Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическое исследование наследственной предрасположенности к раку желудка

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое исследование наследственной предрасположенности к раку желудка"

На правах рукописи

Цуканов Алексей Сергеевич

МОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАКУ ЖЕЛУДКА

03 00 15 - «Генетика»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2008

2 2 СЕН 2008

003446851

Работа выполнена в ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Карпухин Александр Васильевич

доктор медицинских наук, профессор Мякоткин Валерий Андреевич доктор медицинских наук, профессор Акуленко Лариса Вениаминовна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита диссертации состоится « ^ » ^/¿'О^Л 2008 г в » часов на заседании

Диссертационного совета Д 00101601 в ГУ МГНЦ РАМН по адресу Москва, 115478, ул Москворечье, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ МГНЦ РАМН по адресу 115478, Москва, ул Москворечье, д 1

Автореферат разослан 2008]

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 001 016 01, доктор медицинских наук

Зинченко Р. А.

Актуальность темы.

Рак желудка (РЖ) относится к наиболее распространенным онкотогическим заболеваниям В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди женщин в России рак этой локализации занимает 3-е место и 2-е место у мужчин Ежегодно в нашей стране заболевает 46 тысяч человек, а одногодичная летальность составляет 56% [Давыдов М И, 2004]

Около 5-10% случаев рака желудка имеет семейную историю Молекулярной причиной предрасположенности к раку желудка с высоким риском (70-83%) являются наследуемые мутации в ряде генов К основным из них относятся гены CDH1, MLH1 и MSH2 Специфическим геном-супрессором семейного РЖ считают ген CDH1 Частота мутаций в этом гене варьирует от 0 до 10% от всех случаев семейного рака желудка в зависимости от этнической принадлежности изучаемой выборки Вероятность обнаружения мутации может быть повышена при использовании определенных критериев отбора семей [Brooks-Wilson A R et al, 2004]

Примерно у 10-20% семей с РЖ встречаются случаи рака толстой кишки [Oliveira С et al, 2003] Семьи с раком желудка могут соответствовать критериям синдрома наследственного неполипозного рака толстой кишки Данное заболевание, как правило, связано с наследуемыми мутациями в генах MLH1 и MSH2 Мутации в этих генах обнаруживают в семьях с РЖ и с раком толстой кишки, не отвечающих критериям наследственного неполипозного рака толстой кишки, а также в семьях с РЖ без случаев рака толстой кишки [Kim J С et al, 2001]

Частоты мутаций в генах предрасположенности к раку желудка различны в выборках из разных популяций мира В России указанные гены при семейном раке желудка ранее не были исследованы Восполнение этого пробела позволит внести существенный вклад в изучение особенностей мутационных процессов в разных популяциях Кроме того, число исследований ряда генов предрасположенности на одной и той же выборке семейного рака желудка в настоящее время не велико Проведение такого исследования позволит оценить вклад разных генов в семейную предрасположенность к раку желудка, значение чего усиливает существование популяционных особенностей

Мутации даже в нескольких известных генах в совокупности объясняют только часть случаев семейного РЖ Поиски дополнительных генов предрасположенности к РЖ до настоящего времени не дали результатов В связи с этим внимание исследователей обращается на изучение вариантов генов предрасположенности по однонуклеотидным полиморфизмам, которые могут выступать в качестве аллелей риска В пользу этого говорят данные о функциональном значении некоторых из них, в частности, в гене CDH1 Такие варианты могут быть ассоциированы и с риском спорадического РЖ

Определение характеристик вариаций в генах, связанных с возникновением рака желудка важно не только с фундаментальной точки зрения, но и для решения практических медико-генетических задач Основной причиной высокой смертности больных раком желудка является позднее выявление болезни Следовательно, вопросы своевременной диагностики и профилактики рака желудка весьма актуальны, так как запоздалая клиническая диагностика во многих случаях этого онкологического заболевания обусловливает существенное сокращение продолжительности жизни, несмотря на лечение

Изучение молекулярно-генетических причин предрасположенности к раку желудка создаст новые возможности для медико-генетического консультирования и профилактики заболевания

Цель исследования

Изучение молекулярно-генетических особенностей предрасположенности к раку желудка, основанное на анализе изменений первичной структуры генов СОН], МШ1, ШН2

Задачи исследования.

1 Изучение мутаций в генах СОН1, МШ1 и М$Н2 при семейном раке желудка

2 Изучение однонуклеотидных полиморфизмов в гене СВШ при семейном и спорадическом раке желудка и в контрольной выборке

3 Анализ гаплотшов в гене СОН1 по однонуклеотидным полиморфизмам и микросателлитным маркерам

Научная новизна исследования. Впервые изучены характеристики вариантов в генах СПШ, МШ1, М5Н2 на выборке семейного рака желудка в России Мутации в генах МШ1 и ШН2 обнаружены как в семьях с только раком желудка, так и включающих наряду с раком желудка рак толстой кишки При этом наибольшую частоту мутаций наблюдали в семьях с присутствием рака толстой кишки наряду с раком желудка Показана ассоциация с раком желудка генотипов -160АА и 2076ТТ в гене СОЯ/ Обнаружено синергическое влияние на риск развития рака желудка генотипов по вариантам -160С/А и 2076С/Т в гене СОН1 Вьивлено, что генотип 2076ТТ связан с риском развития рака желудка в присутствии генотипа -160СА и не приводит к повышению такого риска в присутствии генотипа -160СС С помощью гаплотипирования по микросателлитным маркерам показано отсутствие единого гаплотипа при вариантах риска по однонуклеотидным полиморфизмам в гене СВН1, что свидетельствует в пользу влияния на риск развития именно данных вариантов

Практическая значимость работы. Практическая значимость результатов настоящей работы обусловлена выявлением связи вариантов первичной структуры ДНК генов СОН1, МШ1 и ШН2 с возникновением семейного и спорадического рака желудка Выявленные мутаций в генах МШ1 и М5Н2 при семейном раке желудка, в том числе их высокая частота с присутствием в семье случая рака толстой кишки, имеют существенное значение для

практической ДНК-диагностики наследственной предрасположенности к раку желудка Обнаруженная ассоциация с раком желудка генотипов по однонуклеотидным полиморфизмам в гене CDH1 может служить основой для последующей разработки протокола диагностики повышенного риска развития рака желудка

Впедрение в практику. Результаты исследований и практические рекомендации внедрены в работу ГУ МГНЦ РАМН

Основные положения, выносимые на защиту.

1 При впервые проведенном исследовании особенностей первичной структуры генов CDH1, MLH1 и MSH2 среди российских пробандов с семейным раком желудка у 13% из них выявлены мутации в генах MLH1 и MSH2, что указывает на значение этих генов в возникновении наследственной формы рака желудка

2 Функционально значимый вариант -160 А/А в промоторном участке гена С Dill ассоциирован с заболеванием раком желудка как у больных семейной формой рака желудка, так и при спорадических случаях Генотип 2076ТТ связан с риском развития рака желудка в присутствии генотипа -160СА и не приводит к повышению риска в присутствии генотипа -160СС

3 Гаплотипирование по трем микросателлитным маркерам показало, что варианты 2076Т и -160А в гене CDH1 не находятся в составе какого-либо единого протяженного гаплотипа на одной хромосоме, что свидетельствует в пользу самостоятельного значения этих вариантов

Личное участие автора в получении научных результатов Основная часть исследований выделение ДНК, молекулярно-генетическая диагностика - полимеразная цепная реакция, рестрикционный анализ, метод SSCP, гетеродуплексный анализ, детекция в полиакриламидных гелях, изучение обнаруженных вариантов in silico, гаплотипирование при помощи микросателлитных маркеров, статистическая обработка результатов выполнена автором самостоятельно

Апробация работы. Основные результаты доложены на V Съезде Российского общества медицинских генетиков 2005, на Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний возможности и перспективы, 2006» и на конференциях European Human Genetics Conference 2007 и European Human Genetics Conference 2008

Публикации По теме диссертации опубликовано 9 научных публикаций, из них 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы и список литературы (96

5

источников, из них 90 зарубежных) Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и 22 таблицами

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сбор образцов крови пациентов, в основном из Москвы и Московской области, и анализ родословных семей пробандов осуществляли в Российском Онкологическом Научном Центре РАМН им Блохина с участием км н Л Н Любченко, км н МП Никулина, проф , дм н РФ Гарькавцевой

Критерием отбора при семейном раке желудка служило наличие у пробанда одного или более родственников 1/П степени родства, страдающего таким же заболеванием Среднее число больных членов семьи (I и II степени родства) в выборке составило 3 человека В выборку входили также пробанды с РЖ, в семьях которых были случаи рака толстой кишки Пробандов, как с семейным анамнезом, так и со спорадическим РЖ отбирали в выборку по мере их поступления в Онкологический Научный Центр при подтверждении наличия первичного данного заболевания у пробанда и выяснения семейной истории

В результате работы проведено мотекуляшо-генетическое исследование ДНК 241 человека (129 пациентов и 112 человек контрольной группы) Были исследованы 30 пробандов с семейньм РЖ и 99 пробандов со спорадическим РЖ Среди пробандов с семейньм РЖ 8 пациентов имели диффузную форму РЖ, 22 человека - интестинальную форму

Контрольную группу составили здоровые люди, в семьях которых не было случаев РЖ и рака толстой кишки Возраст участников контрольной выборки соответствовал диапазону возрастов пробандов с диагнозом РЖ

ДНК из лимфоцитов периферической крови выделяли с использованием инкубации в среде, содержащей протеиназу К и БОБ (0,5%, инкубация 3 часа при 55°С), с последующей экстракцией фенолом и хлороформом

Методом полимеразной цепной реакции с использованием 16 пар праймеров амплифицировали все 16 экзонов гена СОЯ/ с примыкающими частями интронов (50 - 100 п н ) [Вегх й й а1, 1998] Варианты первичной структуры амплифицированных фрагментов ДНК гена СйШ выявляли методом ввСР Электрофорез проводили в 6% полиакриламидном геле (трис-боратный буфер, рН=8,9)

Для амплификации всех экзонов гена МШ1 использовали 19 пар праймеров, гена М5Н2 -16 пар праймеров [КоЫпег Я й а1, 1994, 1995] Фрагменты генов ВКСА1 и ВКСА2 амплифицировали с помощью 88 пар праймеров Электрофоретическое выявление особенностей первичной структуры фрагментов ДНК этих генов проводили с помощью метода СвбЕ [Поспехова НИ и др, 2005] Электрофорез проводили в 10% полиакриламидпом геле (трис-глициновый буфер, рН=9)

Наличие возможных гаплотипов гена СРН1 было исследовано на основе анализа двух внутригенных полиморфных маркеров (каждый маркер представлен двумя аллелями) и 3 микросаттелитных повторов, изученных согласно базе данных http://www.gdb.org.

Для выяснения значения некоторых обнаруженных вариантов первичной структуры использовали программу предсказания сайтов сплайсинга Ке1Сепе2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2). Значения промоторных вариантов в генах СОН1 и МЬН1 изучали с помощью программы Оепотайх (http://www.genomatix.de).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием точного критерия Фишера. Для расчетов использовали программу 8Ш1вйса 6.0. Доверительный интервал для значений отношения шансов (Ой.) рассчитывали согласно работе [Реброва О.Ю., 2003].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование пробандов с семейным раком желудка на наличие мутаций в гене СОН1. Сформированная выборка больных семейным раком желудка соответствовала по структуре семейных форм этого заболевания наблюдаемым в других европейских популяциях [СШуеиа С., 2003]. Она включала около 30% больных наследственным диффузным раком желудка. Пробанды с раком желудка, в чьих семьях встречали рак толстой кишки и/или рак молочной железы, составили примерно 20% выборки.

У 30 пробандов группы семейного РЖ изучали первичную структуру генов СОЯ/, МЬН1 и МБШ, с которыми с наибольшей вероятностью связана наследственная форма РЖ.

При изучении первичной структуры ДНК гена СОН1 у пробандов группы семейного РЖ мутаций в гене СОЯ/ обнаружено не было, но было выявлено 3 редких однонуклеотидных

варианта: 1896С>Т в 12 экзоне; 2253С>Т в 14 экзоне и 531+ЮО>С в 4 интроне (рис. 1,2).

1234567 89

¡ним ■ ' ■ - 1 > 3 ■ ¡8 | г г вн «а рШр 1 ( С^ЩП

-

■"'■'-■■'•■.'• У:' ' ; -л."' •• 23а

•*-« - :

—*■ 12экзон ч— —► 14 экзон ч—

Рис. 1. Электрофоретическое разделение методом ЭвСР амплифицированных фрагментов ДНК гена СйН1. 3 лунка- 1896С/Т; 5 лунка- 2253С/Т; лунки 1, 2,4, 6, 7, 8,9 - норма.

7

с/с

130 но Д. iso

GGGTTCAGGTAGA GA А А С AAGTTCTCT GTT T

Рис. 2. Сиквенс фрагмента последовательности ДНК в районе полиморфизма NT 531+10G>C. Стрелкой указана замена нуклеотида G на С.

Поскольку в литературе существует подразделение РЖ по гистологическим типам и семейной истории, выборка была проанализирована с этой точки зрения. С учетом существующей классификации было выделено 3 группы: 1) больные наследственным диффузным раком желудка; 2) больные семейным интестинальным раком желудка; 3) больные раком желудка, в чьих семьях встречались рак толстой кишки и/или рак молочной железы.

Для выделения первой из указанных групп семей использовали критерии наследственного диффузного рака желудка, определенные Международным Консорциумом по Раку Желудка (IGCLC) [Caldas С. et al., 1999] с последующими дополнениями согласно работе [Brooks-Wilson A.R. et al., 2004]. Всего было выявлено восемь семей, отвечающих критериям наследственного диффузного рака желудка. Характеристика пробандов и их семей представлена в табл.1. Критерию 1а - два или более случаев рака желудка в семье, при этом один из них диффузный и диагностирован в возрасте до 50 лет - удовлетворяет 75% семей (табл. 1). Двое больных не имели родственников с РЖ, однако соответствовали критерию 3 -индивидуальный случай диффузного рака желудка, диагностированный в возрасте до 35 лет.

В данной группе был найден редкий вариант 2253С>Т, не приводящий к замене аминокислоты.

В группе из 16 больных семейным интестинальным раком желудка в семье в среднем встречали около 3-х больных раком желудка. Раки другой локализации в этих семьях отсутствовали. В этой группе больных редких вариантов в гене CDH1 не обнаружено.

Третья группа больных характеризовалась присутствием в семье, помимо РЖ, также рака толстой кишки и/или рака молочной железы. В семьях 4 пробандов кроме РЖ встречался

только рак толстой кишки, в одной семье - только рак молочной железы и еще одна семья имела как рак толстой кишки, так и рак молочной железы (табл 2)

Таблица 1 Характеристика семей с перстневидно-клеточным (диффузным) раком желудка у

пробанда и варианты в гене CDH1

Пробанд Возраст постановки диагноза диффузного рака желудка у пробанда Онкологические заболевания в семье Редкие вариапты последовательное ти ДНК в гене CDH1 Критерии наследственного диффузного рака желудка

Д1 59 РЖ-46 - Критерий 1а

Д2 48 РЖ - 74, РЖ - 22530Т (14 Экзон) Критерий 1а

дз 57 РЖ-50 - Критерий 1а

Д4 36 РЖ-40 - Критерий 1а

Д5 36 4РЖ - 34,20 42,68 - Критерий 1а

Дб 16 - - Критерий 3

Д7 16 - - Критерий 3

Д8 26 РЖ-56 - Критерий 1а

У пробандов данной группы выявлено два редких варианта 531+1(Ю>С в 4-м интроне гена СОН1 и 1896С>Т в 12-м экзоне этого гена (табл 2)

Таблица 2 Варианты в генах СйН1 у пробандов с раком желудка и присутствием других типов

рака в семье

Пробанд Возраст постановки диагноза рака желудка у пробанда Возраст постановка диагноза другого первичного рака у пробанда Онкологические заболевания в семье Редкие варианты последовательности ДНК в гене CDH1

РДЛ 1 26 29-РТК РТК-38, 50 531+10G>C

РДЛ 2 60 62- РТК РЖ-63 РМЖ-36 18960Т

РДЛЗ 55 - РЖ-58 РТК-56 -

РДЛ 4 54 - РЖ-44,70 РТК-60 -

РДЛ 5 53 43- РМЖ 46-РЯ 56- РТК РТК-42,42,30,56 -

РДЛ 6 61 36- РТК РТК-55 -

Ряд авторов рассматривают редкие варианты генов в качестве низкопенетрантных аллелей риска возникновения заболевания [Bodmer W et al, 2005] Один из найденных нами вариантов в гене CDHI - 2253С>Т - был охарактеризован как ассоциированный с риском развития РЖ при семейных случаях [Zhang Y et al, 2006] Однако в силу низкой частоты таких

9

вариантов, затрудняющей исследование ассоциаций, и отсутствия информации об их функциональном значении, окончательные суждения об их роли для риска РЖ преждевременны

В результате исследования, в исследованной российской выборке семейного РЖ мутаций в гене CDHI обнаружено не было В ряде работ по изучению выборок РЖ из других популяций, сформированных без отбора на соответствие критериям НДРЖ [Zhang Y et al, 2006, Keller G et al, 2005, Avizienyte E et al, 2001, hda S et al, 1999], были получены аналогичные или близкие результаты Так, в финской выборке семей с РЖ [Avizienyte Е et al, 2001] и в японской выборке пациентов мутаций в гене CDH1 найдено не было [Iida S et al, 1999] Не было обнаружено мутаций и в китайской выборке из 101 семьи, хотя авторы данной работы считают найденные редкие варианты в гене CDH1 молекулярной причиной риска РЖ [Zhang Y et al, 2006] При исследовании выборки из 30 семей с РЖ в Германии было обнаружено 2 мутации в гене CDH1, однако это значение статистически не отличается от отсутствия мутаций в российской выборке

Поскольку вероятность обнаружения мутации в гене CDH1 может быть связана с гистологическими характеристиками РЖ, мы проанализировали имеющиеся данные по семьям, удовлетворяющим критериям НДРЖ В нашей выборке было восемь семей, удовлетворяющих критериям наследственного диффузного РЖ, среди которых не было обнаружено мутаций в гене CDH1 В целом, к настоящему времени большинство мутаций в гене CDH1 (70%) найдено в семьях, соответствующих критериям 1, 1а и 2 В нашей выборке не было семей с диффузным РЖ у родственников пробанда (критерий 1), но присутствовало 6 семей, соответствующих критерию 1а Авторы работы [Gianpaolo S et al, 2005] у пробандов таких семей в 30% случаев обнаружили мутации в гене CDH1 Частота мутаций в гене CDH1 среди исследованных ранее семей, соответствующих критерию 3, составила в среднем около 3 % [Bacani В et al, 2006] Следовательно, вероятность обнаружения мутации у пробандов двух семей в нашей выборке, соответствующих критерию 3, была невелика Наши данные по изучению мутаций в гене CDH1 среди российских больных с наследственным диффузным РЖ наиболее близки к результатам, полученным на подобных выборках в Италии, Финляндии, Японии, в которых не было найдено мутаций [Oliveira С, 2003]

На основании различий частот мутаций в гене CDH1, полученных на выборках из разных популяций, некоторые авторы высказывают предположение о наличии обратной корреляции частоты наследственных мутаций в гене CDH1 с уровнем распространенности РЖ в популяции Как предполагают, в странах с наиболее высокой заболеваемостью РЖ (Япония, Португалия, Германия и др ) может наблюдаться наименьшая частота мутаций в гене CDH1 Наоборот - в странах с наименьшей заболеваемостью РЖ (США, Канада, Англия, Финляндия и др) может быть высокая частота мутаций в этом гене [Gianpaolo S et al, 2005] Действительно,

если провести статистическое сравнение результатов по частоте мутаций в гене CDH1, полученной в Англии (4 среди И семей) и в Японии (0 среди 19 семей), то различие будет значимым (р=0,012) Сравнение же, например, аналогичных результатов, полученных в Финляндии (0 среди 5 семей) и Германии (2 среди 30 семей) показывает отсутствие значимых различий (р=0,53) По-видимому, для подтверждения данной гипотезы необходимы дальнейшие исследования Наблюдаемая в России частота РЖ (36/100000) может быть оценена как средняя в ряду других стран (например, США - 8/100000, Япония - 69/100000) Однако в нашей выборке мутаций в гене CDH1 не было найдено

Полученные результаты не позволяют считать частоту мутаций в гене CDH1 среди больных семейным, в том числе диффузным, РЖ в России сниженной по сравнению с соответствующими частотами в других популяциях, которые во многих случаях низки Для конкретизации значений этих частот необходимы дальнейшие исследования на выборках большего объема, как в России, так и в других странах

В то же время, к наследственной форме РЖ могут приводить мутации и в других генах-супрессорах Соотношение мутаций в разных генах-супрессорах на одной и той же выборке семейного РЖ ранее не было исследовано

Исследование пробандов с семейным раком желудка на наличие мутаций в генах MLH1 и MSH2. Была изучена первичная структура ДНК генов MLH1 и MSH2 на всей выборке пробандов с РЖ

В этих генах было обнаружено 4 мутации, одна из которых является новой, и новый промоторный вариант (табл2 1) Мутации 1990-2A/G, 1852_1854deLAAG и 1387-8G>T встречались в других популяциях и представлены в базе данных Mismatch Repair Genes Variant Database (http //www med mun ca) Мутация P355L и промоторный вариант -7С>Т обнаружены впервые

Таблица 2.1 Мутации в генах MLH1 и MSH2 у больных с РЖ и с разной частотой рака толстой кишки и РЖ в семье

Вариант Ген Участок гена Тип варианта Онкологические заболевания в семье

P355L MIHI 12 экзон Миссенс-мутация РЖ-67 РЖ-62

delAAG MLH1 16экзон Деления РТК-42,42,30,56

1990-2A>G MLH1 17 интрон Мутация сайта сплайсинга РТК-38,50

1387-8G>T MSH2 8 интрон Мутация сайта сплайсинга РЖ-58 РТК-56

-70Т MIHI Промоторная область Промоторный вариант РЖ-58 РЖ-62

Мутации 1990-2A/G в гене MLH1 и 1387-8G>T в гене MSH2 являются мутациями сайта сплайсинга [Kruger S et al, 2004] Значение мутации 1387-8G>T в гене MSH2 было подтверждено нами также с помощью программы анализа сайтов сплайсинга В последовательности с мутацией программа показала значимое увеличение веса критического сайта сплайсинга Патогенное значение мутации 1852_1854delAAG в гене MLH1, приводящей к потере аминокислоты, было обоснован о в работе [Samowitz W S et al, 2001]

Поскольку промоторный вариант -70Т отсутствовал в базе мутаций и полиморфизмов по гену MLH1 и в доступной литературе, было проведено выяснение его возможного значения in silico Было показано, что при аллельном состоянии Т транскрипционный фактор способен связываться с вероятностью менее 0,7, в то время как для аллеля С она составляет 1 То есть, данный редкий вариант может иметь функциональное значение и, следовательно, играть роль в возникновении РЖ Найденная нами мутация P355L также оказалась новой Она приводит к замене аминокислоты Pro на Leu и является миссенс-мутацией Как известно, миссенс-мутации не всегда являются патогенными В то же время, в гене MLH1 подавляющее число миссенс-мутаций (93%) патогенны [Gorlov I et al, 2003] Авторы данной работы показали существование 4-х экзонных участков с накоплением патогенных миссенс-мутаций и практическим отсутствием незначимых для риска заболевания Найденная нами миссенс-мутация P355L находится в одном из таких участков Приведенные факты с высокой вероятностью указывают на патогенное значение мутации P355L

Следовательно, частота мутаций в генах MLH1 и MSH2 у больных семейным РЖ составила 13% (4/30)

При анализе семейной истории у носителей мутаций в этих генах было выяснено, что большинство из них относятся к группе семей, где наряду с РЖ встречается рак толстой кишки Интересно, что в одной из этах семей (РДЛ 1) рак толстой кишки встретился лишь однажды и дважды - РЖ Две другие семьи с мутацией удовлетворяли Амстердамским критериям наследственного неполипозного рака толстой кишки [Randall W et al, 2000] Однако мутация P355L, а также промоторный вариант -7С>Т, который, по-видимому, имеет функциональное значение, были обнаружены у пробандов с РЖ, в чьих семьях встречался только РЖ и отсутствовал рак толстой кишки Поскольку значение варианта -70Т для риска РЖ еще предстоит уточнить, мы статистически сравнили частоты мутаций в генах MLH1 и MSH2 среди семей с только РЖ и семей, включающих также раки другой локализации Было получено значимое превышение частоты мутаций среди семей, включающих рак толстой кишки наряду с РЖ (Р=0,009)

В нашем исследовании был доступен образец ДНК родственницы с раком толстой кишки одного из пробандов с мутацией в гене MLHI, имевшего в качестве первого заболевания

РЖ У матери пробанда семьи РДЛ 1 были проанализированы варианты в генах CDH1 и MLH1, найденные у пробанда.

У пробанда этой семьи наряду с мутацией 1990-2A/G в гене MLH1 присутствовал редкий вариант 531+10G>C в 4-м интроне гена CDH1 Первым заболеванием пробанда в возрасте 26 лет стал рак желудка, вторым - рак толстой кишки в возрасте 29 лет В семье по линии матери наследовался рак толстой кишки, который был диагностирован у матери в возрасте 38 лет Заболевания РЖ у матери не было В гене MLH1 у матери пробанда была найдена мутация 1990-2A/G, однако вариант 531+10G>C в гене CDH1 отсутствовал

Этот результат подтверждает связь обоих типов рака - РЖ и толстой кишки - с одной и той же мутацией в гене MLH1 Нельзя исключить, что наличие варианта в гене CDH1 только у больного РЖ может быть связано с локализацией рака

Для дальнейшего выяснения генов, влияющих на риск РЖ в третьей группе семей, геномы двух пробандов с присутствием в семье рака молочной железы были изучены на наличие мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 Мутаций в этих генах не было найдено

По данным литературы, РЖ встречается в семьях с мутациями в генах-супрессорах BRCA1 и BRCA2, ответственных преимущественно за возникновение рака молочной железы и рака яичников Так, при изучении в Швеции наследственного рака молочной железы и рака яичников, обусловленного мутациями в генах BRCA1 и BRCA2, было показано, что частота РЖ в возрасте до 70 лет в таких семьях вдвое выше среднепопуляционной [Bermejo J et al, 2004] Тем не менее, в исследованной нами семье мутации в генах BRCA1 и BRCA2 не было обнаружено Следует отметить, что при 70% - 80% случаев семейного рака молочной железы и рака яичников не обнаруживается мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 По крайней мере, за возникновение части таких семей ответственны мутации в других генах [Erkko Н et al, 2007] Нельзя исключить существование другого гена-супрессора (помимо BRCA1 и BRCA2), ответственного за наследственную предрасположенность к раку и в этой семье

Помимо рассмотренных генов-супрессоров, наследственный РЖ может быть обусловлен также мутациями в генах MLH1 и MSH2 Как правило, мутации в этих генах обнаруживают в семьях с наследственным неполипозным раком толстой кишки В семьях с этим синдромом нередко встречается РЖ В Финляндии была исследована 51 семья, отвечающая критериям наследственного неполипозного рака толстой кишки Примерно у 11% больных раком членов этих семей был РЖ, и основная часть доступных для исследования больных РЖ имели мутации в генах MLH1 и MSH2 [Aarnio М et al, 1997] Существенно, что мутации в этих генах обнаруживают также в семьях с РЖ, не удовлетворяющих указанным критериям, а также при отсутствии рака толстой кишки в семье [Kim J С et al, 2001]

В нашей работе из 30 изученных семей с РЖ у пробандов, патогенные мутации в генах MLH1 и MSH2 были найдены в четырех семьях (13%), еще в одной семье встретился

потенциально патогенный промоторный вариант Две из изученных нами семей с РЖ и раком толстой кишки удовлетворяли критериям наследственного неполипозного рака толстой кишки Мутации в гене MLH1 были обнаружены у пробандов обеих таких семей В одной из двух семей с несколькими случаями РЖ и только одним случаем рака толстой кишки была найдена мутация в гене MSH2

Эти семьи не могут быть отнесены к синдрому наследственного неполипозного рака толстой кишки При исследовании семей с одним или несколькими случаями РЖ и рака толстой кишки в Южной Корее, мутации в генах MLH1 и MSH2 были найдены в 54,5% случаев [Kim J С et al, 2001] В нашей работе, среди семей со случаями РЖ и малым числом рака толстой кишки встретилась одна мутация в соответствующих генах среди трех семей То есть, совокупность полученных нами и другими авторами [Kim J С et al, 2001, Aarnio M et al, 1997] данных указывает на высокую частоту мутаций в генах MLH1 и MSH2 при отягощенности семей РЖ и раком толстой кишки Кроме того, в семьях, где встречался только РЖ, были обнаружены промоторный вариант -7С>Т и миссенс-мутация P355L Первый вариант, в соответствие с данными m silico, может бьггь связан с пониженным уровнем транскрипции гена MLH1 и, следовательно, влиять на риск заболевания Встречаемость мутаций в семьях с наследованием РЖ без присутствия в семье других раков в нашей выборке, с учетом варианта -7С>Т, составила 2/24 (8,3%), без учета этого варианта 1/24 (4,1%) В работе [Kim J С et al, 2001] на аналогичной выборке было получено значение 9,4% (3/32)

Особый интерес, как наименее исследованные, представляют типы семей с РЖ и раком толстой кишки, в которых характеристики рака толстой кишки не соответствуют критериям наследственного неполипозного рака толстой кишки В российской выборке семей с раком толстой кишки, выбранных независимо от встречаемости других типов рака и не удовлетворяющих критериям наследственного неполипозного рака толстой кишки, частота мутаций составила около 7% [Карпухин А В и др , 2006] В то же время, в настоящей работе, при наличии случаев РЖ и низкой встречаемости рака толстой кишки в семье, мутация встретилась в одной из трех семей Повышенную частоту мутаций в генах MLH1 и MSH2 среди семей с РЖ и раком толстой кишки без синдрома наследственного неполипозного рака толстой кишки по сравнению с семьями, не удовлетворяющими критериям наследственного неполипозного рака толстой кишки, и без случаев РЖ, получили в работе [Kim J С et al, 2001] -54,5% и 22,2% случаев, соответственно Приведенные данные позволяют предположить, что семьи с несколькими случаями РЖ и рака толстой кишки, не соответствующие критериям наследственного неполипозного рака толстой кишки, представляют собой особый синдром, с высокой частотой обусловленный мутациями в генах MLH1 и MSH2 Еще более интересно, что мутации в генах MLH1 и MSH2 встречаются в семьях только с РЖ

Таким образом, резучьтаты работы по исследованию российской выборки семейного РЖ, по структуре соответствующей соотношению семей разных типов в популяции демонстрируют, возможно, большую роль генов MLH1 и MSH2, по сравнению с геном CDH1, в возникновении семейной формы РЖ

Изучение полиморфизмов -160С/А и 2076СЛГ в гене CDH1 па выборке спорадических и семейных больных РЖ и в контрольной выборке. Изучали варианты -160С/А и 2076С/Т в гене CDH1 Вариант -160С/А находится в промоторном участке гена CDH1 Возможное функциональное значение этого полиморфизма бьио оценено с помошью программы анализа промоторных вариантов (Genomatix) Было выявлено с вероятностью 95,8% появление нового транскрипционного фактора при варианте -160А по сравнению с вариантом -160С Этот результат подтверждает экспериментально наблюдавшееся на искусственной системе снижение эффективности транскрипции А-аллеля по сравнению с С-агшелем [Li L et al, 2000]

С использованием программы анализа сайтов сплайсинга (http //www cbs dtu dk/services/NetGene2) исследовали значение полиморфизма 2076С/Т, локализованного в 13ом экзоне гена CDH1 В последовательности ДНК с вариантом 2076Т программа показала заметное уменьшение веса акцепторного сайта сплайсинга по сравнению с вариантом 2076С (0,32/0,29)

Следовательно, результаты, полученные m silico, дают указания на функциональное значение вариантов -160С/А и 2076С/Т в гене CDH1

Варианты -160С/А и 2076С/Т в гене CDH1 были исследованы на выборке из 99 больных спорадическим РЖ и выборке 112 контрольных образцов Результаты генотипирования по варианту -160С/А даны в табл 3

Таблица 3 Генотипы по варианту -160С/А среди больных РЖ и в контрольной выборке

________ Генотип Выборка С/С С/А А/А

Больные спорадическим РЖ 52 40 7

Контроль 77 44 1

Гетерозиготный генотип -160С/А при спорадическом РЖ встретился у 40 из 99 больных (40,4%) и у 44 из 112 человек в контроле (39,9%), то есть, с одинаковой частотой в этих двух случаях (OR=1,05, р=0,88) В то же время, частота генотипа -160А/А в гене CDH1 среди больных спорадическим РЖ составила 7,1% и только 0,9% в контроле Частота генотипа -160А/А была статистически значимо повышена у больных РЖ по сравнению с контролем (р=0,02, OR=8,4)

Частота аллеля -160А в изученной контрольной выборке была аналогична частоте этого варианта в выборках из других популяций [ОЬуеяа С е1 а), 2003] Таблица 4 Генотипы по варианту 2076С/Т среди больных РЖ и в контрольной выборке

Генотип Выборка ------ С/С С/Т Т/Т

Больные спорадическим РЖ 43 45 11

Контроль 55 52 5

Частоты гетерозиготных генотипов 2076С/Т у больных со спорадическим РЖ (45,5%) и в контрольной выборке (46,4%) были одинаковыми (ОЯ=0,94, р=0,89) Частоты гомозиготных генотипов 2076Т/Т в гене СТЗШ составили 11,1% среди больных спорадическим РЖ и 4,5% в контроле Хотя частота данного генотипа была повышена у больных РЖ по сравнению с контролем (ОЯ=2,б7), однако данное различие не было статистически значимым (р=0,059)

Частота варианта 2076Т в изученной контрольной выборке была аналогична частоте этого варианта в выборках из других популяций [01^е1га С е1 а1,2003]

Частоты обоих генотипов соответствовали соотношению Харди-Вайнберга Полученные результаты демонстрируют ассоциацию гомозиготного генотипа -160А/А в гене СВН1 со спорадическим РЖ и тенденцию к повышению частоты гомозиготных генотипов 2076Т/Т среди больных по отношению к контролю Далее было рассмотрено совместное влияние генотипов по вариантам -160С/А и 2076С/Т в гене СйН1 на риск РЖ Генотипы по этим двум изученным вариантам у больных РЖ и в контроле представлены в табл 5 и 6 Таблица 5 Генотипы по вариантам-160С/А и2076С/Т у больных спорадическим РЖ

^~~~~^£енотип по варианту ^-\ 207бС/Т Генотип варианту -160С/А"\_ СС ст тт

СС 25 24 3

СА 15 17 8

АА 3 4 0

Таблица 6 Генотипы по вариантам -160С/А и 2076С/Т в контроле

фенотип по варианту ^2076С/Т Генотип по варианту -160С/А СС СТ ТТ

СС 35 27 5

СА 19 25 0

АА 1 0 0

При анализе данных в табл 6, прежде всего, обращает внимание отсутствие в контрочыюй выборке генотипов, включающих гомозиготу по редкому аллелю какого-либо из изученных вариантов и одновременно другой вариант в гетерозиготном или гомозиготном по редкому аллелю состоянии В то же время, частота генотипа 2076Т/Т и -160С/А среди больных РЖ составила 8,1%, генотипа -160А/А и 2076С/Т - 4% Данные различия статистически значимы - (СЖ=9,8, р=0,002) и (011=4,7, р=0,047), соответственно Частоты генотипа 2076Т/Т в присутствии варианта -160С/С среди больных и в контроле не различаются (Х2=0,3, р-0,59, 011=0,69) Частоты гомозиготного генотипа -160А/А при варианте 2076С/С среди больных по сравнению с контролем также статистически значимо не отличаются (Х2=1,44, р=0,23,011=3,5) Следовательно, ассоциация с РЖ каждого из изученных гомозиготных генотипов по редкому аллелю связана с присутствием в гене С0Н1 хотя бы одного редкого аллеля по другому однонуклеотидному полиморфизму Особенно ярко это проявляется в случае генотипа 2076Т/Т, статистически значимой ассоциации с которым без учета генотипов по варианту -160С/А не было выявлено В то же время, генотип 2076Т/Т совместно с вариантом -160С/А демонстрирует сильную связь с риском РЖ (011=9,8), тогда как в присутствии варианта -160С/С значение ОЯ не превышает единицу Аналогичная картина наблюдается в случае генотипа -160А/А, хотя, при отсутствии статистической значимости, значение 011=3,5 в присутствии варианта -160С/С выше единицы

Суммарная частота генотипов (2076Т/Т + -160С/А) и (-160А/А + 2076С/Т) составила 12,1% у больных РЖ при отсутствии таких генотипов в 112 образцах контрольной выборки (р=0,0001,011=15,44)

Характеристики генотипов по вариантам -160С/А и 2076С/Т в гене СИН! были изучены также на выборке больных семейньм РЖ (30 больных)

Встречаемость генотипов по этим вариантам представлена в табл 7 и 8 Таблица 7 Генотипы по варианту -160С/А в гене СРН1 среди больных семейньм РЖ

Генотип С/С С/А А/А

Больные семейным РЖ 12 15 3

Вариант -160С/А встретился у 15 из 30 пробандов с семейным РЖ (50%) и, в сравнении с данными контрольной выборки (39,9%), не показал ассоциации с заболеванием (р=0,3,011=1,5) Частота варианта -160А/А в гене СйН1 составила 10% среди больных семейным РЖ и, в сравнении с частотой в контрольной выборке (0,9%), была достоверно повышена (р=0,03, 011=12,3)

Таблица 8 Генотипы по варианту 2076С/Т в гене СРН1 среди больных семейньм РЖ

Генотип С/С С/Т Т/Т

Больные семейным РЖ 6 19 5

Вариант 2076С/Т встретился у 19 из 30 пробандов с семейным РЖ (63%) и в сравнении с данными контрольной выборки (46,4%) не показал ассоциации с РЖ (р=0,15 , (Ж=1,99) Частота варианта 2076Т/Т в гене СЭН1 среди больных семейным РЖ составила 16,6%, что существенно выше частоты в контрольной выборке (4,5%) (р=0,035, <Ж=4,28)

То есть, результаты по ассоциации исследуемых генотипов при семейном РЖ аналогичны данным, полученным при спорадическом РЖ При семейном РЖ наблюдаются более высокие значения риска, ассоциация генотипа 2076Т/Т статистически значима, несмотря на меньший объем выборки

Было рассмотрено значение одновременного присутствия различных генотипов по вариантам -160С/А и 2076С/Т в гене СОШ Результаты представлены в табл 9 Таблица 9 Генотипы по вариантам-160С/А и 2076С/Т среди больных семейным РЖ

по варианту СС ст тт

Генотип по .

варианту -160С/А

СС 3 8 1

СА 2 10 3

АА 1 1 1

При анализе данных в табл 9 и их сравнении с данными табл 6 (контрольная выборка), найдено, что частоты генотипов (2076ТЛГ + -160С/С) и (-160А/А + 2076С/С) при семейном РЖ и в контроле не различаются (р=0,21) Генотип (2076Т/Т + -160С/А) имел высокую ассоциацию с РЖ при семейных случаях (р=0,009, 011=12,3) Частота генотипа (-160А/А + 2076С/Т) статистически значимо не отличалась от таковой в контроле, но при объединении его частоты с частотой полностью гомозиготного генотипа (-160А/А + 2076Т/Т) наблюдали повышенную суммарную частоту (р=0,043, 011=7,9) Общая частота генотипов риска составила 16,6% (р=0,0009,011=19,1)

Среди семейных случаев впервые был обнаружен генотип, гомозиготный по обоим изучаемым вариантам (-160А/А + 2076Т/Т) Этот генотип был у женщины-пробанда, у которой РЖ возник в 29 лет У ее бабушки также был РЖ

Учитывая, что выборки семейных и спорадических больных РЖ при статистической проверке показали однородность по частотам вариантов -160С/А и 2076С/Т гена СйН1, для получения более представительной выборки данные по ним были объединены (табл 10)

Результаты сравнения данных в табл 10 с генотипами в контрольной выборке (табл 6) даны в табл 11

Таблица 10 Генотипы по вариантам -160С/А и 2076С/Т гена СПН1 среди больных РЖ

^"-£|нотип по варианту Генотип варианту -160С/А —^ СС СТ ТТ

СС 28 32 4

СА 17 27 11

АА 4 5 1

Таблица 11 Значения уровней значимости (р) и отношений шансов (СЖ) для частот генотипов по вариантам -160С/А и 2076С/Т гена СОН1 среди больных РЖ по сравнению с контролем

--фенотип по варианту Генотип по варианту -160С/А СС СТ ТТ

СС 011=0,6 р=0,1 оя=1,оз р=1,0 011=0,69 р=0,7

СА 011=0,74 р=0,5 011=0,92 р=0,87 011=10,4 р=0,001

АА 011=3,5 р=0,38 011=5,4 р=0,032

ок=9,3 р=0,01

Частоты генотипов (-160А/А + 2076С/Т) и (-160А/А и 2076Т/Т) были объединены в силу низкой частоты Значения уровней значимости оценены с помощью точного критерия Фишера

Данные, полученные при анализе генотипов в объединенной выборке больных РЖ, весьма схожи с результатами, полученными с использованием выборок как спорадического, так и семейного РЖ Однако увеличение объема выборки позволяет сделать некоторые дополнительные заключения В частности, отчетливо проявляется, что присутствие варианта 2076Т при генотипе -160А/А (ОЯ=5,4, р=0,032) вносит существенно меньший вклад в значение риска РЖ, нежели присутствие варианта -160С/А при генотипе 2076ТТ (011=10,44, 95% ДИ 1,32 - 79,56, р=0,001) При генотипе -160АУА, независимо от генотипов по варианту 2076С/Т, отношение шансов ОК(АА) = 9,3, 95% ДИ 1,18-65,84, р=0,01, в то время как аналогичные характеристики для генотипа 2076ТТ составляют ОЩТТ) = 3, р=0,038 При этом, отношение шансов для частот генотипа -160А/А при варианте 2076СС, хотя и не явтяется статистически

19

значимым, выше единицы ((Ж=3,5), а для генотипа 2076ТТ в присутствии того же варианта -не превышает единицу ((Ж=0,69).

Продемонстрируем частоты генотипов, ассоциированных с РЖ, с помощью следующих схем (рис.3).

Генотипы, обозначенные номерами 1 и 2, ассоциированы с РЖ и встретились только у больных. В объединенной выборке больных РЖ их частота в сумме составила 13,1%. Среди 112 контрольных образцов эти генотипы отсутствовали. Генотип под номером 3 также был ассоциирован с РЖ и встречался среди больных с частотой 3,1%. Его частота в контроле составила 0,89%. Таким образом, суммарная частота трех генотипов, ассоциированных с РЖ, составила среди больных 16,2% против 0,89% в контроле.

Как следует из результатов анализа, основная часть генотипов риска РЖ (13,1%, генотипы под номерами 1, 2 на рис. 3) имеет в своем составе варианты -160А и 2076Т на одной хромосоме. Это обстоятельство вызывало вопрос, не включены ли варианты -160А и 2076Т в гене СОН1 в состав более протяженного гаплотипа. Для ответа на этот вопрос было проведено гаплотипирование гена СОН1 по микросателлитным маркерам.

1 2 3

Больные Контроль

Больные Контроль

Больные Контроль

Т

,4%

0%

А|

Т

А

С

4,7%

0%

А|

А С С

II

А С

3,1% 0,89%

Рис. 3. Схемы генотипов, ассоциированных с РЖ, и частота их встречаемости у больных пробандов и в контроле.

Гаплотипирование гена СОН1 по микросателлитным маркерам. Поскольку в пределах гена СОН1 микросателлитные последовательности ДНК отсутствуют, для исследования были выбраны ближайшие к этому гену известные микросателлитные маркеры: 01683095, 0168421 и Ш 65752.

Гаплотипирование проводили на образцах ДНК больных РЖ, имеющих генотипы, включающие гаплотип -160А, 2076Т в гене СОН1 (генотипы под номерами 1, 2 на рис.3).

Хотя семь из восьми исследованных генотипов по однонуклеотидным полиморфизмам в гене CDH1 являются идентичными (-160АС/2076ТТ), генотипы по микросателлитным маркерам весьма разнообразны Генотип -160АА/2076ТТ по каждому из трех микросателлитных маркеров был гетерозиготен

При исследовании ближайшего к гену CDH1 микросателлитного маркера 16S3095 наиболее часто был представлен аллель 152 - он встретился у 4 больных Для проверки частоты встречаемости этого аллеля при других генотипах по однонуклеотидным полиморфизмам в гене CDH1, было проведено гаплотипирование по микросателлитным маркерам индивидуумов с генотипом -160С/С и 2076С/С

Аллель 152 маркера D16S3095 в этой выборке встретился у 4 из 9 человек, не имеющих гаплотипа -160А/2076Т в гене CDH1

Подобные результаты были получены при исследовании микросателлита D16S421 У больных с генотипом, включающем гаплотип -I60A/2076T по однонуклеотидным полиморфизмам в гене CDH1, наиболее часто был представлен аллель 214 - он встретился у 5 больных Данный аллель в контрольной выборке (генотип -160С/С и 2076С/С) встретился среди 7 из 13 индивидуумов

Следовательно, полученные данные указывают на отсутствие единого протяженного гаплотипа по ближайшим к гену CDH1 микросателлитным маркерам, в состав которого могли бы входить варианты -160А/2076Т по однонуклеотидным полиморфизмам в гене CDH1 Эти результаты свидетельствуют в пользу патологического действия непосредственно вариантов -160А и 2076Т, а не некоего другого изменения в последовательности ДНК гена CDHI, сцепленного с гаплотипом -160А/2076Т

Авторы работы [Humar В et al, 2002] на основании частот гаплотипов -160А/2076Т при РЖ и в контроле, полученных расчетным путем, приюти к заключению о повышенном риске РЖ при наличии указанного гаплотипа Наши результаты по гаплотипированию с помощью микросателлитных маркеров, совместно с данными по ассоциации однонуклеотидньгх полиморфизмов в гене CDH1, демонстрируют, что присутствие гаплотипа -160А/2076Т в генотипе, связанном с риском РЖ, является скорее следствием гомозиготности по 2076Т в присутствии гетеро- или гомозиготы по -160А Генотип -160АА является самостоятельным вариантом риска, хотя дополнительное присутствие варианта 2076Т, видимо, увеличивает уровень ассоциации с РЖ Следует также отметить близкие частоты аллелей микросателлитных маркеров D16S3095 и D16S421 среди больных РЖ и в контроле, что также свидетельствует против связи найденных ассоциаций с иными, помимо изученных в настоящей работе, модификациями в гене CDH1

Как уже отмечалось выше, замена С/А в положении -160 промотора гена CDH1 приводит к существенному понижению его транскрипционной активности По-видимому, снижение

экспрессии гена при заменах С/А в обоих аллелях гена СИН1 может приводить к запуску процесса злокачественной трансформации клеток желудка Относительно функционального значения замены С/Т в 13ом экзоне гена СОН1 имеются только полученные нами ш бШсо данные о ее влиянии на функционирование сайта сплайсинга Возможно, в результате этой замены могут образовываться не канонические продукты сплайсинга. В то же время, необходимость для повышенного риска РЖ присутствия дополнительно к этой замене варианта -160А может свидетельствовать и о значении варианта 2076Т для экспрессии гена СйН1

ВЫВОДЫ

1 Впервые проведено исследование особенностей первичной структуры всех экзонных участков генов СОЯ/, М1Н1 и МЗН2 среди 30 российских пробандов с семейным раком желудка Мутации в генах МШ1 и \fSH2 найдены у четырех пробандов (13%, 95% ДИ 0,040,31) Мутации чаще встречали среди семей с раком желудка и раком толстой кишки по сравнению с семьями только с раком желудка

2 Мутации в гене СЪН1 среди российских пробандов с семейным раком желудка не обнаружены Результаты свидетельствуют о низкой частоте мутаций в гене СОЯ/ среди российских семей с раком желудка, наблюдаемой также в ряде других популяций Выявлены варианты по однонуклеотидным полиморфизмам, в том числе редкие

3 Показана ассоциация варианта -160А/А в промоторном участке гена СОЯ/ с заболеванием раком желудка у больных как семейной формой рака желудка (011=12,3, р=0,03), так и спорадической (ОЯ=8,4, р=0,02)

4 Генотип 2076ТТ связан с риском развития рака желудка в присутствии генотипа -160СА и не приводит к повышению риска в присутствии генотипа -160СС Суммарная частота генотипов, ассоциированных с риском, существенно выше по отношению к контролю при семейной (ОЯ=28, р=0,0003) и спорадической форме рака желудка (0я=20, р=0,0001)

5 Результаты гаплотипирования генотипов, имеющих варианты 2076Т и -160А на одной хромосоме, с помощью трех микросателлитных маркеров указывают на отсутствие единого протяженного гаплотипа, в состав которого могли бы входить указанные варианты в гене СШ1

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Для обнаружения молекулярно-генетических причин наследственной предрасположенности к семейной форме рака желудка рекомендуется исследование генов МШ1 и \fSH2 Вероятность обнаружения наследуемых мутаций в генах МШ1 и М8Н2 особенно высока в тех семьях, где наряду с раком желудка встречался рак толстой кишки

2 Поиск наследуемых мутаций в гене CD1I1 рекомендуется осуществлять у пробандоЕ, в чьих семьях встречалось 3 случая диффузного типа рака желудка возникших у родственников в любом возрасте, либо 2 случая диффузного типа рака желудка, притом, что один из них возник у родственника в возрасте до 50 лет

3 При выявлении мутации в указанных генах у пробанда рекомендуется поиск данной мутации у его родственников Также рекомендуется динамическое наблюдение тех родственников, которые являются носителями мутаций для выявления возможного возникновения рака желудка на ранней стадии

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1. Цуканов А С Наследственная предрасположенность к раку желудка / Цуканов A.C., ПоспеховаН И, Карпухин А В //Медицинская генетика -2006 -№4 (46)-С 16-21

2. Карпухин А В Молекулярная диагностика моногенных форм рака / Карпухин А В , Поспехова Н И, Музаффарова Т А, Захаров С Ф , Смирнова Т Ю , Цуканов A.C., Логинова

А Н, Любченко Л Н, Гончарова Е А, Апанович П В , Сачков И Ю, Шахматов Д Г, Кузьминов А М, Щелыгин Ю А, Гарькавцева Р Ф , Гинтер Е К // Медицинская генетика - 2006 - Т 5, Приложение2 -С 2-7

3. Цуканов А С Молекулярно-генетический анализ генов наследственной предрасположенности к раку желудка / Цуканов А.С , Поспехова Н.И , Любченко Л Н, Захаров С Ф,ГончароваЕ А,НикулинМ П ,ГарькавцеваР Ф ,ГинтерЕ К, Карпухин AB Н Медицинская генетика -2007 -№12 - С 30-34

4. Tsukanov A S The role of CDH1 gene variants in inherited predisposition to gastric cancer / Tsukanov A.S., Pospekhova N I, Lubchenko L N , Nikulin M P, Garkavtseva R F, Ginter E К, KarpukhmAV //European journal of human genetics - 2007 - V15 suppi 1-P 156

5. Tsukano-v A S Analysis of CDH1 and IL1RN\anants among gastric cancer families m Russia / Tsukanov A S., Pospekhova NI, Lubchenko L N , Garkavtseva R F , Karpukhin A V // European journal of human genetics - 2006 - V14 suppl 1-P 215

6 Цуканов А С Анализ первичной структуры ДНК гена CDH1 при наследственной форме рака желудка / Цуканов А.С, Поспехова Н И, Любченко Л Н, Захаров С Ф Никулин М П, Полоцкий Б Е, Гарькавцева Р Ф , Карпухин AB// Медицинская генетика - 2005 Т 4 - №6 -С 286

7. Карпухин А В Молекулярные особенности генов-супрессоров злокачественной трансформации клеток, связанные с возникновением и локализацией ряда частых типов рака / Карпухин А В Поспехова Н И , Захаров С Ф , Музаффарова Т А, Цуканов A.C., Смирнова Т Ю , Логинова А Н, Любченко Л Н , Сачков И Ю, Кузьминов А М, Гарькавцева Р Ф, Гинтер Е К //VI Международная конференция по молекулярной генетике соматических клеток -Звенигород - 2005

8. Никулин М П Клииико - генетические факторы семейного рака желудка / Никулин М П , Любченко Л Н, Цуканов А.С., Сельчук В Ю, Карпухин А В , Поспехова Н И, Гарькавцева Р Ф // IV Съезд онкологов и радиологов СНГ - Баку - 2006

9. Tsukanov A S High frequency of MLHl and MSH2 mutations among familial gastric cancer patients / Tsukanov A S., Loginova A N, Pospekhova NI, Lubchenko L N, Muzaffarova T A, Nikulm M P, Karpukhm A V II Eur J Hum Gen - 2008 - V16 -suppl 2 1- P 224

ГОУ ВПО - Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования

ГУ МГНЦ РАМН - Государственное Учреждение Медико-Генетический Научный Центр

Российской Академии Медицинских Наук

СБОЕ - метод конформационно - чувствительного электрофореза

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ББСР - метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК

ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

П н - пар нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТЕ - трис- ЭДТА буфер

РЖ - рак желудка

РМЖ - рак молочной железы

РТК - рак толстой кишки

Д И - доверительный интервал

РДЛ - рак другой локализации

НДРЖ - наследственный диффузный рак желудка

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Подписано в печать 25 08 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 657 Тираж 110экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Цуканов, Алексей Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. РАК ЖЕЛУДКА.

1.1 Заболеваемость раком желудка в России и в мире.

1.2 Классификации рака желудка.

1.3 Семейный рак желудка.

Глава 2. ГЕНЫ CDH1, MLH1, MSH2 - СУПРЕССОРЫ ОПУХОЛЕВОГО

РОСТА.

2.1 Структура и функции гена CDH1.

2.1.1 Наследственные мутации в гене CDH1.

2.1.2 Полиморфизмы в гене CDH1.

2.2 Гены MLH1 и MSH2.

Глава 3. ДРУГИЕ ГЕНЫ, ОТВЕТСТВЕННЫЕ ЗА НАСЛЕДСТВЕННУЮ

ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬ К РАКУ ЖЕЛУДКА.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1.Пациент ы.

2. Анализ первичной структуры генов предрасположенности к раку желудка.

2.1. Выделение ДНК.

2.2. ПЦР (полимеразная цепная реакция).

2.3. Оценка качества ПЦР.

2.4а. Образование гетеродуплексных фрагментов ДНК.

2.46. Денатурация фрагментов ДНК при использовании метода SSСР.

2.5. Электрофорез.

2.6. Окраска геля.

2.7. Секвенирование.

2.8. Анализ промоторного участка гена CDH1.

2.9 Анализ микросателлитных маркеров в области гена CDH1.

3. Анализ значения некоторых вариантов в генах CDH1, MLH1 и MSH2.

4. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Исследование пробандов с семейным раком желудка на наличие мутаций в гене CDH1.

2. Исследование пробандов с семейным раком желудка на наличие мутаций в генах MLH1 и MSH2.

3. Изучение полиморфизмов -160С/А и 2076С/Т на выборке спорадических и семейных больных РЖ и в контрольной выборке.

4. Гаплотипирование гена CDH1 по микросателлитным маркерам.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическое исследование наследственной предрасположенности к раку желудка"

Рак желудка (РЖ) относится к наиболее распространенным онкологическим заболеваниям. В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди женщин в России рак этой локализации занимает 3-е место и 2-е место у мужчин [Аксель Е.М. и др., 2002]. Ежегодно в нашей стране заболевает 46 тысяч человек, а одногодичная летальность составляет 56% [Давыдов М. И., 2004].

Около 5-10% случаев рака желудка имеет семейную историю. Молекулярной причиной предрасположенности к раку желудка с высоким риском (70-83%) являются наследуемые мутации в ряде генов. К основным из них относятся гены CDH1, MLH1 и MSH2. Специфическим геном-супрессором семейного РЖ считают ген CDH1. Частота мутаций в этом гене варьирует от 0 до 10% от всех случаев семейного рака желудка в зависимости от этнической принадлежности изучаемой выборки. Вероятность обнаружения мутации может быть повышена при использовании определенных критериев отбора семей [Brooks-Wilson A. et al., 2004].

Примерно у 10-20% семей с РЖ встречаются случаи рака толстой кишки [Oliveira С. et al., 2003]. Семьи с раком желудка могут соответствовать критериям синдрома наследственного неполипозного рака толстой кишки. Данное заболевание, как правило, связано с наследуемыми мутациями в генах MLH1 и MSH2. Мутации в этих генах обнаруживают в семьях с РЖ и с раком толстой кишки, не отвечающих критериям наследственного неполипозного рака толстой кишки, а также в семьях с РЖ без случаев рака толстой кишки [Kim J. et al., 2001].

Частоты мутаций в генах предрасположенности к раку желудка различны в выборках из разных популяций. В России указанные гены при семейном раке желудка ранее не были исследованы. Восполнение этого пробела позволит внести существенный вклад в изучение особенностей мутационных процессов в разных популяциях. Кроме того, число исследований ряда генов предрасположенности на одной и той же выборке семейного рака желудка в настоящее время не велико. Проведение такого исследования позволит оценить вклад разных генов в семейную предрасположенность к раку желудка, значение чего усиливает существование популяционных особенностей.

Мутации даже в нескольких известных генах в совокупности объясняют только часть случаев семейного РЖ. Поиски дополнительных генов предрасположенности к РЖ до настоящего времени не дали результатов. В связи с этим внимание исследователей обращается на изучение вариантов генов предрасположенности по однонуклеотидным полиморфизмам, которые могут выступать в качестве аллелей риска. В пользу этого говорят данные о функциональном значении некоторых из них, в частности, в гене CDH1 [Li L. et al., 2000]. Такие варианты могут быть ассоциированы и с риском спорадического РЖ.

Определение характеристик вариаций в генах, связанных с возникновением рака желудка важно не только с фундаментальной точки зрения, но и для решения практических медико-генетических задач. Основной причиной высокой смертности больных раком желудка является позднее выявление болезни. Следовательно, вопросы своевременной диагностики и профилактики рака желудка весьма актуальны, так как запоздалая клиническая диагностика во многих случаях этого онкологического заболевания обусловливает существенное сокращение продолжительности жизни, несмотря на лечение.

Изучение молекулярно-генетических причин предрасположенности к раку желудка будет создавать новые возможности для медико-генетического консультирования и профилактики при этом заболевании.

Цель исследования.

Целью настоящей работы явилось исследование молекулярно-генетических особенностей предрасположенности к раку желудка, основанное на анализе изменений первичной структуры генов CDH1, MLH1, MSH2.

Задачи исследования:

• изучение мутаций в генах CDH1, MLH1 и MSH2 при семейном раке желудка;

• изучение однонуклеотидных полиморфизмов в гене CDH1 при семейном и спорадическом раке желудка и в контрольной выборке;

• анализ гаплотипов в гене CDH1 по однонуклеотидным полиморфизмам и микросателлитным маркерам.

Научная новизна.

Впервые изучены характеристики вариантов в генах CDH1, MLH1, MSH2 на выборке семейного рака желудка в России. Мутации в генах MLH1 и MSH2 обнаружены как в семьях с только раком желудка, так и включающих наряду с раком желудка рак толстой кишки. При этом наибольшая частота мутаций наблюдалась в семьях с присутствием рака толстой кишки наряду с раком желудка. Показана ассоциация с раком желудка генотипов -160АА и 2076ТТ в гене CDH1. Обнаружено синергическое влияние на риск рака желудка генотипов по вариантам

-160С/А и 2076С/Т в гене CDH1. Выявлено, что генотип 2076ТТ связан с риском рака желудка в присутствии генотипа -160СА и не приводит к повышению риска в присутствии генотипа -160СС. С помощью гаплотипирования по микросателлитным маркерам показано отсутствие единого гаплотипа при вариантах риска по однонуклеотидным полиморфизмам в гене CDH1, что свидетельствует в пользу влияния на риск именно данных вариантов.

Научно-практическая значимость работы.

Научно-практическая значимость результатов настоящей работы обусловлена выявлением связи вариантов первичной структуры ДНК генов CDH1, MLH1 и MSH2 с возникновением семейного и спорадического рака желудка. Выявленные мутации в генах MLH1 и MSH2 при семейном раке желудка, в том числе их высокая частота с присутствием в семье рака толстой кишки, имеет существенное значение для практической ДНК-диагностики наследственной предрасположенности к раку желудка. Выявленная ассоциация с раком желудка генотипов по однонуклеотидным полиморфизмам в гене CDH1 может служить основой для последующей разработки способа диагностики повышенного риска рака желудка.

Положения, выносимые на защиту.

1. При впервые проведенном исследовании особенностей первичной структуры генов CDH1, MLH1 и MSH2 среди российских пробандов с семейным раком желудка у 13% из них выявлены мутации в генах MLH1 и MSH2, что указывает на значение этих генов в возникновении наследственной формы рака желудка.

2. Функционально значимый вариант -160А/А в промоторном участке гена CDH1 ассоциирован с заболеванием раком желудка как у больных семейной формой рака желудка, так и спорадической. Генотип 2076ТТ связан с риском рака желудка в присутствии генотипа -160СА и не приводит к повышению риска в присутствии генотипа -160СС.

3. Как следует из результатов гаплотипирования по трем микросателлитным маркерам, варианты 2076Т и -160А в гене CDH1 не находятся в составе какого-либо единого протяженного гаплотипа на одной хромосоме, что свидетельствует в пользу самостоятельного значения этих вариантов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. РАК ЖЕЛУДКА.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Цуканов, Алексей Сергеевич

выводы

1. Впервые проведено исследование особенностей первичной структуры всех экзонных участков генов CDHJ, MLH1 и MSH2 среди 30 российских пробандов с семейным раком желудка. Мутации в генах MLH1 и MSH2 найдены у четырех пробандов (13%, 95% ДИ: 0,04-0,31). Мутации чаще встречались среди семей с раком желудка и раком толстой кишки по сравнению с семьями с только раком желудка.

2. Мутации в гене CDH1 среди российских пробандов с семейным раком желудка не обнаружены. Результаты свидетельствуют о низкой частоте мутаций в гене CDH1 среди российских семей с раком желудка, наблюдаемой также в ряде других популяций. Выявлены варианты по однонуклеотидным полиморфизмам, в том числе редкие.

3. Показана ассоциация варианта -160А/А в промоторном участке гена CDH1 с заболеванием раком желудка у больных как семейной формой рака желудка (OR=12,3; р=0,03), так и спорадической (OR-8,4; р=0,02).

4. Генотип 2076ТТ связан с риском рака желудка в присутствии генотипа -160СА и не приводит к повышению риска в присутствии генотипа -160СС. Суммарная частота генотипов, ассоциированных с риском, существенно выше по отношению к контролю при семейной (OR^B; р=0,0003) и спорадической форме рака желудка (OR=20; р=0,0001).

5. Результаты гаплотипирования генотипов, имеющих варианты 2076Т и -160А на одной хромосоме, с помощью трех микросателлитных маркеров указывают на отсутствие единого протяженного гаплотипа, в состав которого могли бы входить указанные варианты в гене CDH1.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для обнаружения молекулярно-генетических причин наследственной предрасположенности к семейной форме рака желудка рекомендуется исследование генов MLH1 и MSH2. Вероятность обнаружения наследуемых мутаций в генах MLH1 и MSH2 особенно высока в тех семьях, где наряду с раком желудка встречался рак толстой кишки.

2. Поиск наследуемых мутаций в гене CDH1 рекомендуется осуществлять у пробандов, в чьих семьях встречалось 3 случая диффузного типа рака желудка возникших у родственников в любом возрасте, либо 2 случая диффузного типа рака желудка, притом, что один из них возник у родственника в возрасте до 50 лет.

3. При выявлении мутации в указанных генах у пробанда рекомендуется поиск данной мутации у его родственников. Также рекомендуется динамическое наблюдение тех родственников, которые являются носителями мутаций для выявления возможного возникновения рака желудка на ранней стадии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Цуканов, Алексей Сергеевич, Москва

1. Давыдов, М. И. Рак желудка / М. И.Давыдов // Энциклопедия клинической онкологии. 2004. - С.223-237.

2. Шайн, А. А. Онкология для студента и молодого врача. / А. А. Шайн // Рак органов пищеварения 2000. - С. 12-56.

3. Aarnio, М. Features of gastric cancer in hereditary non-polyposis colorectal cancer syndrome / M. Aarnio, R. Salovaara, LA. Aaltonen.// Int J Cancer. 1997. - P. 551-555.

4. Antoniou, A.C. A comprehensive model for familial breast cancer incorporating BRCA1, BRCA2 and other genes/ A.C. Antoniou, P.D.P. Pharoah, G. McMullan, et al. // British Journal of Cancer. 2002. - V.86. - P.76-83.

5. Avizienyte, E. E-cadherin is not frequently mutated in hereditary gastric cancer / E. Avizienyte, V.Launonen et al. // J.Med.Genet. 2001. - Vol. 38, №1. - P.49-52.

6. Bacani. J.T., CZW7/Е-cadherin germline mutations in early-onset gastric cancer/ J.T. Bacani, M. Soares et al. // J Med Genet. 2006. - Vol. 43, №11. - P. 867-72.

7. Becker, K. E-cadherin gene mutations provide clues to diffuse type gastric carcinomas / K. Becker, M. Aktinson, U. Reich et al. // Cancer Res. 1994. - Vol. 54, №14. - P.3845-3852.

8. Berx, G. Mutations of the human E-cadherin gene {CDHI) / G. Berx, K. Becker, H. Hofler et al. I I Hum. Mutat. 1998. - Vol. 12, №4. - P.226-237.

9. Berx, G. E-cadherin is a tumor/invasion suppressor gene mutated in human lobular breast cancers / G. Berx, A. Cleton-Jansen, F. Nollet et al // EMBO J. 1995. - Vol. 14, №24. -P.6107-6115.

10. Blok, P. Loss of Е-cadherin expression in early gastric cancer / P. Blok, M. Craanen, W. Dekker, G. Tytgat // Histopathology J. 1999. - Vol. 34. - P.410-415.

11. Brooks-Wilson, A. Germline E-cadherin mutations in hereditary diffuse gastric cancer: assessment of 42 new families and review of genetic screening criteria / A. Brooks-Wilson, P. Kaurah, D. Huntsman // J. Med. Genet. 2005. - Vol. 41. - P.508-17.

12. Caldas, C. Familial gastric cancer: overview and guidelines for management / C. Caldas, F. Carneiro et al. // J. Med. Genet. 1999. - Vol. 36, №12. - P.873-880.

13. Castilla, L. Mutations in the BRCA1 gene in families with early-onset breast and ovarian cancer / L. Castilla, F. Couch et al. // Nature Genet. 1994. - V.8. - P.387-391.

14. Chen, J. Stable interaction between the products of the BRCA1 and BRCA2 tumor suppressor genes in mitotic and meiotic cells / J.Chen et al. // Mol. Cell. 1998. - V.2. -P.317-328.

15. Chrictofori, G. The role of the cell-adhesion molecule E-cadherin as a tumor-suppressor gene / G. Chrictofori // Trends biochem. Sci. 1999. - Vol. 24, №2. - P.73-6.

16. Claus, E. Genetic analysis of breast cancer in the cancer and steroid hormone study / E. Claus, N. Risch et al. // Am. J. Hum. Genet. 1991 - V.48. - P. 232-242.

17. De la Chapelle, A. Genetic predisposition to colorectal cancer / A. De la Chapelle // Nat Rev Cancer. 2004. - P. 769-780.

18. Dussaulx-Garin, L. A new mutation of Е-cadherin gene in familial gastric linitis plastica cancer with extra-digestive dissemination / L. Dussaulx-Garin, M. Blayau, M. Pagenault et al. // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 2001. - Vol. 13, №6. - P.711-715.

19. Egle, A. E-cadherin is not frequently mutated in hereditary gastric cancer / A. Egle, L. Virpi // J Med Genet. 2001. - Vol. 38. - P. 49-52.

20. Fearnhead, N. Rare variant hypothesis for multifactorial inheritance: susceptibility to colorectal adenomas as a model / N. Fearnhead, B. Winney, W. Bodmer // Cell Cycle. -2005.-Vol. 4.-P. 521-525.

21. Fishel, R. The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer / R. Fishel, M. Lescoe, M. Rao, N. Copeland, N. Jenkins, J. Garber, M. Kane, R. Kolodner // Cell. 1993.- P. 1027-1038.

22. Ford, D. Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in breast cancer families / D. Ford, D. Easton, M. Stratton et al. // Am. J. Hum. Genet. 1998. - V.62. -P.676-689.

23. Frixen, U. E-cadherin-mediated cell-cell adhesion prevents invasiveness of human carcinoma cells / U. Frixen, J. Behrens, M. Sachs // J. Cell Biol. 1991. - Vol. 113. -P.173-185.

24. Gayther, S. Identification of germline E-cadherin mutations in gastric cancer families European origin / S. Gayther, K. Gorringe, S. Ramus et al. // Cancer Res. -1998. Vol. 58, №18. - P. 4086-4089.

25. Gianpaolo, S. Characterization of a recurrent germ line mutation of the E-cadherin gene: implications for genetic testing and clinical management / S. Gianpaolo, Y. Sandie // Clin Cancer Res. 2005. - Vol. 11, №15. - P. 5401-5409.

26. Gorlov, I. Missense Mutations in hMLHl and hMSH2 Are Associated with Exonic Splicing Enhancers /1. Gorlov, O. Gorlova // J. Hum. Genet. 2003. - Vol. 73. - P. 1157-1161.

27. Graziano, F. The role of the E-cadherin gene (CDH1) in diffuse gastric cancer susceptibility: from the laboratory to clinical practice / F. Graziano, B. Humar // Ann. Oncol. 2003. - Vol. 14. - P. 1705-13.

28. Guilford, P. E-cadherin germline mutations in familial gastric cancer / P. Guilford, J. Hopkins, J. Harraway et al. // Nature 1998. - Vol. 392. - P. 402-405.

29. Guilford, P. E-cadherin germline mutations define an inherited cancer syndrome dominated by diffuse gastric cancer / P. Guilford, J. Hopkins, W. Grady et al. // Hum. Mutat. 1999. - Vol. 14, №3. - P. 249-255.

30. Hall, J. Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17q21 / J. Hall, M. Lee, B. Newman et al. // Science 1990. - V.250. - P. 1684-1689.

31. Hannele, E. A recurrent mutation in PALB2 in Finnish cancer families / E. Hannele, X. Bing // Nature. 2007. - Vol. 446. - P. 316-9.

32. Henry, T. Gastric Cancer: New Genetic Developments / T. Henry, W. Grady. // Journal of Surgical Oncology (Seminars) 2005. - Vol. 90. - P. 114-133.

33. Houlston, R. Mutation in DPC4 (SMAD4) cause juvenile polyposis syndrome but only account for minority of cases / R. Houlston, S. Bevan, S. Williams et al. // Hum. Mol. Genet.-1998.-Vol. 7, №12.-P. 1907-1912.

34. Humar, B. Novel germline CDH1 mutations in hereditary diffuse gastric cancer families / B. Humar, Т. Того et al. // Hum. Mutat. 2002. - Vol. 19, №5. - P. 518-525.

35. Humar, B. Association of CDH1 haplotypes with susceptibility to sporadic diffuse gastric cancer / B. Humar et al. // Oncogene 2002. - Vol. 21, №53. - P. 8192-8195.

36. Iida, S. Infrequent germline mutations of the E-cadherin gene in Japanese familial gastric cancer kindreds / S. Iida, Y. Akiyama, W. Ichikawa et al. // Clin. Cancer Res. -1999.-Vol. 5, №6.-P. 1445-1447.

37. Jonsson, B. Germline mutations in E-cadherin do not explain association of hereditary prostate cancer, gastric cancer and breast cancer / B. Jonsson, A. Bergh, P. Stattin et al // Int. J. Cancer. 2002. - Vol. 98, №6. - P. 838-843.

38. Keller, G. Germline mutations of the E-cadherin (CDH1) and TP53 genes, rather than of RUNX3 and HPP1, contribute to genetic predisposition in German gastric cancer patients / G. Keller, H. Vogelsang et al. // J. Med. Genet. 2005. - Vol. 41. - P. 89-93.

39. Keller, G. Diffuse type gastric and lobular breast carcinoma in a familial gastric cancer patient with an E-cadherin germline mutation / G. Keller, H. Vogelsang, I. Becker et al. // Am.J. Pathol. 1999. - Vol. 155, №2. - P. 337-342.

40. Kiemeney, L. Polymorphisms in the E-cadherin (CDH1) gene promoter and the risk of bladder cancer / L. Kiemeney, K. van Houwelingen , M. Bogaerts // Eur J Cancer. -2006. P. 3219-27.

41. Kim, J. hMLHl and hMSH2 mutations in families with familial clustering of gastric cancer and hereditary non-polyposis colorectal cancer / J. Kim , H. Kim, S. Roh // Cancer Detect Prev. 2001. - Vol. 25, №6. - P. 503-10.

42. Kolodner, R. Structure of the human MSH2 locus and analysis of the two Muir-Torre kindreds for MSH2 mutations / R. Kolodner, R. Hall et al. // Genomics. 1994. -Vol. 24.-P. 516-526.

43. Kolodner, R. Structure of the human MLH1 locus and analysis of a large hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma kindred for mlhl mutations / R. Kolodner, R. Hall, et al. // Cancer Research 1995. - Vol. 55, №2. - P. 242-8.

44. Kriiger. S. Ten novel MSH2 and MLH1 germline mutations in families with HNPCC / S. Kriiger, A. Bier et al. // Hum Mutat. 2004. - Vol. 24, №4. - P. 351-2.

45. Kuraoka, K. Correlation of a single nucleotide polymorphism in the E-cadherin gene promoter with tumorigenesis and progression of gastric carcinoma in Japan / K. Kuraoka , N. Oue, H. Yokozaki. // Int J Oncol. 2003. - P. 421-7.

46. Lauren, P. The two histological main types of gastric carcinoma. An attempt at a histo-clinical classification / P. Lauren // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1965. - Vol. 64. -P.31-49.

47. Li, L. A single nucleotide polymorphism in the E-cadherin gene promoter alters transactional activites / L. Li, R. Chui, M. Sasaki // Cancer Res. 2000. - Vol. 60, №4. -P. 873-876.

48. Lindstrom, S. Comprehensive genetic evaluation of common E-cadherin sequence variants and prostate cancer risk: strong confirmation of functional promoter SNP / S. Lindstrom, F. Wiklund, B. Jonsson // Hum Genet. 2005. - P. 339-47.

49. Lorenzo, B. Risk of cancer at sites other than the breast in Swedish families eligible for BRCA1 or BRCA2 mutation testing / B. Lorenzo // Annals of Oncology.2004.-Vol. 15.-P. 1834-1841.

50. Lu, Y. E-cadherin gene C-160A promoter polymorphism and risk of non-cardia gastric cancer in a Chinese population / Y. Lu, Y. Xu, J. Shen // World J Gastroenterol.2005.-P. 56-60.

51. Lynch, H. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) / H. Lynch // Cytogenet Cell Genet. 1999. - P. 130-135.

52. Machado, J. E-cadherin gene (CDH1) promoter methylation as the second hit in sporadic diffuse gastric carcinoma / J. Machado, C. Oliveira, R. Carvalho et al. // Oncogene. -2001. Vol. 20, №12. - P. 1525-1528.

53. Markku, A. Features of gastric cancer in hereditary non-polyposis colorectal cancer syndrome / A. Markku, S. Reijo // Int. J. Cancer (Pred. Oncol.). 1997. - Vol. 74. - P. 551-555.

54. Medina-Franco, H. Single Nucleotide Polymorphisms in the Promoter Region of the E-cadherin Gene in Gastric Cancer: Case-Control Study in a Young Mexican Population / H. Medina-Franco, A.R. Medina // Ann Surg Oncol. 2007.- P. 2246-9.

55. Miki, Y. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1/ Y. Miki et al.// Science. 1994.- V.266.-№5182.-P.66-71.

56. Moran, C. CDH1 associated gastric cancer: a report of a family and review of the literature / C. Moran, M. Joyce, O.J. McAnena // Eur. J. Surg. Oncol. 2005. - Vol. 31, №3. - P. 2005 259-64.

57. Nakagawa, H. Identification and characterization of genomic rearrangements of MSH2 and MLH1 in Lynch syndrome (HNPCC) by novel techniques / H. Nakagawa, H. Hampel, A. de la Chapelle // Hum Mutat. 2003.- P. 258.

58. Nagafuchi, A. Transformation of cell adhesion properties by exogenously introduced E-cadherin cDNA / A. Nagafuchi, Y. Shirayoshi, K. Okazaki, K. Yasuda, M. Takeichi // Nature 1987. - Vol. 329. - P. 341-343.

59. Oda, T. E-cadherin gene mutations in human gastric carcinoma cell lines / T. Oda, Y. Kanai et al // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1994. - Vol. 91, №5. - P. 1858-1862.

60. Oliveira, C. Screening E-cadherin in gastric cancer families reveals germline mutation only in hereditary diffuse gastric cancer kindred / C. Oliveira, M.C. Bordin, N. Grehan et al. // Hum.Mutat. 2002. - Vol. 19, №5. - P. 510-517.

61. Oliveira, C. Genetic screening for Familial Gastric Cancer / C. Oliveira, R. Seruka et al. // J. Hereditary cancer in clinical practice 2004. - Vol. 2, №2. - P. 51-64.

62. Oliveira, C. Genetic screening for HDGC / C. Oliveira, R. Seruka, C. Caldas et al. //Rev. Mol. Diagn. -2003. Vol. 3, №2. - P. 201-215.

63. Peltomaki, P. Mutations associated with HNPCC predisposition-Update of ICG-HNPCCANSiGHT mutation database / P. Peltomaki, H.Vasen // Dis Markers. 2004.-V.20.- P. 269-276.

64. Pharoah, P.D. CDH1 c-160a promoter polymorphism is not associated with risk of stomach cancer / P.D. Pharoah // Int J Cancer.- 2002. P. 196-197.

65. Potter, E. The cadherin-catenin system: implications for growth and differentiation of endocrine tissues / E. Potter, C. Bergwitz, G. Brabant // Endocr. Rev. 1999. - Vol. 20.-P. 207-239.

66. Randall, W. Colon cancer screening / W.Randall // Gastroenterology 2000. -Vol. 119.-P. 837-853.

67. Ruzzo, A. The G/A nucleotide change at cDNA position 2494 in the E-cadherin gene (CDH1): analysis in Italian patients / A. Ruzzo, F. Graziano, A. Costagliola et al. // Tumour Biol. 2003. - Vol. 24, №3. - P. 47-50.

68. Richards, F. Germline E-cadherin gene (CDH1) mutations predispose to familial gastric cancer and colorectal cancer / F. Richards, S. McKee, M. Rajpar et al // Hum. Mol. Genet. 1999. - Vol. 8, №4. - P. 607-610.'

69. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual 2nd edn. / Sambrook J., Maniatis T. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1989.

70. Samowitz, W. The colon cancer burden of genetically defined hereditary nonpolyposis colon cancer / W. Samowitz, K. Curtin // Gastroenterology. 2001. - Vol. 121, №4.-P. 830-8.

71. Scully, R. Association of BRCA1 with Rad51 in mitotic and meiotic cells / R. Scully et al. // Cell. 1997. - V.88. - P.265-275.

72. Shinmura, K. Familial gastric cancer: clinicopathological characteristics, RER phenotype and germline p53 and E-cadherin mutations / K. Shinmura, T. Kohno, M. Takahashi et al. // Carcinogenesis 1999. - Vol. 20, №6. - P. 1127-1131.

73. Shinohara, A. Cloning of human, mouse and fission yeast recombination genes homologous to RAD51 and recA / A. Shinohara, H. Ogawa, Y. Matsuda, N. Ushio, K. Ikeo, T. Ogawa // Nat. Genet. 1993. - V.4. - P.239-243.

74. Shinohara, A. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein / A. Shinohara et al. // Cell. 1992. - V.69. - P.457-470.

75. Sokoloff, B. Predisposition to cancer in the Bonaparte family / B. Sokoloff // Am. J. Surg. 1938. - Vol. 40. - P. 673-678.

76. Song, C. Association of -160(C~>A) polymorphism in CDH1 gene with gastric cancer risk in Fujian Chinese population / C. Song , C. Huang , X. Liu // Zhonghua. -2005.-P. 557-559.

77. Takaku, К. Gastric and duodenal polyps in Smad4 (Dpc4) knockout mice / K. Takaku, H. Miyoshi et al. // Cancer Res. 1999. - Vol. 59, №24. - P. 6113-6117.

78. Tavtigian, S. The complete BRCA2 gene and mutations in chromosome 13q-linked kindreds / S. Tavtigian, J. Simard, J .Rommens et al.// Nature Genet. 1996. -V.12. -P.333-337.

79. Timothy, R. Contribution of cyclin dl (CCND1) and E-cadherin (CDH1) polymorphisms to familial and sporadic colorectal cancer / R. Timothy, et al. // Oncogene. 2002.- P. 1928-1933.

80. Vasen, H. Cancer risk in families with hereditary nonpolyposis colorectal cancer diagnosed by mutation analysis / H. Vasen, J. Wijnen // Gastroenterology.- 1996.-V.110.-P. 1020-1027.

81. Wang, H. CDH1 germline mutation in hereditary gastric carcinoma / H. Wang, J. Ren, Z. Lian // World J. Gastroenterol. 2004. - Vol. 10, №21. - P. 3088-3093.

82. Wang, Y. BASC, a super complex of BRCA1-associated proteins involved in the recognition and repair of aberrant DNA structures / Y. Wang, D. Cortez, P. Yazdi, N. Neff, S.J. Elledge, J. Qin // Genes Dev. 2000. - V.14. - P.927-939.

83. Weinberg, R. Tumor suppressor genes / R.Weinberg // Science. 1991. - V.254. -P.l 138-1146.

84. Wu, M. Association of the -160 С --> a promoter polymorphism of E-cadherin gene with gastric carcinoma risk / M.Wu , S.P. Huang , Y.T. Chang // Cancer. 2002. -P. 1443-1448.

85. Yabuta, Т. E-cadherin gene variants in gastric cancer families whose probands are diagnosed with diffuse gastric cancer / T. Yabuta, K. Shinmura, M. Tani et al. // Int. J. Cancer-2002. Vol. 101, №5. - P. 434-441.

86. Yoon, K. Germline mutations of E-cadherin gene in Korean familial gastric cancer patients / K. Yoon, J. Ku et al.// J. Hum. Genet. 1999. - Vol. 44, №3. - P. 177-180.

87. Zhang, Y. Germline mutations and polymorphic variants in MMR, E-cadherin and MYH genes associated with familial gastric cancer in Jiangsu of China / Y. Zhang, X. Liu, Y. Fan // Int J Cancer. 2006. -Vol. 119, №11. - P. 2592-6.

88. Zhu, Z. Germline mutational analysis of CDHI and pathologic features in familial cancer syndrome with diffuse gastric cancer/breast cancer proband in a Chinese family / Z. Zhu, Y. Yu, Y. Zhang, J. Ji, J. Zhang // EJSO. 2004. - P. 531-535.