.

В отношении опухолевых клеток ХГч также проявляет супрессорный эффект, статистически значимо снижая МИ культур клеток Нер-2 и ЯЕ> (Рис.3). Исследование апоптоза показывает, что ХГч также индуцирует апоптоз в клетках ЯП и Нер-2, причем проапоптотический эффект наблюдается при использовании 1 и 2 МЕ/мл ХГч, а повышение содержания ХГч до 4 МЕ/мл снижает количество апоптозных клеток в пробах (Табл.2). Такая же картина наблюдается при постановке МТТ-теста: увеличение концентрации ХГч в среде культивирования до 4 МЕ/мл повышает ОП лизата клеток (Рис.4). Поскольку при этом МИ не увеличивается, то данный факт можно объяснить только стимуляцией метаболизма клеток.

45.00 40,00

и 35,00

С 30,00

| 25,00 и

Е 20,00

В 15,00

§ 10,00

ГС

5,00 0,00

£ 40,00 «

¡2 25,00

И 15,00 ¡я

контроль 1 МЕ/мл 2 МЕ/мл 4МЕ/мл Конценцхсри ХГч

5,00 0,00

ни

кошроль 1МЕ/МЛ 2 МЕ/мл 4МЕ/мл Концентрация ХГч

Рис.3. Влияние ХГч на митотическую активность опухолевых клеток. А — культура клеток Нер-2; Б - культура клеток ЯЭ. * - р<0,05; ** - р<0,005 в сравнении с серией «контроль»

Таблица 2

Влияние ХГч на изменение доли апоптозных клеток в культурах опухолевых клеток

Концентрация ХГч, МЕ/мл Доля апоптозных клеток (%) в культурах

Ы> Нер-2

контроль 4,16±1,68 6,10±1,36

1 6,37±1,39; р=0,354 10,49±2,02; р=0,048

2 7,19±1,58; р=0,233 17,67±1,44; р=0,000

4 4,13±1,07; р=0,751 7,72±1,99; р=0,365

Г* и

£ 0,45

0.4

0,35

ё м

5 0,4

1 0,3

^ 0,2

0,1

контроль 1МЕ/глл 2МЕ/МЛ 4МЕ/мл Концентрация ХГч

контроль 1МЕ/мл 2 МЕ/мл 4 МЕ/мл

Концентрация ХГч

Рис.4. Влияние ХГч на оптическую плотность лизатов опухолевых культур клеток. А - культура клеток 1Ш; Б - культура клеток Нер-2. * - р<0,05; ** - р<0,005 в сравнении с серией «контроль»

Изменения, индуцируемые ХГч в опухолевых клетках Нер-2, приводят к изменению морфометрических показателей (Табл.3). Под влиянием ХГч наблюдается тенденция к увеличению площади и периметра ядра культивируемых клеток Нер-2, а в концентрациях 1 МЕ/мл и 4 МЕ/мл эти показатели оказались достоверными. Во всех сериях эксперимента наблюдается статистически значимое снижение ядерно-клеточного отношения. Снижение ЯКО как правило свидетельствует о дифференцировке клетки, что выражается в снижении митотической активности, усилении метаболизма, в то время как увеличение ЯКО обычно свидетельствует об обратном процессе. Вероятно, изменение ЯКО в культуре Нер-2 можно объяснить именно запуском дифференцировки этих клеток. Для клеток 1Ш изменения морфометрических показателей не являются выраженными и статистически недостоверны.

Таблица 3

Влияние ХГч на кариологичеекие показатели опухолевых клеток

Концентрация ХГч, МЕ/мл Клетки 1Ш Клетки Нер-2

Площадь ядра (мкм2)

контроль 557±12 482±12

1 601±32; р=0,333 559±14; р=0,002

2 607±27; р=0,311 499±6; р=0,065

4 579±12; р=0,311 564±1 1; р=0,002

Периметр ядра (мкм)

контроль 88,17±0,85 81,14± 1,13

1 92,40±2,14; р=0,053 87,22±1,07; р=0,013

2 93,53±2,12; р=0,094 82,43±0,52; р=0,705

4 90,51±0,95; р=0,146 86,63±0,96; р=0,080

Ядерно-клеточное отношение

контроль 0,278±0,005 0,382±0,026

1 0,280±0,008; р=0,758 0,291 ±0,006; р=0,016

2 0,305±0,011; р=0,058 0,322±0,007; р=0,049

4 0,273±0,007; р=0,220 0,283±0,009; р=0,010

Эмбихин использовался в концентрациях 2 и 4 мкг/мл. Такая схема позволяет испытать как заведомо токсичную концентрацию (4 мкг/мл эмбихина), так и создать субтоксические поражения клеток (2 мкг/мл эмбихина), что дает возможность клеткам усилить процессы метаболизма, включать системы репарации ДНК и создает «метаболическое окно» для действия ХГч. В отношении клеток Ь20В в МТТ-тесте ХГч в комбинации с эмбихином не проявляет статистически достоверных эффектов. Не изменяет он и долю апоптозных клеток в пробах. В отношении легочных фибробластов ХГч проявляет цитопротекторные свойства, повышает выживаемость данных клеток в присутствии эмбихина, о чем свидетельствует повышение ОП лизатов в концентрации 1 МЕ/мл (Рис.5).

0.18

эмбихин 2мкг/мл ■ только эмбихин Ш1МЕ/МЛ

эмбихин 4мкг/мл □ 2МЕ/мл В4МЕ/мл

Концентрации ХГч и эмбихина

Рис.5. Влияние ХГч и эмбихина на оптическую плотность лизатов фибробластов легкого крысы. * - р<0,05; ** - р<0,005 в сравнении с сериями эмбихинового контроля.

Необходимо отметить, что статистически достоверный эффект наблюдается только при использовании 2 мкг/мл эмбихина, когда имеется вышеуказанное «метаболическое окно». При повышении концентрации эмбихина в среде культивирования такого эффекта не наблюдается. В отношении клеток ЯГ) в комбинации с 2 мкг/мл эмбихина ХГч также проявляет цитопротекторный эффект, что отражается на значениях ОП в МТТ-тесте (Рис.6). Тем не менее, доля апоптозных клеток при этом достоверно возрастает с 85,3±3,47% (контроль) до 96,11±1,10% (эмбихин 2 мкг/мл +ХГч 1 МЕ/мл) 95,00±2,01% (эмбихин 2 мкг/мл + ХГч 2 МЕ/мл) 95,31±0,73% (эмбихин 2 мкг/мл +ХГч 4 МЕ/мл), соответственно р=0,020, р=0,014 и р=0,014. При повышении содержания эмбихина до 4 мкг/мл ХГч не оказывает статистически значимых эффектов. По-видимому, повышение ОП и протективный эффект ХГч в МТТ тесте (серия эксперимента «эмбихин 2 мкг/мл +ХГч 4 МЕ/мл») обусловлены стимуляцией метаболизма выживших клеток.

В отношении клеток Нер-2 ХГч в комбинации с эмбихином снова оказывает двойственный эффект, то понижая, то повышая ОП лизатов в МТТ-тесте (Рис.7).

0,25

КГ М

0,15

ё <1> Е

0,05

ГГр

эмбихин 2мкг/мл

эмбихин 4мкг/мл

■ толькоэмбихин П1МЕ/МЛ 0 2МЕ/мл ГЭ4МЕ/МЛ

Концентрации ХГч и эмбихина Рис. 6. Влияние ХГч и эмбихина на оптическую плотность лизатов клеток М). * - р<0,05; ** - р<0,005 в сравнении с сериями эмбихинового контроля.

0,600

0,000

эмбихин 2мкг/мл эмбихин 4мкг.'мч

I только эмбихин □ 1 МЕ/мп С12МЕ/мп 04МЕ/мл

Концентрация ХГч

Рис.7. Влияние ХГч и эмбихина на оптическую плотность лизатов клеток Нер-2. * - р<0,05; ** - р<0,005 в сравнении с сериями эмбихинового контроля.

Колебаниям подвергается также и доля апоптозных клеток в пробах (Табл.4).

Таблица 4

Влияние ХГч и эмбихина на долю апоптозных клеток Нер-2

Концентрация ХГч, МЕ/мл Доля апоптозных клеток (%) в культуре

Эмбихин 2 мкг/мл Эмбихин 4 мкг/мл

Контроль 30,57±3,27 67,76±6,98

1 20,87±0,92; р=0,009 75,25±2,60; р=0,745

2 15,00±2,01; р=0,003 50,11±7,58; р=0,055

4 13,82±3,70; р=0,009 42,86±3,62; р=0,018

Результаты исследования доли апоптозных клеток при комбинированном действии ХГч и эмбихина говорят о том, что присутствие ХГч в культуральной среде практически во всех сериях эксперимента приводит к снижению чувствительности клеток Нер-2 к эмбихину. Единственно возможным вариантом остается влияние ХГч на метаболическую активность клеток Нер-2. При этом угнетение метаболизма клеток приведет к энергодефициту. Апоптоз, как известно, процесс энергозависимый и опосредован сигнальными путями, поэтому их торможение может привести к частичному торможению апоптоза в том числе. Следовательно, в зависимости от условий использовния действие ХГч на культуру Нер-2 оказывается различным. В чистом виде для концентраций 1 и 2 МЕ/мл его можно описать как супрессорное (антипролиферативное, проапоптотическое), но повышение концентрации ХГч в среде культивирования до 4 МЕ/мл приводит к ослабеванию данного эффекта. Возможно, причиной этого служит вступление клеток на путь дифференцировки, о чем свидетельствует значимое изменение ЯКО. В комбинации с эмбихином влияние ХГч нельзя отнести ни к токсическому, ни к протективному: по результатам МТТ-теста эфефкт ХГч снова является двойственным, результаты апоптозного теста говорят о торможении процесса апоптоза под влиянием гормона.

Поскольку с увеличением концентрации ХГч до 4 МЕ/мл эффект гормона изменился с супрессорного на стимулирующий, было принято решение исследовать влияние более высоких концентраций гормона - 50,100 и 150 МЕ/мл. При оценке общей морфологической картины монослоя клеток, культивируемых с ХГч, отмечалась дезорганизация монослоя, разъединение межклеточных контактов. Количество ядрышек уменьшалось с 4-6 до 2-3, что говорит о торможении синтетических процессов в клетках. Митотическая

активность клеток также снижалась пропорционально содержанию ХГч в среде культивирования (Рис.8).

^ контроль 50МЕ/МЛ 100МЕ/мл 150МЕ/мл

□ 4843COD культивирооания □ 72 часа культивирования

Конценфацш ХГч

Рис. 8. Влияние сверхвысоких концентраций ХГч на митотический индекс клеток Нер-2. * - р<0,05; ** - р<0,005 в сравнении с серией «контроль».

На срок культивирования 48 часов снижение составило 3,61%, 26,54%, 22,72% от контрольных значений соответственно для 50, 100 и 150 МЕ/мл хорионического гонадотропина. Через 72 часа культивирования показатель снижения МИ составил соответственно 5,49%, 29,77% и 37,89%. Известен факт, что митотическая активность культивируемых клеток зависит от срока культивирования и может прирастать со временем (Алов И.А., 1972; Блюмкин В.Н., Жданов В.М., 1973). При воздействии ХГч изменяется дельта митотического индекса (ДМИ) клеток Нер-2относительно контрольных культур (Рис.9).

Рис.9. Влияние сверхвысоких концентраций ХГч на прирост митотического индекса клеток Нер-2.

Имеющийся в контрольной серии эксперимента положительный прирост МИ (в период культивирования от 48 до 72 часов) снижается в 1,8 раза при действии 50 МЕ/мл ХГч, практически отсутствует при действии 100 МЕ/мл ХГч, и является отрицательным для 150 МЕ/мл ХГч. Параллельно снижению митотической активности клеток происходит повышение доли патологических форм митозов на обоих сроках культивирования (Рис. 10,11).

контроль 50 МП/мл 100 МЕ/мл 150 МЕ/мл

□ 48 часов культивирования □ 72 часа культивирования

Концентрация ХГч

Рис.10. Влияние сверхвысоких концентраций ХГч на содержание патологических митозов в культуре Нер-2. * - р<0,05; ** - р<0,005 в сравнении с серией «контроль»

Рис. 11. Патологические митозы в культуре Нер-2. А - рассеяние хромосом в метафаз; Б - трехполюсная метафаза; В - трехполюсная анафаза; Г -отставание группы хромосом в метафазе, Д - трехполюсная анафаза с хроматидными мостами, Е-К-митоз.

Корреляция между концентрацией ХГч и долей патологических митозов через 48 часов составляет г=0,91, через 72 часа г=0,86. ХГч также влияет на метафазно - профазный индекс (МПИ) клеткок Нер-2 (Рис.12).

9 8 7

контроль 50 МЕ/мл 100МЕ/мл 150МЕ/мл □ 48 часов культивирования Ш 72 часа культиоирования

Концентрация ХГч

Рис. 12. Влияние сверхвысоких концентраций ХГч на МПИ в культуре Нер-2. *— р<0,05; **-р<0,005 в сравнении с серией «контроль»

Как известно, возрастание доли метафаз и повышение МПИ свидетельствует о повышении митотический активности клеток. Снижение МПИ при этом может быть обусловлено как снижением пролиферативной активности клеток, так и задержкой митоза в профазе, что классифицируется как одна из патологических форм митотического деления (Алов И.А., 1972). ХГч увеличивает также долю поликариоцитов с 15-20 до 30-40%о. Корреляция между содержанием ХГч в среде культивирования и долей поликариоцитов в популяции клеток Нер-2 составляет г=+1,00 для срока культивировали 48 часов и г=+0,89 для срока культивирования 72 часа. Следовательно, даже в заведомо завышенных дозировках ХГч не приводит к запуску сценария опухолевой прогрессии в клетках Нер-2 и действие сверхвысоких концентраций ХГч в целом можно охарактеризовать как антипролиферативное и дестабилизирующее.

Основываясь на результатах проведенных исследований, можно достоверно утверждать, что хорионический гонадотропин человека in vitro способен влиять на клетки культур Нер-2, RD, L20B и легочные фибробласты

крысы, изменяя их митотическую активность, коммитируя их к апоптозу или влияя на метаболизм путем реализации иных, не известных пока механизмов. Данные клетки происходят из тканей, не имеющих рецепторов к половым гормонам. Следовательно, сигналы ХГч передаются иными путями, нежели ХГч/ЛГ рецептор. В целом супрессорный эффект ХГч проявляется сильнее в отношении опухолевых клеток, что позволяет предложить данный гормон в качестве противоопухолевого средства. В комбинации с эмбихином ХГч проявляет преимущественно супресорное действие, в высоких концентрациях -преимущественно протективное действие в отношении опухолевых клеток, что необходимо учитывать при составлении схем противоопухолевой терапии.

Выводы:

1. Хорионический гонадотропин в условиях культуры клеток оказывает прямое влияние на клетки, происходящие из тканей, не имеющих рецепторов к половым гормонам и гонадотропинам (фибробласты, рабдомиосаркома, карцинома гортани).

2. В отношении культур неопухолевых клеток L20B и фибробластов легкого крысы хорионический гонадотропин снижает митотическую активность клеток и стимулирует их апоптоз.

3. В отношении культур опухолевых клеток Нер-2 и RD хорионический гонадотропин оказывает выраженное антипролиферативное и проапоптотическое действие, снижает метаболическую активность и ядерно-клеточное отношение клеток Нер-2, что является признаком их дифференцировки.

4. В комбинации с эмбихином хорионический гонадотропин в концентрациях 1 и 2 МЕ/мл приводит к стимуляции апоптоза, снижении оптической плотности лизатов в МТТ-тесте, а в концентрации 4 МЕ/мл оказывает преимущественно протективное действие, что проявляется в снижении доли апоптозных клеток и повышении оптической плотности лизатов в МТТ-тесте в отношении опухолевых клеток.

5. В сверхвысоких концентрациях (50, 100 и 150 МЕ/мл) хорионический гонадотропин не приводит к катаплазии клеток Нер-2, снижает митотическую активность данных клеток, дезорганизует монослой, повышает долю патологических митозов в культуре.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Горшков А.С. Митотическая активность клеточной культуры Нер-2 на ранних сроках в эксперименте/ Горшков А.С. , Полушин А.В //Сборник тезисов 81-й Всероссийской студенческой научной конференции, посвященной 150-летию В.М. Бехтерева. Казань. -2007-С. 120-121.

2. Горшков А.С. Влияние хорионического гонадотропина человека на митотическую активность карциномы гортани Нер-2/ Горшков А.С., Полушин А.В., Семенов А.Н. //Вятский медицинский вестник. Специальный выпуск. -2007. -№1.- С.58-59

3. Горшков А.С. Патологические митозы в культуре Нер-2 как показатель противоопухолевого эффекта хорионического гонадотропина/ Горшков А.С., Полушин А.В. //Сборник материалов II Всероссийской конференции «Студенческая наука и медицина XXI века: традиции, инновации и приоритеты», посвященной 85-летию студенческого научного общества Сам ГМУ. —2008 — С.71.

4. Полушин А.В. Дозозависимое влияние гонадотропина хорионического на клеточную культуру Нер-2/ Полушин А.В., Горшков А.С. //Сборник материалов II Всероссийской конференции «Студенческая наука и медицина XXI века: традиции, инновации и приоритеты», посвященной 85-летию студенческого научного общества Сам ГМУ-2008,- С. 198-199.

5. Патент РФ № 200711862/13, 17.05.2007. Способ модуляции патологических изменений и дезорганизации в культуре клеток карциномы гортани Нер-2 /Косых А.А., Горшков А.С., Полушин А.В. // Патент России № 2349600.2009. Бюл. №8.

6. Косых А.А. Регуляция пролиферации клеток с помощью хорионического гонадотропина человека /Косых А.А., Горшков А.С., Полушин А.В. // Фундаментальные исследования. —2008 — № 10.— С.74-76.

7. Горшков А.С. Сравнительный анализ влияния хорионического гонадотропина на опухолевые и нормальные эпителиальные культуры/Горшков А.С., Полушин А.В. // Сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки».-2009.- С.71-72.

8. Косых А.А. Инновационная составляющая студенческой науки в медицинском ВУЗе. /Косых А.А., Полушин А.В., Горшков А.С., и др. //Заочная электронная конференция. Научный электронный архив академии естествознания-25.02.10 — URL: http://www.ekonf.rae.ru/article/4891

9. Gorshkov A.S. Human chorionic gonadotropin suppresses throat carcinoma Hep-2/Gorshkov A.S., Polushin A.V. //Молодежь и медицинская наука в XXI

веке: материалы Х1Г-ой открытой итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием 30 марта - 1 апреля 2011г. /Под ред. И.В. Шешунова, С.А Дворянского, C.B. Игнатьева. Киров: Кировская государственная медицинская академия-2011.-С.209-210

10. Косых A.A. Совместное действие хорионического гонадотропина и эмбихина на клеточную культуру карциномы гортани Нер-2/ Косых A.A., Горшков A.C., Полушин A.B. // Фундаментальные исследования. —2011.— № 10 (часть 1).-С. 91-94.

11. Марченков A.A. Влияние хорионического гонадотропина человека на культуры клеток рабдомиосаркомы RD и нетуморогенных фибробластов Ь20В/Марченков A.A., Горшков A.C. //Материалы XIII научно-практической конференция студентов и молодых ученых с международным участием, «Молодежь и медицинская наука XXI веке», посвященная 25-лютию академии. Киров. -2012.-С.143

12. Горшков A.C. Оценка сравнительного влияния хорионического гонадотропина на клетки Нер-2 и RD /Горшков A.C., Косых A.A., Утемов C.B., Марченков А. А .//Материалы XIV международного конгресса. «Здоровье и образование в XXI веке». Специальный выпуск.-2012.-№1.-Т.14.-С.196.

13. Горшков A.C. Влияние хорионического гонадотропина на опухолевые и неопухолевые клетки/ Горшков A.C. //Аспирантские чтения - 2012. -Самара: ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России.-С.150-153.

14. Горшков A.C. Влияние хорионического гонадотропина на митотическую активность и метаболизм клеток рабдомиосаркомы RD/Горшков A.C., Косых A.A., Утемов C.B., Марченков А.А.//Фундаментальные исследования - 2013. - № 1 (часть 3). - С. 568-571.

ГОРШКОВ АНТОН СЕРГЕЕВИЧ

03.03.04-клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано к печати 15.04.2013. Объем 1 печ.л. Отпечатано в типографии ГБОУ ВПО Кировская ГМА Минздрава России, г. Киров, ул. К. Маркса, 112. Тираж 100. экз. Заказ № 888.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Горшков, Антон Сергеевич, Саранск

ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

Горшков Антон Сергеевич

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ОПУХОЛЕВЫХ И НЕОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ПОД ВЛИЯНИЕМ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА

И ЭМБИХИНА

Специальность: 03.03.04. - «клеточная биология, цитология, гистология»

часа „

диссертация на соискание ученой степени

со °

Сч| кандидата медицинских наук

со о

СМ

Научный руководитель - доктор медицинских наук,

профессор А.А. Косых

Киров-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.................13

1.1. Строение и функции хорионического гонадотропина.........................13

1.2. Рецептор хорионического гонадотропина и пути передачи

гормонального сигнала.....................................................................16

1.3. Негонадные эффекты хорионического гонадотропина.........................17

1.4. Хорионический гонадотропин в канцерогенезе...................................22

1.5. Использование цитостатиков для лечения опухолей............................27

1.6. Молекулярные механизмы регуляции пролиферации и онкогенеза... 28

1.7. Молекулярные основы дифференцировки клеток.................................33

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ РАБОТЫ...........................................38

2.1. Дизайн эксперимента...............................................................................39

2.2. Культивирование клеток..........................................................................39

2.3. Криоконсервация клеток...........................................................................43

2.4. Митотический анализ культивируемых клеток....................................44

2.5. Морфометрический анализ культивируемых клеток..........................46

2.6. МТТ-тест...................................................................................................48

2.7. Апоптозный тест......................................................................................49

2.8. Статистическая обработка данных..........................................................51

Глава 3. ВЛИЯНИЕ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА НА

НЕОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ.........................................................52

3.1. Общая характеристика культивируемых линий....................................52

3.2. Влияние хорионического гонадотропина на клетки культуры Ь20В 54

3.3. Влияние хорионического гонадотропина на клетки культуры

фибробластов легкого.......................................................................65

Глава 4. ВЛИЯНИЕ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА НА

ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ...............................................................69

4.1. Общая характеристика культивируемых линий.....................................69

4.2. Влияние хорионического гонадотропина на клетки культуры ИХ) ....71

4.3. Влияние хорионического гонадотропина на клетки культуры Нер-2 78

Глава 5. ВЛИЯНИЕ СВЕРХВЫСОКИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ

ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА НА КУЛЬТУРУ

НЕР-2..................................................................................................86

Глава 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ..................93

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................................................104

ВЫВОДЫ.........................................................................................................107

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ..........................................108

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА.....................................130

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ДМБА ■ - диметилбензантрацен

ИЛ - интерлейкин

ЛГ - лютеинизирующий гормон

ТТГ - тиреотропный гормон

ФСГ - фолликкуло-стимулирующий гормон

ХГч - хорионический гонадотропин человека

яко - ядерно-клеточное отношение

со - кластер дифференцировки

сак - циклин-зависимая киназа

ЕвР - эпидермальный фактор роста

СТР - гтф-связывающий белок

1ТА - антиген инвазивного трофобласта

РСЫА - антиген ядер пролиферирующих клеток

ТСР - трансформирующий фактор роста

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

В последнее время в медицинском сообществе возрастает интерес к регенеративной медицине [44,72-76,117]. Это связано с тем, что управление процессами дифференцировки и пролиферации клеток позволит решать такие насущные проблемы здравоохранения, как заместительная клеточная терапия, а также восстановление функций органов и тканей путем введения стимуляторов роста и дифференцировки клеток.

Несмотря на большие достижения в области молекулярной биологии, ряд насущных медицинских проблем до сих пор не решен, поскольку не все механизмы данных процессов изучены достаточно полно. Так, стимуляция пролиферативной активности клеточных популяций в патологически измененных органах чревата запуском программы малигнизации. С другой стороны, подавление отдельных клеточных популяций при цитостатической терапии неизбежно сказывается и на немалигнизированных клетках, что приводит к тяжелым побочным эффектам. Решение данной проблемы пытались найти при помощи молекулярно-генетических методов [39,42,56,70]. В некоторых случаях манипуляции с геномом эукариот приводят к его нестабильности, и, как следствие этого, к злокачественной трансформации клеток. Так, создание ¡РЗ-сеПБ было сопряжено с малигнизацией части репрограммированных клеток, в основном за счет трансгена с-Мус [179].

На этом фоне особую актуальность приобретают работы ученых советского периода - М.В. Воронцовой, Б.П. Солопаева, А.Я. Фриденштейна, отдававших проблемам регенерации и регенеративной медицины ключевую роль в развитии морфологической науки и практики. Именно они показали, что организм имеет собственные мощные резервы восстановления утраченных функций, основанные, в частности, на взаимодействии различных клеток в тканях, что в настоящее время принято связывать с

понятиями «стволовой клетки», «тканевых ниш», «хоуминга». Поэтому тенденцией современной биологической науки является повышенный интерес к возможностям включения собственных резервов клеток организма, контроля их клеточного цикла при помощи естественных пара- и аутокринных модуляторов. Эмбриональный период развития организма характеризуется наличием большого количества таких модуляторов -дифференцировочных факторов и гормонов. Их слаженное взаимодействие приводит к развитию из зиготы большого числа тканей, находящихся в сбалансированном состоянии кооперации, за счет которого реализуется четкая программа миграции, пролиферации и дифференцировки клеток. При этом существует достаточно строгий контроль над данными процессами -часть образовавшихся клеток отсеивается и погибает в результате направленного отбора, примером чего может служить, например, клональная селекция лимфоцитов, сенсибилизированных к аутоантигенам. Поскольку дифференцировочные факторы и гормоны стимулируют процессы пролиферации и дифференцировки в эмбриогенезе, теоретически можно предположить возможность их влияния на процессы регенерации и онкогенеза взрослого организма.

Из большого количества гормонов, участвующих в эмбриогенезе, особый интерес представляет хорионический гонадотропин, обладающий способностью стимулировать регенерацию патологически изменённых органов и тканей [44,72-76].

Рецепторы к ХГч имеются на поверхности клеток органов репродуктивной системы (железистый эпителий молочной железы, тека, клетки Лейдига и эмбриональные ткани) [76,95,111,163]. Кроме того, действие данного гормона не ограничивается репродуктивной системой и внутриутробным периодом. Показано, что он способен повышать митотическую активность гепатоцитов при циррозе и резекции печени в эксперименте с 0,04%о до 4,26%о [44,76]. При этом рядом авторов отмечается, что митотический сигнал передается не прямо, а опосредован

лимфоцитарным присутствием [76]. Более того, ХГч способен не только стимулировать, но и подавлять деление некоторых типов клеток. Так, например, он подавляет митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов, снижает иммунореактивность организма матери по отношению к формирующимся тканям плода, угнетает пролиферацию клеток промиелоидного лейкоза HL-60 in vitro и ряда лейкемий in vivo. [16,15,123]. Исследуемый гормон способен подавлять клетки рака молочной железы MCF-7 через активацию апоптоза и ингибирование транскрипционных факторов NF-kB и АР-1, на основании чего некоторые исследователи предлагают включить хорионический гонадотропин в протоколы терапии рака молочной железы [163,167]. В отношении клеток HL-60, MCF-7, лимфоцитов достоверно известно, что они имеют специфические рецепторы к ХГч. Однако нет достоверных данных о том, будет ли ХГч оказывать влияние на клетки, не имеющие специфических рецепторов к ХГч. В последнее время рядом авторов высказывается мнение, что хорионический гонадотропин способен действовать на многие клетки и ткани, в том числе и на негонадные ткани взрослого организма [76,164,165].

Таким образом, результаты экспериментального и клинического применения ХГч при негонадной патологии говорят о том, что данный гормон обладает доказанным клинически и статистически значимым эффектом стимуляции регенерации патологически измененных органов, что говорит о его протективном действии в отношении немалигнизированных клеток. При этом есть данные о его токсическом действии на ряд опухолевых линий, что позволяет рассматривать ХГч с точки зрения не изолированного ингибитора/стимулятора, а регулятора пролиферации, дифференцировки и малигнизации клеток. Тем не менее, большинство исследований, противопоставляющих эффекты ХГч на опухолевые и неопухолевые клетки, выполнено на модели in vivo, что вносит существенные коррективы и обладает рядом недостатков. Например, в данном случае невозможно устранить вероятность косвенных эффектов ХГч через другие гормональные

пути или иммунную систему. Чтобы ответить на вопросы, какую роль играет ХГч в дифференцировке, пролиферации и апоптозе опухолевых/неопухолевых клеток, селективно ли его действие, необходимо исследовать его действие на клетки, не имеющие рецепторов к ХГч, что осуществимо только в условиях in vitro.

Говоря о противоопухолевых эффектах веществ, необходимо опираться на уже известные методы борьбы с процессом опухолевого роста. На сегодняшний день ведущую роль в схемах лечения опухолей занимают цитостатики, и разработка новых противоопухолевых средств предполагает их использование в первую очередь в адъювантной терапии. Поэтому при разработке новых противоопухолевых препаратов необходимо учитывать эффекты их комбинаций с уже известными противоопухолевыми средствами. Таким образом, рассматривая противоопухолевые свойства ХГч, необходимо установить его влияние на опухолевые и неопухолевые клетки не только в чистом виде, но и в комплексе с цитостатиком. Одной из групп цитостатиков являются алкилирующие агенты, селективно повреждающие ДНК клеток-мишеней (например, эмбихин). Данный препарат наиболее удобен для комбинирования с ХГч, поскольку предполагаемые эффекты ХГч связаны с запуском апоптоза и возможно влиянием на ДНК клеток.

Цель и основные задачи исследования

Оценить морфофункциональное состояние опухолевых и неопухолевых клеток под влиянием хорионического гонадотропина и эмбихина в условиях in vitro. Для достижения данной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Определить структурно-функциональные особенности и морфометрические показатели культур неопухолевых клеток L20B и фибробластов легкого крысы в норме и при воздействии хорионического гонадотропина в концентрациях 1, 2 и 4 МЕ/мл.

Публикации

Материалы исследований опубликованы в 14 печатных работах, в том числе 2 статьи опубликованы в журналах, включенных в перечень ведущих рецензируемых изданий ВАК, 1 статья в материалах XIV Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке», получен 1 патент на изобретение.

Научная новизна исследования

В работе впервые проведено исследование влияния хорионического гонадотропина в различных концентрациях на опухолевые и неопухолевые клетки млекопитающих, как в чистом виде, так и в комплексе с эмбихином. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ХГч способен воздействовать на клетки, происходящие из тканей, не имеющих специфических рецепторов к половым гормонам и гонадотропинам, стимулировать апоптоз и дифференцировку опухолевых клеток Нер-2. При этом действие ХГч не опосредовано иными гормональными путями и лимфоцитами, поскольку все эксперименты проведены в условиях in vitro.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты работы позволяют рассматривать хорионический гонадотропин не только как маркер неоплазий, но как индуктор апоптоза опухолевых клеток в условиях in vitro, что позволяет предложить ХГч в качестве противоопухолевого средства. Показано, что в комбинации с эмбихином в низких концентрациях хорионический гонадотропин проявляет преимущественно супресорное действие, в высоких концентрациях - преимущественно протективное действие в отношении опухолевых клеток, что необходимо учитывать при составлении схем противоопухолевой терапии. Теоретические положения включены в учебный процесс кафедр биологии, патологической физиологии, гистологии, цитологии и эмбриологии и онкологии Кировской ГМА и используются при чтении лекций, проведении занятий со студентами, на основании полученных данных разработан и запатентован метод подавления карциномы гортани Нер-2.

Внедрение результатов исследования

Теоретические положения включены в учебный процесс кафедр биологии, патологической физиологии, гистологии, цитологии и эмбриологии и онкологии Кировской ГМА и используются при чтении лекций, проведении занятий со студентами по темам «Эмбриология» и «Основы опухолевого роста», а также вошли в учебно-методические пособия «Временная организация клетки. Клеточный цикл» и «Проблемы клеточной

пролиферации. Клеточный цикл» для самостоятельной работы студентов I и II курсов по предмету «Медицинская генетика». Созданные микропрепараты патологических митозов используются как демонстрационные на практических занятиях со студентами, на основе хорионического гонадотропина проводится разработка противоопухолевого препарата.

Положения диссертации, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов работы

электронный архив академии естествознания), XII научно-практической конференции «Молодежь и медицинская наука в XXI веке», 31 марта -1 апреля 2011 года (г. Киров), на конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», 14- 17 ноября 2012 года (г.Москва), а также на расширенном межкафедральном заседании ГБОУ ВПО Кировская ГМА 21 декабря 2012г.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 130 страницах машинописного текста, включает 12 таблиц и 35 рисунков (микрофотографии, графики, диаграммы). Диссертация состоит из введения, 3 глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя. Список литературы включает 192 источника, в том числе 93 отечественных и 99 иностранных авторов.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ �

Информация о работе

Горшков, Антон Сергеевич
кандидата медицинских наук
Саранск, 2013
ВАК 03.03.04

Диссертация

Морфофункциональное состояние опухолевых и неопухолевых клеток под влиянием хорионического гонадотропина и эмбихина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы