Морфологическая характеристика структур тимуса лабораторных мышей при введении хорионического гонадотропина

Ялалетдинова, Лейсан Рамиловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфологическая характеристика структур тимуса лабораторных мышей при введении хорионического гонадотропина
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфологическая характеристика структур тимуса лабораторных мышей при введении хорионического гонадотропина"

На правах рукописи

ЯЛАЛЕТДИНОВА ЛЕИСАН РАМШТОВНА

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУР ТИМУСА ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ ПРИ ВВЕДЕНИИ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 г ИЮЛ 2015

Казань-2015 005570780

005570780

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова»

Научный руководитель: Сергеева Валентина Ефремовна - доктор биологических наук, профессор кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова», заслуженный работник высшей школы Российской Федерации

Официальные оппоненты:

Швалев Вадим Николаевич — доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН, ведущий научный сотрудник лаборатории нейроморфологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения Российской Федерации Диндяев Сергей Валерьевич — доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «25» сентября 2015 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.034.01 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 496) и на сайте: http://www.kgmu.kcn.ru

Автореферат разослан С/ МУ/Л 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета __,

доктор медицинских наук, профессор Л.Д. Зубаирова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность

Изучение роли гормонов и иммунологических факторов при физиологических и патологических состояниях организма в последние годы приобретает большую актуальность, обусловленную большим количеством клинических проблем, связанных с нарушением гуморальной регуляции функционирования различных органов и тканей, а также недостаточным изучением этих процессов (Кветной И. М. и соавт., 2005; Пальцев М. А. и соавт., 2006; Корнева Е. А. и соавт., 2012).

Несмотря на широкое применение хорионического гонадотропина (ХГ) в медицине, остаются малоизученными вопросы воздействия гормонов на функционирование клеток иммунной системы, процессы пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток (Kuklina Е. М. et al., 2003).

В рамках этой проблемы несомненный интерес представляют вопросы состояния центрального органа иммунитета - тимуса - при введении хорионического гонадотропина, так как возможное влияние этого гормона на стуктурно-функциональные характеристики тимуса практически не исследованы. Для клиницистов важно знать закономерности, лежащие в основе иммунологических изменений в тимусе при действии ХГ, так как это может помочь при решении конкретных клинических задач. Хорионический гонадотропин обеспечивает формирование иммунологической толерантности при беременности, увеличивает процент CD3+ CD4+ Т-лимфоцитов в культуре клеток (Куклина Е.М., 2003; Ширшев С. В., Заморина С. А., 2011; 2013), способствует увеличению количества натуральных киллеров в культуре ткани (Заморина С. А., 2010), способствует созреванию и увеличению количества тучных клеток в печени (Солопаева И. М., 2010), однако его эффекты на различные клеточные типы тимуса мало исследованы. Это очень важно и в связи с тем, что на мембране лимфоцитов найдены рецепторы помимо ХГ и к половым гормонам, в том числе к эстрогенам (Кветной И. М., 2005).

Известно, что в тимусе происходит пролиферация, дифференцировка и апоптоз клеток, однако гуморальная регуляция этих процессов при введении хорионического гонадотропина мало изучена. В создании микроокружения Т-лимфоцитов тимуса значительная роль принадлежит макрофагам, дендритным и тучным клеткам, а также адренергическим нервным волокнам. Вместе с тем мы пока мало что знаем о том, как изменяются различные характеристики этих клеток и структур, например при наступлении беременности в условиях повышенной секреции ХГ. Известна, большая роль катехоламинов, серотонина и гистамина в регуляции разнообразных функций тимуса (Гордон Д. С., Сергеева В. Е., 1992; Сарилова И. JI., Сергеева В. Е., 2012). Ведущую роль в продукции нейроаминов занимают люминесцирующие гранулярные клетки между корковым и мозговым веществом, в накоплении — люминесцирующие гранулярные клетки

коркового вещества (Гордон Д. С. и соавт., 1982; Гурьянова Е. А., 2011), однако остаются неизученными вопросы содержания нейроаминов в структурах тимуса при длительном введении ХГ, механизмы их влияния на процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток различных органов иммунной защиты.

Несмотря на то, что хорошо известны эффекты различных нейромедиаторов в регуляции иммунных реакций, возможная роль влияния ХГ на их секрецию различными клетками тимуса практически не исследована (Девойно Л. В., 1983; Идова Г. В., 2004).

Беременность сопровождается изменением содержания множества гормонов в организме, в том числе хорионического гонадотропина, поэтому ряд исследований посвящен вопросам состояния тимуса при беременности, (Олангин О. И., 2000; Еикауаша М. е1 а1., 1990; Ваша1 А. 8. е1 а!., 2012), однако в данных работах были исследованы в основном морфологические изменения в этом органе. В связи с этим комплексное изучение влияния хорионического гонадотропина на сроках 1, 2, 3, 4 недели на тимус представляется важным и актуальным в практическом и теоретическом аспектах.

Цель работы — изучение морфологической характеристики тимуса лабораторных мышей при введении хорионического гонадотропина через 1,2, 3 и 4 недели.

Задачи исследования:

1. Изучить морфометрические изменения дольки тимуса лабораторных мышей, процессы пролиферации и апоптоза при внутримышечном введении хорионического гонадотропина в дозе 2 Международные единицы (МЕ)/животное 2 раза в неделю через 1, 2, 3 и 4 недели.

2. Сравнить количество и степень дегрануляции тучных клеток в тимусе, обеспеченность их биогенными аминами и кислыми мукополисахаридами при введении хорионического гонадотропина через 1, 2, 3,4 недели.

3. Изучить распределение катехоламинов, серотонина и гистамина в биоаминосодержащих клетках коркового и мозгового вещества долек тимуса, адренергических нервах при введении хорионического гонадотропина через 1, 2, 3, 4 недели.

4. Исследовать количественное распределение С04- и С08-позитивных клеток в различных зонах дольки тимуса у лабораторных мышей при введении хорионического гонадотропина через 1, 2, 3,4 недели.

5. Сравнить экспрессию белков-маркеров пролиферации (К>67), апоптоза (р-53), а также антиапоптотического белка (Ьс1-2) в клетках тимуса при введении хорионического гонадотропина через 1, 2, 3, 4 недели от момента введения.

Научная новизна

Впервые при введении хорионического гонадотропина через 1, 2, 3, 4 недели воздействия показаны микроморфологические особенности долек тимуса (увеличение площади мозгового вещества долек тимуса), а также

увеличение количества тучных клеток в поле зрения, сопровождающееся усилением степени их метахромазии и дегрануляции у лабораторных мышей.

Нами выявлено, что введение хорионического гонадотропина в течение 4-х недель сопровождается увеличением интенсивности люминесценции гистамина в содержащих его клетках и уменьшение интенсивности люминесценции катехоламинов и серотонина в нейроаминосодержащих клетках и адренергических нервах, причем эти изменения имеют разнонаправленный характер.

Приоритетными являются данные о процессах дифференцировки Т-лимфоцитов (увеличении количества СБ4+ — маркера Т-лимфоцитов-хелперов и СБ8+ - маркера Т-лимфоцитов-киллеров клеток тимуса) под воздействием ХГ в течение 1, 2, 3,4 недель.

Впервые показано, что введение хорионического гонадотропина в течение 1, 2, 3, 4 недель приводит к снижению пролиферативных процессов (Кл-67 - маркеров клеточной пролиферации) в корковом веществе долек тимуса мышей и запускает процессы дифференцировки клеток, о чем свидетельствует увеличение количества С04+ и С08+ клеток и экспрессия в клетках белка апоптоза р-53.

Теоретическое и практическое значение

Научные положения и выводы диссертационного исследования существенно расширяют представления о механизмах иммуномодулирующего действия хорионического гонадотропина и дополняют современные данные о состоянии структурно-функционального статуса тимуса лабораторных мышей в зависимости от сроков гормонального воздействия.

Результаты и практические рекомендации диссертационного исследования применяются в учебном процессе и могут быть использованы при написании учебных пособий по клеточной биологии, цитологии, гистологии, иммуноморфологии, а также при написании монографий по теоретической и репродуктивной медицине.

Особенный интерес эти данные представляют для врачей иммунологов, эндокринологов и гинекологов.

Реализация результатов исследований

Научные разработки и положения диссертационных исследований используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова», в работе бюджетного учреждения «Президентский перинатальный центр» Министерства здравоохранения и социального развития Чувашской Республики, бюджетного учреждения «Городская клиническая больница №1» Министерства здравоохранения и социального развития Чувашской Республики, АУ Чувашии «Институт усовершенствования врачей» Минздравсоцразвития Чувашии на кафедре терапии и семейной медицины.

Степень достоверности и апробация работы

Выбранная модель введения в организм хорионического гонадотропина соответствует поставленной цели диссертационного исследования. Для

получения экспериментального материала (гистопрепаратов, цифровых данных) использовалось сертифицированное оборудование. Примененные иммуногистохимические маркеры Ki-67, bcl-2, р-53 широко используются для оценки процессов апоптоза и пролиферации в тканях. Достоверность результатов проведенных экспериментов обеспечивалась адекватным подбором люминесцентно-гистохимических, иммуногистохимических методов исследования, а также использованием методов параметрической и непараметрической статистики для обработки полученного цифрового массива.

Основные научные положения, выводы и результаты работы доложены и обсуждены: на 44-й научной студенческой конференции (Чебоксары, 9—10 апреля 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 80-летию факультета естествознания и дизайна среды (Чебоксары, 23 мая 2011); Всероссийской научной конференции с международным участием «Морфология в теории и практике» (Чебоксары, 22 ноября 2012); 86-й Всероссийской студенческой научной конференции памяти чл.-корр. АН РТ, проф. И. Г. Салихова (Казань, 23-24 апреля 2012); XIX Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммуннореабилитации (Нью-Йорк, 2012); XIX Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (ОАЭ, Дубай, 11-15 октября 2013); XVII заочной научной конференции Research Journal of international Studies (Екатеринбург, 2013); V Международном молодежном медицинском конгрессе (Санкт-Петербург, 4—6 декабря 2013); научно-практической конференции «Современные проблемы естественнонаучных исследований» (Чебоксары, 20 мая 2014); Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Чебоксары, 26 сентября 2014); Международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования» (Курск, 27—28 марта 2015); расширенных заседаниях, кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова» (Чебоксары, 16 октября 2014, 22 мая 2015).

Научные положения, выносимые на защиту:

1. Введение хорионического гонадотропина мышам на разных сроках приводит к увеличению количества и степени дегрануляции тучных клеток в тимусе, обеспеченности их биогенными аминами и кислыми мукополисахаридами, увеличению CD4+ и CD8+ клеток долек тимуса, при этом наряду с увеличением количества клеток, экспрессирующих белки-регуляторы апоптоза, происходит уменьшение количества клеток, экспрессирующих белок пролиферации.

2. Морфологические изменения в корковом и мозговом веществе долек тимуса на различных сроках от 1 до 4 недель воздействия хорионического гонадотропина сопровождаются увеличением содержания гистамина в

люминесцирующих клетках долек тимуса и уменьшением содержания катехоламинов и серотонина в биоаминосодержащих клетках и адренергических нервах, причем эти изменения имеют разнонаправленный характер в распределении между гистамином, с одной стороны, и катехоламинами, серотонином - с другой.

Публикации

Основные положения диссертационной работы отражены в 14 опубликованных работах, 7 из них (4 статьи и 3 публикации с тезисами докладов конференций) — в центральных периодических журналах «Аллергология и иммунология», «Фундаментальные исследования», «Международный научно-исследовательский журнал», «Вестник Чувашского университета», которые входят в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, определенных ВАК России.

Структура и объем диссертации

Диссертационный материал изложен на 155 страницах компьютерного исполнения и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственного исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка использованной литературы, списка сокращений, списка иллюстративного материала, приложений. Работа включает 9 таблиц и 28 рисунков, из которых 14 — диаграммы и 14 — микрофотографии. Список литературы содержит 199 отечественных и 107 иностранных источников.

Личное участие автора

Выбор экспериментальных животных, сроков и дозировки воздействия ХГ, проведение собственно экспериментов, выведение животных из экспериментов проходили при непосредственном участии диссертанта. Лично диссертантом осуществлялось приготовление криостатных срезов, постановка люминесцентно-гистохимических реакций по методам Кросса, Эвена, Роста и Фалька-Хилларпа, описание люминесцентной морфологии тимуса, была проведена цитоспектрофлуориметрия с последующей статистической обработкой полученных данных. Выбор иммуногистохимических маркеров, микроскопия препаратов, фотографирование, морфометрия также проводились автором лично. Написание глав диссертационного исследования, подготовка материалов диссертации к публикации осуществлялись автором самостоятельно.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнялась в 2008-2014 гг. в научной лаборатории кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова» согласно государственному плану по теме «Гистохимия биогенных аминов в

морфофункционалыюм состоянии органов и тканей в норме и эксперименте» (№ 0120. 0851887 от 10.09.2008 г.).

Объектом исследования служил тимус 100 белых лабораторных мышей-самок одного возраста и одинаковой массы (25-30 г), содержавшихся в обычных условиях при естественном освещении и сбалансированном рационе питания.

Животные были разделены на три группы: I - интактная группа (п = 20);

II - контрольная (п = 40), которым внутримышечно вводили 0,02 мл физраствора на животное 2 раза в неделю; III - опытная с внутримышечным введением 2 Международные единицы (МЕ)/животное раствора ХГ 2 раза в неделю: III А — введение ХГ в течение 1 недели (п = 10); III Б — введение ХГ в течение 2 недель (п = 10); III В — введение ХГ в течение 3 недель (п = 10);

III Г — введение ХГ в течение 4 недель (п = 10).

Введение препаратов проводилось с соблюдением правил асептики и антисептики. Все процедуры по уходу за мышами осуществляли согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» («Приказ МЗ РФ от 19.06.2003 г. № 267») и в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях».

Экспериментальный материал забирался в одно и то же время суток с 16 до 18 часов, в феврале — марте. Тимус извлекался непосредственно после декапитации животных, производилась его фиксация в 10% растворе формалина с последующей заливкой в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм были окрашены общими морфологическими, а также иммуногистохимическими методами, часть органа замораживали для последующего приготовления криостатных срезов и постановки люминесцентно-гистохимических реакций.

Методы исследования

1. Окраска гематоксилином и эозином применялась для общей гистологической характеристики структур тимуса.

2. Для контроля состояния кислых мукополисахаридов в тучных клетках тимуса, а также определения степени их дегрануляции срезы окрашивались полихромным толуидиновым синим по Унна.

3. Люминесцентно-гистохимический метод Фалька-Хилларпа в модификации Е. М. Крохиной. Этот метод применяется для выявления в структурах тимуса биогенных аминов (БА): катехоламинов (КА) и серотонина (CT).

4. Люминесцентно-гистохимический метод Кросса, Эвена, Роста. Данный метод применяется для выявления клеток, содержащих гистамин (Г).

5. Для выражения количественных уровней катехоламинов, серотонина и гнетам ина в микроструктурах тимуса использовался метод цитоспектрофлуориметрии с использованием люминесцентной

фотометрической насадки ФМЭЛ-1А. Интенсивность люминесценции нейроаминов измерялась в следующих структурах: люминесцирующих гранулярных клетках (ЛГК) на границе коркового и мозгового вещества, ЛГК коркового вещества, в лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек тимуса, тучных клетках и в варикозных расширениях адренергических нервных волокон в условных единицах флуоресценщш (усл. ед.). Для получения представления об интенсивности синтеза, распада или задержки серотонина в клетках использовался серотониновый индекс (соотношение серотонина и катехоламинов).

6. Корреляционный анализ проводился с целью выявления статистической взаимосвязи между показателями интенсивности люминесценции БА в структурах долек тимуса.

7. Иммуногистохимический метод для выявления С04-клеток (NovoCastra, Великобритания).

8. Иммуногистохимический метод для выявления С08-клеток (NovoCastra, Великобритания).

Иммуногистохимические методы для выявления CD8+ и CD4+ были проведены в лаборатории на базе патологоанатомического отделения ГАУЗ «Республиканская клиническая больница Министерства здравоохранения Республики Татарстан».

9. Иммуногистохимический метод (George L. Kumar, Lars Rudbeck, 2011) для выявления клеток, экспрессирующих маркеры Ki-67, р-53, bcl-2.

В работе применялись моно- и полпклональные антитела:

1) моноклональные антитела к маркеру клеточной пролиферации Ki-67, клон ММ-1 (NovoCastra, Великобритания);

2) поликлональные антитела к антиапоптотическому белку bcl-2 (Santa Cruze, США);

3) поликлональные антитела к белку апоптоза р-53 (Santa Cruze, США).

Иммуногистохимические исследования проводили в соответствии со

стандартными протоколами на базе патологоанатомического отделения БУ «Республиканский клинический онкологический диспансер» Министерства здравоохранения и социального развития Чувашской Республики. Срезы тимуса толщиной 3 мкм наносили на предметные стекла, обработанные L-polysine, которые высушивали при комнатной температуре в течение суток. Окрашивание проводили ручным и аппаратным способами с использованием иммуногистохимических автоконтейнеров AUTOSTAINER-360 (THERMO, Великобритания) и Leica BOND-MAX (Германия).

Для постановки иммуногистохимических реакций готовились срезы тимуса мышей-самок. Блокада эндогенной пероксидазы осуществлялась охлажденным 3% раствором Н2О2 на протяжении 10 мин. С целью восстановления клеточной антигенной структуры после фиксации в формалине и заключения в парафин материала в течение 20 мин гистологические срезы выдерживали на водяной бане в 0,01 М цитратном буферном растворе (pH 6,0) при 95 °С. Инкубацию с первичными антителами

Ki-67, p-53, bcl-2 проводили при комнатной температуре в течение часа. Для визуализации продуктов иммунной реакции использовали стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод («Dako», LSAB+Kit,HRP), в качестве красящего соединения применяли раствор диаминобензидина(«Dako», Liguid DAB+), докраска ядер осуществлялась гематоксилином. В качестве негативного контроля использовали срезы, на которые наносили вторичные антитела без нанесения первичных антител. Положительной экспрессией белка Ki-67, р-53 считалось наличие специфической коричневой окраски ядер клеток; положительной экспрессией bcl-2 — специфического окрашивания мембран клеток в коричневый цвет .Индекс Ki-67 и р53 вычисляли как соотношение количества специфически окрашенных ядер к количеству всех ядер в 10 полях зрения и выражали в процентах.

Компьютерная морфометрия. Цифровые снимки микропрепаратов получены с применением системы архивирования на базе микроскопа Leica DM4000B с использованием цветной фотокамеры Leica DFC 425 и лицензионной программы Leica Application Sute 3.6.0. Фотографии для проведения программных морфометрических измерений были получены при увеличении микроскопа хЮО и х400. Для количественных замеров интенсивности ядерной иммуногистохимической реакции выполнен подсчет числа окрашенных ядер к числу неокрашенных и перевод значений в проценты (http://imtmicroscope.fi/immunoratio/).

10. Морфометрический анализ заключался в измерении площадей коркового и мозгового веществ долек тимуса (увеличение объектива 10 и окуляра 10) под световым микроскопом МИКМЕД-5 с окулярным микрометром МОВ-1 и с использованием программы «Sigma Scan Pro 5.0». О количественном распределении клеток судили по подсчету их в 10 полях зрения при увеличении объектива 40 и окуляра 10.

Статистическая обработка полученных цифровых данных проводилась с помощью программы Microsoft Office Excel с оценкой статистической значимости различий средних величин с использованием, в зависимости от результатов проверки вариационных рядов на нормальность распределения t-кригерия Стьюденга или критерия Манна-Уитни. Оценка различий качественных признаков проводилась с использованием z-критерия. Значимость различий показателей контрольных (введение физраствора) и опытных групп (введение ХГ) между собой и по сравнению с интакгной группой: * — различия с контрольной группой статистически значимы, р < 0,05; **- различия с контрольной группой статистически значимы, р < 0,001; р„— различия с интактной группой статистически значимы, р < 0,05 и р < 0,001.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Морфологическая характеристика тимуса

Тимус мышей интактной группы при окраске гематоксилин-эозином имеет дольчатое строение, дольки имеют овально-полигональную форму. В дольках различимы более светлое мозговое вещество, в котором лимфоциты расположены рыхло, и более темное, с плотным расположением лимфоцитов, корковое вещество в сети из эпителиальных клеток.

На всех сроках введения ХГ средняя площадь мозгового вещества долек тимуса опытных животных превышает таковую контрольных и интактных мышей. Так, средняя площадь мозгового вещества долек тимуса мышей, контрольной и опытных групп составляет 222,4+52,4 мкм2 и 723±26,6 мкм2, для 2-й и 3-й недель введения ХГ равна 223,3+34,4 мкм2 и 905±22,2 мкм2 и 229,4±48,6 мкм2 и 866,2±78,8 мкм2 соответственно, для 4-й неделе введения ХГ - 220,5+91,4 мкм2 и 320,4±32,9 мкм2 (р < 0,05).

Характеристика тучных клеток тимуса

При введении ХГ в течение 1, 2, 3, 4 недель количество тучных клеток в поле зрения в паренхиме тимуса мышей составляет 2,8±0,3; 3,0±0,5; 3,6±0,4; 4,0+0,7 клеток соответственно, а в соединительнотканных корковых перегородках 4,8+0,8; 4,8+0,6; 5,6+0,6 и 6,4+0,9 клеток соответственно.

Окраска срезов полихромным толуидиновым синим по методу Унна показала, что при введении ХГ увеличивает процентное содержание тучных клеток с Р2 и р3 метахромазией, и их количество зависит от срока воздействия гормона (Рисунок 1).

В соединительнотканных корковых перегородках тимуса мышей интактной группы 23% общего числа тучных клеток можно отнести к Тг-формам, в паренхиме тимуса - 29%. Встречаются полностью дегранулированные клетки (Тз-форма): 23% в корковых перегородках, 29% в паренхиме.

При введении ХГ через 1 неделю преобладают дегранулированные тучные клетки Тг (35% в септе и 24% в паренхиме). Увеличивается число тучных клеток с гранулами, расположенными внутри клеток. В септе число клеток То-формы составило 13%, в паренхиме — 35%. При введении ХГ в течение 3 недель по степени дегрануляции преобладают Тз-формы с разорванной цитолеммой и рассеянными гранулами (67% в корковых перегородках (р < 0,01) и 49% в паренхиме). Длительное введение ХГ в течение 4 недель сопровождается увеличением количества Тг-форм с признаками дегрануляции (по 39% в корковой перегородке и в паренхиме), количество Тз-форм уменьшается при сравнении с данными 3-недельного эксперимента (42% в септе и 36% в паренхиме).

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

Рисунок 1 - Характеристика популяции тучных клеток соединительнотканных корковых перегородок тимуса мышей интактной, контрольной и опытной групп, %. А - по методу Унна; Б - по степени дегрануляции. * - р < 0,05, ** - р < 0,001

Нейроаминсодержащие структуры тимуса

Поступление ХГ в течение четырех недель в дозировке 2МЕ/мышь оказывает на нейроаминсодержащие клетки тимуса однонаправленное воздействие, которое не зависит от типа клеток, но зависит от конкретного биогенного амина. Так, во всех клетках, содержащих катехоламины и серотонин: тучных, ЛГК коркового вещества, ЛТК на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса, лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек тимуса, наблюдается уменьшение интенсивности люминесценции серотонина с пиками снижения на 1-й и 3-й неделях.

Серотониновый индекс у интактных животных в нейроаминсодержащих клетках колеблется от 0,90 до 0,95. Обращает на себя внимание небольшое превалирование серотонина над катехоламинами в клетках тимуса на 1-й, 2-й, 3-й, 4-й неделях введения ХГ.

Под влиянием ХГ в тимусе мышей наблюдаются реципрокные отношения между интенсивностью люминесценции гистамина и катехоламинов, а также гистамина и серотонина во всех клетках, содержащих гистамин, катехоламины и серотонин (Рисунок 2).

Опытная группа

Контрольная группа

т-——?т2Э- 6 09 6^39

4^83 * ч • ч3,58

зЦГ 3^4 ^ 3,43

2,65

10 8 6 4 2 0

1 нед 2 нед 3 нед 4 нед

Опытная группа

3,47 "А

-алз-

2,88

1 нед 2 нед 3 нед 4 нед

«Ж 3.25 __3,12

.3,54 ' ¿3,4

3,39

10 8 6 4 2 О

8,1 8,45 -А- -¥ 7,85

- 7,8 7,85 —»7,9

3,7 3,75 3,69 3,85

А- - - - А- - - " "Ж

1 нед 2 нед 3 нед 4 нед

Контрольная группа

10 8 6 4 2 О

12 10 8 6 4 2 О

8,2 -#- -♦- СП

8,1 7,95 — ■ - 7 ?

3,35 3,35 3,3 3,65

А - - - - -А - - - А - - - А

1 нед 2 нед 3 нед ■ 4 нед

9,55 9,35 9,6 9,6

—

5,15 8,85 8,89 8,15

2.95

2,25

-1-1 1

1 нед 2 нед 3 нед 4 нед

ка —■--СТ - --а.-- - г

Рисунок 2 — Интенсивность люминесценции катехоламинов, серотонина и гистамина в ЛГК в тимусе мышей опытной и контрольной групп, усл. ед. х102. А - ЛГК между корковым и мозговым веществом долек тимуса, Б - лимфоциты мозгового вещества долек тимуса, В - лимфоциты коркового вещества долек тимуса

Обращает на себя внимания сходный характер изменения силы корреляционной связи по интенсивности катехоламинов и серотонина между тучными клетками и ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса на 3-й неделе введения ХГ. Для интактных животных она положительная (коэффициент корреляции для катехоламинов - 0,30; для серотонина - 0,25), на 3-й неделе связь в обоих случаях заметно усиливается

(коэффициент корреляции составляет 0,76 и 0,98 для катехоламинов и серотонина соответственно).

Иммуногистохимия тимуса

В тимусе интактных мышей СБ4+ клетки располагаются преимущественно в корковом веществе долек тимуса, их количество составляет 2,20±0,01 клетки в поле зрения, в то время как в мозговом веществе этих клеток обнаруживается 1,20±0,01 клетки в поле зрения. На границе коркового и мозгового вещества долек тимуса СГ)4+ клетки единичны (0,2010,01 клеток в поле зрения). Поступление в организм мышей ХГ приводит к увеличению количества во всех морфофункциональных зонах тимуса СБ4+ клеток в поле зрения, с достижением максимальных значений на сроке 4 недели (Таблица 1).

Таблица 1 - Количество С04-позитивных клеток в морфофункциональных _зонах долек тимуса мышей интактных и опытных групп (М±ш)_

Морфофункциональная зона долек тимуса Группа животных

Интакгные Срок введения ХГ

1-я неделя 2-я неделя 3-я неделя 4-я неделя

Корковое вещество долек 2,2+0,01 5,2±0,03* 5,1±0,05* 5,6±0,5* 5,4±0,3*

Мозговое вещество долек 1,2+0,01 4,6+0,1* 2,8+0,6* 2,8+0,1* 9,6+0,6*

Граница между КВ МВ 0,2+0,01 0,6+0,01 0,7+0,01 1,8+0,01* 3,0+0,2*

* — различия с интактной группой статистически значимы, р < 0,05.

В корковом веществе долек тимуса интактных животных количество CD8+ клеток составляет 0,60+0,05 клетки в поле зрения, в мозговом веществе долек и на границе коркового и мозгового вещества 2,00+0,20 и 1,40+0,09 клеток в поле зрения соответственно (Таблица 2).

Таблица 2 — Количество С08-позитивных клеток в морфофункциональных _зонах долек тимуса мышей интактных и опытных групп (М+т)_

Морфофункциональная зона долек тимуса Группа животных

Интактные Срок введения ХГ

1-я неделя 2-неделя 3-я неделя 4-я неделя

Корковое вещество долек 0,6+0,05 2,4±0,4* 3,5±0,5* 5,2±0,6* 8,0+0,4*

Мозговое вещество долек 2,0±0,2 8,8±0,9* 7,9±0,6* 6,0+0,3* 7.6±0,03*

Граница между КВ МВ 1,4±0,09 0,6±0,05 2,8±0,2 3,6±0,5* 3,4±0,05*

* - различия с интактной группой статистически значимы, р < 0,05

В корковом веществе долек тимуса мышей, независимо от экспериментальной группы, содержится большее количество клеток, экспрессирующих белок Кь67 (Рисунок 3).

Введение ХГ обусловливает снижение пролиферативной активности клеток как в корковом, так и в мозговом веществе долек тимуса, за

исключением 1-недельного срока эксперимента. Поступление ХГ в течение двух, трех и четырех недель приводит к снижению экспрессии белка ¥л-61 клетками мозгового и коркового вещества долек тимуса мышей (Таблица 3).

Таблица 3 - Экспрессия Кл-67 в клетках тимуса экспериментальных мышей, %

Экспрессия И-67 в корковом Экспрессия Ю-67 в мозговом

веществе долек тимуса. % веществе долек тимуса, %

Срок Интактные Получавшие ХГ Интактные Получавшие ХГ

1 неделя 53,0+1,7 70,4+2,5** 25,8±0,8 36,2+2,3*

2 недели 54,2+2,4 40,8+2,0* 24,4+1,2 23,4+1,8

3 недели 51,3±2.0 33,5±1,8* 26,6±1,3 19,9±1,3*

4 недели 56,1+2,7 27,3+1,9* 28,9+1,5 16,9+1,9**

* - различия с интактной группой статистически значимы, р < 0,05.

** — различия с интактной группой статистически значимы, р < 0,001.

У интактных животных мышей в тимусе нами отмечены различия в экспрессии белка Ьс1-2: в корковом веществе обнаруживается 6,2±1,3 клетки в поле зрения (при увеличении х400), в то время как в мозговом веществе долек тимуса они нами не выявлены. При введении ХГ в течение 1 недели количество этих клеток возрастает до 7,3±0,6 штук в поле зрения. Максимальное число изучаемых клеток фиксируется на 2-недельном сроке введения ХГ и составляет 9,1 ±0,5 штук в поле зрения. В последующем количество клеток, экспрессирующих белок Ьс1-2, возвращается к исходному уровню и составляет 6,1 ±0,4 и 6,2±0,3 штук в поле зрения для сроков введения ХГ 3 и 4 недели соответственно.

Количество р-53 клеток неодинаково в тимусе экспериментальных мышей. В корковом веществе у интактных животных количество клеток, экспрессирующих белок р-53, составляет 3,8±0,3 штук в поле зрения (при увеличении х400). Через одну неделю после введения ХГ количество р-53-позитивных клеток незначительно снижается до 3,6±0,5 штук в поле зрения. Через две недели воздействия количество клеток, экспрессирующих р-53, резко увеличивается, достигая до 12,0±0,9 штук в поле зрения. Эта тенденция сохраняется через три и четыре недели поступления ХГ: 18,2+0,8 и 25,2±1,3 штук в поле зрения соответственно (Рисунок 4).

Итак, в ходе исследования установлено существование морфофункциональных взаимосвязей нервной, иммунной и эндокринной систем. При длительном введении в организм мышей-самок гормона хорионического гонадотропина в дозе 2 МЕ/животное в течение одной, двух, трех, четырех недель происходят изменения структурно-функционального состояния тимуса, которые затрагивают количественные изменения тучных, С04+, СЭ8+ клеток, а также отражаются на процессах пролиферации и апоптоза Т-лимфоцитов. Эти изменения сопровождаются волнообразными колебаниями интенсивности люминесценции катехоламинов, серотонина и гистамина во всех клетках тимусной дольки, содержащих эти нейроамины, причем между интенсивностью люминесценции гистамина, с одной стороны,

и интенсивностью люминесценции катехоламинов и серотонина — с другой, стороны наблюдается реципрокный характер.

интактная группа введение ХГ в течение 4 недель

Рисунок 3 - Тимус мыши. Иммуногистохимическая реакция, выявляющая маркер Ki-67 в корковом веществе долек тимуса, ув. X 400 Микроскоп Leica DM4000B.

Рисунок 4 - Тимус мыши. Позитивная реакция к р-53 в клетках коркового вещества долек. Иммуногистохимическая реакция к р-53, ув. Х400. Микроскоп

Leica DM4000B.

Иммуномодулирующее действие ХГ на примере тимуса заключается в снижении интенсивности в нем пролиферативных процессов, увеличении экспрессии в клетках белка апоптоза р-53 и возрастании количества CD4+ и CD8T клеток в корковом веществе долек тимуса, причем выраженность этих изменений прямо пропорциональна сроку воздействия гормона. Количественные и качественные характеристики тучных клеток, которые принимают непосредственное участие в обеспечении лимфоцитов катехоламинами, серотонином и гистамином, напрямую зависят от срока поступления в организм ХГ. Изменение содержания нейромедиаторных биогенных аминов в ЛГК, тучных клетках, лимфоцитах, сопровождающиеся изменением процессов пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов подтверждают значимость роли этих биогенных аминов в адаптации тимуса к внешним и внутренним воздействиям.

ВЫВОДЫ

1. У мышей-самок через 1, 2, 3, 4 недели введения хорионического гонадотропина два раза в неделю в концентрации 2МЕ/животное выявлено увеличение площади мозгового вещества долек тимуса, сопровождающееся увеличением количества тучных клеток, С04- и С08-позитивных клеток во всех зонах тимуса и снижением содержания катехоламинов, серотонина и повышением содержания гистамина.

2. Введение хорионического гонадотропина на сроках 1, 2, 3, 4 недели приводит к увеличению количества тучных клеток на единицу площади, усилению степени их метахромазии и дегрануляции, а также к снижению содержания катехоламинов и серотонина в 2,7; 1,5; 4,6 и 2,5 раз (р < 0,001) соответственно к срокам введения по сравнению с показателями интактной группы. Содержание гистамина в тучных клетках, наоборот, возрастает в 2,1; 1,5; 2,4 и в 1,3 раз (р < 0,001) соответственно срокам проведения эксперимента в сравнении с аналогичными показателями интактной группы.

3. При введении хорионического гонадотропина происходит однонаправленное снижение содержания катехоламинов и серотонина во всех биоаминосодержащих клетках тимусной дольки: люминесцирующих гранулярных клетках, лимфоцитах коркового и мозгового вещества, а также в адренергических нервах в течение всего эксперимента. Содержание гистамина, наоборот, возрастает в клетках долек тимуса с пиками резкого повышения на 1-й и 3-й неделях введения.

4. Введение хорионического гонадотропина через 1, 2, 3, 4 недели приводит к увеличению С04+ и СБ8+ клеток во всех зонах долек тимуса с достижением максимальных значений на 4-й неделе. Причем в корковом веществе долек тимуса количество С08-позитивных клеток увеличивается прямо пропорционально сроку воздействия гормона.

5. Действие хорионического гонадотропина в течение 1 - 4 недель в тимусе мышей сопровождается увеличением количества клеток, экспрессирующих белки-регуляторы апоптоза, и уменьшением количества клеток, экспрессирующих маркер пролиферации, и эти эффекты более выражены в корковом веществе долек тимуса.

6. Введение хорионического гонадотропина в течение месяца оказывает иммуномодулирующее действие на организм лабораторных мышей: а) приводит к снижению пролиферативных процессов во всех зонах долек тимуса; б) запускает процессы дифференцировки Т-лимфоцитов при непосредственном участии тучных клеток и адренергических нервов, обеспечивающих дольку тимуса нейромедиаторными биогенными аминами.

РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При проведении практических занятий по медицинской биологии,

гистологии, иммунологии в образовательных учреждениях высшего

профессионального медицинского образования следует подчеркивать

роль нейроиммуноэндокринной системы в процессах адаптации организма к внешним и внутренним изменениям.

2. Проведение исследований на животных для изучения иммунных или обменных процессов следует дополнять данными о биогенных нейроаминах, полученных с помощью доступных в исполнении и малозатратных методов люминесцентной гистохимии, чтобы получить многомерное представление о происходящих процессах.

3. При исследовании роли биогенных аминов в тканях и органах в эксперименте желательно обращать внимание параллельно на несколько биогенных аминов, так как изменения, сопровождающиеся их перераспределением между клетками, а также между клетками и их микроокружением, являются свидетельством вовлечения нейроиммуноэндокринной системы в регуляторные процессы жизнедеятельности организма.

4. Данные о том, что введение хорионического гонадотропина в лечебной дозе мышам-самкам вовлекает в изменения структурно-функционального статуса тимуса биогенные нейроамины (катехоламины, серотонин, гистамин) могут быть полезны при чтении лекций врачам-гинекологам для формирования и укрепления у них понятия о нейроиммуноэндокринной системе и взаимосвязях ее компонентов в живом организме.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аюпова (Ялалетдинова), Л. Р. Изучение морфологических параметров структур тимуса, селезенки и яичников под воздействием иммуномодуляторов и гормонов / С. А. Ястребова, Е. М. Лузикова, Л. Р. Аюпова (Ялалетдинова) [и др.] / Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2010. - № 1. - С. 61.

2. Аюпова (Ялалетдинова), Л. Р. Изучение морфологических параметров структур тимуса, селезенки и яичников под воздействием иммуномодулятора галавита и гормона гонадотропина / Л. Р. Аюпова (Ялалетдинова), С. А. Ястребова // Сборник трудов 44-й научной студенческой конференции. - Чебоксары, 2010. - С. 267-268.

3. Аюпова (Ялалетдинова), Л. Р. Морфологическая характеристика структур тимуса, селезенки и яичников под воздействием гонадотропина и галавита / С. А. Ястребова, Л. Р. Аюпова (Ялалетдинова), Т. Л. Смирнова [и др.] // Современные проблемы естественнонаучных исследований. — Чебоксары, 2011. - С. 6-8.

4. Аюпова (Ялалетдинова), Л. Р. Морфометрический анализ структур тимуса и яичников под воздействием гонадотропина / С. А. Ястребова, В. Е. Сергеева, Л. Р. Аюпова (Ялалетдинова) // Морфология в теории и

практике: материалы всероссийской научной конференции. - Чебоксары: Изд-во Чуваш, ун-та, 2012. - С. 296-297.

5. Ялалетдинова, JI. Р. Гистохимические исследования популяции тучных клеток тимуса и яичников при введении гонадотропина / J1. Р. Ялалетдинова, С. А. Ястребова // Сборник тезисов по материалам 86-ой Всероссийской студенческой научной конференции памяти чл.-корр. АН РТ, проф. И.Г. Салихова и 15-й Всероссийской медико-исторической конференции, посвященной 200-летию клинического медицинского образования в Казани. — Казань: Изд-во Казанского государственного медицинского университета, 2012. — С.241—242.

6. Ялалетдинова, JL Р. К вопросу о характеристике тучпо-клеточной популяции при перераспределении гистамина в лнмфондных органах лабораторных животных / В. С. Гордова, О. А. Шатских, JI. Р. Ялалетдинова [и др.] // Аллергология и иммунология. - 2013. -Т. 14, №3.-С. 191.

7. Ялалетдинова, JI. Р. Иммуногистохимия С04-клеток яичников при длительном воздействии хорионического гонадотропина / JI. Р. Ялалетдинова, В. Е. Сергеева, С. А. Ястребова // Международный научно-исследовательский журнал. — Екатеринбург. - 2013. - № 6 (13). - С. 69-71.

8. Ялалетдинова, JI. Р. СВ4-позитивные клетки тимуса при введении хорионического гонадотропина / JI. Р. Ялалетдинова, С. А. Ястребова // Вестник Чувашского университета. — 2013. — № 3. — С. 572—577.

9. Ялалетдинова, JI. Р. Реакция С04-позитивных макрофагов селезенки на введение Т-активина / С. А. Ястребова, Т. JI. Смирнова, JI. Р. Ялалетдинова // Вестник Чувашского университета. — 2013. -№ 3. - С. 578-580.

10. Ялалетдинова, Л. Р. Морфометрические показатели СВ8-позитивных структур тимуса при введении хорионического гонад отропина / Л. Р. Ялалетдинова, В. Е. Сергеева, С. А. Ястребова // Современные проблемы естественнонаучных исследований: сборник научных статей — Чебоксары: Изд-во Чуваш, гос. пед. ун-та, 2014. - С.66-69.

11. Ялалетдинова, Л. Р. Эффект хорионического гонадотропина на СД8-позитивные структуры вилочковой железы / Л. Р. Ялалетдинова, В. Е. Сергеева, С. А. Ястребова // Фундаментальные исследования. — 2014. - № 7 (часть 5). - С. 1075-1079.

12. Ялалетдинова, Л. Р. СБ4-позитивные клетки яичников при введении хорионического гонадотропина / Л. Р. Ялалетдинова // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: материалы Межрегион, науч.-практ. конф., поев. 40-летию кафедры патофизиологии (Чебоксары, 26 сентября 2014 г.). — Чебоксары: Изд-во Чуваш, ун-та, 2014.-С. 130-133.

13. Ялалетдинова, Л. Р. Адаптационные реакции макрофагов лимфоидных органов лабораторных животных на введение

иммуномодуляторов / В. С. Гордова, О. А. Шатскпх, Л. Р. Ялалетдинова [и др.] // Аллергология и иммунология. — 2015. -Т. 16, №. 3-С. 312-313.

14. Ялалетдинова, Л. Р. Пролиферативные процессы в структурно-функциональных зонах тимуса в эксперименте / Л. Р. Ялалетдинова, В. С. Гордова, // Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования: материалы Междунар. науч.-практ. конф. (часть II). - Курск. -2015.-С. 291-294.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Г — гистамин;

КА - катехоламины;

КВ — корковое вещество;

ЛГК - люминесцирующие гранулярные клетки;

ЛГК КВ — люминесцирующие гранулярные клетки коркового вещества;

ЛГК между КВ и МВ — люминесцирующие гранулярные клетки между

корковым и мозговым веществом;

ЛКВ — лимфоциты коркового вещества;

ЛМВ — лимфоциты мозгового вещества;

МВ — мозговое вещество;

СТ - серотонин;