Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональная характеристика органов иммунной системы, периферической крови и печени мышей после имплантации криоконсервированных фетальных тканей человека

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональная характеристика органов иммунной системы, периферической крови и печени мышей после имплантации криоконсервированных фетальных тканей человека"

На правах рукописи

Рябчиков Олег Павлович

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОРГАНОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ, ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ ПОСЛЕ ИМПЛАНТАЦИИ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ФЕТАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ ЧЕЛОВЕКА

03. 00. 25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 2004

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН

Научный консультант - доктор биологических наук, профессор З.С. Хлыстова

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Л.К. Романова

доктор медицинских наук, профессор В.Э. Торбек доктор медицинских наук, профессор В.В. Яглов

Ведущая организация:

Московский медико - стоматологический университет

Защита состоится <<^Н»—------ 2004г. в 14 00 часов на

заседании диссертационного совета (Д.001.004.01) ГУ НИИ морфологии человека РАМН по адресу. 117418, Москва, ул. Цюрупы, д.З

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ морфологии человека РАМН

Автореферат разослан « »-2004г.

Учёный секретарь дисссертационного совета

кандидат медицинских наук Л.П. Михайлова

Список сокращений

ЛИТ- акцидентальная инволюция тимуса АМГФ- а 2-микроглобулин фертильности АФП- а -фетопротеин

БОЕ-э - бурстообразующая единица (наиболее ранний предшественник эритропоэза)

Г- КСФ- гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ЕАС-РОК- клетка, образующая розетку с комплексом эритроцит-антитело-

комплемент (например, В-лимфоцит)

Е-РОК- клетка, образующая розетку с эритроцитами барана (например, Т-

лимфоцит)

Ig- иммуноглобулин

НОР(ЮР)- инсулиноподобные факторы роста КОЕ-ГМ- колониеобразующая единица грануломоноцитопоэза КОЕ-ГЭММ- колониеобразующая единица гранулоцито-эритро-моноцито-мегакариоцитопоэза

КОЕ-с- колониеобразующая единица эритропоэза КОЕ-с- колониеобразующая единица в селезёнке Кон-А- конканавалин - А (Т-клеточный митоген)

КПФТЧ-комплексный препарат фетальных тканей человека, состоящий из клеток гипоталамуса, селезёнки, печени, надпочечников, матки, простаты, гонад, плаценты

ЛПС- липополисахарид (В-клеточный митоген)

ЛГ- лютеинизирующий гормон

НК-натуральный киллер

НРГ-неспецифический реактивный гепатит

ПАМГ-1-плацентарный а 1-микроглобулин

ПлЛ- плацентарный лактоген

РОР-2,5 дифенилоксазол

РОРОР- 1,4-ди-5 фенил-2оксазолил бензол

ПСКК- плюриопотентная стволовая кроветворная клетка

ПСР-ДНК-полимеразная цепная реакция

ПТЛ-2- предшественник Т-лимфоцита второго типа

РБТЛ-реакция бласттрансформации лимфоцитов

РНП-рибонуклеопротеиды

СТГ-соматотропный гормон

сТ-3- свободный трийодтиронин

сТ-4- свободный тироксин

СФП-суспензия фетальной печени

ТБГ-трофобластический гликопротеид

Т кр.У- непараметрический Т-критерий достоверности Уайта

ТТГ - тиреотропный гормон

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ ВКЬЛИОТРКА

ТФР- ß(TGF- ß) трофобластический фактор роста ß

ФК- фетальные клетки

ФНО (TNF)- фактор некроза опухолей

ФРГ (HGF)- фактор роста гепатоцитов

ФСГ-фолликулостимулирующий гормон

ФТ-фетальные клетки

ФТС (FCS)- фетальная сыворотка телёнка

ФТЧ-фетальные ткани человека

хАКТГ- хорионический адренокортикотропный гормон хГЧ-хорионический гонадотропин человека ЭП-экстракт плаценты ЭФР (EGF)- эпидермальный фактор роста

Актуальность проблемы. Метод тканевой терапии был предложен и обоснован выдающимся отечественным ученым В. П. Филатовым в 1933г. (В.П. Филатов 1943, 1948). Многочисленные клинические и экспериметальные исследования по изучению действия тканевых препаратов на организм человека и животных показали, что тканевая терапия приводит к изменению реактивных свойств организма (Н.А. Пучковская, 1975).

Современный этап развития учения о тканевой терапии характеризуется тем, что в клинике активно используются клеточные препараты из

различных фетальных тканей человека и животных (живые, криоконсервированные и лиофилизированные клетки) (B.C. Репин, Г. Т. Сухих 1998; Г.Т. Сухих, А.Н. Ерин, 1996,1998; F. Smid, 1983, 1992). Интерес к фетальным тканям (ФТ) и клеткам (ФК) объясняется тем, что они обладают большой пластичностью, связанной с высоким содержанием стволовых и полустволовых элементов, включают в себя значительное количество ростовых факторов и стадиоспецифических антигенов (В.И. Говалло 1998; Г.Т. Сухих, 1998).

При клиническом применении различных препаратов фетальных тканей человека и животных в более чем сорока клиниках Российской Федерации и Украины установлено, что они эффективны при лечении различных заболеваний желудочно-кишечного тракта, сердечно-сосудистой, нервной, эндокринной, костной и мышечной систем, кожи, органов женской половой сферы, а также при некоторых онкологических заболеваниях (Г.Т. Сухих, А.Н. Ерин, 1996, 1998). Особого внимания заслуживают данные немецкого ученого F. Smid (1983,1992 ), который с успехом применял лиофилизированные ткани животных при лечении 141 заболевания человека, используя, как правило, сочетание трех различных тканей.

В настоящее время сложилась точка зрения, что при действии ФТ и ФК проявляются специфические и неспецифические механизмы. К первым относится заместительный эффект живых ФК и ФТ, когда они определенное время функционируют в организме реципиента, выполняя при этом свои специфические функции, характерные для того или иного типа клеток (В.И. Говалло, 1996; B.C. Репин, 1998; Г.Т. Сухих, 1998). Неспецифичекий эффект действия ФТ и ФК связывают прежде всего с активацией иммунной системы реципиента. При этом возрастают защитные силы организма, сязанные с повышением уровня специфических и неспецифических иммуноглобулинов, ростом фагоцитарной активности лейкоцитов (Д.С. Щастный,1950; Е.Е. Шулюмова, 1962; З.И. Дорогая, 1963; К.А. Федько, 1965). Кроме этого активированная иммунная система в совокупности с многочисленными ростовыми факторами и цитокинами способствует усилению процессов регенерации различных клеток и тканей (А.Г.Бабаева,Е.А.Зотиков,1987;Н.В Васильев, 1998). Некоторые авторы при этом подчеркивают, что, учитывая сложность связей между иммунной системой и другими интегрирующими

системами организма (нервной, эндокринной), реакцию иммунной системы следует считать специфической (Н.В. Васильев, 1998).

Учитывая все вышеизложенное, а также тот факт, что иммунная система организма — это прежде всего ее органы (тимус, селезенка, красный костный мозг, в определенной степени печень и т.д. (НА Жарикова, 1979; Р.В. Петров, 1982 ; М.Р. Сапин, Л.Е. Этинген, 1996), реакция которых на введение ФК и ФТ практически не изучена, выбранная нами тема диссертационного исследования является актуальной.

Согласно постановлению 76 сессии Общего собрания РАМН (17 - 20 февраля 2004г.), принято решение: "Считать разработку клеточных технологий в различных областей медицины одним из приоритетных

направлений медицинской науки."

Цель и задачи исследования

Основной целью настоящей работы является изучение гистофизиологии органов иммунной системы, периферической крови и печени мышей линий Balb/c и СВА разного возраста после имплантации животным криоконсервированных препаратов фетальных тканей человека, с одновременным исследованием гормональной и морфологической характеристик данных прпаратов после их размораживания.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. исследовать морфофункциональное состояние тимуса, селезенки, красного костного мозга, периферической крови и печени 8-месячных мышей линии Balb/c на 7, 14, 42 и 64 сутки после однократной имплантации животным различных доз супензии феталыюй печени и экстракта плаценты человека;

2.определить иммуноморфологические параметры тимуса, селезенки, красного костного мозга 12-месячных мышей линии СВА после серийного (7 дней подряд) введения животным комплексного препарата фетальных

тканей человека;

3.изучить иммуноморфологическую перестройку тимуса, селезенки, красного костного мозга и периферической крови старых (двухлетних) мышей линии СВА на 7, 14, 42 и 64 сутки после однократной имплантации животным комплексного препарата фетальных тканей человека;

4. исследовать иммуноморфологические параметры тимуса, селезенки, красного костного мозга, периферической крови и печени 8-месячшлх мышей линии Balb/c после введения животным стандартного антигена - эритроцитов барана;

5. описать гистологическую картину размороженных криоконсервированных препаратов фетальных тканей человека: суспензии печени, экстракта плаценты и пупочного канатика, комплексного препарата фетальных тканей человека, состоящего из клеток гипоталамуса, печени, желудка, кишечника, селезенки, гонад, матки, простаты, надпочечников и

плаценты с параллельным определением уровня ряда гормонов и белков зоны беременности в вышеуказанных тканях,

6 дать иммуноморфологическую характеристику суспензии и отпечатков печени плода человека 16-22 нед развития до криоконсервирования

Научная новизна

Впервые в эксперименте изучены морфофункциональные изменения органов иммунной системы, крови и печени при введении мышам разного возраста ряда криоконсервированных препаратов фетальных тканей человека СФП, ЭП, КПФТЧ

Препараты ФТЧ в виде 2% раствора содержат пролактин, ЛГ, ФСГ, СТГ, ПлЛ, этрадиол, ТТГ, сТ-3, сТ-4, кортизон и тестостерон в концентрациях, соответствующих сывороточному уровню взрослого здорового человека, а содержание прогестерона, ПАМГ-1, АМГФ, АФП, ХГЧ превышает контрольные значения

Криоконсервированные при -196° С без криопротектора и размороженные при +37°С препараты ФТЧ характеризуются низкой жизнеспособностью клеток (1-8%) и относительно высокой сохранностью морфологической структуры различных клеток

При однократном введении субтолерантных и клинических доз ФТЧ, а также эритроцитов барана в тимусе животных развивается акцидентальная инволюция, стадийность которой (1-1У стадии) определяется тканевым составом и дозой ФТЧ, а также возрастом мышей и сроком от начала эксперимента

Имплантация подопытным животным различных доз криоконсервированных ФТЧ не приводит к видимым повреждениям в органах иммунной системы мышей и вызывает повышение спонтанной пролиферативной активности составляющих эти органы клеток

Однократное введение 8-мес мышам различных доз СФП и ЭП приводит к увеличению митогешшдуцированной пролиферации Т- и В-лимфоцитов селезенки, увеличению в ней количества плазматических клеток При этом общее число спленоцитов, относительное и абсолютное содержание Т- и В-лимфоцитов зависят от дозы ФТЧ

Однократное введение 8-мес мышам субтолерантных доз СФП и ЭП вызывает активацию костномозгового эритро- и в меньшей степени гранулопоэза, что обусловлено возрастанием в костном мозге количества Т-лимфоцитов

Однократная имплантация 8-мес животным субтолерантных доз СФП и ЭП инициирует развитие неспецифического реактивного гепатита слабой степени актизности, чего не наблюдается при введении указанных ФТЧ в клинической дозе

При однократной имплантации 24-мес. мышам КПФТЧ задерживается процесс возрастной инволюции тимуса и селезенки, а в костном мозге уменьшается абсолютное количество эритрокариоцитов и всех клеточных форм гранулопоэза, что связано с уменьшением в нем количества Т-лимфоцитов.

Дробное 7-дневное введение 12-мес. мышам субтолерантных доз СФП и ЭП приводит к развитию в селезенке животных картины иммунодефицитного состояния с резким уменьшением в ней количества Т- и В-лимфоцитов как на весь орган, так и на 1 мг массы органа.

Имплантация препаратов ФТЧ вызывает в сыворотке крови подопытных животных повышение уровня суммарных иммуноглобулинов, что является следствием активации В-лимфоцитов, плазмобластов и плазматических клеток иммунной системы организма.

Научно — практическая значимость

Установленные нами иммуноморфологические характеристики органов иммунной системы, периферической крови и печени после имплантации мышам различных препаратов ФТЧ могут быть положены в основу теории, объясняющей механизм действия ФТЧ на организм реципиента, т.к. в определенной степени дают научное обоснование этого метода тканевой терапии.

Полученные данные позволяют в известной степени прогнозировать состояние органов иммунной системы и печени человека после введения ему различных фетальных ксенотканей и при необходимости вносить коррективы в проводимую терапию.

Проведенные исследования показали, что однократное введение мышам различных доз СФП, ЭП и КПФТЧ не влияют токсически на тимус, селезенку, красный костный мозг, печень и периферическую кровь подопытных животных. При этом повышается функциональная активность Т- и В-лимфоцитов, спонтанная пролиферативная активность клеток, составляющих вышеуказанные органы иммуногенеза.

Полученные нами данные по состоянию тимуса, селезенки и красного костного мозга старых мышей после имплантации животным субтолерантных доз КПФТЧ делают возможным рекомендовать данный препарат ФТЧ в гериатрии, но в дозах меньших, чем субтолерантная для мышей.

Обоснована непригодность ежедневная (в течение 7 дней подряд) имплантация КПФТЧ в субтолерантной дозе.

Положения, выносимые на защиту

1.Размороженные после криоконсервирования без криопротектора фетальные ткани человека (ФТЧ) представляют собой комплекс, состоящий из 95-98% мертвых клеток, гормонов и белков зоны беременности, обладающих различной иммуномодулирующей активностью

2 Введенные мышам препараты ФТЧ и эритроциты барана вызывают в вилочковой железе подопытных животных морфологические изменения, характерные для I - ГУ стадий акциденталыюй инволюции тимуса.

3.Имплантация мышам ФТЧ и эритроцитов барана вызывает в селезенке подопытных животных изменения, характерные для каждого типа иммунизирующего агента.

4. После введения мышам ФТЧ и эритроцитов барана в печени животных развивается неспецифический реактивный гепатит минимальной степени активности.

З.Имплантация мышам препаратов ФТЧ и введение эритроцитов барана инициирует в красном костном мозге подопытных животных изменения клеточного состава, зависящие как от типа иммунизирующего агента, так и от возраста мышей.

Апробация полученных данных.

Результаты иследований доложены на конференции « Актуальные проблемы развития человека и животных» (Москва, 1981); IX Всесоюзном съезде АГЭ ( Минск, 1981); конференции « Гистогенез и регенерация» (Ленинград, 1986); ГУ Всесоюзной конференции по патологии клетки (Москва, 1987); Всесоюзном симпозиуме « Морфология и развитие органов иммунной системы» (Пермь, 1988); ГУ-м Всесоюзном симпозиуме по иммунологии репродукции (Киев, 1990); 27 ежегодном конгрессе Европейского общества педиатрической нефрологии (ФРГ, Гайдельберг, 1993); Международном симпозиуме « Иммунология репродукции» (Киев, 1993); ГУ Международной конференции « Традиционные и нетрадиционные методы оздоровления детей» (Москва, 1995); Международном симпозиуме « Фетальные клетки и ткани-клиническое применение» (Москва, 2000); Межинститутских ежегодных конференциях НИИ морфологии человека РАМН: «Актуальные вопросы современной гистопатологии «(Москва, 1990); «Актуальные вопросы современной гисто- и цитопатологии» (Москва, 1991); «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2002, 2003, 2004).

Научные публикации

Результаты исследований по теме диссертации опубликованы в 30 печатных работах, включающих 14 статей в центральных журналах.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 3 страницах машинописного текста и состоит из введения, обэзр^литературы, общей характеристики материала и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа

иллюстрирована таблицами,

микрофотографиями. Библиография включает зарубежный источник.

эи

отечественных и

рисунками,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика материалов и методов исследования

Экспериментальная часть работы выполнена на 190 мышах линий СВЛ и Ва1Ь/с обоих полов массой тела 25 - 30 гр. в возрасте 8, 12 и 26 месяцев от рождения, что примерно соответствует сроку жизни человека в 30, 40 и 70-75 лет. Сорок пять мышей линии СВА 5-6 месячного возраста были использованы для приготовления и тестирования кроличьей антисыворотки против общих популяций Т- и В-лимфоцитов мыши.

Препараты фетальных тканей человека (ФТЧ) были приготовлены по оригинальной методике сотрудниками Московского института биологической медицины под руководством члена-корреспондента РАМН, профессора Г.Т. Сухих и сохранялись до имплантации животным без криопротектора при -196°С. Комплексный препарат ФТЧ (КПФТЧ) представлял собой смесь клеток печени, селезенки, надпочечников, гипоталамуса, гонад, матки, простаты, желудка, толстого и тонкого кишечника, плаценты, полученных в стерильных условиях непосредственно после смерти плодов человека обоих полов в возрасте 16-22 нед. Другими препаратами ФТ служили экстракт плаценты ( ЭП ) и суспензия фетальной печени ( СФП ), приготовленные от плодов вышеуказанного возраста. Все работы с материалом от плодов человека были проведены согласно Рекомендациям ВОЗ, принятым МЗ Российской Федерации. Различные современные тест-системы, в том числе и ПСР-анализ, дали возможность исключить инфицировашюсть плодов и матерей, а тщательно собранный клинический анамнез отверг прием беременными женщинами медикаментозных препаратов, наличие у них каких-либо заболеваний и вредных привычек.

Для иплантации животным ФТЧ были выбраны две дозы препаратов: субтолерантная, которая меньше толерантной дозы для мышей в 4-5 раз (Б. 8гшс1, 1983, 1992) и клиническая, рассчитанная на 1 гр. массы мыши, исходя из количества ФТЧ на 1 кг веса человека (0,6ц1 2% раствора ФТЧ). При этом субтолерантная доза ФТЧ (12-18 2% растзора ФТЧ) превышала

клиническую в 20-30 раз. По данным литературы толерантным считается то количество препарата (вещества), которое не вызывает токсических явлений у животного (Б. 1983, 1992). Все расчеты были сделаны исходя из того, что

в клинике препараты ФТЧ обычно применяются в виде однократной инъекции 2 мл. 2% раствора.

Первой группе животных - мыши СВА 12-месячного возраста-КПФТЧ вводили однократно, подкожно в область бедр ежедневно по 0,05 мл. в течение 7 дней подряд до достижения субтолерантной дозы. Второй группе мышей СВА 26-месячного возраста КПФТЧ однократно,

подкожно в область бедра в субтолерантной дозе. Третьей группе мышей -животные линии Ба1Ь-е в возрасте 8 месяцев от рождения вводили ЭП и СФП однократно, подкожно в область бедра в клинической и субтолерантной дозах.

Четвертой группе мышей - животные линии Ва1Ь/с 8-месячного возраста - однократно вводили эритроциты барана в количестве 80х106 клеток на 1 мышь (В.Ю. Скворцов и др. 1985). Контрольная группа животных получала подкожно культуральную среду 199. Препараты ФТЧ вводили животным во второй половине дня, обычно после 15 часов, что объясняется фактом диаметральной противоположности суточных ритмов иммунной и эндокринной систем мыши и человека (Ю.И. Бородин и др., 1992). Животных после легкого эфирного наркоза забивали декапитацией на 7, 14, 30, 42 и 64 сутки после начала эксперимента. По литературным данным первые два срока почти идентичны пикам первичного и вторичного иммунного ответа на введение большинства антигенов, а остальные временные интервалы соответствуют периоду затихания иммунных реакций (А.Я. Фриденштейн, И.Л. Чертков, 1969; П.Ф. Здродовский 1971; НА. Жарикова, 1979 и др.).

Фрагменты тимуса, селезенки и печени после взвешивания целых органов фиксировали в жидкостях Карнуа или Буэна с последующей классической гистологической проводкой и заливкой в парафин. Из парафиновых блоков готовили микротомные срезы толщиной 5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином, метиловым зеленым пиронином по Браше и гемоцианином для выявления РНП, реактивом Шиффа для определения гликопротеинов в том числе и гликогена, по Перлсу для выявления железа (Б. Ромейс, 1954). Ко1ггрольные срезы при выявлении РНП с помощью гемоцианина были обработаны РНК-азой (1 мг/мл при + 37°С в течени 1 часа). Уровень РНП в гепатоцитах был определен с помощью компьютерной цитофотометрии на базе производственно-торгового

предприятия ЛАБМЕТОД. Для этих целей определяли коэффициент пропускания света, который обратно пропорционален оптической плотности объекта. При этой методике 0 единиц отображает 100% черного оттенка цвета, а 255 единиц- 100% белого. Количественное определение гликогена в печени проводили в замороженных при -20°С 500 мг навесках органа, используя для этого многоступенчатый кислотный гидролиз печени, подробно описанный А.Ф. Кинле с соавт.(2002). Уровень глюкозы в гидролизатах печени определяли по орто-толуидиновому методу с помощью концентрационного фотоэлектрического колориметра КФК- 2 МЛ. Количество гликогена в органе (мг%) высчитывали по формуле: 930 х (С опыт. С-стандарт), где С-опыт и С-стандарт - показатели колориметра при измерении гидролизата и стандарта соответственно (А.Ф. Кинле с соавт., 2002). Площадь белой и красной пульпы селезенки, а также величину корковой и мозговой зон тимуса определяли морфометрическим методом при помощи точечной сетки Г. Г. Автандилова (1990), просчитывая при этом не менее 30 полей зрения на каждом срезе органа. Количество макрофагов и тучных клеток в тимусе, мегакариоцитов и

макрофагов в селезенке высчитывали на одно поле зрения микроскопа (ув. 600), просчитывая при этом 40-60 полей зрения от каждого органа каждой мыши. Плотность заселения лимфоцитами коркового и мозгового слоя тимуса определяли по правилам счета мазка крови (ув.600). Митотический индекс клеток определяли общепринятым методом, выражая результат в процентах (И.А. Алов, 1972). При этом просчитывали не менее 1000 неделящихся клеток. Для определения абсолютного числа лимфоцитов на всь тимус и селезенку, а также на 1 мг ткани использовали методику, описанную нами ранее (О.П. Рябчиков, 1983).

Полученные с помощью стеклянного гомогенизатора клеточные суспензии тимуса и селезенки трижды отмывали средой 199 по 5 мин. при 1500 об/мин., после чего их доводили до концентрации 1-2х106 лимфоцитов в 1 мл. Подготовленные таким образом лимфоциты использовали для определения общих популяций Т- и В-лимфоцитов, спонтанной и митогениндуцированной пролиферативной активности клеток in vitro. Число погибших клеток после вышеуказанных манипуляций не превышало 5 %. Бедренные кости мышей использовали для подсчета общей клеточности красного костного мозга на одну кость, выявления в нем Т- и В-лимфоцитов, а также определения миелограммы по 13 морфологически различимым клеточным типам (В.Н. Никитин, 1949; М.Г. Абрамов, 1985) после фиксации мазков абсолютным метанолом и окраски по Романовскому- Гимза (Б. Ромейс, 1954).

Кроме вышеуказанного материала использовали также печень от 10 плодов человека в возрасте 16-22 нед. Это было сделано в целях выяснения цитологического состава данного органа перед получением из него тканевого препарата с последующим криоконсервированием.

Т-лимфоциты мышей - клетки) выявляли с помощью кроличьей антисыворотки против ткани головного мозга мыши (E.S. Golub, 1971), которую адсорбировали в течение 1 часа при комнатной температуре плотным осадком гепаринизированных эритроцитов мыши в соотношении 3:1. Процентное содержание Т-клеток определяли с помощью цитотоксического теста, применяя в качестве источника комплемента коммерческую лиофилизированную сыворотку морской свинки в рабочем разведении 1:8-1: 16 ( K.Komuro, E. Boyse, 1973).

В-лимфоциты мыши определяли по наличию на поверхности данного типа клеток иммуноглобулинов (Ig). Для этих целей проводили реакцию прямого антиглобулинового розеткообразования (Е.Р. Кудрявцева, 1973). Гипериммунную кроличью антисыворотку против Ig мыши, необходимую для этого теста, получили в лаборатории проф. К.Л. Шаханиной (НИИ им. Гамалеи, Москва) за что выражаем ей свою глубокую признательность и благодарность. Из данного полуфабриката методом ионнообменной хроматографии на ДЕАЭ-52 целлюлозе (Г. Фримель, 1987) получали чистые препараты IgG, которые концентрировали на амиконовской мембране соответствующей пористости, диализовали против физиологического раствора и доводили до концентрации 5-

6 мг/мл. Фракционную чистоту препарата (именно IgG) проверяли с помощью электрофореза в агаре (П. Грабар, 1972). После этого препараты IgG разливали по аликвотам (0,1 мл), замораживали и хранили при -70 ° С. Для приготовления реактотенной смеси эритроцитов барана или крупного рогатого скота с IgG фракцией сыворотки кролика против Ig использовали 0,1% раствор Сг С1з, который предварительно «созревал» при комнатной температуре в течение 3 недель. В-лимфоциты определяли реакцией розеткообразования после теплового шединга (+ 37 ° С 30 мин.) пассивно сорбированных через Fc-рецептор иммуноглобулинов. Подсчет клеток, как и в случае цитотоксического теста, проводили с помощью смеси акридинового оранжевого и этидиума бромида ( 0,25 мг/мл), используя для этих целей люминесцентный микроскоп Люмам Р-3 (а. Клаус, 1990).

Для определения Т- и В-лимфоцитов в печени плода человека использовали суспензию органа, ( не более 1-4 часов после смерти плода), полученную с помощью стеклянного гомогенизатора. Т-клетки тестировали по наличию на поверхности лимфоцитов рецепторов к эритроцитам барана СЕРОК), а В-лимфоциты определяли реакцией ЕАС-розеткообразования. Для этих целей готовили кроличью антисыворотку первичного ответа против эритроцитов крупного рогатого скота. В качестве комплемента использовали свежую сыворотку мыши, разведенную 1:10 (О.П. Рябчиков, 1983). Розеткообразующие клетки определяли с помощью люминесцентного микроскопа после добавления к суспензии клеток смеси акридинового оранжевого и этидиума бромида (АКлаус, 1990).

Для определения функциональной активности лимфоцитов селезенки мышей использовали общепринятую реакцию бласттрансформации этих клеток (РБТЛ) на поликлональные Т- ( Кон-А) и В-(ЛПС) клеточные митогены ( Г. Фримель, 1987). В стерильных условиях лимфоциты селезенки из полученных клеточных суспензий переносили в «полную» культуральную среду следующего состава: RPMI-1640 + 2,5% FCS + 0,2 мл. L-глутамина + 10 мМ Hepes-buffer+ 5x10 2 2-меркаптоэтанола+ 50 мкг гентамицина. РБТЛ проводили в течение 48 (Кон-А) - 72 (ЛПС) часов в микроплейтах (V-200 мкл.), триплетами. В лунки к суспензии лимфоцитов (250х103) добавляли следующие концентрации митогенов - Кон-А (Difko, США)- 0,1 мкг., ЛПС (Pharmacia, Швеция)- 1 мкг. В контрольных лунках митоген отсутствовал. Клетки с митогеном инкубировали во влажной атмосфере с 5% СО2 . За 4 часа до конца инкубации к лимфоцитам добавляли 1 мкКю Н- тимидина (уд.активность — 24 Кю/ммоль).

Величину р - распада 3Н -тимидина (импульсы / минуту) определяли на р - счетчике, используя стекловолокнистые фильтры с клетками, погруженными в стандартный толуольный сцинтиллятор на основе POP и РОРОР. Индекс стимуляции лимфоцитов (и.с.л.) определяли по формуле:

Имп. /мин. (контроль)

Для определения влияния аутологичной сыворотки на показатели РБТЛ ее добавляли в ячейки микроплейта в количестве 50% от объема лунки.

Спонтанную пролиферативную активность клеток тимуса, селезенки, красного костного мозга in vitro определяли с помощью 3Н-тимидина, который в количестве 1 мкКю прибавляли к 100000 клеток. Время инкубации — 16 часов. По литературным данным за этот период почти все клеточные типы проходят S-фазу клеточного цикла (И.А. Алов, 1972).

Для тестирования биологической активности ФНО в печени мыши применяли общепринятую методику, в которой в качестве клеток — мишеней использовали перевиваемую фибробластоподобную линию клеток мышей L-929 (Takasuka N. et. a., 1991). Процент цитолиза вычисляли по формуле:

оптическая плотность (опыт)

оптическая плотность (контроль)

В качестве источника ФНО использовали центрифугированные супернатанты замороженных и размороженных по нескольку раз фрагментов печени мышей (10 мг на 1 мл среды 199).

Для определения уровня цитотоксическоц активности натуральных киллеров (НК) в печени плода человека и крови детей применяли общепринятый 17-часовой цитотоксический тест (Т.Аво, 1978). В качестве клеток-мишеней использовали перевиваемые клетки эритролейкоза человека К-562, которые предварительно метили Сг51. Соотношение между эффекторами и мишенями - 50:1. Уровень цитотоксической активности НК определяли в % по формуле:

имп./мин. (опыт) - имп./мин (контроль)

80% макс, выхода изотопа -имп./мин. (контроль)

где имп/мин - показатель у - счетчика. Максимальный выход изотопа в имп /мин из клеток-мишеней определяли после их лизиса дистиллированой водой.

Уровень суммарных иммуноглобулинов в сыворотке крови мышей определяли методом радиальной иммунодиффузии по G. Manchini (Г. Фримель, 1987). В качестве наполнителя агарового геля использовали IgG -фракцию кроличьей гипериммунной антисыворотки против Ig мыши в конечной концентрации 0,5мг/мл. Диаметр преципитатов измеряли в мм обычной школьной линейки.

Уровень гормонов: ФСГ, ЛГ, ТТГ, сТ-3, сТ-4, пролактина, эстрадиола, тестостерона, кортизола в препаратах ФТЧ определяли высокочувствительным иммуноферментным анализом с использованием тест-наборов фирмы"АтегсЬат" (Англия) с компьютерным програмным обеспечением постановки реакции и обработки полученных результатов. При определении концентрации АФП, ПАМГ-1, АМГФ, СТГ, ПлЛ, ТБГ применяли твердофазный иммуноферментный анализ на основе моноклональных антител к этим веществам, приготовленных в лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ морфологии человека РАМН.

Все полученные цифровые результаты были подвержены статистической обработке с подсчетом а также критериев достоверности разницы

сравниваемых величин (1 - критерий Стьюдента) (Н.А. Плохинский, 1980) и непараметрический Т-критерий Уайта (Г.Ф. Лакин, 1979). Разница считалась достоверной при значении ^критерия Стьюдента < 0,05 и Т-критерия Уайта-0,95.

Забой мышей и все манипуляции с клетками животных проводили после 15 часов, поскольку суточные ритмы иммунных и эндокринных систем мыши и человека диаметрально противоположны ( Ю.И. Бородин, 1992).

Клеточный и гормональный состав препаратов фетальных тканей человека

По нашим данным кроме гепатоцитов в суспензии печени 16-22 нед. плода человека, подготовленной для криоконсервирования содержится большое число клеток, представляющих собой различные ростки кроветворения (табл. 1). Седи них преобладают ядерные эритроциты различных стадий дифференцировки (84,3%). На долю белого ростка гемопоэза приходится в среднем 4% всех кариоцитов. Сходные данные представлены и в монографии Н.А Торубаровой с соавт.(1993). Кроме этого мы обнаружили в печени плода человека 16-22 нед. развития Т-лимфоциты (2,4 %), В-клетки (2,3-6,1%), а также натуральные киллеры, обладающие высокой цитотоксической активностью. По литературным данным печень плода в указанные сроки развития содержит также большое количество стволовых и коммитированных клеток-предшественников типа КОЕ-ГЭММ, КОЕ-ГМ, БОЕ-Э (Н.А. Торубарова и др., 1993).

Таким образом, полученные нами данные, а также литературные сведения (В.А Балашова, К.М. Абдулкадыров, 1984; З.С. Хлыстова, 1987; СП. Шмелева и др., 1989; Н.А. Торубарова и др., 1993) позволяют говорить о печени плода человека 16-22 нед. развития как об органе гемопоэза, в котором происходит дифференцировка клеток различных ростков кроветворения, начиная с плюриопотентной стволовой кроветворной клетки (ПСКК) и кончая зрелыми кариоцитами крови. Этот процесс направляет и поддерживает

большое количество цитокинов, продуцируемых главным образом in situ (Л.В. Ковальчук и др., 1999).

Цитологичекая оценка криоконсервированных без криопротектора (-196° С) и размороженных препаратов ФТЧ показала, что в СФП содержится в среднем 35х106 кариоцитов на 1 мл, 95% из которых нежизнеспособные и лишь 5% жизнеспособные. Количество клеток, имплантированное одному животному, составило в среднем 250x103.

Таблица 1

Цитограмма печени плода человека 16-22 нед.

Тип клетки Процентное содержание

Эритробласт 2,2 ±0,1

Пронормобласт 2,3 ± 0,05

Нормобласт базоф илышй 3,4 ± 0,2

Нормобласт полихроматоф ильный 60,1 ±3,2

Нормобласт оксифильиый 3,6 ± 0,3

Мегалобласт базоф ильный 1,3 ±0,05

Мегалобласт полихроматофильный 8,3 ± 2.4

Мегалобласт оксифильный 3,3 ±0,6

Всего эритрокариоцитов 84,3±1,6

Миелобласт 0,7 ±0,2

Промиелоцит 0,85±0,3

Метамиелоцит 0,5 ±0,2

Нейтрофил лалочкоядерный 0,7 ±0,2

Нейтрофил сегментоядерный 0,9 ±0,1

Эозинофил 0,3 ±0,1

Базоф ил 0

Всего миелоидных клеток 3,95 ±0,15

Лимфобласт 0

Лимфоцит 7,2 ±1,6

Моноцит/ макрофаг 3,1±0,6

Мегакариоцит 0,2±0,1

75% кариоцитов СФП представлено гепатоцитами, а оставшиеся относятся к гемопоэтичсским элементам, причем значительная часть из них является ядросодержащими эритроцитами (в основном различные стадии нормобластов). У 60% гепатоцитов сохранена морфологическая структура, остальные представлены клетками в состоянии деструкции. Большая часть гепатоцитов расположена в препарате в виде отдельных клеток, либо небольшими группами по 3-15 клеток. Оценить количество клеток в препаратах экстракта плаценты (ЭП) затруднительно, поскольку они встречаются в виде достаточно крупных агрегатов и представлены в основном клетками синцитиотрофобласта. Живые клетки в ЭП единичны- 1-5%. В комплексном препарате ФТЧ (КПФТЧ), состоящем из клеток печени, селезенки, надпочечников, гипоталамуса, гонад, матки, простаты, желудка, кишечника и плаценты клетки собраны в достаточно крупные конгломераты, жизнеспособные клетки встречаются редко - 1-8%.

Спектр, количественный уровень истинных гормонов и белков зоны беременности, которые мы определили в препаратах ФТЧ, представлены в табл.

2. По нашим расчетам, суммарное количество гормонов, введенное мышам извне с препаратами ФТЧ, во много раз ниже, чем их уровень в организме мыши (в 9,8-1704 раза). Возникает вопрос: могут ли такие сверхмалые дозы гормонов и белков зоны беременности оказыать системный и местный эффект? По данным литературы, ответ на этот вопрос должен быть утвердительным. В ряде работ (А.А. Сазанов, С.В. Зайцев, 1992; Е.Б. Бурлакова, 1994; Фармакология сверхмалых доз. Под ред. Е.Д. Гольдберга, 2002) авторами выявлены системные эффекты малых доз различных, в том числе и гормональных препаратов. Что касается модулирующего действия гормонов на иммунокомпетентные клетки, то в литературе по этому поводу содержится большое количество работ (О Н. Савченко, 1967; О.И. Епифанова, 1967 ; В.Б. Розен , 1969; В.Ф. Чеботарев, 1979; ЕАКорнева и др., 1978, 1988; Н.Н. Кеворков и др., 1979, 1982, 1984, 1986; СВ. Ширшев, Н.Н. Кеворков, 1991; СВ. Ширшев, 1993.Н.Н. Кеворков, 1995 и многие др.). Резюмируя содержащиеся в этих исследованиях данные, можно сделать заключение о том, что влияние гормонов на иммунные процессы in vivo и in vitro определяется не только химической структурой данных соединений, но и множеством других факторов. К их числу прежде всего относятся доза и продолжительность гормонального воздействия, а также тот факт, что среди различных популяций иммунокомпетентных клеток имеются высоко- и низкочувствительные к гормонам и гормоноподобным веществам кариоциты. Подобная закономерность имеет место и для других соматических клеток. Тем не менее, к иммуностимулирующим гормонам относят эстрогены, пролактин, СТГ, ЛГ, сТ-

3, сТ-4, хТТГ, ТТГ, а к иммуносупрессирующим - кортизол, тестостерон, ПлЛ, ХГ, АФП, ТБГ, ПАМГ-1, АМГФ, хАКТГ, АМГФ, а - МСГ. Перечень определенных нами в препаратах ФТЧ гормонов и белков зоны беременности далеко не полностью освещает спектр биологически активных веществ,

содержащихся в этих тканях. К ним можно отнести эндорфины и энкефалины, различные ростовые факторы (EGF, HGF, IGF, TGF-p, эритропоэтин), ганглиозиды плаценты, большую группу цитокинов, которые влияют на пролиферацию и функциональную активность не только иммунокомпетентных, но и других соматических клеток (А.П. Милованов, 1999). К веществам этого же ряда можно причислить и сравнительно недавно открытые цитомедины, выполняющие в организме роль низкомолекулярных пептидных биорегуляторов (В.Х. Хавинсон и др., 2000, 2002, 2003).

Таблица 2

Уровень гормонов и белков зоны беременности в препаратах ФТЧ

Гормоны и белки зоны беременност и Сфп Эп Эпк Кпфтч

Пролакгин мЕД/л 95,3*10.3 385,0±1,5 168,0±68,0 360,0+62,0

ЛГ мЕД/л 9,9±2,9 7,8±1,9 6,4±0,2 5,3*0,3

ФСГ мЕД/л 5,2±0,1 7,1 ±2,3 3,7±0,15 7,8*1,4

Прогестерон пм/л 50,2±12,0 >160 >160 0

Эстрадная пм/л 9747±3337 6007+1642 >15000 Но

ТТГ мкЕД/л 0,3±0,06 0,3±0,1 0,1±0,03 0,2*0,1

С-ТЗ пм/л 4,3±0,4 2,1±0,6 2,91±0,1 0,6±0,03

С-Т4 пм/л 9,3±2,6 5,б±0,1 4,9±0,1 4,9±0,1

Кортнзал нм/л 82,4±34,7 69,3±4,9 54,9±1,2 24,0±1,8

Тестостерон нм/л 1,14±0,1 0,7±0,1 1,0±0,4 4,3*0,4

СТГ нг/мл 2,5±0,2 5,4±3,2 0 но

ПАМГ-1 нг/мл 8,3±4,4 60,0±55,0 59,3*25,3 60,0±9,2

АМГФ нг/мл 0 1789,0*1609,0 105,0*7,8 1300,0±124

АФП 2133,0±769,2 38,5±18,7 2320,0±548,0 10240±827

ХГЧ мЕД/мл 50,0*50,0 4700,0±2650,0 0 0

ПлЛ 0 9,25±0,75 но но

ТБГ нг/ ил 0 265,0*55,0 но 760,0±53,0

Примечание: но - не определяли

При обсуждении действия лекарственных и вообще химических

веществ на биологические объекты наиболее легко делать выводы тогда, когда исследователь имеет дело с одним конкретным соединением. Совсем другое дело - работать с группой веществ. В этом случае в выделяют,

по крайней мере, три возможности: 1.индиферентное действие воществ друг на друга; 2.усиливающий эффект одного вещества на другое; 3. подавляющий эффект одного вещества на другое (Я.Я. Балткайс, В.А Фатеев» 1991). Очень трудно, почти невозможно, охарактеризовать действие на комплекса

веществ, содержащихся в препаратах ФТЧ, которые' мы использовали в эксперименте (СФП, ЭП, КПФТЧ). В данном случае речь должна идти о действии именно суммарного комплекса различных химических соединений с возможным, повторяем, возможным выделением механизма

(компонента).

Гистофизнология органов иммунной системы и печени 8-месичпых мышей линии Ва1Ь/с после однократной имплантации субтолерактных доз СФП и ЭП

Тимус. Кратко характеризуя реакцию тимуса мышей введение

субтолерантных доз СФП и ЭП можно отметить После

имплантации животным этих препаратов ФТЧ в тимусе процесс,

обозначаемый в литературе как «акцидентальная инволюция «(АИ, АИТ) вилочковой железы (Т.Е. Ивановская и др., 1986, 1996; В.П. >Сарченко и др., 1998). Она происходят на фоне возрастной инволюции органа, имеет

свои характерные морфологические признаки, в ряде случаев с

описанием гистофизиологии АИТ, но полностью ей не (Т.Е.

Ивановская и др., 1996). Как показано различными авторгими, варианты фазовых изменений АИТ тесно связаны с длительностью и антигенного

воздействия и со степенью зрелости самого органа. При мышам

субтолерантных доз ФТЧ большое количество тимоцитов вилочковую

железу и выходит на периферию (табл.3), а не подвергается усиленному распаду внутри органа (количество нежизнеспособных клеток не более 3%). Вероятно, этот пул тимоцитов пополняет как органы

иммунитета (по нашим данным селезенку и костный мозг), различные

соматические ткани. При этом по литературным данным они могут контролировать рост и дифференцировку различных клеток (А.Г\ Бабаева, Е.А. Зотиков, 1987). Введение мышам ФТЧ изменяет и и

ретикулоэпителиальный компонент вилочковой железы. При этом ведение СФП вызывает более поздние стадии АИТ, чем что, по-

видимому, объясняется прежде всего антигенным составом и

большим количеством неразрушенных клеток. Иными имеется

большая антигенная (стрессорная) нагрузка на организм. При содержание

в тимусе Т-клеток (90%) не отличается от контрольных параметров (табл.3). Если оценивать фазовость изменения в тимусе по стадиям АИТ, то можно отмстить» следующее. На 7 сутки в вилочковой железе мышей после имплантации им субтолерантой дозы СФП наблюдается 1-111 фазы ЛИТ, а при введении. ЭП цитоархитектоника тимуса практически соответствует параметрам, что, вероятно, обуславливается качественным различием вышеуказанных препаратов ФТЧ. На 14 сутки после имплантации СФП стадия АИТ не изменяется, а при введенииЭП сохраняется уменьшение клеточности в мозговом и корковом веществе. Значительно возрастает количество лимфоцитов на весь орган при введении обоих видов ФТЧ, что прежде всего огражается на увеличении массы тимуса (табл.3). На 42 сутки опыта после имплантации животным СФП регистрируется Ш-1У фаза АИТ, а после -введения ЭП сохраняются вышеуказанные изменения. На 64 сутки эксперилмеита после введения субътолерантных доз обоих видов ФТЧ в тимусе можно отметить морфологические изменения, характерные для 11-1У фаз АИТ. При значительно уменьшается количество лимфоцитов на единицу

в корковом и мозговом веществе вилочковой железы, а абсолютные данного параметра имеют самые низкие значения на протяжении всего эксперимента. Особое внимание мы хотели бы обратить на в вилочковой железе, которое свойственно не только введению в организм ФТЧ, но и наблюдается при различных антигенных нагрузках, классических стрессорных воздействиях. В литературе этот процесс называется дисрегенераторным или дистрофическим (Т.Е. Ивановская и др., 1996; В.П. Харченко и др., 1998). По нашему мнению, эпителиальные кисты, точнее входящие в состав Шифф-положительного вещества этих образований сиаловые кислоты, принимают самое непосредственное участие в тимуса при антигенных и стрессорных нагрузках на организм уменьшения плотности контакта между тимоцитами и с одной стороны, и, защищая тимоцит от захвата вилочковой железы, с другой.

Селезенка. При введении 8-месячным мышам линии Ва1Ь/с субтолерантных доз и ЭП селезенка животных реагирует на имплантацию ФТЧ (табл.4).

При снижается масса органа с параллельным уменьшением числа

и макрофагов на орган. Подобные изменения отмечены у и животных после стрессорных нагрузок различного характера и интенсивности (П.Д. Горизонтов и др., 1983). Это не характерно для ответа селезенки на такие широко применяемые в лабораторной практике антигены как эритроциты барана и БСА, когда наблюдается значительное увеличение органа (Н.А. Жарикова, 1979). По нашему мнению при животным ФТЧ часть лимфоцитов из селезенки мигрирует в

периферические лимфоидные органы и различные соматические ткани, а не непосредственно в органе, поскольку, количество

нежизнеспособных клеток в суспензии селезенки и в контроле и в опыте не превышает 10% на всех сроках эксперимента Введение субтолерантных доз СФП и ЭП вызывает по нашим данным возрастание числа В-клеток в селезенке

Таблица 3

Цитологические параметры тимуса 8 - мес. мышей линии Ва1Ь-с после введения субтолераптных доз СФП и ЭП

Срок после введения ФТЧ (сутки) Количество Лимфоцито в на орган (хЮ6) Количество лимфоцитов на 1 мг ткани (хЮ8) Количество Т-клегок на орган (хЮ6) Количество Т-клеток на 1мг ткани (хЮ6) Количество В-клеток на орган (хЮ6) Количество В-клеток На 1 мгткани (хЮ6)

7 (п-5) 18.9±3.0. 0,7±0,4 18,Ot3,4 0,7±0,4 0,2±0,009 0008±0,003.

13,8±3,б. + 0,7±0,1 12,4±3,б 0,6±0,1 0,2±0,01. 0,009±0,004

14 (п-5) 47,3±2,8. + 1,4±0,04 х 41,5±4,9. х 1,2±0,1 0,2±0,00б 000б±0,003.

4б,5±4,2. + 1,8±0,3 х 41,3±б,1 . 1,б±0,5 0,5±0,01.+х 0,2±0,004 .х

42 (п-5) 71,6±8,8. +х 2,7±0,05. +х б7,5±8,5 . 2,4±0,05. х 0,4±0,03. х 0,01±0,008х

47±5,4. + х 1,5±0,2 х 42,3±7,2 . 1,3±0,2 0,1 ±0,02 0,004±0,004

64 (п-5) 1б,9±1,7 + 0,8±0,08 х 17,0±1,7х 0,8±0,09 х 0,2±0 0,009±0

40,0±5,1. х 1,0±0,3 х 38,0±б,3 . 1,0±0,3 0,3±0,01 . 0,008±0,006

Контроль (п-5) 23,0±2,9 1,0±0,5 20,4±2,б 0,9±0,4 0,2±0,003 0,009±0,00

Примечание: п - количество животных. В числителе - СФП, в знаменателе - ЭП.

(.) -достоверно к контролю. Ткр. У - 0,95 , (х) - достоверно между сроками эксперимента одного вида ФТЧ (+) - достоверно между группами ФТЧ, Ткр. У - 0,95 ФТЧ, Т кр. У- 0,95

с момента имплантации фетальных тканей и до 42 суток эксперимента, что, может служить основой для увеличения продукции иммуноглобулинов. По -видимому, этот процесс стимулируется и недавно открытым в плаценте человека поликлональным В-клеточным митогеном, получившим коммерческое название « римолан» (В.П. Быкова и др., 1992). В паренхиме селезенки после введения мышам субтолерантных доз ФТЧ увеличивается количество т.н. «темных клеток». По литературным сведениям они появляются в селезенке животных после иммунизации различными антигенами и являются пре-В-лимфоцитами (Н.А. Жарикова, 1979). По нашим данным эти клетки в своем большинстве являются ядерными эритроцитами, что мы доказали с помощью окраски препаратов по Лепену, которая позволяет выявить гемоглобинсодержащие клетки (Ф. Хейхоу, Д. Кваглино, 1983).

Эритрокариоциты с иммунологических позиций являются супрессорами (эр-супрессоры), которые, в частности, отвечают за пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов, ограничивая их избыточное размножение с одновременным уменьшением индуктивной фазы иммунного ответа (И.Г. Цырлова и др., 1985, 1986). Кроме того эр-супрессоры стимулируют митогениндуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов. В нашем случае появление большого количества данного типа клеток, по-видимому, связано с возрастанием числа В-лимфоцитов после введения мышам ФТЧ. Вышеуказанные структурные особенности селезенки животных после введения им субтолерантных доз СФП и ЭП (снижение массы органа, резкое уменьшение абсолютного количества Т-, В-лимфоцитов и макрофагов на весь орган ) заставляет подумать о том, что данные изменения могут быть основой иммунодефицита. Однако наши исследования функциональной активности лимфоцитов селезенки с помощью РБТЛ на Кон-А и ЛПС отвергли данное заключение. Они показали, что после введения мышам ФТЧ, особенно ЭП, достоверно возрастает пролиферация лимфоцитов и Т- и В-типов на 7 и 40 день эксперимента, причем это связано с истинным повышением пролиферативного потенциала одного лимфоцита. Особенно это заметно после прибавления к культуре клеток 50% аутологичной сыворотки крови. Вышеуказанные данные позволяют нам сделать вывод о том, что диагноз иммунодефицита, поставленный на основании снижении массы селезенки и уменьшения суммарного количества лимфоцитов на весь орган неправомочен. Для этих целей обязателен анализ функциональной активности Т- и В-клеток, в частности, постановка РБТЛ на различные митогены с привлечением аутологичной сыворотки крови (источник элементов микроокружения), которая по нашим данным, полученным на основании изучения РБТЛ и цитотоксической активности натуральных киллеров у детей с почечной патологией, а также РБТЛ у мини-свиней с хроническим алкоголизмом, может значительно модулировать функциональную активность иммунокомпетентных клеток.

Таблица 4

Иммунологические показатели селезенки мышей линии Ва1Ь/с после введения субтолерантных доз СФП и ЭП человека

Срок после введения ФТЧ (сутки) Вес органа (мг) Кол-во лимфоцитов на 1 мг ткани (хЮ6) Кол-во лимфоцитов на орган (хЮ4) В- лимфоциты (%) Т- лимфоцит ы (%)

7(п-5) 119±1. 122 ± 8 . 1 ±0,1. 1 ± 0,2 120 ± 4,4 . 123 ± 14 . 32 ±1,7 . 29 ± 3,7 . 22,3±1,2. 21,3±2,4 .

14 (й-5) 102 ± 5 . 158 ±14 . 1,3 ±0,1. 1,4 ±0,1. 137 ±5 . 213 ±9 28,3 ± 2 25,7 ±1,1. 27,3 ± 2,7 24,7 ±2,4

42 (п-5) 115 ±7 . 131 ± 8,1. 1,7 ±0,3 2,6 ±0,3. 195 ±18 . 342 ±58 х + 25 ± 0,6 . 19 ± 2,5 + 33 ±2 . 25 ± 1,7 х

64 (п-5) 153 ± 3 . 141 ±3 . 1,2 ±0,2 . 1,2 ±0,2. 177 ± 42 . 175 ±35 . 17 ± 0,7 . 14,7± 1,2. 43 ± 3,8. + 38 ± 4,4 .

Контроль (п-5) 234 ±4,5 1,6 ±0,3 345 ±36 20 ± 0,6 26,7 ± 2,2

Примечание: п - количество животных (. ) - достоверно к контролю. Т кр. У - 0,95 ( + ) - достоверно между сроками введения ФТЧ. Т кр. У - 0,95 (х) - достоверно между группами введения ФТЧ. Т кр. У - 0,95

Красный костный мозг и периферическая кровь. Миелограмма красного костного мозга после введения 8-месячным мышам линии Ба1Ъ/е субтолерантных доз СФП и ЭП дана в табл.5. К этому можно добавить, что имплантация животным ЭП ведет к. увеличению числа клеток на одну бедренную кость, начиная с 14 дня эксперимента. Подобный эффект отсутствует после введения СФП. Процентное содержание В-лимфоцитов уменьшается на поздних стадиях эксперимента (42 и 64 сутки) после имплантации обоих препаратов ФТЧ, что, по-видимому, связано с их миграцией в селезенку, где число вышеуказанных клеток по нашим данным значительно увеличивается. Количество Т-клеток в костном мозге подопытных животных наиболее значительно нарастает к 64 суткам опыта после введения и СФП и ЭП. По литературным данным, это может сказываться и на качественной стороне гемопоэза При этом короткоживущие Т-1 клетки (кортизон- и радиочувствительные) стимулируют эритроидный росток, а долгоживущие Т-2 лимфоциты( кортизон- и радиорезистентные)

способствуют пролиферации белого ростка кроветворения ( Е.Д. Гольдберг и др., 1983, 2000; О.О. Ромашко, 1985). Кроме того показано, что Т-лимфоциты, стимулируя рост КОЕ-с, БОЕ-э, КОЕ-е способствуют активации эритропоэза (Е.Д. Гольдберг и др., 2000). Вероятно, все вышесказанное играет роль в той картине гемопоэза, которую мы обнаружили в костном мозге мышей после введения им ФТЧ (табл.5,6). Как видно из них, резко увеличивается величина эритроидного ростка, в стимуляции которого кроме вышеописашюго механизма, по нашему мнению, участвует и большое количество ростовых факторов (эритропоэтин, ГМ-КСФ, Г-КСФ и др.), которые вырабатывает система мононуклеарных фагоцитов, также активирующаяся (по крайней мере по нашим данным в печени) при введении животным ФТЧ. Это подтверждается и тем, что почти на всех стадиях эксперимента увеличивается и абсолютное количество молодых форм белого ростка кроветворения (табл.5,6), в активации которого большую роль играют именно ГМ-КСФ и Г-КСФ (Г.И. Козинец, Е.Д. Гольдберг, 1982).

В периферической крови подопытных мышей число лейкоцитов в единице объема крови повышается на 42 и 64 сутки после введения животным ФТЧ. Именно из-за этого возрастает и абсолютное количество сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов в 1 мм.3 крови. В остальном картина крови мышей, получивших СФП и ЭП, и контрольных животных не отличается.

Таблица 5

Миелограмма красного костного мозга мышей линии Ва1Ь/с после введения субтолерантных доз СФП человека в %

Тип клетки Срок после введения СФП (сутки)

Контроль (п-5) 7 (п-5) 14 (п-5) 42 (п-5) 64 (п-5)

Эритробласт 0,07 ±0.7 2,7±0,9 1,7 ±1,2 0 1,3±0,9

Пронормобласт 0 3,7±1,9. 0 0 0

Базофильный нормобласт 0 0 2,3±1.5. 2,3±0,3 3,7±0,9.

Полихроматоф ильный нормобласт 0 7,7±1,5 б.3±2.0. 2,3±0,3 3,3±0,7.

Оксифнльный нормобласт 12,7*1,5 11,7±2,7 15,3±4,8 5,0±0,2 12,3±3,8

Всего ядерных эритроцитов 13,3±1.5 25,7±1,8 25,7±2.2 9,7±0,3. 20,7±1,б

Миелобласт 1.3±0,3 3,7±0,7 4,0±2,0 0,7±0,7 и±о,з

Промиелоцит 1,0+0,6 4.0±2,0 2,7±0,9 зз±оз. 4,0±0,6.

Миелоцит 14,7±0,9 9,3 ±2,3 4,7±0,3 9,3±0,9. 7,0±2,0.

Метамиелоцит 15,0±1,7 2,3±2,2 9,3±2,7. 15,7±2,3 9,0±2,5.

Палочкоядерный нейтрофил 19,3±0,9 19,3±4,9 21.041,0 21,0±0,б 22,7±1,0

Сегментоядерный нейтрофил 22.7+1,8 15,0+3,8 23,0±2,6 2б,0±2,9 но

Всего нейтрофилов 74,0±1,0 70,0±2,7 67,5±1,8 . 7б,3±1,8 71,0±1,0

Отношение нейтрофилы/эритроциты 5.6 3.0. 2,8. 5.2 3.5.

Моноциты/макрофаги 2,3±0.3 4,3±1,2 5,7±0,3. 2,0±0,01 2,3±0.9

Лимфоцит 6,7±2.0 3.0±0,6 9,3±2.7 3,7±0,9. 4,7±0,5

Остеобласт 0,3±0,3 0.3±0.3 0. 3,3±0,9. 0,7±0,1.

Остеокласт 2,7±0,3 0. 2,3+0,3 2,7±0,1

Мегакариоцит 0,3±0,3 0. 0. 0. 0.

Митотический индекс Г ОН 0.15 0,35. но 0.1 0,1

Примечание: (•) - достоверно к контролю. Тк. У-0,95 п -число животных но - не определяли

Таблица 6

Миелограмма красного костного мозга мышей липли Ва1в/с -после введения субтолерантных доз ЭП человека

Примечание: ( • ) - достоверно к контролю. Ткр. У-0,95 п ■ число животных, но - не определяли

Печень. После введения животным субтолерантных доз СФП и ЭП в печени мышей имеет место морфологическая картина, характерная для т.н. неспецифического реактивного гепатита (НРГ). который не является

специфической нозологической единицей, и наблюдается в печени больных при большом количестве инфекционных и неинфекционных заболеваний, а также после приема некоторых лекарственных препаратов (В.В. Серов, К.Лапиш, 1989). В других работах НРГ описывается как "мезенхимальная воспалительная реакцшГ(А.Ф. Блюгер, И.Н. Новицкий, 1984). Наблюдаемый нами при введении животным ФТЧ НРГ отличается слабой выраженностью. В печени мышей сохраняются функции накопления гликогена и синтеза РНП. Одновременно с этим увеличивается число клеток Купфера и двуядерных гепатоцитов. Последнее по нашему мнению и данным литературы (В.Ф. Сидорова и др., 1966; Л.К. Романова, 1984; В.И. Покровский и др., 2003) служит отражением повышенной регенерационной способности печени з ответ на воздействие ФТЧ, поскольку двуядерные гепатоциты полиплоидны и обладают значительной метаболической активностью (З.А. Рябинина, В.А. Бенюш, 1973; Л.К. Романова, 1984; В.И. Покровский и др., 2003). На морфологическую картину печени мышей после введения им ФТЧ, вероятно, оказывают влияние цитомедины и НОР, содержащиеся в СФП и ЭП. По литературным данным и печеночный цитомедин, и НОР напрямую регулируют пролиферативную активность печеночных, клеток. Благоприятное действие фетальных тканей на функцию и морфологию печени мышей с индуцированным циррозом печени отмечают также и А.Н. Батанов и др.(2000) При этом авторы подчеркивают, что данный вид терапии превосходил по эффективности все современные виды лечения цирроза печени, в том числе и хирургическое вмешательство. В клинических условиях на группе детей с хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени подобный результат, в частности, получила Л.В. Чистова с соавт.(199б).

Гнстофизиология органов иммунной системы, периферичес-кой крови и печени 8- месячных мышей линии Balb/c после однократной имплантации клинических доз СФП н ЭП

Поскольку в экспериментах по введению 8-месячным мышам мы использовали разные дозы препаратов: субтолерантную для мыши и клиническую для человека, то особый интерес вызывает вопрос о том, существуют ли различия в структурно- функциональном состоянии органов иммунной системы и печени у этих групп животных? Проведенные исследования показали, что различия имеются.

Если при введении животным субтолерантных доз СФП и ЭП в корковом и мозговом веществе вилочковой железы количество тимоцитов уменьшается, то после имплантации мышам клинических доз ФТЧ этот показатель значительно увеличивается при одновременном росте пролиферативной активности лимфоцитов. Введение животным клинических доз СФП и ЭП ведет к росту процентного и абсолютного содержания Т- и В-лимфоцитов, чего не наблюдается при имплантации субтолерантных доз ФТЧ. При введении мышам субтолерантных доз СФП и ЭП в вилочковой железе животных

имеются морфологические изменения, соответствующие НГ-ГУ стадиям ЛИТ. Имплантация клинических доз вышеуказанных ФТЧ вызывает в тимусе мышей I и отчасти ГУ стадии АИТ.

В селезенке подопытных животных также имеются различия (табл. 7). Прежде всего это касается ее веса. Если при введении субтолерантных доз СФП и ЭП наблюдается снижение массы органа, то после имплантации клинических доз ФТЧ вес селезенки возрастает, при этом наблюдается значительное увеличение абсолютного количества лимфоцитов, Т- и В-клеток на весь орган. Спонтанная пролиферативная активность спленоцитов при введении субтолерантных доз СФП и ЭП уменьшается, а при имплантации обоих препаратов ФТЧ в клинических дозах - увеличивается. Что касается процентного содержания Т- и В-лимфоцитов в селезенке, то при введении субтолерантных доз ФТЧ увеличивается число В-клеток, а при имплантации клинических доз СФП и ЭП возрастает количество Т-клеток. При оценке функционального состояния Т- и В-лимфоцитов, например, по их реакции на Т- и В-лимфоцитарные митогены, ответ лимфоцитов на эти вещества более стабильно возрастает после введения мышам клинических доз ФТЧ. В морфологической картине органа отличий мало. Одно из них- это практически полное отсутствие в паренхиме селезенки мышей, которым имплантировали клинические дозы ФТЧ, островков гемопоэза, которые столь характерны для этого органа при введении животным субтолерантных доз СФП и ЭП.

Суть цитологических различий в красном костном мозге мышей после введения животным разных доз СФП и ЭП заключается в том, что после имплантации субтолерантых доз ФТЧ уменьшается процентное содержание В-лимфоцитов, резко возрастает величина эритроидного ростка кроветворения и количество молодых форм гранулоцитов. А в костном мозге мышей, которым вводили клинические дозы ФТЧ, напротив, увеличивается процентное содержание В-лимфоцитов, пролиферативная активность различных клеток, процентное содержание сегментоядерных нейтрофилов.

Если говорить о морфологических изменениях в печени при имплантации животным разных доз ФТЧ, то можно отметить, что введение мышам клинических доз СФП и ЭП не вызывает картины неспецифического реактивного гепатита низкой степени активности, характерного по нашим данным для животных, получивших субтолерантные дозы ФТЧ. Кроме того, имплантация клинических доз СФП и ЭП вызывает увеличение уровня РНП в цитоплазме гепатоцитов, особенно заметное при введении СФП. Подобную картину наблюдали И.А. Алов с соавт. (1964) при введении взрослым мышам клеточной суспензии аллогенной печени.

Таблица 7

Иммунологические показатели селезенки мышей линии Ва1Ь/с после введения клинических доз СФП и ЭП

человека

Срок после введения ФТЧ (сутки) Вес органа (мг) Кол-во лимфоцитов на 1 мг ткани (хЮ6) Кол-во лимфоцитов в на орган (хЮ6) В- лимфоциты (%) Т-лнмфоцшы (%)

Печень Плацента печень Плацента Печень Плацента Печень Плацента печень плацента

7 (п-5) 192±29. X 137±23 2,7±0,2 . 2,5±0,4 . 523 ± 79. 364±10б. X 21 ±1,2 23 ± 1 57 ± 2,6. 59 ±2,7.

14 (п-5) 165±25 . 174±23. + 2,1 ±0,1 . 2,4±0,3 . 343±54. + 410*51 . 27,6±3,1 26,4*4,3 50,1*4,3. 4б,4±2,7

42 (п-5) 134±18 93±6. + х 1,8±0,2 1,8±0,1 241±29 + 159*14.+ X 16,2±0,6. + 31*1,1 49,6±0,8. 31±1. +

Контроль (п-5) 133 ± 15 1,7 ±0,1 228 ±41 27,8 ±1,9 45,0 ±1,7

Примечание: (.) - достоверно к контролю. Т кр. У - 0,95

( + ) - достоверно между сроками введения ФТЧ Т кр. У - 0,95 (х )-достоверно между группами ФТЧ. Ткр У -0,95

Структура органов иммунной снтемы и печени 8-месячных мышей линии Ва1Ь/с после введения эритроцитов барана

Это исследование было предпринято нами в целях дать ответ на вопрос: насколько различается иммуноморфологическая картина органов иммунной системы и печени мышей после имплантации им фетальных тканей в виде СФП и ЭП и после введения животным такого широко известного в лабораторной практике антигена как эритроциты барана? Как известно эритроциты барана представляют собой Т-зависимый антиген, в иммунном ответе на который (точнеее, в выработке антител на который) обязательно участие Т-хелперов, которые затем стимулируют В-лимфоциты к выработке антител на комплекс антигенов, представленных в эритроцитах барана (Л.1.8. Баиез е1 а., 1969).

Из полученных нами данных следует, что в тимусе мышей на 42 и 64 сутки после введения эритроцитов барана увеличивается число лимфоцитов на 1 мг. ткани, а на 7 и 14 сутки имеется заметная тенденция к росту этого параметра по сравнению с контролем. Это противоположно тому, что наблюдается при введении животным субтолерантных доз СФП и ЭП и напоминает клеточную кинетику в тимусе мышей после имплантации клинических доз ФТЧ. Кроме того, в вилочковои железе мышей после иммунизации их эритроцитами барана почти никогда не наблюдаются эпителиальные кисты с Шифф-положительным веществом, столь характерные для тимуса животных после имплантации им ФТЧ, особенно в субтолерантных дозах.

Таким образом, по нашим данным после введения мышам эритроцитов барана в морфологической картине тимуса преобладают изменения, характерные для I и П фаз АИТ. Наши результаты подтверждают и данные литературы (ИИ. Гринцевич, 1989). В то же время после имплантации животным субтолерантных

доз СФП и ЭП для тимуса типична картина П- 1У фаз этого процесса.

Морфологические параметры селезенки мышей после иммунизации их эритроцитами барана также отличаются от таковых при имплантации животным субтолерантных доз СФП и ЭП. Нами обнаружено, что иммунизация мышей эритроцитами барана ведет к возрастанию веса селезенки, резкому увеличению количества лимфоцитов на орган по сравнению с контрольными параметрами. Имплантация животным субтолерантных доз СФП и ЭП приводит к иным результатам. Иммунизация мышей эритроцитами барана также вызывает в селезенке подопытных животных резкий рост абсолютного числа Т- и В-лимфоцитов, что, вероятно, и вызывает увеличение количества АОК в этом органе (Н.В. Масная и др., 2001). При этом количество лимфоцитов на 1 мг. ткани селезенки мало отличается между обеими группами мышей. При введении животным эритроцитов барана относительно небольшие лимфоидные узелки белой пульпы, наблюдаемые в селезенке контрольных мышей, вероятно, сливаются между собой, формируя большие по площади образования, достигающие иногда гигантских размеров. При имплантации животным СФП и ЭП в различных дозах лимфоидные узелки белой пульпы

таких размеров не достигают и обычно представляют собой средние по величине образования. Кроме того, при иммунизации мышей эритроцитами барана мы не наблюдали в селезенке значительной активации эритропоэза, что характерно для этого органа у животных после имплантации субтолерантных доз СФП и ЭП.

Гистофизиология печени мышей, иммунизированных эритроцитами барана, на 7 и 14 день после начала эксперимента мало отличается от контрольных показателей. Но уже в эти сроки уменьшается количество двуядерных гепатоцитов, клеток Купфера, появляются зоны гепатоцитов с оптически пустой цитоплазмой.

Подобные печеночные клетки получили название клеток Краевского (Н.К. Пермяков, 1979). Они содержат,как правило, небольшое количество гликогена и выявляются при стрессорных воздействиях, одним из которых можно рассматривать и иммунизацию животного эритроцитами барана (Т.К. Давтян, Л.А. Аванесян, 2001). В последнее время подобные по морфологии гепатоциты были описаны В.И. Покровским с соавт. (2003) как особый вид дистрофии печеночных клеток - клеточно-инволютивная форма дистрофии гепатоцитов. Как подчеркивают авторы, подобные клетки обладают существенным регенерационным потенциалом внутриклеточных органелл. На 42 сутки после иммунизации животных эритроцитами барана значительно увеличивается число клеток Краевского, а также количество крупных лимфоцитарно-макрофагальных инфильтратов, находящихся как перипортально, так и внутрилобулярно. Эта морфологическая картина печени характерна для гепатита, протекающего со значительной степенью активности (А.Ф. Блюгер, И.Н. Новицкий, 1984; В.В. Серов, К. Лапиш, 1989). При этом количество двуядерных гепатоцитов меньше, чем у контрольных животных. В случае имплантации мышам субтолерантных доз СФП и ЭП в печени мышей выявляется неспецифический реактивный гепатит слабой степени активности, причем по сравнению с мышами, иммунизированными эритроцитами барана, в печени животных после имплантации ФТЧ, определяется большое количество двуядерных гепатоцитов и клеток Купфера, число которых превышает контрольные параметры.

Наши результаты показывают, что после имплантации 8-месячным мышам субтолерантных доз СФП и ЭП, особенно второго препарата, имеется рост числа ядросодержащих клеток на одну бедренную кость на 14 и 64 сутки эксперимента. Иммунизация животных эритроцитами барана не вызывает изменеий этого показателя во все сроки опыта (7- 64 сутки). По литературным данным, введение эритроцитов барана молодым мышам приводит к уменьшению числа клеток па одну бедренную кость на 4-21 сутки эксперимента (В.В. Жданов с соавт., 2002).

При введении 8-месячным мышам эритроцитов барана мы не выявили изменений процентного содержания Т- и В-клеток в костном мозге

подопытных животных . В то же время имплантация мышам подобного

возраста субтолерантной дозы СФП вызывает в костном мозге рост процентного содержания В-клеток, а введение животным субтолерантной дозы ЭП вызывает существенное увеличите процентного содержания Т-клеток. При этом абсолютное количество Т- и В-лимфоцитов на одну бедренную кость у этих групп животных не отличается между собой. В миелограмме костного мозга мышей, иммунизированных эритроцитами барана, увеличивается процентное содержание эритрокариоцитов, а у животных с имплантацией ЭП и СФП в субтолерантной дозе увеличивается не только процентное содержание эритрокариоцитов и молодых клеточных форм гранулоцитов, но и их абсолютное количество на одну бедренную кость. По сравнению с группой мышей, которым вводили субтолераитшле дозы ФТЧ, и у которых в периферической крови наблюдался рост процентного содержания сегментоядерных лейкоцитов, в лейкоцитарной формуле животных, иммунизиованных эритроцитами барана, их число уменьшается.

Таким образом, полученные нами данные говорят о том, что морфологической картине тимуса, селезенки, печени, красного костного мозга и периферической крови 8-месячных мышей линии Ва1Ь/с после иммунизации их эритроцитами барана и имплантации субтолерантных доз СФП и ЭП имется существенные различия. Они носят как качественный, так и количественный характер.

Гистофизиология тимуса и селезенки 12-месячных мышей, линии СВА после 7-дневной имплантации КПФТЧ

Комплексный препарат ФТЧ (КПФТЧ), состоящий из клеток гипоталамуса, надпочечников, селезенки, печени, желудка, кишечника, гонад, простаты, матки, плаценты от плодов 16-22 не д., начиная примерно с 1998г., в клинике не применяется, и его действие на различные органы и ткани имеет в настоящее время лишь научный интерес. Гормональный состав этого комплекса фетальных тканей отражен в табл. 2, из которой видно, что по сравнению с другими фетальными тканями, которые мы изучали, в нем содержится большее количество кортизола, эстрадиола, тестостерона и другихгормонов. Наши исследования показали, что при ежедневном в течение 7 суток подряд (что в клинике не делалось) введении этого препарата дробно до достижения субтолерантной дозы мышам СВА 12-месячного возраста, на 7 сутки от начала эксперимента количество тимоцитов на 1 мг ткани вилочковой железы у самцов выше, чем в контроле.

Это укладывается в картину I фазы АИТ (Л.С. Румянцева, 1975), но в нашем опыте она пролонгирована, по времени. В селезенке количество лимфоцитов на 1 мг ткани и у самок и у самцов резко снижено, что коррелирует с уменьшением клеточности лимфоидных узелков органа. Это свидетельствует в пользу развивающегося иммунодефицита по клеточному и гуморальному типу (О.Д. Ягмуров, 1997), что подтверждается и уменьшением на 1 мг ткани числа Т- и В-лимфоцитов. Не исключено, что в делимфатизации лимфоидных

узелков селезенки играет роль и обнаруженное нами одновременное повышение клеточности тимуса, которое может являться следствием замедленной миграции Т-клеток из вилочковой железы на периферию, в частности, в селезенку. На 30 сутки эксперимента картина селезенки и ее клеточный состав не отличается от вышеописанного, что говорит о сохранении иммунодефицитного состояния в этом органе.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что вышеуказанная схема введения КПФТЧ приводит к выраженному периферическому иммунодефицитному состоянию по клеточному и гуморальному типу, основой которого служит значительное уменьшение в селезенке абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов. Это говорит против использования КПФТЧ в клинической практике, или по крайней мере большой осторожности при его применении по даной схеме (ежедневное введение).

Иммуноморфологическая характеристика органов иммунной системы и периферической крови старых мышей лини СВА после имплаптации субтолерантной дозы КПФТЧ

Известно, что старение организма сопровождается морфологическими изменениями дистрофического характера практически во всех органах и тканях. При этом значительно снижается их физиологическая активность, что ведет к возникновению новых и прогрессированию уже имеющихся заболеваний (Т. Макинодан, Э. Юнис, 1980).

Одной из существующих теорий старения является иммунологическая, которая во главу угла ставит инволютивные изменения в иммунной системе, что приводит к старению всех клеточных систем организма (Т. "аНоп! е1. а., 1976).

С момента появления тканевой терапии ученые различного профиля стремились применить тканевые препараты в геронтологии При этом в части случаев эти попытки были успешными и помогали замедлить процесс старения (Н.А. Пучковская, 1975).

В своей работе мы исследовли влияние КПФТЧ на гистофизиологию тимуса, селезенки, красного костного мозга и периферической крови старых мышей линии СВА. Возраст животных составлял в среднем 2-2,5 года, что соответствует возрасту человека примерно в 70-75 лет.

Нами установлено (табл.9), что тимус старых мышей реагирует на имплантацию субтолерантной дозы КПФТЧ рядом изменений в цитоархитектонике органа, которые характерны для вилочковой железы молодых животных. При введении старым животным КПФТЧ полностью не останавливается, но значительно задерживается процесс возрастной инволюции тимуса. В первую очередь в вилочковой железе подопытных животных начинает нарастать количество лимфоцитов, что становится возможным как за счет усиления митотической активности тимоцитов, так и за счет усиленной миграции клеток-предшественников из крстного мозга в вилочковую железу. Этот процесс возможен лишь при активации гормональной

функции тимуса (А.А. Ярилин и др., 1991). Высокий митотический индекс тимоцитов на всем протяжении эксперимента и отсутствие большого количества погибших клеток (не более 3%) говорит о том, что значительная часть тимоцитов покидает вилочковую железу и выходит на периферию, где пополняет запасы периферических органов лимфопоэза. Этот процесс усиливает иммунокомпетентность организма в борьбе с чужеродными антигенами, в том числе и с собственными злокачественными клетками.

При введении в организм старых мышей КПФТЧ изменяется и структура селезенки. Из литературы известно, что у мышей данной возрастной группы снижается лимфоцитопоэз, что проявляется в селезенке уменьшением площади белой пульпы, лимфоидные узелки которой становятся мелкими, а иногда просто исчезают (Т. Макинодан, Э. Юнис, 198О).При имплантации КПФТЧ в паренхиме селезенки увеличивается число лимфоидных узелков, которые являются необходимыми морфологическими образованиями в органах иммунной системы животных и человека для оптимального иммунного ответа (А.Я. Фриденштейн, И.Л. Чертков, 1967; Н.А. Жарикова, 1979). На 7 и 42 сутки экперимента возрастает количество В-лимфоцитов на 1 мг ткани, что, по-видимому, ведёт за собой усиление процесса антителогенеза. Повышенный распад эритроцитов в красной пульпе селезенки после введения старым мышам субтолерантной дозы КПФТЧ может служить сигналом для стимуляции эритропоэза, а увеличенное содержание в ней мегакариоцитов, наряду с влиянием на свертывающую систему крови, может стимулировать, по литературным данным, и лимфоцитопоэз, и развитие соединительной ткани (Г.И. Козинец, В.А. Макаров, 1997).

Печень старых животных после имплантации им субтолерантных доз КПФТЧ имеет ряд отличий от контрольных параметров. Прежде всего это касается содержания в ней гликогена, который как известно, служит основным энергетическим потенциалом гепатоцита и принимает самое активное участие в углеводном обмене организма. По нашим данным после введения мышам КПФТЧ имеется заметная тенденция к росту количества гликогена в гепатоцитах практически на всех стадиях эксперимента (7-64 сутки), что отличается от «стрессорной печени», в которой гепатоциты теряют значительную часть гликогена с замещением его жировыми включениями (О.И. Кириллов, 1973). Наши результаты также показывают, что уровень РНП в гепатоцитах старых мышей после имплантации им КПФТЧ не отличаются от контртольных параметров.

Благодаря своим морфологическим особеностям, красный костный мозг занимает в жизни человека и животных одно из главных мест (И.А. Кассирский, Г.А. Алексеев, 1970; Н.А. Федоров,

1985). При введении старым мышам субтолерантой дозы КПФТЧ в костном мзге подопытных животных наблюдается снижение абсолютного количество - лимфоцитов (Т-лимфоциты, ПТЛ-2), увеличение числа В-клеток, уменьшение абсолютного количества эритроцитов и всех клеточных форм

гранулоцитопоэза. С нашей точки зрения возможны следующие объснения вышеуказанных изменений: 1).снижение количества Т-лимфоцитов в костном мозге животных после имплантации им КПФТЧ редуцирует эритро- и гранулопоэз, поскольку в общей популяции Т-клеток присутствуют Т-1 и Т-2 лимфоциты, которые напрямую регулируют эритро- и гранулоцитопоэз соответственно (О.О. Ромашко, 1985; Е.Д. Гольдберг и др., 1983, 1999); 2).примененнные нами дозы КПФТЧ все-таки оказались высокимми для старых животных, а в геронтологической практике для достижения эффекта при том или ином заболевании обычно используют пониженные дозы различных лекарственных препаратов (О.В. Коркушко и др., 1986); 3).в

КПФТЧ присутствует большая концентрация веществ, редуцирующих костномозговой гемопоэз, например, таких, как трансформирующий фактор роста - Р (А.П. Милованов, 1999).

Лейкоцитарная формула периферической крови старых мышей после имплантации им субтолерантной дозы КПФТЧ не претерпевает больших изменений. Лишь на 7 сутки опыта наблюдается достоверное снижение процентного содержания сегментояденых лейкоцитов, уровень которых нормализуется к 30 суткам эксперимента. Это полностью согласуется с костномозговым лейкопоэзом, где именно на 7 сутки опыта наблюдается наибольшее снижение процентного и абсолютного количества вышеуказанных форм лейкоцитов. Дальнейшее пониженное содержание сегментоядерных клеток в костном мозге не отражается на их количестве в периферической крови, что вероятнее всего объясняется выходом в эту зону пристеночного пула гранулоцитов, что бывает лишь при особых состояниях организма (стресс, инфекционные заболевания и др.) (Г.И. Козинец, Е.Д. Гольдберг, 1982).

37

Таблица 8

Цитологические параметры тимуса старых мфщей линии СВА после введения субтолсрантиых доз КПФТЧ

Срок после введения КПФТЧ (сутки) Исследуемый параметр

Вес тимуса (мг) Кол-во лимфлцито в на орган (хЮ6) Кол-во лимфлцито в на 1 мг ткани (хЮ6) Т-клетки № Кол-во Т-клегок на орган (хЮ4) Кол-во Т-клеток на 1 мг ткани (хШ6) В- клетки (%) Кол-во В-клеток на орган (х106) Кол-во В-клеток на 1 мг ткани (хЮ*)

7 (п-7) 15 ±2,5 22,7±6,7. 1,4±0,2. 89 ± 1,6 19,9±2,8. 1,3 ±0,2 2,1 ± 0,3 0,4 ± 0,03. 0,03±0,006.

14 (п-7) 9 ± 1 х 11,8±2,5х 1 ± 0,3 х 88 ± 8,5 5,4 ± 0,8 х 0,6 ±0,1 х 2 ±0,6 0,2 ± 0,08 0,02±0,007

42 (п-7) 10 ± 1,5 9 ±3,5 0,8 ± 0,1 88 ± 1 5,3 ± 3,3 0,5 ± 0,1 2 ±0,3 0,2 ±0,1 0,03±0,003.

64 (п-5) 13,5±1,5 7,3±3,5 0,б±0,3 95 ±5 7,1 ± 3,8 0,6 ± 0,1 2 ± 1 0,07±0,03 0,1 ±0,09

Контроль (п-7) 14,7±3,7 10 ±4 0,6±0,1 93 ± 0,6 9,6 ±4,1 0,6 ± 0,1 1,7 ±0,3 0,2 ± 0,1 0,01±0,004

Примечание: п - количество животных (. ) - достоверно к контролю, р < 0,05 (х) - достоверно к предыдущему сроку р < 0,05

Заключение

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что однократно введенные мышам криоконсервированные препараты фетальных тканей человека, представляющие собой главным образом нежизнеспособные клетки, вызывают в органах иммунной системы и печени животных-реципиентов морфологические и иммунологические изменения. Однако, подавляющее большинство из них : акцидентальная инволюция тимуса, изменение количества Т- и В- лимфоцитов в селезенке и красном костном мозге, усиление спонтанной пролиферации клеток, возрастание митогениндуцированной пролиферации Т- и В-лимфоцитов, подъем

сывороточного уровня суммарных иммуноглобулинов, неспецифический реактивный гепатит, гиперплазия лимфоидных узелков в селезенке и некоторые другие следует считать неспецифическими, т.к. по литературным данным они свойственны в той или иной степени введению любого иммуногенного антигена. Интенсивность иммунных реакций и морфологическая палитра органных изменений при этом зависят по крайней мере от нескольких причин: химических и биологических свойств антигена, его количества, времени введения и возраста животного. В наших экспериментах, вероятно, существенный вклад в морфофункциональную картину органов иммуногенеза и печени вносят гормоны, белки зоны беременности, различные стадиоспецифические антигены, количество которых в фетальных тканях человека значительно отличается от тканей человека в постнатальном периоде развития. Очевидно, что значительная часть вышеуказанных изменений является проявлением стрессорной реакции организма (правда невысокой интенсивности), поскольку введение любого антигена также является одним из видов стрессорных воздействий для животного и связано с перераспределением иммунокомпетентных клеток среди органов иммунной системы и различных соматических тканей. По нашему мнению, все описанные выше морфофункциональные изменения в органах им-муногенеза и печени носят адаптивный характер, в своём большинстве служат основой для возрастания функциональной активности вышеуказанных систем и не являются токсичными для организма.

Введенные в организм фетальные клетки и ткани, очевидно, стимулируют пролиферацию стволовых мезенхимальных клеток, о чем можно коственно судить по изменениям цитологических параметров красного костного мозга, найденных нами в ходе экспериментальных исследований. По литературным данным они обладают полипотентностью и могут давать начало развитию различных соматических клеток.

Выводы

1.Введение подопытным животным (мыши) различных препаратов фетальных тканей человека (ФТЧ) от плодов 16-22 нед. развития вызывает в органах иммунной системы, периферической крови и печени реципиента

комплекс морфологических и иммунологических изменений, которые носят адаптивный характер и не являются деструктивными. Их спектр зависит от качества и дозы ФТЧ, а также от времени, прошедшего с момента имплантации. Токсичность препаратов не выявлена.

2.Препараты ФТЧ - суспензия, фетальной печени (СФП), экстракт плаценты (ЭП), комплексный препарат, состоящий из клеток девяти органов плода 16 - 22 нед. развития (КПФТЧ), после криоконсерви-рования (-196° С) без клеточного протектора представляют собой и отдельные клетки, и клеточные конгломераты, как с сохраненной цитологической структурой, так и в состоянии частичной деструкции. Число жизнеспособных клеток колеблется от 1 до 5%.

3.В вышеуказанных препаратах ФТЧ выявлено 13 гормонов (пролактин, ЛГ, ФСГ, прогестерон, СТГ, ХГЧ, плацентарный лактоген, эстрадиол, ТТГ, сТ-3, сТ-4, кортизол, тестостерон) и 4 белка .зоны беременности (ПАМГ-1, АМГФ, АФП, ТБГ) в концентрации как равноценной сывороточному уровню здорового взрослого человека, так и превышающей его (прогестерон, ПАМГ-1, АМГФ, АФП, ХГЧ).

4.При однократном введении подопытным животным субтолерантных доз СФП и ЭП развивается акцидентальная инволюция тимуса (АИТ) ГГ-ГУ стадий без увеличения числа погибших клеток, что свидетельствует в пользу усиления миграции тимоцитов на периферию. Более выраженные стадии АИТ наблюдаются при имплантации мышам СФП. Введение клинических доз ФТЧ вызывает в тимусе подопытных животных АИТ I и Ш стадий с одновременным ростом процентного и абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов на весь орган, активацией пролиферативной активности тимоцитов.

5.Однократная имплантация 8-месячным мышам субтолерантных доз СФП и ЭП сопровождается снижением массы селезенки, уменьшением количества лимфоцитов и макрофагов на весь орган с одновременным увеличением в нём числа В-лимфоцитов и нормобластов. Клинические дозы ФТЧ вызывают увеличение массы селезенки и возрастание в ней абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов.

б.Однократное введение животным субтолерантной дозы ЭП повышает индекс стимуляции лимфоцитов селезенки после их активации Т- и В-клеточным митогеном с одновременным уменьшением спонтанной пролиферации спленоцитов. Клинические дозы СФП и ЭП вызывают у подопытных животных увеличение спонтанной пролиферации лимфоцитов селезенки, а также стабильное повышение ответа Т- и В-клеток на митогены.

7.При уменьшении массы селезенки и снижении суммарного количества лимфоцитов в ней диагноз иммунодефицитного состояния неправомочен. Для этого необходимо одновременное проведение тестов на функциональную активность лимфоцитов с применением элементов микроокружения (например, сыворотки крови).

8.Однократное введение животным разного количества препаратов ФТЧ вызывает в их костном мозге неоднозначные изменения. После имплантации субтолерантных доз СФП и ЭП в нем уменьшается процентное содержание В-лимфоцитов, увеличивается число Т-клеток, резко возрастает величина эритроидного ростка и количество молодых форм гранулоцитов. В костном мозге мышей, которые получали клинические дозы СФП и ЭП, напротив; увеличивается процентное содержание В-лимфоцитов, сегментядерных нейтрофилов, возрастает спонтанная пролиферативная активность ядросодержащих клеток.

9.Однократное введение 8-месячным мышам субтолерантных доз СФП и ЭП вызывает в печени экспериментальных животных картину неспецифического реактивного гепатита (НРГ) слабой степени активности. При имплантации клинических доз ФТЧ структура печени подопытных и контрольных животных почти не отличаются друг от друга.

Ю.Введение 8-месячным мышам эритроцитов барана вызывает АИТ 1-11 стадий, возрастание массы селезенки с резким увеличением в ней количества лимфоцитов, Т- и В-клеток на весь орган, слияние лимфоидных узелков в большие по площади образования. В красном костном мозге наблюдается рост процентного содержания эритрокариоцитов с одновременным сдвигом белого ростка кроветворения в сторону более зрелых клеточных форм. В паренхиме печени выявляются реактивные изменени, которые характерны для стрессорных состояний организма.

11.Многократная имплантация (7 ежедневных подсадок) КПФТЧ 12-меечным мышам до достижения субтолерантной дозы сопровождается развитием в селезенке картины ммунодефицитного состояния по клеточному и гуморальному типу, что проявляется обеднением лимфоцитами лимфоидных узелков органа, резким уменьшением в нём количества Т- и В-лимфоцитов на 1 мг ткани. Это делает непригодным для клиники данный режим введения ФТЧ.

12.При имплантации старым мышам КПФТЧ значительно задерживается процесс возрастной инволюции тимуса. Одним из механизмов этого является повышение митотической активности тимоцитов. В селезенке старых мышей после введения им КПФТЧ образуются новые лимфоидные узелки с одновременным уменьшением массы органа и снижением в нем общего числа лимфоцитов, увеличением процентного содержания В-клеток и мегакариоцитов. В костном мозге до 14 суток опыта снижается абсолютное количество Т-клеток, увеличивается число В-лимфоцитов, уменьшается абсолютное количество эритрокариоцитов и всех клеточных форм гранулоцитопоэза. На 42 сутки эксперимента вышеуказанные параметры превышают контрольные нормативы.

13.Полученные нами экспериментальные данные с определенной долей вероятности позволяют прогнозировать морфологические и функциональные изменения в органах иммунной системы, периферической крови и печени при клиническом использовании ФТЧ, а также дают возможность на основании

этого вносить коррективы в лечение того или иного заболевания с применением препаратов фатальных тканей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Рябчиков О.П.- Кинетика розеткообразующих клеток в лимфоидных органах эмбрионов и плодов человека. - Бюллет. экспер. биол. и мед., 1980,5, с.626-627

2.Хлыстова З.С., Шмелева С.П., Рябчиков О.П. и др.- Эмбриональный гистогенез печени человека и ее роль в развитии лимфоидной ткани.-Тез докл. Всесоюзной конференции «Гистогенез и регенерация».. Л., 198б,с.75

3.Хлыстова З.С., Рябчиков О.П., Шмелева СП. и др.- Поверхностные мембранные рецепторы лимфоцитов эмбриона и плода человека. -Тез. докл.

IY Всесоюзной конференции по патологии клетки.-М., 1987,с.122

4.Рябчиков О.П., Хлыстова З.С.- Становление Т-клеточного звена иммунной системы в пренатальном онтогенезе человека.- Усп. соврем, биол., 1986,вып.1,с.85-99

5.Хлыстова З.С, Шмелева С.П., Рябчиков О.П. и др.- Роль печени в развитии системы иммуногенеза у плода человека.- Тез. докл. Всесоюзного симпозиумам «Морфология и развитие органов иммунной системы»- Пермь, 1988, с.40

6.Шмелева С.П., Рябчиков О.П.- Некоторые иммуноморфологические параметры печени эмбриона и плода человека.- В сб.: «Актуальные вопросы современной гистопатологии.»- АМН СССР, НИИ морфологии человека и НИИ общей патологии и патологической физиологии. М., 1988, с.65

7.Хлыстова З.С., Поспишил М, Рябчиков О.П. и др.- Сравнительное исследование Т- и В-клеточных систем иммунитета в процессе эмбриогенеза человека и животных.-Онтогенез, 1988,т.19,с.327-331

8.Шмелева С.П., Хлыстова З.С, Рябчиков О.П.- О гетерогенности лимфоцитов печени плода человека.- Иммунология, 1989, с. 39-41

9.Рябчиков О.П., Шмелева СП. - Естественные киллеры в пренатальном онтогенезе человека.- В сб.: «Актуальные аспекты современной гисто- и цитопатологии.»- РАМН, НИИ морфологии человека РАМН., М., 1991,с.8б-91

10.Рябчиков О.П., Кириллов В.И., Шаров А.А.- Влияние аутосыворотки на пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови детей с пиелонефритом.- Там же, с. 92-96

11. Ю.Цыгин А.Н., Мишина И И., Рябчиков О.П. и др.- Уровень аполипопротеинов и бластная трансформация лимфоцитов у детей со стероидочувствительным нефротическим синдромом.- Иммунология, 199б,3,с.63-64

12. Цыгин А.Н., Рябчиков О.П., Мишина И.И., Пинелис В.В.- Влияние терапии преднизолоном на трансформацию лимфоцитов при стерои-дочувствительном нефротическом синдроме у детей." Тез. докл. 27 ежегодного конгресса Европейского общества педиатрической нефрологии.- ФРГ, Гайдельберг, 1993, с. 014

13.Рябчиков О.П., Шмелева С.П., Чуич Н.А и др.- Гемопоэтические клетки печени эмбриона и плода человека в норме и после аварии на Чернобыльской АЭС в зоне загрязнения.- Тез. докл. международного симпозиумам « Иммунология репродукции».- Киев, 1993, с. 108

14.Цыгин А.Н., Мишина И.И., Рябчиков О.П., Пинелис В.В.- Имму-норегулирующие свойства сыворотки крови и стероидочувствитель-ность у детей с нефротическим синдромом.- Тез. докл. IY международной конференции «Традиционные и нетрадиционные методы оздоровления детей.»-М., 1995с. 94-95

15.Рябчиков О.П., Шмелёва С.П.. Чуич Н.А. с соавт.- Влияние малых доз радиации на гемопоэз в печени эмбриона и плода человека I триместра беременности.- Арх. патол.,1995,2, с.61-64

16.М.Калинина И.И., Рябчиков О.П., Шмелева С.П. и др.-Иммуноморфологическое изучение органов иммуногенеза мыши после введения суспензии фетальных тканей человека.- В сб.: Трансплантация фетальных тканей и клеток человека.-М., 1996, с. 124-127

17.Хлыстова З.С, Шмелева С.П., Рябчиков О.П. и др.- Реакция печени мышей на введение фетальных тканей печени и плаценты человека.-Бюллет. экспер. биол. и мед., 1998, приложение 1, с. 176-178

18.Рябчиков О.П., Кузнецова Л.В., Шмелева С.П., Лобусов Е.В.- Проли-феративная активность лимфоцитов селезенки мышей Balb/c после введения экстракта плаценты и суспензии фетальной печени человека.- Бюллет. экспер. биол. и мед., 1998, приложение 1, с. 182-183

19.Рябчиков О.П., Кузнецова Л.В., Назимова С.В. и др.- Гормональный и клеточный состав препаратов фетальных тканей человека.- Бюллет. экспер. биол. и мед., 1998, приложение 1,с. 156-158

20.Рябчиков О.П., Хлыстова З.С., Шмелева С.П. и др.- О природе «тёмных» клеток селезенки мыши в ходе иммунного ответа на антиген.-В сб.: «Актуальные проблемы общей и частной патологии,»- РАМН, НИИ морфологии человека РАМН, М., 2000, с. 81-84

21.Рябчиков О.П., Шмелева С.П., Минина Т.А. и др.- К вопросу о постановке морфологического диагноза «иммунодефицит».- В сб.: « Актуальные проблемы общей и частной патологии.»- РАМН, НИИ морфологии человека РАМН, М., 2000, с. 49-51

22.Рябчиков О.П., Шмелева С.П.,Хпыстова З.С. и др.- Цитологическая характеристика красного костного мозга мышей линии Ва1Ь-с после имплантации фетальных тканей человека. - Бюллет.

экспер. биол. и мед., 2000,3, с. 340-343

23.Рябчиков О.П., Кириллов В.И., Цыгин А.Н., Мишина И.И.- Модулирующий

эффект аутологичной сыворотки крови на некоторые пара-метры

функциональной активности иммунокомпетентных клеток человека.- Бюллет.

экспер. биол. и мед., 2001, 10, с. 416-418

24.Хлыстова З.С, Калинина И.И., Рябчиков О.П. и др. - Иммунологичес-кая характеристика тимуса старых мышей линии СВА после имплантации фетальных тканей человека.- Успехи геронтологии, 2002, вып. 9, с. 101-104

25.Хлыстова З.С, Калинина И.И., Рябчиков О.П. с соавт.- Последовательность встраивания лимфоидных органов в развивающуюся иммунную систему плода человека и ее значение в перинатальной патологии.-Арх. патол., 2002,2,с. 16-19

26.Хлыстова З.С, Шмелева С.П.,Рябчиков О.П. с соавт. - Карта заселения органов иммунной системы эмбриона и плода человека Т- и В-лимфоцитами и начало эндокринной функции тимуса.-Иммунология, 2002,2, с. 80-82

27.Рябчиков О.П., Шмелева С.П., Хлыстова З.С. и др. - Красный костный мозг старых мышей линии СВА после имплантации фетальных тканей человека.-В сб.: «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии.»- РАМН, НИИ морфологии человека РАМН, М., 2003, с. 62-64

28.Рябчиков О.П., Работником Е.Л., Хлыстова З.С. и др.- Структура селезенки старых мышей после имплантации фетальных тканей человека.- В сб.: «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии.»-М., РАМН,НИИ морфологии человека РАМН, 2003,с. 64-66

29.Рябчиков О.П., Шмелева С.П., Хлыстова З.С. и др.- Возможная роль эпителиальных кист вил очковой железы.- В сб.: «Актуальны вопросы морфогенеза в норме и патологии.»- М., РАМН, НИИ морфологии человека РАМН, 2003, с. 68-69

30.Рябчиков О.П., Работникова Е.Л., Дубровина И.В. и др.- Пролиферативная активность клеток тимуса, селезёнки и красного костного мозга мышей линии Ва1Ь-с после имплантации животным суспензий фетальной печени и плаценты человека.- В сб.:» Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии.»- М., РАМН, НИИ морфологии человека РАМН, 2004, с. 103-104

Соискатель

"'чпография ордена "Знак почета" издательства МГУ 117234, Москва, Ленинские горы ?'-каз № 1270 Тираж 100 экз.

19