Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетические и фенотипические особенности геновариантов возбудителя холеры эль тор, выделенных на территории Российской Федерации

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические и фенотипические особенности геновариантов возбудителя холеры эль тор, выделенных на территории Российской Федерации"

На правах рукописи

Агафонов Дмитрий Алексеевич

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕГИЧЕСКИЕ И ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНОВАРИАНТОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ ЭЛЬ ТОР, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 АВГ 2014

Саратов-2014 005551673

005551673

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Смирнова Нина Ивановна

Официальные оппоненты:

Замараев Валерий Семенович, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава Российской Федерации, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии с курсом клинической микробиологии.

Монахова Елена Владимировна, доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, ведущий научный сотрудник лаборатории микробиологии холеры.

Ведущая организация:

ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава Российской Федерации.

Защита состоится «30» сентября 2014 г. в 10.00 на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке и на сайте Ьир://уууууу.т!сгоЬе.гиАтшт/^в5ег/^85е11/ Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб».

Автореферат разослан « $ » /¿¿¿¿-¿У 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эпидемии и вспышки холеры продолжают регистрироваться во многих странах Юго-Восточной Азии, Центральной Африки и Южной Америки. По данным Всемирной организации здравоохранения холерой ежегодно заболевает 3-5 млн. человек, из которых около 100-120 тыс. умирают (Информационный бюллетень ВОЗ, N107, 2014). Широкое распространение возбудителя холеры и активная миграция населения определяют реальную возможность ее завоза на территорию Российской Федерации (РФ). Недавние эпидемические вспышки и спорадические случаи холеры в РФ свидетельствуют о том, что эпидемиологическая обстановка по этой инфекции в стране остается напряженной (Онищенко Г.Г. и др., 1995, 2001; Москвитина Э.А. и др., 2008, 2006; Назаретян А.А., Москвитина Э.А., 2013). Для возбудителя холеры характерно внутривидовое разнообразие. Семь известных пандемий холеры были вызваны вирулентными штаммами Vibrio cholerae 01 серогруппы, относящимися к двум разным биоварам - классическому и Эль Тор, которые отличаются друг от друга по фено- и геноти-пическим свойствам (Бароян О.В., 1971; Карег J.B. et al., 1995; Longini I.M.Jr. et al., 2002; Bhattacharya T. et al., 2006). Основные генетические различия между ними состоят в разной структуре острова патогенности (ОП) VP 1-1 и генома профага СТХф, детерминирующих, соответственно, продукцию токсин-корегулируемых пилей адгезии (TCP, от toxin-coregulated pilus) и холерного токсина (СТ, от cholera toxin) - ключевых факторов патогенности. Различия в структуре профага СТХф выражаются в разной нуклеотидной последовательности двух фаговых генов - rstR и ctxB, последний из которых определяет продукцию В-субъединицы СТ. Вследствие этого различают СТ 1-го или классического типа и СТ 2-го или Эль Тор типа, присущего V. cholerae биовара Эль Тор (Waldor М.К. et al., 1996,1997). Кроме того, в хромосоме вибрионов Эль Тор присутствуют два дополнительных мобильных элемента - острова пандемичности VSP-I и VSP-II, отсутствующие у холерных вибрионов классического биовара (Dziejman М. et al., 2002; O'Shea Y.A. et al., 2004; Pradhan S. et al., 2010).

Токсигенные штаммы V. cholerae биовара Эль Тор, вытеснив V. cholerae классического биовара на эндемичных по холере территориях, стали возбудителем 7-ой пандемии холеры, начавшейся в 1961 г. и продолжающейся до сих пор (Бароян О.В., 1971; Waldor M.K.et. al., 1996). Штаммы, вызвавшие текущую пандемию, несли геном профага СТХЕ/""ф и продуцировали СТ второго типа. Однако, в 1991 г. появились новые патогенные варианты этого биовара, несущие, в отличие от типичных, профаг СТХф классического типа (Nair G.B. et. al., 2002; Safa A. et. al., 2010). К настоящему времени эти генетически измененные штаммы или геновари-анты возбудителя холеры Эль Тор, вытеснив типичные штаммы в эндемичных по холере регионах, стали причиной многочисленных эпидемий холеры на территории многих стран Юго-Восточной Азии, Африки и Южной Америки. Что касается РФ,

то совсем недавно стало известно о заносе штаммов геновариантов и на ее территорию. Оказалось, что с начала 90-х эпидемические вспышки и локальные случаи холеры в России были вызваны именно геновариантами, несущими ген ctxBl классического типа (Смирнова Н.И. и др., 2008; Монахова Е.В. и др., 2005, 2009; Миронова JI.B. и др., 2012, 2014; Савельев В.Н. и др., 2012). Кроме того, один штамм ге-новарианта был выделен из морской воды Таганрогского залива в 2011 г. (Мазрухо А.Б. и др., 2013).

Возникшие геноварианты отличаются от типичных штаммов повышенной вирулентностью и высоким эпидемическим потенциалом, что связано с измененной структурой их генома. Особую эпидемическую опасность представляют недавно выявленные геноварианты, имеющие остров пандемичности VSP-II с протяженной делецией, поскольку такие штаммы вытесняют ранее появившиеся геноварианты с интактным геномом этого мобильного элемента. Между тем, несмотря на повышенный интерес многих исследователей к возбудителю холеры с новыми генетическими свойствами, многие вопросы, касающиеся структуры и функции его генома, остаются до сих пор малоизученными. Так, недостаточно сведений об особенностях структуры генома их острова патогенности VPI-1, в состав которого входят ключевые гены вирулентности. Нет данных о распространенности измененного острова пандемичности VSP-II среди штаммов геновариантов, выделенных в России. Отсутствуют генодиагностические тест-системы для дифференциации геновариантов с разным эпидемическим потенциалом. Открытым остается вопрос о роли нового профага CTXc/<MS(p в повышенной вирулентности геновариантов, а также в их высоком эпидемическом потенциале. В этой связи очевидна актуальность исследований, направленных на выяснение особенностей молекулярно-генетической организации геновариантов, изолированных в разные периоды текущей пандемии холеры на территории России, а также на изучение возможности их образования при экспериментальном моделировании этого процесса. Полученные результаты необходимы для оценки биологического разнообразия геновариантов, а также для понимания динамики изменения их свойств, и выяснения механизмов их образования. Кроме того, полученные данные могут служить основой для поиска новых ДНК-мишеней при разработке новых тест-систем, повышающих качество генодиагностики возбудителя холеры.

Цель работы - выявление и молекулярно-генетический анализ штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор с измененной структурой генов пандемичности и вирулентности, выделенных на территории Российской Федерации; экспериментальное моделирование возникновения геновариантов в процессе конъюгации.

Задачи исследования:

1. Провести молекулярно-генетический анализ острова пандемичности VSP-II у геновариантов, выделенных в разные периоды текущей пандемии холеры в Российской Федерации, и изучить распространенность штаммов с измененной структурой этого мобильного элемента.

2. Изучить структуру острова патогенности VPI-1 у геновариантов с измененным островом пандемичности VSP-II.

3. Разработать способ дифференциации генетически измененных штаммов с разным эпидемическим потенциалом на основе оценки структуры их острова пандемичности VSP-II методом мультилокусной ПЦР.

4. Разработать алгоритм расширенной идентификации генетически измененных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор.

5. Провести экспериментальное моделирование образования геновариантов в процессе конъюгации; изучить их фенотипические и молекулярно-биологические свойства.

Научная новизна работы. Впервые на основе изучения структуры острова пандемичности VSP-II определена распространенность геновариантов с высоким эпидемическим потенциалом среди штаммов возбудителя холеры Эль Тор, выделенных на территории РФ. Получены новые данные об изменении структуры острова патогенности VPI-1 геновариантов, изолированных в последние два десятилетия текущей пандемии холеры. Установлено, что появление мутаций (однонуклео-тидные замены и вставка) в кодирующем и регулирующем регионах гена tcpA из VPI-1, как правило, сопровождается возникновением делеции в острове пандемичности VSP-II.

Предложен способ дифференциации геновариантов с разным эпидемическим потенциалом на основе выявления различий в структуре их острова пандемичности VSP-II методом мультилокусной ПЦР. Подана заявка №2014100736 на изобретение; приоритет от 09.01.2014 г.

Впервые с помощью генетического моделирования получены экспериментальные доказательства возникновения геновариантов при переносе участка ДНК с геном ctxBl V. cholerae классического биовара в клетки типичного штамма V. cholerae биовара Эль Тор в процессе конъюгации. Высокий уровень вирулентности экспериментально полученных геновариантов обусловлен повышенной продукцией ими холерного токсина, а также измененной экспрессией ряда дополнительных факторов патогенности (подвижности, продукции растворимой гемагглюти-нин/протеазы и фосфолипазы). Впервые проведен сравнительный протеомный анализ сконструированных изогенных штаммов, различающихся между собой типом профага СТХф. Получены новые сведения о том, что внедрение в хромосому типичного штамма V. cholerae биовара Эль Тор генома профага СТХс'""ф классического типа приводит к изменению экспрессии ряда генов жизнеобеспечения.

Практическая значимость работы. На основе изучения структуры острова пандемичности VSP-II у различных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, выделенных на территории России, разработана мультилокусная ПЦР тест-система для дифференциации геновариантов с разным эпидемическим потенциалом.

По результатам изучения фенотипических и молекулярно-биологических свойств геновариантов возбудителя холеры Эль Тор составлены методические рекомендации "Алгоритм идентификации штаммов геновариантов возбудителя холе-

ры Эль Тор", одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 5 от 09.10.2012 г.) и утвержденные директором института 10 октября 2012 г.

В Государственной коллекции патогенных бактерий при РосНИПЧИ «Микроб» депонированы четыре штамма геновариантов V. сИо1егае биовара Эль Тор (М-1264 ахВ1 ШЯЕ!,0Г ¡грА (срАЕ"0Г УБР-П; Р-17647 с1хВ1 г^ЯЕ!,ог /грЪ ¡срАа'ог У8Р-11Д4; Л-4150 ОхВ7 пИ?'™ ¡гр5 1срЕТсшз У8Р-НД21; 301 с1хВ1 тКа,0Г

1гр\ 1срЕТст У8Р-НД21) с разной структурой острова пандемичности УБР-Н. Депонированные штаммы могут быть использованы в качестве контрольных при определении типа УБР-Ц у исследуемых природных штаммов.

Полученные в ходе выполнения данные о молекулярно-биологических особенностях геновариантов V. ско1егае биовара Эль Тор используются при паспортизации штаммов, хранящихся в ГКПБ при РосНИПЧИ «Микроб», а также при чтении лекций «Микробиология и генетика возбудителя холеры» на курсах первичной специализации по особо опасным инфекциям по специальности «бактериология» при РосНИПЧИ «Микроб».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Различные штаммы геновариантов V. сИо!егае биовара Эль Тор, выделенные на территории РФ в разные периоды текущей пандемии холеры, содержат в геноме три разных типа острова пандемичности УБР-П: интактный, имеющий короткую делецию и содержащий протяженную делецию. Присутствие в геноме всех штаммов геновариантов, занесенных на территорию РФ в последнее десятилетие, УБР-П с протяженной делецией подтверждает их высокий эпидемический потенциал.

2. Все изученные штаммы геновариантов, несущие остров пандемичности У8Р-П с делецией ряда генов, имели различные мутации (однонуклеотидные замены, инсерция) в гене 1срА, кодирующим основной белок токсин-корегулируемых пилей и локализованом на острове патогенности УР1-1.

3. Сконструирована мультилокусная ПЦР тест-система для дифференциации штаммов геновариантов V. ско1егае биовара Эль Тор с разным эпидемическим потенциалом на основе определения структуры их острова пандемичности У8Р-П. Разработан алгоритм расширенной идентификации штаммов геновариантов V. сИо1егае биовара Эль Тор, основанный на комплексной оценке их фенотипических и молекулярно-генетических свойств.

4. В модельном эксперименте показана возможность конъюгационного переноса гена с/х5/ классического типа в клетки типичного штамма V. сЪо1егае биовара Эль Тор. Включение в геном типичного штамма V. ско1егае биовара Эль Тор гена сСсВ/ холерных классических вибрионов приводит к формированию клонов с повышенной продукцией холерного токсина и измененным уровнем экспрессии других генов, связанных с вирулентностью и/или жизнеобеспечением.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на заседании проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2012-2013 гг.), Международной конференции «Молекулярная эпидемиоло-

гия актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2013 г.), на 8-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014 г.), на научно-практических конференциях РосНИП-ЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов 2013-2014 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, их них 6 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 181 цитируемую работу, из них 42 отечественных и 139 зарубежных. Общий объем диссертации составляет 136 страниц. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 26 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе были использованы 63 штамма V. cholerae 01 серогруппы (4 штамма классического и 59 штаммов Эль Тор биоваров), выделенные от больных и из окружающей среды. Культивирование штаммов осуществляли на агаре и бульоне LB при 30° и 37°С с аэрацией и без нее. Применялись традиционные и современные микробиологические, биохимические и молекулярно-генетические методы, включая секвенирование ДНК и протеомный анализ. Продукцию СТ оценивали с помощью РПИГ на плотной среде и иммуноферментного метода GM1ELISA. Вирулентность штаммов определяли по N.K.Dutta и M.K.Habbu (1955). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием специфических праймеров проводили на термоциклере «Терцик» (ДНК-технология, Россия). Гибридизацию ДНК-ДНК по Саузерну осуществляли по Т.Маниатису с соавт. (1994). Секвенирование генов проводили на приборе «Applied Biosystems 3500 xL» (Applied Biosystems, США). Анализ последовательностей ДНК осуществляли с использованием программы «Mega 5.0».

1. Выявление и молекулярно-генетический анализ природных генова-риантов V. cholerae биовара Эль Тор с измененной структурой генов панде-мичности и патогенности, выделенных на территории Российской Федерации

Эпидемический потенциал патогенных штаммов определяется их способностью не только продуцировать ключевые факторы патогенности, но и адаптироваться к меняющимся условиям окружающей среды. Присутствие в геноме V. cholerae биовара Эль Тор двух дополнительных участков ДНК (VSP-I и VSP-II), отсутствующих у V. cholerae классического биовара, определяет, видимо, повышенную устойчивость вибрионов Эль Тор к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды по сравнению с классическими вибрионами. Недавно было обнаружено, что VSP-II оказался нестабильным (Nusrin S. et al., 2009). Новые варианты этого острова, отличающиеся от интактного VSP-II делецией ряда его генов,

были обнаружены в основном среди недавно возникших высокопатогенных гено-вариантов возбудителя (Nusrin S. et al., 2009; Taviani E. et al., 2011; Chen P.Y. et al., 2011; Okada K. et al., 2012; Bhuiyan N.A. et al., 2012). При этом возникновение делении в VSP-II отразилось на эпидемическом потенциале штаммов. Геноварианты, у которых делетирован большой участок ДНК VSP-II, стали в настоящее время доминировать в бактериальных популяциях, становясь причиной многочисленных эпидемических осложнений по холере (Taviani Е. et al., 2010). Эти данные указывают на существование связи между структурой VSP-II и эпидемическим потенциалом штамма. В этой связи была изучена структура VSP-II у штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, занесенных на территорию РФ.

Для поиска штаммов с измененным VSP-II среди 48 изученных типичных (18) и генетически измененных (30) штаммов мы применили метод ПЦР с использованием 12 пар специфических праймеров, позволяющий определить присутствие 12 генов (vc0490-vc0493, vc0495-vc0498, vc0502, vc0510, vc0512, vc0513), локализованных в краевых и центральных регионах этого острова. Оказалось, что все изученные типичные штаммы, независимо от места и времени выделения (1970-1990 гг.), содержали в геноме интактный VSP-II. В измененных штаммах геновариантов было выявлено 3 варианта VSP-II. В штаммах, выделенных в первое десятилетие, интактный VSP-II присутствовал в геноме 86% геновариантов. Вместе с тем, были выявлены штаммы, имеющие VSP-II с короткой делецией, затрагивающей четыре гена (vc0495-vc0498). Такой измененный VSP-II (VSP-IIA) был обнаружен у 14% штаммов от числа изученных. В то же время геноварианты, изолированные в последнее десятилетие (2004-2012 гг.), в 100% случаев имели VSP-II с протяженной делецией (VSP-ПДД), затрагивающей семь генов из 12 тестируемых (рис. 1). Последующее секвенирование этого участка ДНК. другими исследователями показало отсутствие у них 21 гена VSP-II. Причину возникновения протяженных делеций в VSP-II у штаммов геновариантов еще предстоит установить. Тем не менее, тот факт, что именно такие штаммы, несущие VSP-II с протяженной делецией, были занесены на территорию РФ лишь в последнее десятилетие, может служить дополнительным подтверждением их широкого распространения в эндемичных по холере регионах.

VSP-IIA

1993-2001 гг.

2004-2012 гг.

Рисунок 1. Количество штаммов геновариантов (в %) с разным типом острова пандемичности VSP-II среди изученных штаммов, занесенных на территорию РФ в разные временные периоды текущей пандемии холеры (1993-2012).

Обнаружение различий в структуре VSP-II у недавно возникших геновари-антов возбудителя холеры дало основание говорить о возможной нестабильности и в других хромосомных регионах, в частности в ОП VPI-1. Ввиду того, что одним из ключевых генов вирулентности, входящих в состав этого ОП является ген tcpA, кодирующий основной белок пилей TCP, структурные изменения этого гена и были изучены. У 8 типичных штаммов и 30 геновариантов мы определили нуклеотидную последовательность гена tcpA (597 п.н.), а также его промоторной области (?,срЛ). В результате секвенирования кодирующей и промоторной области этого гена было выявлено четыре его аллеля. Аллель tcpAl был характерен для всех типичных штаммов и совпадал с таковым референс штамма V. cholerae N16961. Что касается геновариантов, то они несли четыре разных аллеля в зависимости от времени их выделения. Большинство штаммов геновариантов (73% от числа изученных), изолированных в предыдущее десятилетие, несли, как и типичные, аллель tcpAl. вместе с тем, в 27% случаев были обнаружены штаммы с аллелем tcpA, для которого характерно присутствие 2х точковых мутаций в промоторной области - вставка аденина (А) и замена цитозина на тимин (С/Т). В то же время все штаммы, изолированные в последнее десятилетие, кроме мутаций в промоторной области несли мутацию в кодирующей части гена tcpA - несинонимичную замену аденина на гуанин (A/G) в позиции 266 и входили в 2 группы - с аллелем tcpA3 (87,0%) и аллелем tcpA4 (13%) (табл. 1).

Таблица 1. Результаты изучения структуры ключевого гена вирулентности tcpA и его промоторной области у геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, изолированных в разные временные периоды на территории РФ.

Изученные штаммы Аллель генагсрА Мутации в гене tcpA

Промоторная область Кодирующая область

Вставка А Замена С/Т Замена A/G

V. cholerae биовара Эль Тор. генетически измененные tcpAl - - -

tcpA2 + + -

КрАЗ + + +

tcpA4 + - +

ЩЦЬь '"*4 -

1993-2001 гг. 2004-2012 гг.

Таким образом, при исследовании структуры гена tcpA выявлена вариабельность его нуклеотидной последовательности. Поскольку мутации в промоторной области возникли в общем участке связывания белков регуляторов, то они могут быть причиной повышенной транскрипции гена tcpA (Wittey J.F., DiRita W.J., 2006; Son M.S. et al., 2011). Следует особо отметить тот факт, что появление мутаций в гене tcpA в большинстве случаев (79,0%) сопровождалось делецией в острове пан-

демичности УБР-П. При этом штаммы, несущие УЭР-П с протяженной делецией, во всех случаях имели мутации как в кодирующей, так и в регулирующей областях.

Сравнительный анализ молекулярно-генетических свойств геновариантов, выделенных в разные временные периоды, позволил представить следующую динамику изменения генетических свойств возбудителя холеры Эль Тор в современный период. После приобретения типичными штаммами нового генетического материала (гена МхВ! холерных классических вибрионов) все последующие этапы микроэволюции возбудителя были связаны с изменением генома уже возникших высокопатогенных геновариантов. При этом в результате последовательного накопления мутаций различного типа геноварианты, возникшие в более поздний период, получили, видимо, новые селективные преимущества (рис. 2).

дополнительные мутации в СТХф, ВУР1-1 и\ЯР-||

Типичные пандемические Генетические изменежые пандемлчакиг штампы V.cholerae биовара Эль Тор

штаммы Vcholerae биовара Эль Тор

Рисунок 2. Динамика изменения молекулярно-генетических свойств пандемических штаммов геновариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, изолированных на территории Российской Федерации в разные временные периоды текущей пандемии холеры.

Примечание: ?,срА - мутации в промоторной области гена tcpA, входящего в состав острова патогенности VPI-I; tcpA и РкрА - мутации в кодирующей и промоторной области гена tcpA; VSP-ИД и VSP-ПДД- остров пандемичности VSP-II с короткой и протяженной делецией.

Таким образом, представленные данные и их анализ говорят о том, что в ходе непродолжительной микроэволюции генетически измененных пандемических штаммов возбудителя холеры Эль Тор возникли новые варианты, структура геномов которых отличается от всех ранее известных штаммов.

2. Конструирование тест-системы для дифференциации геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор с различным эпидемическим потенциалом на основе различий в структуре их острова пандемичности VSP-II, выявляемых методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим учетом результатов.

Проведенный выше анализ распространенности штаммов с разными вариантами VSP-II показал, что среди штаммов, занесенных на территорию РФ в последнее десятилетие, доминируют изоляты, содержащие в VSP-II протяженную деле-

цию и имеющие высокий эпидемический потенциал. В связи с тем, что в эндемичных очагах холеры, циркулируют штаммы с разным эпидемическим потенциалом, способные нанести в разной степени ущерб здоровью населения и экономике страны, актуальным является вопрос об оценке эпидемического потенциала штаммов геновариантов, занесенных на территорию РФ. Поскольку существует явная связь между структурой VSP-II и эпидемическим потенциалом штаммов, мы разработали простой и доступный метод дифференциации штаммов геновариантов с разным эпидемическим потенциалом, основанный на выявлении делеций в этом участке генома с помощью мультилокусной ПЦР.

В качестве ДНК мишеней в ПЦР были выбраны три гена: vc0514, локализованный в 3'-концевом регионе VSP-II, наличие которого характерно для всех типов VSP-II; vc0502, расположенный в центральной части VSP-II, присутствующий в геноме штаммов как с интактным островом пандемичности, так и несущих короткую делецию VSP-II; vc0497, локализованный также в центральной части острова и присутствующий только в геноме штаммов с интактным VSP-II. Праймеры на гены vc0514, vc0502 и vc0497 обеспечивают соответственно образование ампликонов размерами 604 п.н., 761 п.н. и 320 п.н. Экспериментально был установлен состав реакционной смеси, в которую вошли: 2,5 мкл 10х ПЦР-буфера, содержащего BSA, рН 8,4, 0,3 мкл Taq-полимеразы, 2,5 мкл 2 мМ дНТФ, 2 мкл 25мМ раствора MgCl2, по 6 пмоль каждого праймера и деионизованной воды до 15 мкл в расчете на одну реакцию.

Таблица 2. Учет результатов мультилокусной ПЦР тест-системы для дифференциации штамов геновариантов V. сИо1егае биовара Эль Тор с разным эпидемическим потенциалом.

Пробы vc0497 vc0502 vc05I4 Результаты

320 п:н. 761 п.н. 604 п.н.

ОКБ, К- - - Результаты анализа подлежат учету. Контаминация реактивов положительно реагирующей ДНК или ампликонами отсутствует.

наличие хотя бы одного ампликона Результаты анализа не подлежат учету. Контаминация реактивов положительно реагирующей ДНК или ампликонами.

ПК1-М818 + + + Результаты анализа подлежат учету.

ПК2-Р17644 - + - +■

ПКЗ-Л-Э226 - -

Исследуемые пробы + + + Низкий эпидемический потенциал (интактный УБР-П)

+ + Низкий эпидемический потенциал (УЭР-И с короткой делецией)

- - + Высокий эпидемический потенциал (У5Р-И с протяженной делецией)

Примечание: ОКБ - отрицательный контроль выделения; ПК - положительный контроль.

Была составлена программа амплификации: предварительная денатурация при 95°С - 5 мин, далее 35 циклов, включающих денатурацию при 95°С - 30 с, от-

жиг праймеров при 60°С - 30 с, синтез комплементарной цепи при 72°С - 30 с. Заключительным этапом амплификации является достройка цепи при 72°С - 7 мин. Учет результатов проводят в соответствии с идентификационной таблицей 2.

Специфичность разработанной ПЦР тест-системы проверена при тестировании гетерологичных бактерий других родов (Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Shigella sonnei), близкородственных вибрионов других видов (V. angiularum, V. parahaemoliticus, V. mimicus, V. albensis, V. vulnificus), а также нетоксигенных штаммов V. cholerae не Ol/не 0139 серогрупп, не имеющих эпидемической значимости. В качестве положительных контролей (ПК) использовали штаммы V. cholerae биовара Эль Top М818, PI7644 и Л-3226, с определенной нами ранее структурой VSP-II. В результате проведенных исследований неспецифические реакции не были зарегистрированы.

Для оценки эффективности ПЦР тест-системы использовали две группы штаммов V. cholerae биовара Эль Тор: 16 типичных, выделенных от больных на территории РФ во время эпидосложнений по холере в 1970-1990 гг., и 31 генетически измененный штамм, изолированый в РФ в более поздний период пандемии - с 1993 по 2011 гг. В результате комиссионной оценки результатов, полученных с помощью разработанной тест-системы, было установлено, что у всех типичных штаммов имеется прототипный VSP-II. В то же время геноварианты образуют две группы. В первую группу входят штаммы, имеющие к настоящему времени низкий эпидемический потенциал. Эта группа включает штаммы, изолированные в 19932001 гг. и содержащие интактный VSP-II либо VSP-II с короткой делецией. Вторая группа представлена штаммами, VSP-II которых имеет протяженную делецию. Эти штаммы геновариантов, изолированные в последнее десятилетие (2004-2012 гг.), имеют высокий эпидемический потенциал (рис. 3).

W 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Рисунок 3. ПЦР-тестирование генов vc0502, vc0514, vc0497 у исследуемых штаммов V. cholerae биовара Эль Тор. М - маркер молекулярного веса (GeneRuler™ ЮОЬр DNA Ladder). Геноварианты с низким эпидемическим потенциалом: 1 -М1295; 2 - М1266; 10 - Р17644; 11 - Р17647. Геноварианты с высоким эпидемическим потенциалом: 3 - М1429; 4 - М1430; 5 - Р18899; 6 - Л3225; 7 - Л3226; 8 -Л4150; 9-301. Контроли: 12 - ПК1-М818; 13 - ПК2-Р17644; 14 - ПКЗ-Л3226; 15-отрицательный контроль (вода).

Таким образом, показано, что разработанная нами мультилокусная ПЦР тест-система для дифференциации геновариантов возбудителя холеры Эль Тор с различным эпидемическим потенциалом специфична и эффективна.

3. Алгоритм расширенной идентификации генетически измененных штаммов V. Ло1егае биовара Эль Тор

Выявленные нами молекулярно-биологические особенности геновариантов, а также литературные сведения о фенотипических и генетических свойствах таких штаммов, были использованы при решении другой прикладной задачи - разработки комплексного алгоритма расширенной идентификации геновариантов V. ско1егае биовара Эль Тор. Основанием для этой работы служил тот факт, что существующая комплексная система лабораторной диагностики холеры не позволяет одновременно а) идентифицировать генетически измененные штаммы V. сИо1егае биовара Эль Тор, б) дифференцировать геноварианты по их эпидемическому потенциалу; в) оценивать внутривидовую вариабельность ключевых генов патогенно-сти с(хВ и 1срА, которая может влиять на тяжесть клинических проявлений инфекции. Разработанный алгоритм основан на использовании известных ранее фенотипических методов, а также сконструированных мультилокусных ПЦР тест-систем, и метода фрагментарного секвенирования и включает четыре этапа.

Первый этап - определение серогруппы, серовара и биовара выделенного изолята на основе его фенотипических свойств. Для определения серогруппы и серовара используют объемную реакцию агглютинации с холерными диагностическими антисыворотками. Биовар изолята определяют, используя реакцию агглютинации с куриными эритроцитами, реакцию Фогес-Проскауэра, определение чувствительности к полимиксину и выявление чувствительности к холерным диагностическим бактериофагам классическому и Эль Тор.

Второй этап - подтверждение серогруппы и биовара изолята и определение его принадлежности к генетически измененным штаммам возбудителя холеры Эль Тор посредством мультилокусной ПЦР «Ген с1хВ РЭФ». На необходимость генетического подтверждения серогруппы и биовара указывает высокая доля (75,090%) отличных по биологическим свойствам выделенных культур.

Третий этап - дифференциация геновариантов возбудителя с разным эпидемическим потенциалом на основе анализа структуры их острова УБР-П с помощью сконструированной нами и представленной выше мультилокусной ПЦР.

Четвертый этап - выявление полиморфизма генов с!хВ и 1срА методом секвенирования этих генов.

Разработанный алгоритм, основанный на использовании микробиологических и молекулярно-генетических методов, может обеспечить получение расширенной информации о стандартизированных свойствах возбудителя при осуществлении мониторинга с установлением происхождения штамма и возможных путей заноса инфекции.

4. Экспериментальное моделирование образования геновариантов в процессе -конъюгации и изучение их фенотипических и молекулярно-генетических свойств

Самостоятельный интерес представляют впервые проведенные исследования по экспериментальному моделированию возникновения геновариантов возбудителя холеры Эль Тор. Моделирование основано на использовании сконструированных нами донорного штамма, несущего профаг СТХср классического типа и способного к его переносу, и типичного реципиентного штамма возбудителя холеры Эль Тор, выделенного в начальный период 7-ой пандемии, не продуцирующего гемолизин и несущего введенную мутацию (strA), обеспечивающую контрселекцию донора в конъюгационных скрещиваниях.

Для создания донорного штамма была использована описанная ранее (Simon R. et al., 1984) бинарная система, состоящая из транспозона Tn5-Mob (KmR) и плаз-миды-помощника pRP4-4 (ApRTcRKms). Указанный транспозон, определяющий резистентность к канамицину, был удобен тем, что имел в своем составе начало переноса (oriT) плазмиды pRP4-4 (ApRTcRKms), получившую обозначение как область Mob. Внедрение Tn5-Mob в бактериальную хромосому при наличии в клетке ■ дополнительного tra-оперона плазмиды pRP4-4 в транс-положении может обеспечить направленный перенос хромосомных генов (Simon R. et al., 1984). В этой связи для конструирования донора был взят полученный ранее штамм биовара Эль Top V. cholerae МАК757 chr::Tn5-Mob, KmR, Тох++, являющийся производным предпандемического штамма МАК757 и несущий транспозон Tn5-Mob вблизи профага СТХСТамф классического типа (Щелканова Е.Ю. и др., 2008). Такая локализация транспозона позволяла использовать KmR в качестве селектируемого маркера при отборе рекомбинантов, получивших донорный аллель ctxBI. С целью получения донорного штамма в клетки V. cholerae МАК757 chr::Tn5-Mob KmRTox++ была . введена плазмида-помогцник pRP4-4 (ApRTcRKms). Донором этой плазмиды служил штамм Е. coli С600 (pRP4-4). В результате коньюгационных скрещиваний были получены трансконъюганты V. cholerae MAK757chr::Tn5-Mob (pRP4-4), фенотип которых был ApRTcRKmR! Частота переноса плазмиды pRP4-4 составляла 7х104. Один из полученных трансконъюгантов, несущих Tn5-mob в хромосоме и плазмиду pRP4-4 в клетке, был выбран в качестве донора и обозначен как V. cholerae КМ7Р chr::Tn5-Mob (pRP4-4).

На втором этапе донорный штамм скрещивали с реципиентным штаммом биовара Эль Top V. cholerae М818 StrRTox+, несущим в хромосоме одну копию профага СТХи""ф и продуцирующим незначительное количество СТ. Рекомбинан-ты отбирали на питательной среде, содержащей канамицин. Рост донорных клеток предотвращали добавлением в селективную среду стрептомицина. Далее все KmR рекомбинанты проверяли на наследование ими неселектируемого донорного алле-ля ctxBI, лакализованного вблизи транспозона. Поскольку известно, что донорный штамм, как и другие природные геноварианты, несущие классический аллель ctxBI, как правило, продуцируют заметно больше CT по сравнению с типичными

штаммами (Naha A. et al., 2013; Son M. et al., 2011), мы полагали, что KmR реком-бинанты, получившие донорный аллель ctxBl, должны отличаться от реципиента повышенной продукцией этого белка. Присутствие неселектируемого маркера ал-леля ctxBl у KmR - рекомбинантов определяли путем оценки у них продукции СТ с помощью простого чашечного метода - РПИГ на плотной среде (рис. 5). В результате среди проверенных 505 KmR клонов было выявлено семь рекомбинантов, отличающихся от реципиента более высоким уровнем продукции СТ. Для подтверждения этих данных у всех семи рекомбинантов была определена продукция СТ количественным иммуноферментным методом GMi ELISA. Оказалось, что продукция ими СТ составляла 10-32 мкг/мл, явно превышая таковую у реципиентного штамма М818.

Таким образом, сконструированный донорный штамм биовара Эль Тор V. cholerae КМ7Р chr::Tn5-Mob (pRP4-4) содержал вблизи генома профага CTXa"ss(p транспозон Tn5-Mob. Реципиентный штамм V. cholerae М818 StrR биовара Эль Тор, несущий, в отличие от донора, CTXs'°rcp с геном ctxB3, имел фенотип Тох+ StrR (рис. 4).

-ч

**"" ""** lIOvIV-lrilllLdl

ггнпиаркапт)

р«1шпнеит

(ккомбиианг

Рисунок 4. Схема конъюгационного скрещивания донорного и реципиентного штаммов V. cholerae биовара Эль Тор: донорный штамм КМ7Р имеет в хромосоме профаг CTXc/ass<p с геном ctxBl и транспозон Tn5-Mob, реципиент - профаг СТХ£"°г(р с геном ctxB3. Рекомбинанты содержат в хромосоме транспозон Tn5-Mob и геном донорного профага CTXctecp, включающий оперон ctxABl с промоторной областью.

Выявленное изменение продукции СТ у изученных KmR - рекомбинантов могло быть следствием изменения структуры их профага СТХср за счет приобретения гена ctxB классического типа (аллель ctxBl) от донорного штамма. Это предположение было подтверждено определением аллеля гена ctxB методом МАМА-ПЦР. Оказалось, что у всех рекомбинантов действительно имелся донорный аллель ctxBl, тогда как в геноме профага реципиента присутствовал аллель ctxB3.

Обнаружение повышения в уровне экспрессии генов холерного токсина у геновариантов позволяет полагать, что внедрение гена ctxBl может сопровождаться изменением экспрессии и других генов, связанных с вирулентностью. Ввиду

этого мы сравнили геноварианты с реципиентным штаммом по их подвижности, а также по способности продуцировать растворимую гемагглютинин/протеазу (НА/Р) и фосфолипазу, которые относятся к дополнительным факторам вирулентности. Среди исследованных все геноварианты были заметно более подвижны по сравнению с реципиентом М818. Что касается НА/Р и фосфолипазы, то продукция этих ферментов патогенности у исследованных геновариантов оказалась также повышенной в 1,3-1,6 раз по сравнению в реципиентным штаммом (табл. 3).

Таблица 3. Результаты фенотипического анализа экспериментально полученных геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор.

Штамм CT*, (мкг/мл) НА/Р", (мм) Фосфолипаза", (мм) Подвижность*", (мм)

569В**** 8,3±1,25 0,0 н.о. н.о.

КМ7Р 14±0,8 1,0±0,57 1,0±0,57 3±0,57

М818 0,01±0,005 3,0±0,57 3,0±0,57 5±1,52

R1 13±0,8 3,0±0,57 4,0±1,15 15±3,2

R2 10±1,25 4,0±0,57 4,0±0,57 14±0,57

R3 16±1,41 4,0±0,57 6,0±1,15 15±1,15

R4 32±1,63 5,0±0,57 5,0±0,57 18±2,0

R5 29±2,94 5,0±0,57 6,0±0,57 22±2,0

R6 26±0,8 5,0±0,57 6,0±1,5 20±1,0

R7 25±0,8 н.о. н.о. н.о.

Примечание: количество продуцируемою СГ по данным иммуноферментного метода GM, ELISA; НА/Р - растворимая гемагглютинин/протеаза или фосфолипаза, в мм дана зона просветления вокруг макроколоний; в мм дана зона ореола вокруг макроколоний;

569В - высокопатогенный штамм V. cholerae классического биовара, взятый в качестве положительного контроля при определении CT; н.о. - не определяли. Приведены средние значения из Зх измерений.

Рисунок 5. Продукция холерного токсина по данным РПИГ КшкТох^ ре-комбинантами V. сИо1егае биовара Эль Тор, полученными при скрещивании донора V. ско1егае Кт7Р с реципиентным штаммом V. сИо1егае М818. 1-2 - реципиент М818; 3-6, 7-10, 11-14 - рекомбинанты Ш-ЯЗ соответственно; 15-16 - донорный штамм КМ7Р; 17-18 - высокотоксигенный штамм V. сИо1егае 569В классического биовара, взятый в качестве положительного контроля.

Таким образом, впервые получены данные об изменении экспрессии у гено-вариантов не только генов СТ, но и генов, кодирующих такие дополнительные факторы вирулентности как НА/Р, фосфолипаза и подвижность.

Изменение экспрессии ключевых и дополнительных факторов вирулентности in vitro у полученных рекомбинантов, содержащих аллель ctxBl, отразилось на уровне их вирулентности для лабораторных животных. При внутрикишечном заражении крольчат-сосунков клетками реципиентного штамма М818 и двух произвольно выбранных геновариантов в трех разных дозах (107, 105, 102 КОЕ) было установлено, что, в отличие от реципиента, геноварианты вызывали развитие специфического холерогенного эффекта (сильное растяжение тонкого и толстого кишечника животных за счет наполнения их прозрачной опалесцирующей жидкостью) при заражении крольчат не только высокими (105, 107 КОЕ), но и низкими (102 КОЕ) дозами. Этот факт свидетельствует о более высокой вирулентности полученных геновариантов по сравнению с реципиентом, относящимся к типичным штаммам V. cholerae биовара Эль Тор. Более высокий уровень вирулентности геновариантов может быть следствием усиления- продукции как ключевых, так и изученных дополнительных факторов патогенности.

Таблица 4. Результаты ПЦР-анализа генома штаммов донора, реципиента и рекомбинантов V. ско1егае биовара Эль Тор.

СТХф RS^ ТЬСф RTX

Название штамма Коровая область RS2-oблacть -О

сер orfU асе о 1 ctxBl «»1 s С =5 £ § ва се 8 3 се 2 2 1 с Н О •v* С tlcR 'В rlx/i rtxC

КМ7Р + + + + + + - + - + + + - + + + +

М818 + + + + + - + - + + + - + + + + +

R1 + + + + + + - + + + + + + + + + +

R2 + + + + + + - + + + + + ■ + + + + +

R3 + + + + + + - + + + + + + + + + +

R4 + + + + + + - + + + + + + + + + +

R5 + + + + + + - + + + + + + + + + +

R6 + + + + + + - + + + + + + + + + +

R7 + + + + + + - + + + + + + + + +

Примечание: с1хВ1 - аллель гена с1хВи°сЬсВЗ - аллель гена с1хВш'°г; гИК"''', ык"™ -аллели гена га/Я, характерные соответственно для штаммов V. сИокгае биовара Эль Тор или V. с!ю1егае классического биовара.

На следующем этапе был проведен молекулярно-генетический анализ полученных геновариантов. В результате показано, что во всех случаях происходило, видимо, наследование генов всей области профага, включая коровую и 118-2. Об этом свидетельствует тот факт, что рекомбинанты имели не только все тестируемые гены коровой области (ОхА, ОхВ1, гог, асе, ог^и и сер), но и наследовали до-норный аллель гена гс/Д (ге£Кс'а™)> входящего в состав последовательности К8-2 (табл. 4). Выявление у рекомбинантов реципиентного аллеля могло быть

связано с присутствием в их геноме профага RSl(p, несущим этот аллель гена rstR. Секвенирование этих генов подтвердило данные ПЦР-анализа.

Далее, мы сравнили нуклеотидную последовательность промотора оперона ctxABl рекомбинантов с таковой реципиентного и донорного штаммов, содержащую тандемно повторяющуюся последовательность 5'-TTTTGAT-3', которая, взаимодействуя с регуляторными белками ToxR и ТохТ, усиливает транскрипцию оперона. При этом уровень экспрессии оперона ctxAB зависит от числа повторов 5'-TTTTGAT-3' (Yu R.R., DiRita V.J., 2002). Результаты секвенирования показали, что в промоторной области донорного штамма имелось 3 повтора 5'-TTTTGAT-3', тогда как у рецепиента было обнаружено 4 копии этой последовательности. Что касается рекомбинантов, то в промоторной области их оперона ctxABl содержалось, как у донорного штамма, 3 повтора 5'-TTTTGAT-3' (рис. 6). Такие данные подтверждают получение рекомбинантами от донорного штамма всего оперона ctxABl с промоторной областью. Было также установлено, что, согласно данным блот-гибридизации по Саузерну Pst-I-фрагментов хромосомной ДНК с CT-зондом, все проверенные рекомбинанты содержали одну копию профага.

Таким образом, показано, что полученные экспериментальным путем гено-варианты сформировались в результате включения в хромосому реципиентного штамма участка донорной ДНК, содержащей транспозон Tn5-Mob и прилежащий к нему геном профага CTXc/lMI<p с опероном ctxAB и его промоторной областью, а также RS-2 областью с геном rstRc,as\рис. 4).

210 220 <30 240 250 2ÍD 270 200 230 300 ...-I....I----1----1 ....!....{ ...Л....! ...,i....| ....!....) ....I....1 ....I....I ----1----1

R в Е a a er

0395 ASACAGGAAA TGATAAAAAA GGJC7AAATA GTATATTnS АТТТПЯ.Т? TTTGÄ.?TTTT"GÄTTTT?GA? TTTTGSTrTTOÍriTCAM TAATACAäAT

юпр мюеаш tgitawm ggjctaaata отлтлтттто Атпттатт тттсапт............................сааа iaatacsaat

ei шааеш tgataaaaaa ggjctaaata gtatattttg atttttoltt tttgattt...........................-casa таатасааат

Ю AAKAGGSAA TGATAAAAAA GGACTAAATA GTATATTTTG ATTTTTSVTT TTTGATTT.......—..................-CAÍA ТААТАЕАААТ

ЕЗ AAACAC-GAAA TGATAAAAAA GCSCTAAATA GTATATTTTG ATTTTTGAn ТТОАГП............-...............СААА ТААТАОАА?

R. шласаа tgataaaaaa ggactaaata gtat&ttttg аптттсагг гттоатп...........................-casa таатасааат

R5 АААСЩША TGATAAAAAA GGJCTAAATA GTATATTTTG ATTTT7GA1T TTTGATTT............................CSAA ТААТАЕАААТ

R6 JAJCAGGAAA TGATAAAAAA GGMTTAAATA CTATATTTTG ATTTTTGATT 7TTGA7TT............................CSAA TAATSEÍAST

R7 AAJCAGGAAA TGATAAAAAA GGKTAAA7A GTATATTTTG АТТТ7ТЯ.7Т TTTGATTT............................СААА TAATACAAAT

ЙЭ1В AAACAGGAAA TGATAAAAAA GGSCTAAATA GTATATTTTG ATTTTTSU7 T7TGATTTTT GATTT---------------------СААА ТАШСАААТ

N16961 AiiCMGAAA TGATAAAAAA GGäCTAäATA GTATATTTTG А7ТТТТШТТ TTTGATtTT? fflTTT....................-CSAA ТШАШАТ

Рисунок 6. Нуклеотидные последовательности промоторной области генов ctxAB полученных рекомбинантов V. cholerae R1-R7 биовара Эль Тор. Буквой R обозначены гептаповторы TTTTGAT; 0395 - референс-штамм V. cholerae классического биовара; донор - донорный штамм V. cholerae КМ7Р биовара Эль Тор; R1-R7 - KmRTox++ рекомбинантные штаммы; М818 - реципиентный штамм V. cholerae биовара Эль Тор; N16961 - референс-штамм V. cholerae биовара Эль Тор.

Заметное повышение токсигенности и вирулентности полученных рекомбинантов (геновариантов) может служить указанием на изменение активности не только их различных генов патогенности, но и генов жизнеобеспечения. Для проверки этого предположения совместно с протеомным центром ИБХМ им. Б. Н. Ореховича методом двухмерного гель-электрофореза и MALDI-TOF масс-

спектрометрии были получены протеомные карты реципиентного штамма М818 и рекомбинанта Ш. При компьютерном анализе протеомных карт исследуемых штаммов было выявлено 2338 белков. Их сравнительный анализ показал, что в клетках рекомбинанта Ш действительно изменился уровень экспрессии 26 белков, среди которых биосинтез 17 повысился, 9 - понизился. Для последующей идентификации методом масс-спектрометрии было отобрано 13 белков, экспрессия которых достоверно различалась у сравниваемых штаммов более чем в два раза. Среди них обнаружено 8 белков, уровень экспрессии которых у рекомбинанта повышен в 2,3-4,3 раз по сравнению с реципиентным штаммом. Эти белки принимают участие в таких важных процессах в клетке, как энергетический и метаболический обмен (дегидролипоамид дегидрогеназа, КФ 1.8.1.4; 4-гидроксифенилпируват диоксигена-за, КФ 1.13.11.27; аланин дегидрогеназа, КФ1.4.11), транспорт аминокислот, пептидов и аминов (переносчик АВС олигопептидов, периплазматический олигопептид-связывающий белок), а также фолдинг белков и защита клетки от повреждающего действия высоких температур (шаперон ОгоЦ. Кроме того, у рекомбинантов более чем в 3 раза повышена экспрессия белка-порина ОтрТ, входящего в состав клеточной стенки, который, регулируя поступление в клетку воды, питательных веществ и различных соединений, обеспечивает устойчивость бактерий к действию органических кислот и анионных детергентов (Мегте11 Б.Б. е1 а1., 2000). Вместе с тем выявлено 5 белков, содержание которых у рекомбинанта Ш снижено в 2,0-4,2 раза. К ним относятся уридин фосфорилаза (КФ2.4.2.3), железосодержащая алко-гольдегидрогеназа (КФ 1.1.1.1), модифицированные формы аланиндегидрогеназы и 4-гидроксифенилпируват диоксигеназы, а также универсальный стрессовый белок иврЕ, ответственный за устойчивость бактерий к оксидазному стрессу.

Механизм изменения экспрессии генов, кодирующих выявленные белки, остается пока неизвестным. Можно лишь предположить, что индукция или репрессия указанных белков у геновариантов может быть следствием изменения активности каких-то глобальных регуляторных систем, контролирующих экспрессию генов, связанных не только С; вирулентностью, но и жизнеобеспечением клетки (Сове Т.О. е1 а1., 2013; Ьегу Ь. й а1., 2013; БЫкиша N. е! а1., 2013). В целом же измененная экспрессия указанных генов у геновариантов может, видимо, повысить устойчивость таких штаммов к действию неблагоприятных факторов окружающей среды.

Итак впервые экспериментальным путем получены геноварианты V. сИо1егае биовара Эль Тор, несущие СТХс/а"ф холерных вибрионов классического биовара. Генетическое моделирование подтвердило возможность образования геновариантов в процессе конъюгации и позволило получить новые экспериментальные данные о роли внедренного в хромосому типичного Эль Тор штамма профага СТХс1а55ф в изменении продукции не только холерного токсина, но и других дополнительных факторов патогенности, возможно, за счет изменения активности регуляторных генов. Полученные данные открывают перспективу широкого использования созданной системы экспериментального моделирования для дальнейшего более глубокого изучения роли профага СТХа""ф в изменении не только виру-

лентных, но и других важных свойств геновариантов, определивших их глобальное распространение в мире.

В заключении подведены итоги работы и определены перспективы дальнейших исследований. Отмечено, что новые сведения об изменении структуры у острова пандемичности У8Р-П и острова патогенности УР1-1 природных геновариантов, изолированных в последнее десятилетие, а также выяснение роли нового участка ДНК с геном с&В1 в изменении экспрессии генов вирулентности и жизнеобеспечения у экспериментально полученных геновариантов является заметным вкладом в понимание природы патогенности недавно возникших генетически измененных штаммов V. ско1егае биовара Эль Тор.

ВЫВОДЫ

1. Различные штаммы геновариантов V. сИокгае биовара Эль Тор, изолированные в разные периоды текущей пандемии холеры на территории Российской Федерации, содержат в геноме три типа УБР-И: интактный (УБР-П), имеющий короткую делецию, включающую четыре гена (~ЧЗР-\Шус0495^с0498), и содержащий протяженную делецию, затрагивающую семь генов из 12 тестируемых (УБР-\IAvc0495-vc05 12). Присутствие У8Р-П с протяженной делецией в геноме всех штаммов, занесенных на территорию Российской Федерации в последнее десятилетие (2004-2012 гг.), подтверждает их широкое распространение в эндемичных по холере регионах за счет их высокого эпидемического потенциала.

2. Впервые показано, что утрата протяженного участка ДНК в У8Р-П характерна для штаммов геновариантов V. сИо1егае биовара Эль Тор с измененной структурой ключевого гена вирулентности ¡срА, кодирующего основной белок ток-син-корегулируемых пилей и локализованных на острове патогенности УР1-1. В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена ¡срА обнаружено, что у геновариантов, содержащих УЭР-П с протяженной делецией, этот ген представлен двумя аллелями — /срАЗ, содержащим две однонуклеотидные замены (А/С и С/Т) и инсерцию (А), и /срА4, имеющим лишь две однонуклеотидные замены (А/С и С/Т).

3. Сконструирована мультилокусная ПЦР тест-система для дифференциации штаммов геновариантов V. сИо1егае биовара Эль Тор с различным эпидемическим потенциалом на основе выявления различий в структуре острова пандемичности УБР-П. Специфичность и эффективность разработанной ПЦР тест-системы составляет 100%.

4. Разработан алгоритм расширенной идентификации генетически измененных штаммов V. сИо1егае биовара Эль Тор, основанный на использовании микробиологических и молекулярно-генетических методов. Представленный алгоритм позволяет проводить комплексную оценку фенотипических и молекулярно-биологических свойств выделяемых штаммов, являющихся диагностически значимыми и/или определяющими вирулентность.

5. Впервые проведено экспериментальное моделирование образования геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор в процессе конъюгации, основанное на использовании сконструированных донорного и реципиентного штаммов. Приобретение клетками типичного штамма V. cholerae биовара Эль Тор гена ctxBl холерных вибрионов классического биовара приводит к повышению продукции ими холерного токсина, а также изменению экспрессии ряда других генов, связанных с вирулентностью или жизнеобеспечением.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шашкова A.B., Агафонов Д.А., Черкасов A.B., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Фенотипический и молекулярно-генетнческий анализ генетически измененного токсигенного штамма Vibrio cholerae 301 биовара Эль Тор, изолированного в 2011 году в России // Проблемы особо опасных инфекций. - 2012. - Вып. 4(114). - С. 61-64. (журнал из перечня ВАК)

2. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Агафонов Д.А., Шашкова A.B., Челдышова Н.Б., Черкасов A.B. Сравнительный молекулярно-генетический анализ мобильных элементов природных штаммов возбудителя холеры // Генетика. - 2013. - Т.49, №9. - С. 1036-1047. (журнал из перечня ВАК)

3. Смирнова Н.И., Агафонов Д.А., Щелканова Е.Ю., Заднова С.П., Черкасов A.B., Кутырев В.В. Геноварианты возбудителя холеры Эль Тор: получение, молекулярно-генетический и протеомный анализ // Мол. генет. микроб, вирусол. - 2014. - №1. - С. 21-31. (журнал из перечня ВАК)

4. Заднова С.П., Агафонов Д.А., Шашкова A.B., Смирнова Н.И. Сравнительная устойчивость типичных и генетически измененных штаммов Vibrio cholerae биовара El Tor к действию неблагоприятных факторов внешней среды // Жури, микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2014. - №.2 -С. 11-17. (журнал из перечня ВАК)

5. Смирнова Н.И., Агафонов Д.А., Заднова С.П., Черкасов A.B., Кутырев В.В. Алгоритм идентификации токсигенных генетически измененных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2014. - №.2 - С. 36-46. (журнал из перечня ВАК)

6. Агафонов Д.А., Заднова С.П., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Конструирование ПЦР тест-системы для дифференциации генетически измененных токсигенных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор с разным эпидемическим потенциалом // Проблемы особо опасных инфекций - 2014. -Вып. 2. - С. 85-88. (журнал из перечня ВАК)

7. Шашкова A.B., Агафонов Д.А., Черкасов A.B., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Структура острова пандемичности VSP-II у измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, выделенных на территории Российской Федерации // Сб. матер, проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы», Ростов-на-Дону. - 2012. - №.25. - С. 114-117.

8. Агафонов Д.А., Щелканова Е.Ю., Ливанова Л.Ф., Заднова С.П., Краснов Я.М., Смирнова Н.И. Молекулярно-генетический анализ геновариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, полученных путем конъюгационных скрещиваний // Материалы совещания специалистов Роспотребнадзора «Холера и патогенные для человека вибрионы», Ростов-на-Дону. - 2013. - №. 26. - С. 115-118.

9. Агафонов Д.А., Шашкова A.B., Заднова С.П., Черкасов A.B., Смирнова Н.И. Структурные изменения генома возбудителя холеры в процессе эволюции // Материалы Международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (Санкт-Петербург), Инфекция и иммунитет. - 2013. - Т. 3, №2.-С. 108.

10. Черкасов A.B., Краснов Я.М., Агафонов Д.А., Шашкова A.B., Смирнова Н.И. Вариабельность структуры острова пандемичности VSP-II штаммов Vibrio cholerae, выделенных на территории России // Материалы Международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (Санкт-Петербург), Инфекция и иммунитет. - 2013. - Т. 3, №2. - С. 185.

11. Агафонов Д.А., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Мультилокусная ПЦР тест-система для дифференциации токсигенных геновариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор с разным эпидемическим потенциалом // Сб. матер. 8-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014». - 2014. - Т. 1. - С.450-451.

Подписано к печати 10.07.2014 Формат 60 х 84 1/16 Печать лазерная Бумага офисная Объем 1,0 усл. п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46