Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ хромосомной сар-области vibrio cholerae 0139

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щелканова, Елена Юрьевна, Саратов



\ лТ.-ГТ ТГ/ПТГЧТЛТ'Г5;~ Я ТТЛ Я ПГ,П' ''П Д tic? TT.írr ЛГ'ТГГГ'Г! A ТТТлТ/Г

éirmu i ьгь i du /ЬдгКоиилгАпПдПИА rU^uímurs.Uíi чуадсгАцУш

РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ

ИНСТИТУТ "МИКРОБ'

На правах рукописи

ЩЕЛКАНОВА Елена Юрьевне

ШЖКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ХРОМОСОМНОЙ САР-ОБЛАСТИ

VIBRIO CH0LERAE 0139

Оу.ии.и? - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Н.И.Смирнова

Саратов -

1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ....................................................

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. 0139-АНТИГEH I ПОЛИОАХАРИДНАЯ КАПСУЛА - НОВЫЕ ДО-

■1 ч

ВЕРХНОСТНЫЕ АНТИГЕНЫ V.OHOLERAE 0139____......... 1

1.1. 0139-анткген! структура и функция................ 15

1.2. Капоульный полисахарид V.oholerae 0139 и его роль

в вирулентности и иммуногеннооти................. 19

1.3. Генетический контроль биосинтеза полисахаридной

w.—t * f утт*

d-xio У г J A, fri АялаХйал*ля&л*ля**л*я*ялллллА*езалляал»а»л й-f

ГЛАВА 2. УМЕРЕННЫЕ ФАГИ V.CHOLERAE 0139 Pi Ж РОЛЬ В ИЗМЕНЧИВОСТИ ВИРУЛЕНТНЫХ СВОЙСТВ..................................30

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛаВа s. МАхЬРИАЛЫ >1 МЕТОДЫ............................... с$9

3.1. Бактериальные штаммы............................. ЗУ

3.2. Питательные среды и реактивы..................... 41

3.3. Методы.....................................................................41

3.3.1. Получение мутантов с помощью индуцированного

мутагенеза и определение их питательных потреб-

IriLji^/'X а адддавааалаааааааяааллазадавазадлааааваа ^ J-

3.з.¡¿. Конъюгационные скрещивания..................... 4й

Определение чувствительности культур к холерным

фагам.......................................... 43

Определение продукции маннозо- чувствительных гемаггжзтикйрующйх пилен адгезии ^МЧПА)........ 43

у,а,ь, определение подвижности,*...................... 44

3.3.6. Приготовление лизата транодуцирующего фага,,.,. 44

3.3.7. Трансдукционные скрещивания .................... 44

3.3.8. Электронно-микроскопический анализ холерных виб-

Рт F .-. Т- -г.—■ т—; /f

'MUttUS ................ ...... ........ ...........

'1 р

3.3.9. Выделение фаговой ДНК........................

3.3.10. Реотрикционный анализ.......................... 46

3.3.11. ДНК-ДНК гибридизация на нитроцеллюлозных фильт-

77 г*^„i .-.Т.у. А "у

у<ЛЛ. UU £-•. OUUL-licU II. .. ....... .............. ......

3.3.12. Электрофоретическии анализ..................... 4V

ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ САР-ОБЛАСТИ V.CH0LERAE 0139.. 49

4.1. Генетическое картирование гена cap о помощью конъ-югационных скрещиваний........................... 49

4.2. Определение сцепленности гена cap с генами, контролирующими подвижность холерных вибрионов и биосинтез маннозо-чувствительных гемагглютинирующих

liifisll ti Pi dflr Cil'll''i аа»е»лагв»вгдлавла*4лад«вхв4дл**»8»£ О X

4.3. Определение локализации на хромосоме умеренного

OQ • —, Q

К f 'CU С*- -L w' £?а аа4аадаадаа«аааа»а»аадаа*а»ала*еааа»ааа,а W* s—'

ВА 5. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ И РОЖ УМЕРЕННОГО ФАГА 139 В НАРУШЕНИИ СИНТЕЗА КАПОУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА.,,.,..,. 73 Выделение фаговой ДНК и ее реотрикционный анализ. 73 Определение присутствии фага 139 в различных штаммах V.oholerae 0139.............................. 77

Роль фага 139 в фенотипической изменчивости V.cho-

] ar-ciP Ж '"3Q R"1

X 1 iJC • -i. л л л a. ...an...»»,., .а,«,,«.,,., ......... / -»-

Трансдуцирующие свойства умеренного фага 139..... 92

п ТТЛ

i J1H&

р -1 cj. (

А 139 П"1—РР1— Е.SOUTHERN . ........................................... 99

^^iiirii'lE дда4*1»ааааааадагадааав»««ад*ааае»адаа»ед*8»»ааааа X tJ i

ВЫВОДЫ, а а.....а д а а а а а.....а а а . а а а а а а а.....* а а . а.....a a a a a a a a llS

ПТТТ.^ППЛ/ TTT^TTTTl А ТТГрТ^Т -1 rip.

L/XXfiJ..-' w i w JUfL. X Ex Г И. X А ¿Л Адааааахаалаажаааааааааааааааддаааааааааааа Л. i--r w

ИЗУЧЕНИЕ РАСПРОСТРАНЕННОСТИ УМЕРЕННОГО ФАГ. СРЕДИ РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ ¥.СН01ЕРАЕ 01- И НЕ РОГРУПП НА ОСНОВЕ ДНК-ДНК ГИБРИДИЗАЦИИ ПО

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

KmrlSi - устойчивость (или чувствительность) к канамицину RifrCs) - устойчивость (или чувствительность) к рифампицину SporlSi- устойчивость(или чувствительность) к спектиномицину StrrlsJ- устойчивость (или чувствительность) к стрептомицину Тп - трансповон kDa - килодальт-он

МЧПА - маннозо-чувствительные пили адгезии

НГ - нитрозогуанидин (М-метил-N'-нитро-Ы-нитрозогуанидин)

НЧС - нормальная человеческая сыворотка т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов BSA - бычий сывороточный альбумин 0V - яичный альбумин Chyiïi - химотрипсиноген

П'ГЭТТГН'ЦТ.'ГГГ

DCC^trU'it,

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ, Возбудителем семи пандемий холеры (с 1817 г. по настоящее время) являлись только токсигенные штаммы Vibrio cholerae ül-серогруппы классического или эльтор биоваров (Karaolis D.K. et al., 1994: Bik Е.М. et al., 1995;; Kaper J.B., et al., 1995; Madico J., 1996; Waldor M.K., Mekalanos J.J., 1996). Считалось, что холерные вибрионы других серогрупп (V.cholerae не 01 или НАГ-вибрионы) неспособны вызывать эпидемии. Они могли быть причиной отдельных случаев или локальных вспышек энтеритов, а также раневых инфекций, септице-мий и т.д. (Ермолаева S.B. о соавт., 1970; Дунаев Г.С. с соавт,, 1980; Адамов А.К., Наумшина М.С., 1984; Развых В.М., 1984; Мединский Г.М. о соавт,, 1988; Середин В,Г. с соавт., 1988; Андросова С,В. с соавт., 1989; ГордееЕа Л.А. с соавт., 1989; Honda Т, et al., 1987; Dhar R. et al., 1989; Hall R.H. et al., 1993), Однако в конце 1992 г, данная точка зрения неожиданно была опровергнута, поскольку в Индии и Бангладеш вспыхнула большая эпидемия холеры, возбудителем которой впервые стал V.cholerae не 01-оерогруппы (Albert M.J., Ansaruzzaman M. et al., 1993; Albert M,J,, Siddique A.К,, 1993; Cholera Working Group, 1993; International center for diarrhoeal disease research, 1993; Islam M.S, et al., 1993; Ramamurthy T.S. et al., 1993; Shimada T, et al,, 1993; Swerdlow D.L., 1993; Albert M.J, et al., 1996; Garde1 C.L. et al,, 1996; Nairl G,B, et al., 1995, 1996;). Возбудителем этой эпидемии был выооковирулентный штамм, принадлежавший к ранее неизвестной серогруппе 0139 (V.cholerae 0139) и получивший обозначение "Бенгал", поскольку береговые районы бенгальского залива

были первоначальным местом его выделения (Shimada Т. et al., 1993). Клинические симптомы заболевания} характеризующиеся про-фузной диареей, рвотой, мышечными судорогами, были не отличимы от симптомов, вызванных холерными вибрионами серогруппы 01 (Albert M.J. et al., 1993; Ramamurthy I. et al., 1993; Shimada Т. et al., 1993). Кроме того, был большой процент заболевания взрослого населения, поскольку иммунитет, приобретенный им против V.cholerae 01, не защищал от воздействия антигенов нового-возбудителя холеры (Albert M.J. et al, 1993; Islam M.S. et al., 1993). Возбудитель холеры новой серогруппы вытеснил с указанных территорий вибрионы биовара эль-тор и быстро распространился за пределы Индийского суб континента (Cholera Working Group, 1993), что свидетельствует о его мощном эпидемическом потенциале. Весьма быстрое распространение этого штамма в Азии и Европе вызывало опасение, что V.cholerae 0139 может заменить вибрионы эльтор таким же образом, как в середине 60-х гг. последний заменил штаммы 01-серогруппы классического биовара и стать возбудителем восьмой пандемии холеры (Albert M.J. et al., 1993; Srnerdlow D.L. et al., 1993; Waldor M.K. et al., 1994; Kaper J.B. et al., 1995). Неожиданно в 1996 г. появился новый клон V.cholerae 01 биовара зль-тор, временно заменивший холерные вибрионы серогруппы 0139, однако затем после 32-месячного отсутствия в Калькутте основным возбудителем холеры стал опять V.cholerae 0139 (Albert M.J. et al., 1997; Faruque A.S.G., 1996). Сосуществование бенгальских штаммов с вибрионами эльтор продемонстрировало временное изменение эпидемиологии холеры в Бангладеш (Sing1 J., 1996; Sharma С. et al., 1997). Следует заметить, что V.cholerae 0139 был не единственным штаммом не ul-оерогруппы, вызвавшим эпидемию холе-

- б -

ры, поскольку в 1958 г. штамм 037-серогруппы был причиной большой вспышки холеры в Судане, Таким образом, суданский штамм представляет собой второй пример эпидемической холеры, обусловленной V.choleras с не 01-антигеном (Bik Е.М. et al., 1996).

Неожиданное появление возбудителя холеры 0139-оерогруппы с новыми антигенными свойствами вызвало огромный интерес исследователей к этому патогену. К настоящему времени получены данные, указывающие на большое сходство V.cholerae 0139 с холерными вибрионами 01-серогруппы биовара эльтор (Calía К.Е. et al., 1994). Оба возбудителя в отличие от вибрионов классического биовара агглютинируют куриные эритроциты, резистентны к полимиксину В (Cholera Working Group, 1993), имеют тандемную дупликацию и идентичную хромосомную локализацию СТХ-генетического элемента (от англ. cholera toxin), несущего гены холерных токсинов otxAB, zot, асе (Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1994), а также характеризуются одинаковой последовательностью генов фактора колонизации topA, кодирующих биосинтез основной субъединицы токсин-корегули-руемых пилей адгезии (Tacket O.J. et al., 1998), и одними и теми же условиями выращивания in vitro для экспрессии Факторов вирулентности (waldor M.K., Mekalanos J.J., 1994). В то же время штаммы V.cholerae 0139 существенно отличаются от v.cholerae 01-серогруппы, включая и вибрионы эльтор, по трем основным свойствам: бенгальские штаммы продуцируют ранее неизвестный 0139-антиген, имеют полиоахаридную капсулу и содержат в хромосоме новый тип конъюгативного транспогона, который кодирует резистентность к триметоприму, стрептомицину и сульфаметоксазолу (Hi-satsune К. et al., 1993; Johnson J.A. et al., 1994; Manning1 P.A. et al., 1994; Waldor M.K. et al., 1994; Waldor M.K., Mekalanos

- Q -

J. J., 1УУ4; Fail an no A. et al., 19У7; Mekalanos J.J. et al,, 1997). Указанные специфические свойства бенгальских штаммов обусловлены наличием в их хромосоме новых генов, отсутствующих в геноме традиционных возбудителей холеры 01-серогруппы.

Полиоахаридная капсула является одним из важных факторов па-тогеннооти и иммуногенности. Имеющие капсулу штаммы V.cholerae 0139 обладают повышенной резистентностью к бактерицидному действию нормальной человеческой сыворотки, что в ряде случаев обусловливает септицемию (Johnson J.А. et. al., 1994). Кроме того, капсула играет важную роль в адгезии и колонизации тонкого кишечника человека и экспериментальных животных новым возбудителем холеры (Смирнова Н.И. с соавт., 1995; Waldor M.K. st al.} 1994). Доказано, также, что капсула относится к протективным антигенам (Федорова В.А., с соавт., 1997; Sengupta D.K. etal., 1996) . Однако, несмотря на такую значительную роль капсулы в патогенезе и иммуногенезе холеры, вызванной V.cholerae 0139, до сих пор весьма мало известно о генетическом контроле ее биосинтеза.

Остается также не решенной проблема изменчивости вирулентных свойств V.cholerae 0139. Было установлено, что штаммы V.cholerae 0139 с большой частотой продуцируют бескапсульные мутанты с пониженной вирулентностью (Waldor M.K. et al., 1994). Тем не менее, пока нельзя утверждать, что изменение вирулентности прямо связано только с утратой 'капсулы, поскольку у бескапсульных вариантов отмечается пониженная продукция маннозо-чувствительных гемагглютиш-фующих пилей адгезии, а также уменьшение подвижности, которые являются факторами патогенности (Смирнова Н.И. с соавт., 1995). Не известен и генетический механизм появления таких вариантов. Возможно, что возникновение спонтанных мутантов с из-

мененной вирулентностью обусловлено умеренным фагом 139, который присутствует в хромосоме штаммов 0139-серогруппы, поскольку ранее описанные умеренные фаги V.cholerae оерогруппы 01 (VcAl, VcA2 и УсАЗ) индуцировали делеционные мутации в хромосоме (Goldberg S., Murphy J.R., 1983; Johnson S.R. et al., 1981;Moseley S.L., Falkow S., 1980). Тем не менее, для установления связи между профагом 139, продукцией капсулы и другими факторами вирулентности требуются дополнительные эксперименты. Кроме того к началу нашей работы почти отсутствовали сведения о местоположении генома фага 139 в хромосоме бенгальских штаммов, о его структуре, распространенности и функции. До сих пор нет данных об участии этого фага в переносе бактериальных генов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ- молекулярно-генетический анализ хромосомной области V.oholerae 0139, содержащей ген(гены) биосинтеза полисахаридной капсулы, а также изучение распространенности умеренного фага 139 и его роль в изменчивости вирулентных свойств бенгальских штаммов.

ЗАДАЧ! ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Определить на хромосоме штаммов V.oholerae 0139 локализацию гена (генов) cap, контролирующего биосинтез полисахаридной капсулы.

2. Определить присутствие в сар-области хромосомы других генов вирулентности (mot и msh, контролирующих, соответственно, подвижность холерных вибрионов и биосинтез маннозо-чувствительных гемагглютинирующих пилей .адгезии), а также генома фага 139.

3. Выяснить роль фага в изменении экспрессии генов cap.mot и

pur (контролирующего синтез пурина), которые определяют вирулентность бенгальских штаммов,

4, Определить трансдуцирующую активность холерного умеренно-

« —, Л-. J-. -г-г -i

i'и фсьГа ± оз,

5. Изучить распространенность умеренного холерного фага 139 среди различных штаммов V.cholerae 01-серогруппы классического и эльтор биоваров, а также среди штаммов V,cholerae не 01.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ,

В результате генетического анализа впервые установлено, что в состав cap-области хромосомы бенгальских штаммов входят важные для вирулентности гены pur и mot, определяющие, соответственно, биосинтез пурина и подвижность холерных вибрионов, а также геном умеренного фага 139, Показано, что фаг 139 присутствует в геноме значительного числа клинических и природных штаммов V, cholerae 0139, выделенных из разных мест. Интеграция фага в хромосому является сайт-специфической,

Получены новые данные о связи фага 139 с нестабильностью генов cap, mot и pur. Этот фаг, индуцируя, видимо, хромосомные перестройки в близлежащих к нему участках, изменяет экспрессию генов cap, mot и pur, что приводит к появлению мутантов о пониженной вирулентностью, В результате получен ряд представляющих интерес для генетических исследований штаммов о мутациями в указанных генах,

Получены приоритетные данные о том, что умеренный фаг 139 может переносить хромосомные гены возбудителей холеры 01-серогруппы классических и эльтор биоваров. В отличие от ранее извест-

кых холерных фагов, осуществляющих общую транодукцию, умеренный фаг 139 относится к специалнвированным транодуцирующим фагам,

Впервые проведено обширное сравнительное исследование распространения умеренного фага 139 в геномах V.cholerae классического и эльтор биоваров, а также V.cholerae не 01. Показано, что 139-фаг или гомологичный ему фаг присутствует в геноме почти 50% традиционных возбудителей холеры и редко встречается в геноме неагглютинирующих вибрионов.

тт л Д У Т Tf ТТ С Л Г/ А ГГ О IT Д Т1 Т/Г VÍ П л т т

ü г н. A. i А Ч h и [\ н л ¿3 п А Ч h м U U' i Х5.

По материалам диссертации составлено методическое пособие: "Идентификация капсульных и бескапсульных штаммов Vibrio ohole-rae 0139-серогруппы при помощи холерных бактериофагов 20 и Ина-ба" (в соавторстве о Задновой 0.П., Конновым Н.П., Смирновой Н.И.), которые утверждены директором РосНИПЧИ "Микроб" по учрежденческому уровню 02 октября 1998 г. В ГКПЕ РосНИПЧИ "Микроб" депонированы 10 штаммов V.cholerae серогруппы 0139, несущие мутации в различных генах вирулентности, а также 1 шта^м V.cholerae 01-серогруппы о гиперпродукцией умеренного фага 139. Указанные штаммы предназначены для молекулярно-генетических исследовании возбудителя холеры 0139-серогруппы и для изучения обмена генетической информацией между возбудителями холеры 01- и 0139-ое-рогрупп. Новые данные о механизме изменчивости вирулентных свойств V.cholerae 0139 могут быть полезными при создании диагностических препаратов и вакцин против холерных вибрионов серогруппы 0139.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ

и А О а пт Т/Г Т Т Г

Л il '_> ft ill, И i -J ,

x. о AuuMuuUMiiUH иау иидшти иЬш Мсиь^л ш'хаМкив upwuy xuTiay

ет важный дли проявления вирулентности ген mot, определяющий подвижность, а также расположен геном умеренного фага 139.

2. Бескапсульные штаммы V.cholerae серогруппы 0139 чувствительны к холерным фагам 20 и Инаба, а капоульные - резистентны.

3. Холерный умеренный фаг 139, ДНК которого является линейной и двунитевой, присутствует в геноме около 70 % изученных бенгальских штаммов. При утрате фагового генома бенгальские штаммы остаются резистентными к литическому действию этого фага.

4. 139-профаг изменяет экспрессию генов cap, mot и pur, важных для проявления вирулентности у бенгальских штаммов.

5. Холерный умеренный фаг 139 способен переносить хромосомные гены холерных вибрионов классического и эльтор биоваров. Указанный фаг относится к специализированным трансдуцирующим фагам.

6. Умеренный фаг 139 или гомологичный ему фаг широко распространены среди различных штаммов V.cholerae 01 классического и зль-тор биоваров и редко содержатся в геномах V.cholerae не 01. Профили гибридизации профага 139 в хромосоме бенгальских и эль-тор штаммов идентичны, что указывает на эволюционную связь этих двух возбудителей холеры.

АПРОБАЦИЯ Р А Б 0 Т Ы. Материалы диссертации доложены и представлены на итоговой научной конференции РосНИПЧИ "Микроб", посвященной 100-летию образования противочумной службы

-1 л

России, Саратов, 1997, а также на Международной конференции "Гс меостав и инфекционный процесс", Саратов, 1996,

11

Л И К А Ц И И, По теме диссертации опубликовано 6 на-

учных

работ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Vibrio oholerae является гетерогенным видом, включающим в себя более 150 оерогрупп, из которых, как считалось до недавнего времени, только токсигенные V.choleras 01 могли вызвать эпидемии холеры (Karaolis D.K. et al., 1994;, Manning- P.A. et al., 1994; Kaper J.B. et al,, 1994, 1995; Bik E.M. et al., 1995). Однако в конце 1992 г. эта точка зрения неожиданно была опровергнута, поскольку в Индии и Бангладеш возникла большая .эпидемия холеры, возбудителем которой стали V. oholerae 0139-оерогруппы или бенгальские штаммы, имеющие, в отличие от V.oholerae 01, два новых поверхностных антигена (0139-антиген и полисахаридную