Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая причина остеопетроза в Чувашии

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая причина остеопетроза в Чувашии"

На правах рукописи

ии3053535

Близнец Елена Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПРИЧИНА ОСТЕОПЕТРОЗА В ЧУВАШИИ

03.00.15-"Генетика"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА, 2007

003053535

Работа выполнена в ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор A.B. Поляков Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.В. Носиков доктор медицинских наук В.А. Мякоткин

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при ГУ МГНЦ РАМН по адресу: Москва, 115478, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ МГНЦ РАМН

Защита диссертации состоится

2007

часов

Автореферат разослан «__»

2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Л.Ф. Курило

Актуальность темы

Генерализованный остеопетроз (болезнь Альберс-Шёнберга, мраморная болезнь костей) впервые был описан немецким рентгенологом Альберс-Шёнбергом в 1904 году (Рендель с соавт, 1935; Семенова с соавт., 1976). К настоящему времени в результате изучения различных аспектов процесса внутренней перестройки костей и заболеваний, связанных с его нарушением, термин остеопетроз включает все остеохондродисплазии, характеризующиеся увеличением плотности костей скелета вследствие нарушения резорбционного процесса во время их внутренней перестройки (Вактапэ е.1 а!., 2005; 0§Ьигеке й а1., 2005).

Для остеопетроза характерна клиническая гетерогенность. Это связано с разнообразием обуславливающих его развитие генетических дефектов и, как следствие, с разной степенью уплотнения костной ткани и распространенности этого патологического процесса. При клинически мягких, как правило, аутосомно-доминантных типах остеопетроза пациенты могут быть ассимптоматичны, в то же время существует злокачественная инфантильная аутосомно-рецессивная форма, проявляющаяся генерализованным уплотнением костей скелета с резким сокращением нормальных анатомических пространств, каналов, отверстий костей. При этом в первую очередь затрагивается костномозговое пространство, что ведет к нарушению медуллярного гемопоэза и, как следствие, развитию очагов экстрамедуллярного гемопоэза в различных паренхиматозных органах. У таких больных уже во младенчестве наблюдается развитие тяжелой анемии, гипертензивно-гидроцефального, гепатолинеального и миатонического синдромов, которое носит резко прогрессирующий характер, и при традиционной посиндромной терапии заболевание заканчивается летальным исходом в раннем детском возрасте.

Именно такая злокачественная аутосомно-рецессивная форма остеопетроза (ЗАРО) наблюдается в Чувашии. Среди наследственных заболеваний, регистрируемых на территории Республики, остеопетроз занимает особое место в первую очередь в связи с необычно высокой для него частотой - 1 больной на 3900 новорожденных (Гинтер с соавт., 2001) - при том, что в России, как и во всем мире, частота встречаемости его в популяциях составляет в среднем от 1:200 000 до 1:100 000 (Семенова с соавт., 1976; Коньков, 1981; Во11ег51еу, 1987). До настоящего времени действительно эффективной терапии для аутосомно-рецессивного остео-

петроза нет, и при такой высокой частоте данное заболевание в Чувашии рассматривается как большая медицинская и социальная проблема.

Как альтернатива лечению рассматривается профилактика рождения детей с остеопетрозом. За последние годы для профилактики рождения больных детей в Чувашии разработана система мероприятий, включающая пренатальное ультразвуковое исследование плода, использование Республиканского регистра остео-петроза, целенаправленное медико-генетическое консультирование в службах планирования семьи (Кириллов, 2004). Однако до настоящего времени не возможно проведение точной ДНК-диагностики данного заболевания, в том числе прена-тальной на ранних сроках беременности, а также выявление гетерозиготного носи-тельства, поскольку неизвестна молекулярная причина остеопетроза в Чувашии. Ее установление позволило бы проводить скрининг на гетерозиготное носительство остеопетроза для выявления супружеских пар, где оба родителя являются гетеро-зиготами по мутантному гену, и последующую диагностику остеопетроза у плода всех беременностей. Поэтому особо актуальным является именно молекулярно-генетическое изучение остеопетроза в Чувашии.

Цель исследования

Установление молекулярно-генетической причины остеопетроза в Чувашии и выяснение популяционно-генетических механизмов его распространения в республике для оптимизации профилактики и диагностики носительства заболевания среди чувашей.

Задачи исследования

1. Анализ гаплотипов полиморфных маркеров, тесно сцепленных с геном-кандидатом, в группе больных остеопетрозом и их здоровых родственников из Чувашии с целью картирования локуса заболевания.

2. Поиск мутации в гене-кандидате. Разработка системы молекулярно-генетических методов для простой и быстрой идентификации выявленной мутации, в том числе скрининговой системы на гетерозиготное носительство заболевания.

3. Исследование последствий выявленной мутации путем изучения экспрессии мутантной мРНК.

4. Установление популяционной частоты носительства заболевания в вы-

борках здоровых чувашей и близких им народностей - марийцев, удмуртов и башкир.

5. Установление «возраста» мутации в Чувашии на основе анализа гаплоти-пов хромосом, несущих мутантный аллель.

Научная новизна

В ходе данной работы впервые изучаются молекулярно-генетические аспекты остеопетроза в Чувашии, и это первая популяция в России, для которой изучается причина эндемичного заболевания. Установлена причина развития заболевания у чувашей - единственная мутация в гене функционального маркера остеокластов - и разработана система быстрой ее идентификации. Выполнена оценка «возраста» мутации и выяснены некоторые популяционно-генетические механизмы ее распространения. Установлена популяционная частота заболевания и его носи-тельства, как в самой Чувашии, так и еще в трех популяциях Волго-Уральского региона: марийской, удмуртской и башкирской.

Практическая значимость

Разработанная система идентификации обнаруженной в ходе работы мутации позволит эффективно проводить диагностику остеопетроза, в том числе и пре-натальнуго, а также выявлять его гетерозиготное носительство в семьях чувашей и марийцев и на популяционном уровне в целях профилактики рождения больных детей. Определение молекулярной природы остеопетроза в республике также могло бы послужить в будущем основой для выбора стратегий более перспективной, по мнению многих исследователей, клеточной терапии данного заболевания. Результаты популяционных исследований заболевания и оценка «возраста» мутации, возможно, внесут дополнительную ясность в понимание процесса этногенеза народов Волго-Уральского региона.

Положения, выносимые на защиту

1. Аутосомно-рецессивный остеопетроз в Чувашии картирован на хромосоме 11я13.4-я13.5 в области гена ТСШа. Единственная мутация с.807+5О А в данном гене является причиной развития всех случаев аутосомно-рецессивного остеопетроза среди чувашей. Транзиция с.807+5С>А приводит к нарушению процесса сплайсинга в интроне 8 гена ТСШй1, образованию нонсенс-транскрипта и уменьшению его количества в клетке.

2. Популяционная частота мутации c.807+5G>A в гене TCIRG1 среди чувашей составляет 1,68% (с 95% ДИ 0,95+2,77%), а расчетная частота заболевания - 1 : 3500 новорожденных. Частота данной мутации среди марийцев - 0,84% (с 95% ДИ 0,33+1,75%), расчетная частота ЗАРО составляет 1 : 14000 новорожденных.

3. Случаи ЗАРО в Чувашии и Марий Эл являются результатом одного древнего мутационного события. Распространение мутации среди чувашей связано с дрейфом генов, при этом возраст мутации для данной популяции составляет 880 ± 260 лет.

4. Использование молекулярно-генетических методов идентификации мутации c.807+5G>A в гене TCIRG1 среди чувашей позволяет верифицировать диагноз злокачественного аутосомно-рецессивного остеопетроза, а также проводить скрининговое тестирование на гетерозиготное носительство для выявления семей с риском рождения больного ребенка и выполнять пренатальную диагностику заболевания на ранних от 8 недель сроках беременности для профилактики рождения больных ЗАРО.

Апробация работы

По материалам исследования опубликованы 10 научных работ, включая 5 статей и 1 коллективную монографию. Материалы диссертации доложены: на конференции Human Genome Meeting 2004, на конференции European Human Genetics Conference 2005, на V съезде Российского общества медицинских генетиков 2005, на конференции European Human Genetics Conference 2006 и на Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний: возможности и перспективы, 2006».

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста; включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 9 глав собственных исследований и обсуждение результатов исследования, заключение, выводы, список использованной литературы. Библиография содержит 18 отечественных и 103 зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 21 рисунком.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для исследования использовали образцы геномной ДНК из 11 чувашских семей с ЗАРО (11 больных детей, 25 здоровых родственников) и 1 марийской семьи с ЗАРО (1 больной, 3 здоровых родственника). Диагноз ЗАРО верифицировался в ГУЗ «Республиканский перинатальный центр» в г. Чебоксары, а также врачами-генетиками Медико-генетического научного центра РАМН.

Популяционную выборку составили 327 образцов геномной ДНК, полученных от чувашей, 299 - от марийцев, 396 - от удмуртов и 271 - от башкир. Популя-ционный материал собран в ходе экспедиций сотрудниками лаборатории генетической эпидемиологии МГНЦ РАМН и лаборатории молекулярной генетики человека Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Выборку составили неродственные коренные жители Чувашии, Марий Эл, Удмуртии и Башкортостана, представляющие все этнографические группы соответствующих народностей.

Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли с помощью готового набора реактивов для выделения DIA torn™ DNA Prep 100 (Isogene Lab.ltd., Россия) по протоколу производителя.

Выделение тотальной РНК осуществлялось из культуры клеток кожных фибробластов с использованием набора реактивов RNAgents®Total RNA Isolation System (Promega, США) согласно протоколу фирмы производителя. Для получения кДНК производили обратную транскрипцию с использованием набора реагентов Promega® Reverse Transcription System, Technical Bulletin No.099 (Promega, США) согласно протоколу фирмы-производителя. Культивирование фибробластов кожных биоптатов осуществлялось в питательной среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки с периодической сменой среды.

Для исследований использовали 10 микросаттелитных маркеров на хромосоме Ilql3.4-ql3.5, расположенных в области размером 12,25 млн.п.н. вокруг гена TCIRG1 и 6 внутригенных SNP маркеров. Все маркеры (кроме СА-повтора из клона АС034259) выбраны с помощью базы данных NCBI. СА-повтор из клона АС034259 в базе данных NCBI не описан и был найден самостоятельно при анализе нуклеотидной последовательности области гена TCIRG1. Физическая и генети-

ческая локализация маркеров на хромосоме оценена с помощью карт Sequence и Marshfield той же базы. Обозначение аллелей маркеров проводили в соответствии с номенклатурой GDB (Human Genome Database - http://www.gdb.org).

Амплификацию всех исследуемых фрашентов ДНК и кДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров, которые синтезировались в НПО «Литех» или НПО "SYNTOL "

Исследование микросателлитных и SNP маркеров проводилось методами соответственно ПДАФ- и ПДРФ-анализа. Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD (США) в УФ-излучении. В работе использовали эндо-нуклеазы производства фирмы «СибЭнзим», Россия, «Fermentas», Литва и «Promega», США.

Для выявления изменений нуклеотидной последовательности гена TCIRG1 использовался как метод SSCP-анализа (Orita et al., 1989) с щелочной денатурацией амплифицированных фрашентов ДНК с последующим их электрофорезом в неденатурирующем полиакриламидном геле, окраской геля 1х раствором SYBR® Gold nucleic acid gel stain (lnvitrogene™Molecular Probes™, США) и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD (США) в УФ-излучении, так и путем автоматического секвенирования, которое проводилось согласно протоколу фирмы-производителя на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, США). В качестве матрицы для секвенирования использовали фрагменты ДНК или кДНК, полученные после проведения ПЦР. Анализ результатов секвенирования проводился с помощью программ Chromas и BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Прямую идентификацию мутации c.807+5G>A в гене TCIRG1 осуществляли с помощью разработанных тест-систем: методом ПДРФ-анализа и методом RealTime qPCR (для популяционных исследований гетерозиготного носительства данной мутации среди башкир) на термоциклере с Real-Time PCR детектирующей системой iCycler® ThermalCycler фирмы BIO-RAD. Пробы типа TaqMan синтезировались в НПО "SYNTOL ".

При сравнении частот аллелей в хромосомах с мутацией и в популяционных хромосомах использовали х2-тест для двупольной таблицы; а также точный критерий Фишера для случаев, когда критерий %2 неприменим при малом числе наблюдений.

Для оценки неравновесности по сцеплению для полиморфных маркеров в группе больных использовали оценку 8 = (PD - Pn)/(1 - Pn), где 8 - мера неравновесности сцепления, PD - частота ассоциированного аллеля среди хромосом с мутацией, PN - частота этого же аллеля среди нормальных хромосом. (Levin et al., 1978; Devlin et al., 1995; Bengtsson et al., 1981) с доверительным интервалом по Diaz et al., 2000.

Для определения возраста мутации остеопетроза в чувашской популяции применяли один из подходов, основанных на понятии «генетических часов» (Labuda et al., 1997), и оценивающий количество поколений g (Risch et al., 1995) с момента появления мутации в популяции до настоящего времени, исходя из изменения неравновесия по сцеплению полиморфных маркеров с локусом заболевания за этот период времени. Кроме того, для более точной оценки мы учитывали поправку go на растущую популяцию (Labuda et al., 1997):

log 5г

g=-; g0 = -l/dln(9/d) ,

log (1-9)

где 6 - рекомбинационная фракция;^ = e /(e — 1) для популяции, растущей со скоростью d.

Результаты и обсуждение

Картирование гена

Широкое распространение ЗАРО в Чувашии можно, по-видимому, связать с заметной национальной изолированностью данной популяции, сохраняющейся в сельском населении республики и в настоящее время, и действием дрейфа генов (Гинтер с соавт., 2001; Зинченко (Мамедова) с соавт., 2002). Поскольку заболевание является эндемичным для Чувашии, предполагалось наличие эффекта основателя для остеопетроза в данной популяции. Поэтому мы использовали принципы тонкого генетического картирования для установления локуса заболевания, основанные на анализе неравновесия по сцеплению заболевания с полиморфными маркерами, тесно сцепленными с данным локусом.

Более половины описанных в мировой литературе случаев злокачественного аутосомно-рецессивного остеопетроза обусловлены мутациями в гене ТСШС! (БоЬассЫ й а!., 2001; Э^ат & а1., 2004) и 10-15% - в гене СХСЛ7 (Вактапэ е1 а1„ 2005). Поэтому данные два гена ТСШС1 были выбраны нами как основные гены-кандидаты. Сначала было решено исследовать наиболее из них вероятный -ТСШа, и в качестве кандидатной области был выбран регион хромосомы 1 Ц13.4^13.5, где располагается этот ген.

Для картирования лохуса заболевания были исследованы 8 семей со случаем ЗАРО из Чувашии (8 больных детей и 16 здоровых родственников) по 4 полиморфным локусам, тесно сцепленным с областью гена ТСШС1. Два из них представляют собой внутригенные БМ* (с1Ь5КР884826:А>0, с1Ь8МР2075609:А>С), а еще два - высокоинформативные динуклеотидные повторы (СА-повтор из клона АС034259 и 0118987), удаленные от гена на расстояние не более 80 т. п. н. соответственно в сторону центро- и теломеры. В результате анализа было обнаружено полное неравновесие по ецгплению заболевания со всеми исследованными маркерами, т. е. все больные оказались гомозиготами по одному и тому же гаплотипу: СА-повтор из АС034259 - <ММР884826 - сММР2075609 - Б11Б987 : 4 - А - А -5. Полные гаплотипы членов всех исследованных семей по указанным полиморфным маркерам представлены на Рис. 1. Ни у одного из здоровых родственников в гомозиготном состоянии данный вариант гаплотипа обнаружен не был.

Рисунок 1

Результаты гаплотипкрования членов восьми чувашских семей с ЗАРО

Серым цветом выделен гаплотип основателя.

№6 №7 №8

□ О

Для определения статистической значимости ассоциации аллелей данного гаплотипа с ЗАРО проведена оценка различий распределений частот аллелей каждого из полиморфных маркеров в выборке 16 хромосом больных и контрольной выборке (15 «здоровых» хромосом их родственников, не передавшихся больным) (Табл. 1). Недостоверность различия исследуемых распределений аллелей одного из маркеров с!Ь8КР:2075609 связана с присутствием в гаплотипе, сцепленньм с заболеванием, наиболее частого в популяции аллеля данного маркера.

Эти данные позволили картировать аутосомно-рецессивный остеопетроз в области гена ТСШа и подтвердили предположение о проявлении эффекта основателя для данного заболевания среди чувашей.

Таблица 1

Распределение частот аллелей 4-х полиморфных маркеров, тесно сцепленных с геном ТС№в1, в выборке хромосом больных ЗАРО («бол.») и хромосом их родственников, не передавшихся больным («зд.»)

маркер аллели «бол.», % N=16 «зд.», % N=15 у} Р

СА-повтор из АС034259 1 2 3 4 5 6 о о о о сэ о о 7 7 40 26 7 13 43,73 < 0,001

(1Ь5№884826 А в 100 0 40 60 24 < 0,001

с!Ь5№2075609 А в 100 0 80 20 4 >0,05

0118987 4 3 7 5 8 0 0 0 100 0 13 7 40 33 7 32 < 0,001

Идентификация мутации

При исследовании всей кодирующей области и экзон-интронных соединений гена ТСЖв! у больного ЗАРО было обнаружено единственное изменение нуклео-тидной последовательности - не описанная ранее мутация с.807+50>А (Рис. 2), выявленная впоследствии у всех больных ЗАРО в гомозиготном состоянии и у их родителей - в гетерозиготном (Рис. 3).

с с с о норма с с с g мутация

miN m/N NM miNm/N mim N/N : m/N m/N miN m/N m/m Г.

' U lit I r'liiiW

Рисунок 2

Фрагмент результатов секвенирова-ния гена ТС1ЯС1 с мутацией с,807+5С>А в гомозиготном состоянии у больного ЗАРО из Чувашии

Рисунок 3

Результаты ПДРФ-анализз мутаци c.807+5G>A в гене TCIRG1 m/m - мутация в гомозиготном состоянии -80 п.н. m/N - мутация в гетерозиготном состоянии

N/N - мутация отсутствует; -45 п.н. м.м.в. - маркер молекулярного веса (?JPstl). -35 п.н.

Анализ последствии' мутации c.807+5G>A в гене TCIRG1

Мутация c.807+5G>A в гене TCIRG1 представляет собой транзицию в доно-роном сайте сплайсинга интрона 8, т. е. она не затрагивает инвариантные 5'-GU основания интрона, а приводит к замене g-»a в положении +5 частично вариабельной области канонической последовательности донорного сайта сплайсинга. В этом положении в 75-86 % последовательностей различных экзон-интронных соединений встречается нуклеотид G и лишь в 5-11% - A (Zhang, 1998). Поэтому аналитически можно лишь предполагать негативное влияние чувашской мутации на процесс сплайсинга в интроне 8, поэтому мы исследовали влияние мутации на процессинг мРНК.

Предварительно последовательность гена с мутацией была проанализирована с помощью программы предсказания сайтов сплайсинга NetGene2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2), которая показала снижение вероятности существования нормального донорного сайта сплайсинга в интроне 8 и появление криптического сайта через 37 п.н. в интроне после нормального сайта в последовательности гена с мутацией.

Результаты предсказания программы с уверенностью позволяют предполагать появление в клетках с мутацией новой более длинной сплайс-формы мРНК, образующейся при срабатывании криптического донорного сайта, однако, на-

сколько будет нарушен процесс сплайсинга в нормальном сайте, не понятно, поскольку полное исчезновение этого сайта не предсказано.

Для экспрессионного анализа мутации мы исследовали мРНК культуры клеток кожных фибробластов гетерозиготных носителей мутации (клетки больных остеопетрозом, гомозиготных по мутации, колоний не давали и в последствии погибли) и действительно выявили у них помимо нормального транскрипта другой сплайс-вариант (Рис. 4А, Б) с интронной вставкой 37 п.н., предсказанной программой (Рис. 4В), и не выявляющийся в контрольных клетках без мутации.

Анализ трансляции (EditSeq version 4.0) обнаруженной удлиненной сплайс-формы мРНК показал, что интронная вставка приводит к сдвигу рамки считывания до начала экзона 13, где образуется преждевременный стоп-кодон. При этом должна изменяться большая часть аминокислотной последовательности белка с потерей С-концевой его части. Однако, наиболее вероятно, процесс трансляции будет полностью нарушен из-за разрушения мутантной мРНК и белка посредством

Рисунок 4

Экспрессионный анализ последствий мутации c.807+5G>A в гене TCIRG1

м.м.в.

-N/N

321 _,

284 —з—Ьшя* k«™ WW V—~'.

(А)

экзон 9

экзон 10

ДНК

мРНК (Б)

экзон t

экзон 9

ICIGCilEGaGCTGGflTGCCECCGECCTTECGGSGGCGGGTETriGGAGGTCClCGCGGnC t

C.807+5G>A

(В)

(A) - электорофореграмма результата амплификации фрагмента кДНК, содержащего область мутации: N/N - контрольного образца без мутации,

m/N - образца с мутацией в гетерозиготе, м.м.в. - маркер молекулярного веса; (Б) - схема амплифицированной области гена;

(B) - результат автоматического секвенирования дополнительного более тяжелого фрагмента, выявленного на (А) у гетерозиготных носителей мутации.

универсального механизма разрушения нонсенс-транскриптов мРНК (noncence-mediated mRNA decay, NMD (Frischmeyer et al., 1999)). В связи с этим о снижении уровня удлиненной сплайс-формы мРНК в клетках можно косвенно судить по Рисунку 4А, где интенсивность фрагмента, соответствующего транскрипту с мутацией, существенно снижена, однако это может быть связано также с большей длиной данного фрагмента и, соответственно, меньшей эффективностью его амплификации.

Исследование уровня экспрессии мутантной мРНК

Для исследования относительного количества мутантного транскрипта в клетке был придуман следующий подход: амплифицировать фрагмент кДНК не с мутацией, а фрагмент с внутэкзонным SNP. При этом аллель SNP, сцепленный с мутацией был бы маркером мутантного транскрипта (Рис. 5).

Для этого предварительно мы протипировали ДНК 38 гетерозиготных носителей и 3-х чувашей без мутации по всем известным внутриэкзонным SNPs в гене TCIRG1 (dbSNP3808973:C>T, dbSNP1129633:C>G, dbSNP2471829:G>A и dbSNP1047817:C>T) и только по одному из маркеров в экзоне 4 -dbSNP3808973 :ОТ - выявили 7 гетерозигот. мРНК оказалась доступна только от одного из носителей мутации и одного контрольного человека, также гетерозиготного по SNP. Общим в генотипе всех исследованных был аллель С этого маркера. Он встречается у них как в гетеро-, так и в гомозиготном состоянии, т.е. мутация сцеплена с аллелем С данного SNP.

В результате ПДРФ-анализа SNP на уровне кДНК у носителя мутации мы обнаружили относительное уменьшение интенсивности фрагмента, соответствующего аллелю маркера, сцепленному с мутацией (Рис. 6). Таким образом, действительно можно говорить об относительном снижении уровня мутантного транскрипта в клетке, что может быть связано как с малой эффективностью процесса сплайсинга в криптическом донорном сайте, так и с малым временем жизни этого нонсенс-транскрипта в связи с быстрым естественным ее разрушением. Белок же с мутантной мРНК, вероятнее всего, совсем не будет транслироваться.

Рисунок 5

Иллюстрация использованного подхода исследования уровня мутантного транскрипта в клетках

С.807+50А SNP 8МР БЫР теш || \| I I-б—о-ем—сн-п-&-ввм-дна—в-вя-в-в

_С гтЛ_

_Т N_

Рисунок 6

Анализ уровня экспрессии мутантной мРНК

intensity Intensity

100 150 200 100 150 200

Электрофореграмма ПДРФ-анализа dbSNP3808973:C>T:

2 - образца кДНК двойной гетерозиготы no SNP и по мутации,

3 - контрольного образца кДНК гетерозиготы no SNP, но без мутации,

1 - маркер молекулярного веса;

справа в графическом варианте представлено исследование интенсивности свечения фрагментов на

электрофореграмме.

Количественные характеристики определяли с помощью программы Quantity One® version 4.2 (BIO-RAD).

Последствия других мутаций в гене TCIRG1

В связи с полученными результатами исследования чувашской мутации нас заинтересовали эффекты других мутаций в гене TC1RG1. На сегодняшний день описано около 50 мутаций в гене. Интересно, что около 40% из них нарушают именно процесс сплайсинга гена.

Мы проанализировали все описанные изменения, затрагивающие экзон-интронные соединения, предварительно, используя программу предсказания сайтов сплайсинга NetGene2, и затем возможные нарушения трансляции предсказанных измененных транскриптов - с помощью программы EditSeq version 4.0. В ре-

зультате оказалось, что 17 из всех 21 описанных в литературе мутаций сайтов сплайсинга приводят к сдвигу рамки считывания белка с образованием преждевременных стоп-кодонов. Эти мутации встречаются как в донорных, так и в акцепторных сайтах, и приводят либо к вставке интрона, либо делеции экзона. Редко (5 мутаций) встречаются более сложные перестройки в измененном транскрипте, как правило, связанные со срабатыванием скрытых (критических) сайтов сплайсинга (наподобие случая с чувашской мутацией). Только 4 мутации сайтов сплайсинга обуславливают появление протяженной делеции или инсерции, не приводящие к сдвигу рамки считывания. Как оказалось, и подавляющее большинство (21 из 29) остальных мутаций, затрагивающих кодирующие регионы гена, представляют собой нонсенс-мутации или другие изменения, приводящие к образованию преждевременных стоп-кодонов.

Таким образом, 81% мутаций в сайтах сплайсинга и 72% внутриэкзонных изменений приводят к образованию преждевременных стоп-кодонов, т.е. эффекты 76% мутаций в гене TCIRG1, возможно, реализуются через общий механизм деградации мРНК - нонсенс-опосредованную деградацию. По-видимому, именно поэтому в немногочисленных исследованиях уровня экспресии а3 субъединицы У(Н^)-АТФазы у больных остеопетрозом этот белок вообще не определялся в клетках (Taranta et al., 2003).

Популяционные исследования частоты мутации c.807+5G>A в гене TCIRG1

Среди 327 обследованных здоровых чувашей было выявлено 11 гетерозиготных носителей мутации, т.е. частота мутации составляет 1,68% (с 95% ДИ 0,95-^2,77%). Поскольку гомозиготы по мутации не оставляют потомство, то среди здоровых чувашей следует ожидать частоту появления гомозигот 0,000282 или 1 больной на 3500 новорожденных.

Эти результаты хорошо соотносятся с данными генетико-эпидемиологического исследования, согласно которым частота остеопетроза составляет 1:3879 (Гинтер и др., 2001).

У марийцев частота мутации составила 0,84% (с 95% ДИ 0,33-4,75%), расчетная частота ЗАРО - 1:14 000. В образцах крови удмуртов и башкир мутация c.807+5G>A не выявлена.

Разработка и практическое применение систем идентификации мутации c.S07+5G>A в гене TCIRG1

Для профилактики рождения больных детей в Чувашии нами разработаны системы молекулярной диагностики и гетерозиготного носительства ЗАРО в чувашских семьях и на популяционном уровне. Система ПДРФ-анализа, упомянутая ранее, удобна для проведения диагностики остеопетроза. На данный момент с ее помощью в нашей лаборатории проведено исследование 10 семей из Чувашии (в том числе 3 пренатальные диагностики) и еще 1 семьи из Марий Эл, помимо семей, описанных выше.

Для скрининга гетерозиготных носителей был разработан более простой и быстрый способ выявления мутации, рассчитанный на одновременный анализ большого количества образцов. Способ основан на методе real-time qPCR. Данная система специфично выявляет одновременно 2 фрагмента: содержащий соответственно мутацию и экзон 6 контрольного гена ТВР в качестве референсного фрагмента. Разработанная диплексная система состоит соответственно из двух пар специфичных праймеров и двух флуоресцентномеченых олигонуклеотидных зондов типа TaqMan. Для фрагмента с мутацией обратный праймер аллельспецифичен по отношению к мутации (Рис. 7).

Рисунок 7

Система real-time qPCR для выявления мутации c.807+5G>A

ROX

О. о

W._/

т

<*А

TCIRG1

c.S07+5C>A G

R6C

ВН1

я

ТВР

Рисунок 8. Результаты анализа мутации c.807+5G>A с помощью real-time qPCR.

Представлена зависимость интенсивности флуоресценции от количества циклов ПЦР соответственно слева - фрагмента с мутацией c.807+5G>A: наблюдается специфическое накопление фрагментов с мутацией, отава - веФеоенсного сЬвагмента.

Данная система используется как качественный тест на наличие мутации, позволяет выявлять индивидуумов, имеющих в генотипе хотя бы один мутантный аллель (Рис. 8). С помощью данной системы к настоящему времени проведено по-пуляционное исследование гетерозиготного носительства мутации с.807+5С>А среди 271 башкира республики Башкортостан.

Неравновесие по сцеплению

Как было описано выше, при картировании гена ЗАРО мы выявили для больных из Чувашии полное неравновесие по сцеплению по 4-м полиморфным маркерам, тесно сцепленных с геном заболевания. Мы провели анализ еще для восьми дополнительных микросателлитных маркеров, 4 из которых расположены в сторону центромеры от гена и 4 - в сторону теломеры, во всех 11 семьях с ЗАРО и в по-пуляционной выборке (77 хромосом).

Результаты анализа для всех микросателлитных маркеров в виде аллельных частот среди хромосом, несущих мутацию, и хромосом без мутации, представлены в Табл. 2. Полные гаплотипы всех хромосом с мутацией показаны в Табл. 3.

Таблица 2

Аллельные частоты микросателлитных маркеров из области гена ТС1Яв1 в хромосомах с мутацией и популяционной выборке чувашей N - количество исследованных хромосом.

Подчеркнуты значения частот аллелей, характеризующихся наибольшей неравновесностью сцепления с локусом ЗАРО в Чувашии.

Ген ТС/Я О

Маркер 01154076 I 01151883 0115913 01151889 | 0115987 01154113 ! 01154136 01184139 ! 01154207

зд бол за бол эд бол зд бол ¡эд бол зл бол I зд бол эд бол ; за бол

_________N А ... 21.. Ж. 23._J.2L. 23_ ,.77__ 23 ¡75 23 11. _ 23 23

Аллель * ---г-- ' " '

1 42.7 Ж 27.7 38.1 04.8 ] 07.8 ; 04.0 31.0 13.0 1

2 25.2 13.0 21.5 82.6 23.8 ш 04.8 ш! 07.8 |26.7 08.7 02.8 06.5 13.0

3 06.7 04.4 26.2 08.6 33.3 04.3 33.3 04.3 ! 04.7 04.3 ; 05.з 01.4 04.4 .01.3

4 04.6 04.4 04.8 19.0 ! 09.5 | 21.3 43.4 01.4 04.4 |

5 01.5 23.8 28.6 Ш 46.7 13.0 | 02.7 05.7 ! 14.3 21.7

6 06.7 04.4 03.1 ! 14.3 03.9 I 17.0 43.4 ^ 18.2

7 8 10.7 08.0 04.4 13.0 04.6 03.1 38.1 | 04.8 ; 04.0 I 18.7 04.4 08.7 01.4 01.4 : 05.2 04.4

9 04.4 07.7 04.4 14.3 I 01.3 | 13.3 30.4 15.5 17.3 ; 03.9

10 10.4 ; 02.8 ! 01.3

11 01.3 I 04.0 04.4 04.4 ¡09.1 08.7

12 13.0 Ш \ 02.8

13 I 01.3 07.0 08.7 111.7 04.4

14 06.5 01.4 116.8 21.7

15 02.8 '06.5 ш

16 ! 04.2 ! 05.2 08.7

17 I ) 01.4 04.4

маркер

Таблица 3

Гаплотипы хромосом с мутацией по девяти микросателлитным локусам

Выделенная область представляет собой сохраненную часть гаплотипа основателя. сМ - генетическая координата по карте МагеМеИ МЬ - физическая координата на хромосоме в миллионах п.н.

СМ МЬ

I й §

^ С- 52

8 I I

>- о 5

«2.62 $5.05 67.4$ 67.4« 67.48 67.4« 68.01 71.6 7282 76.13 61.1 63.13 65 7 67.07 67.53 67.8 68.52 69.32 70.18 73.35

№ семьи

100 в 2 г 2 т 5 12 4 б 15

400 В 2 2 2 т 5 12 4 6 15

300 2 2 2 2 т 5 12 4 6 8

170 1 2 2 2 т 5 12 4 6 14

170 1 2 2 2 т 5 12 4 1 2

120 г 2 2 а 5 12 4 3 5

900 1 2 2 2 т 5 12 4 17 14

400 2 2 2 т 5 12 4 13 11

110 1 г 2 2 а 5 12 9 6 5

110 1 2 2 2 т 5 12 9 6 5

150 1 2 2 2 т 5 12 9 6 14

120 б 2 2 2 т 5 12 9 6 16

300 2 2 г 2 XV 5 12 9 « 15

600 1 2 2 2 т 5 12 2 1 15

100 1 2 2 2 т 5 12 2 1 7

900 1 2 2 2 т 5 12 11 9 14

500 1 2 2 2 т 5 12 8 9 2

600 2 2 2 2 п 5 15 7 13 2

200 9 2 2 2 т 5 [ 5 4 9 11

200 1 3 2 2 т 5 12 9 6 5

150 8 4 2 2 т з 5 4 9 16

100 1 9 3 2 т 5 12 9 6 10

500 1 3 2 3 » 5 12 8 11 5

Мы определили значения неравновесия по сцеплению 5 для каждого аллеля всех исследованных маркеров, также применили %2-тест либо точный критерий Фишера для оценки достоверности ассоциации данного аллеля маркера с локусом ЗАРО. При определении предкового аллеля учитывали наибольшее положительное значение 8 и наименьшее р. Результаты представлены в табл. 4. Таким образом, наиболее вероятным нам представляется следующий гаплотип основателя: 01184076-01181883-0118913-01181889-0118987-01184113-0118413601184139-01184207: 1-2-2-2-5-12-4-6-15.

Из табл. 4 видно, что значения 5 и х2 уменьшаются по мере удаления маркера от локуса заболевания. Такая зависимость характерна для популяций, в которых распространение какого либо редкого аллеля произошло в результате эффекта основателя.

Таблица 4

Ассоциация и неравновесие по сцеплению аллелей маркеров с

маркер аллель Р ъг 5 ± 90% ДИ

01184076 1 0,242 01,37 0,242 + 0,322

01151883 2 <0,001 27,03 0,778 ±0,167

0116913 2 <0,001 23,90 0,943 + 0,093

01131889 2 <0,001* 0,954 ±0,073

пиЛ

011Б987 5 <0,001 21,35 0,939 ±0,100

01154113 12 <0,001' 0,850 ±0,133

01154136 4 0,035 04,43 0,282 ±0,227

01184139 6 0,021* 0,320 ±0,213

01164207 15 0,205* 0,117 ±0,145

р - односторонняя вероятность распределения %2, звездочкой отмечены значения р для одностороннего варианта точного критерия Фишера. 8 - мера неравновесности сцепления аллелей полиморфных маркеров с локусом заболевания, ДИ - доверительный интервал

"Возраст " мутации

Для оценки возраста мутации с.807+5С>А в гене ТСШа в Чувашии была использована формула

1оё[1-С>/(1-РЫ)] даз^^ия) 1оё(1-в)

с поправкой на растущую популяцию go = - 1/d ln(9/j), где/j= ed/(ed - 1) для популяции, растущей со скоростью d. Конечное значение возраста мутации вычислялось как g + go (Labuda et al., 1997).

При расчете использовали значения неравновесия по сцеплению для всех маркеров, описанных в Табл. 4. Для расчета поправки на растущую популяцию необходимо было оценить скорость роста чувашской популяции. Д ля этого были использованы данные по динамики численности чувашей в составе населения страны с 1723 г. до 1989 г. (Иванов с соавт, 2000; Гинтер с соавт., 2006). Эти данные мы представили в виде графической зависимости численности населения (N) от времени и с помощью пакета Microsoft Excel выявили, что эта зависимость наилучшим образом аппроксимируется экспоненциальной кривой с величиной достоверности аппроксимации R2 = 0,9952 (Рис. 9). Если время представить в числе поколений g (продолжительность одного поколения брали равным 27,4 года; пояснения ниже), то данная кривая будет описываться уравнением N(g) = N(0)-e0,2272g , где N(g) - численность населения популяции после прошествия g поколений ее экспоненциального роста. Отсюда получаем скорость роста чувашской популяции d = 0,2272 [1п(чел.)/поколение].

год

Таблица 5

Число поколений, прошедших с момента распространения мутации в Чувашии

маркер g So д+до

D11S4076 28,60 6,30 34,90

D11S1883 10,18 9,35 19,53

D11S4113 30,45 16,05 46,50

D11S4136 30,08 7,02 37,10

D11S4139 20,76 5,88 26,64

D11S4207 23,75 3,76 27,51

среднее значение 32,03 ± 9,48

Полученные значения числа поколений показаны в Табл. 5. Среднее значение числа поколений существования мутации в популяции чувашей составило 32,03 со стандартным отклонением 9,48 поколений.

Мы использовали данные исследований возрастных показателей для городского и сельского населения Чувашии, и в качестве средней продолжительности одного поколения у чувашей брали значение, характерное для сельского населения республики в настоящее время - 27,4 года (Ельчинова Г.И. с соавт., 2005). Соответственно время, за которое произошло накопление мутации в Чувашии - около 880 ± 260 лет. Учитывая, что средний год рождения всех больных 2000, то период начала распространения мутации соответствует первой половине XII века (1120 год + 260 лет).

Поскольку исторических сведений по поводу резкого сокращения численности чувашской популяции с момента ее формирования нет, мы предположили постоянный рост чувашской популяции. И экстраполируя кривую динамики роста до 8 века, мы попытались оценить численность популяции к моменту возникновения мутации. Согласно графику на Рис. 10 в начале XII века она составляла ~ 1 тыс. (0,1-10 тыс.) человек, т.е. можно говорить о влиянии дрейфа генов на накопление мутации ЗАРО среди чувашей.

Рисунок 10

График динамики численности чувашской популяции в логарифмическом масштабе.

тыс. чел. юооо

юоо

100

ю

1

0.1

0.01

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

ГОД

Исследователи, занимающиеся проблемой этногенеза чувашей, выдвигают различные теории и гипотезы по поводу их происхождения. Однако, несмотря на все разногласия, они единодушны в следующем: аборигенами, издревле населявшими Поволжье и Приуралье, следует считать различные финно-угорские племена, «пришлым» - тюрко-язычные племена, а основу будущего этноса составили оба компонента. Согласно версии, традиционно разделяемой большинством современных ученых, начало формирования чувашского этноса связано с массовой миграцией населения Волжской Болгарии вверх по течению Волги в малодоступные лесные районы. Миграция была вызвана татаро-монгольским нашествием и покорением монголами Болгарского царства в 1236 г. и продолжалась до начала XVI в.

По нашим данным, момент возникновения мутации в популяции связан с первой половиной XII века (1120 год ± 260 лет), т.е. до периода XIII - XIV вв., когда происходило заселение чувашами северной половины современной Чувашии. До этого периода на этой территории проживали предки марийцев - настоящие «черемисы». Как было описано выше, при популяционных исследованиях частоты гетерозиготного носительства мутации с.807+50>А , она была выявлена и среди марийцев с в 2 раза меньшей частотой. Позже мы исследовали одну семью марийцев со случаем остеопетроза, и выявили в обеих хромосомах с мутацией с.807+5С>А гаплотип, характерный для хромосом чувашских больных

23

(Рис. 11). Таким образом, мы показали общее происхождение данной мутации для обеих популяций, что говорит о более тесной связи в раннем этногенезе между марийцами и чувашами, нежели имеется в исторических данных. У удмуртов и башкиров мы мутацию не выявили, и за все время проведения эпидемиологических исследований наследственных заболеваний в этой популяции не было выявлено ни одного случая злокачественного аутосомно-рецессивого остеопетроза.

Исследователями давно отмечается, что среди народов Поволжья чуваши ближе всего к марийцам, как географически, так и генетически, в то время, как удмурты генетически несколько удалены от них. Такая оценка степени генетической близости была получена при кластерном анализе генетических расстояний по частотам генов наследственных заболеваний и аллелей полиморфных ДНК-локусов ядерного генома в этих популяциях. Наблюдается значительное сходство чувашей с марийцами по данным системам, в то время, как удмурты демонстрируют свою существенную генетическую отдаленность. Это объясняют этнической изолированностью удмуртов и реатизацией эффективного дрейфа генов (Рычков с соавт, 1990; Гинтер с соавт., 2005).

Согласно историческим данным в процессе формирования чувашского этноса происходило интенсивное смешение болгаров-суваров с издревле населявшими Поволжье марийцами. Однако смешение это не было полным. Если считать, что изначально мутация с.807+50>А распространилась в чувашской популяции, т.к. ее частота в ней выше, то общая доля чувашских мигрантов в реципиентной марийской популяции за все врегля должна составлять около 50%, учитывая нынешние аллельные частоты мутации. Доля мигрантов могла быть и ниже, поскольку распространение остеопетроза среди марийцев могло происходить независимо, также под действием генетического дрейфа, поскольку марийская популяция тоже немногочисленна и считается относительно изолированной.

24

Рисунок 11

Гаплотипы хромосом членов марийской семьи со случаем ЗАРО _

1 5 (Т| 5 1 1 пп

3 1 2 1 3 3 2

1 1 2 \ 1 3 2

5 2 2 г 5 1 2

п т П) т п п т

4 5 5 5 4 3 5

8 12 12 12 9 12 12

12 2 9 2 12 2 В

6 6 1 6 6 1 1

11 б 5 в 11 5 5

Выделенные области - сохраненная часть гаплотила основателя, наблюдаемая и у чувашей.

выводы

1. В группе больных аутосомно-рецессивным остеопетрозом из Чувашии выявлено полное неравновесие по сцеплению по 4-м полиморфным маркерам, тесно сцепленным с геном TCIRG1. При этом ассоциация с заболеванием оказалась статистически достоверной для 3-х из маркеров: СА-повтор из клона АС034259, dbSNP:884826 и Dl 1S987. У всех больных обнаружен один гаплотип в гомозиготном состоянии. Эти данные подтверждают влияние эффекта основателя на накопление остеопетроза в Чувашии и позволяют картировать локус заболевания в области гена TCIRG1.

2. У всех больных остеопетрозом из Чувашии в гене TCIRG1 обнаружено единственное изменение нуклеотидной последовательности - ранее не описанная мутация c.807+5G>A (TVS8+5g-»a) в гомозиготном состоянии.

3. Исследование экспрессии мутантной мРНК показало, что замена c.807+5G>A приводит к нарушению процесса сплайсинга в интроне 8 гена TCIRG1 и образованию нонсенс-транскрипта; при этом уровень его снижен по сравнению с уровнем нормального транскрипта в клетках гетерозиготного носителя мутации.

4. Разработана система молекулярно-генетических методов для простой и быстрой идентификации выявленной мутации в целях диагностики заболевания, а также скрининговая тест-система на основе метода real-time PCR для выявления гетерозиготного носительства мутации c.807+5G>A.

5. Установлена популяционная частота носителей патологической мутации среди чувашей. Частота мутации оказалась оавной 1,68%, а расчетная частота заболевания - 1 : 3500 новорожденных. Эти результаты хорошо соотносятся с данными генетико-эпидемиологаческого исследования, где встречаемость остеопетроза оказалась равной 1:3900 новорожденных, а расчетная частота гетерозиготных носителей - 3,15%. Обнаружена высокая частота мутации c.807+5G>A и в марийской народности. Частота мутации оказалась равной 0,84%, а расчетная частота заболевания - 1 : 14 000 новорожденных. В популяционных выборках удмуртов и башкир мутация c.807+5G>A не выявлена.

6. У чувашей и марийцев выявлен общий гаплотип хромосом, несущих c.807+5G>A, что говорит об общем происхождении данной мутации для обеих популяций и подтверждает историческую общность указанных народностей.

7. На основе анализа гаплотипов хромосом, несущих мутантный аллель, произведена оценка «возраста» мутации в чувашской популяции, которая составила 880 ± 260 лет, что не противоречит историческим данным.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1. Bliznetz Е., Ginter Е.К., Kirillov A.G., Zinchenko R.A., Tverskaya S.M., Polyakov A.V. Genetic mapping of autosomal recessive Chuvash osteopetrosis. Human genome meeting

2004, Berlin, Germany, 4-7 April 2004, P275.

2. Bliznetz E.A., Tverskaya. S.M., Zinchenko R.A., Kirillov A.G., Ginter E.K., Polyakov A.V. The molecular genetic cause of osteopetrosis in Chuvashia. Europ. J. Hum. Genet.

2005. V. 13, suppl. 1. P. 279.

3. Близнец E.A., Тверская C.M., Зинченко P.A., Кириллов А.Г., Гинтер Е.К., Поляков А.В. Молекулярно-генетическая причина остеопетроза в Чувашии. Медицинская генетика, 2005, т.4, №7, стр.315-321.

4. Близнец Е.А., Гинтер Е.К., Кириллов А.Г., Зинченко Р.А., Тверская С.М., Поляков А.В. Молекулярно-генетическое исследование аутосомно-рецессивного остеопетроза в Чувашии. V съезд Российского общества медицинских генетиков, Уфа, 2005

5.: Близнец Е. А., Тверская. С. М., Зинченко Р. А., Абрукова А.В., Гинтер Е.К., Поляков А.В. (2006). "Экспрессионный анализ мутации c.807+5g>a в гене TCIRG1, ответственной за остеопетроз в Чувашии." Медицинская генетика-. 22-26.

6. Близнец Е. А., Зинченко Р. А., Тверская С. М., Никулин М.В., Кириллов А.Г., Гинтер Е.К., Поляков А.В. (2006) «Популяционная частота и возраст мутации в c.807+5G>A, являющейся причиной аутосомно-рецессивного остеопетроза в Чува-хшш Медицинская генетика, 2006, т.5, № 9(51), с.9-14

7. E.Bliznetz, R.Zinchenko, S. Tverskaya, A. Polyakov. Estimating the gene frequency of malignant autosomal recessive osteopetrosis in Volga-Ural region populations of Russia and dating the mutation in Chuvashiya. European Journal of Human Genetics,V. 14.Supp.1 .May 6-9,2006. Амстердам, P 0226, p.149

8. Близнец E.A., Вассерман H.H., Поляков А.В. (2006) «Молекулярные методы диагностики распространенных наследственных чувашских болезней» Медицинская генетика, 2006, т.5, Приложение 1, с. 10-13

9. Зинченко Р.А., Ельчинова Г.И., Тимковская Е.Е., Петрова Н.В., Шокарев Р.А., близнец Е.А., Тверская С.М., Поляков А.В. Дифференциация этнических групп

России по генам наследственных болезней. Медицинская генетика, 2005, т.4, № 4, с. 190

10. Кириллов А.Г., Близнец Е.А., Поляков А.В., Гинтер Е.К. «Аутосомно-рецессивный остеопетроз» гл. в коллективной монографии «Генетическая структура и наследственные болезни Чувашской популяции» под редакцией Гинтера Е.К. и Зинченко Р.А. Издательский дом "Пегас", Чебоксары 2006,232-285 с.

СОКРАЩЕНИЯ

ЗАРО - злокачественный аутосомно-рецессивный остеопетроз

ГУ МГНЦ РАМН - Государственное Учреждение Медико-Генетический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук

NCBI - National Center for Biotechnology Information

OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man

TCIRG1 - ген Т-клеточного иммунного регулятора 1

CLCN7- ген хлорного канала 7

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПДАФ - полиморфизм длины амплифицированных фрагментов

ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

SSCP - Single Strand Conformation Polimorphism

TBE - трис-боратный буфер

DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium

ДИ - доверительный интервал

Заказ № 636. Объем 1п.л. Тираж ЮОэкз. Отпечатано в ООО «Петроруш» г.Москва,ул.Палиха 2а.тел.250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Близнец, Елена Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений.----------------—

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫИ

Классификация, общая характеристика остеопетроза.—.

Этиопатогенез. Молекулярные основы остеопетроза

Ген ТСПЮI (ген Т-клеточного иммунного регулятора 1).

Ген СЬСЫ7 (хлорного канала 7)-.

Другие гены, ответственные за развитие остеопетроза.

Эпидемиология остеопетроза

Остеопетроз в Чувашии.—----------------—

Неравновесие по сцеплению

Тонкое генетическое картирование наследственных заболеваний.

МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования.—.

Выделение геномной ДНК-----------------------------------------------------------------—

Культивирование кожных фибробластов

Выделение тотальной РНК и обратная транскрипция------------------------------—

Генетические маркерыввСР-анализ и автоматическое секвенирование.

Анализ мутации807+5С>А в гене ТСПИИ

Неравновесие по сцеплению

Расчет возраста мутации.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Картирование гена--------------------------------------------------—.

Идентификация мутации.

Анализ последствий мутации807+5С>А в гене ТСШС1^

Исследование уровня экспрессии мутантной мРНК

Последствия других мутаций в гене ТСГОС1.

Разработка и практическое применение систем идентификации мутации с.807+50А в гене ТСИНИ

Популяционные исследования частоты мутации807+5С>А в гене ТСИКИ

Неравновесие по сцеплению.

Возраст" мутации

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Близнец, Елена Александровна

1 В фуппе больных аутосомно рецессивным остеопетрозом из Чувашии выявлено полное неравновесие по сцеплению по 4 м полиморфным маркерам тесно сцеплен ным с геном TCIRGI При этом ассоциация с заболеванием оказалась статистически достоверной для 3 х из маркеров СА повтор из клона АС034259 dbSNP 884826 и D11S987 У всех б01ьных обнаружен один гаплотип в гомозиготном состоянии Эти данные подтверждают влияние эффекта основателя на накопление остеопетроза в Чувашии и позволяют картировать локус заболевания в области гена TCIRGI 2 У всех больных остеопетрозом из Чувашии в гене TCIRGI обнаружено единственное изменение нуклеотиднои последовательности ранее не описанная мутаиия с 807+5G>A (lVS8+5g->a) в гомозиготном состоянии 3 Исследование экспрессии мутантной мРНК показало что замена с 807+5G>A приво дит к нарушению процесса сплайсинга в интроне 8 гена TCIRGI и образованию нон сенс-транскрипта при этом уровень его снижен по сравнению с уровнем нормально го транскрипта в клетках гетерозиготного носителя мутации 4 Разработана система молекулярно генетических методов для простой и быстрой идентификации вьшвленной мутации в целях диагностики заболевания а также скрининговая тест-система на основе метода real time PCR для выявления гетерози готного носительсгва мутации с 807+5G>A 5 Установлена популяционная частота 1юсителеи патологической мутации среди ly вашей Частота мутации оказалась оавной 1 68% а расчетная частота заболевания 1 3500 новорожденных Эти результаты хорошо соотносятся с данными генетико эпидемиологического исследования где встречаемость остеопетроза оказалась рав НОИ 1 3900 новорожденных а расчетная частота гетерозиготных носителей 3 15% Обнаружена высокая частота мутации с 807+5G>A и в марийской народности Час тога мутации оказалась равной О 84% а расчетная частота заболевания 1 14 000 новорождениьг< В популяционных выборках удмуртов и башкир мутация с 807+5G>A не вьшвлена 6 У 1увашеЙ и марийцев выявлен общий гаплотип хромосом несуших с 807+5G>A что говорит об общем происхождении данной мутации для обеих популяции и под тверждает историческую общность указанных народностей 7 На основе анализа гаплотипов хромосом несущих мутантныи аллель произведена оценка возраста> мутации в чувашской популяции которая составила 880 + 260 лет что не противоречит историческим данным список ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ А V Genetic mapping of autosomal recessive Chuvash osteopetrosis Human ge nome meeiing 2004, Berlin, Germany, 4-7 April 2004 P275 Genet 2005 V 13. supp! 1 P 279 4 Близнец Е.А , Гинтер В К , Кириллов А Г, Зинченко Р А , Тверская С М , По ляков А В Молекулярно-генетическое исследование аутосомно-рецессивного остеопетроза в Чувашии V съезд Российского общества медицинских генети ков, Уфа, 2005 5 Близнец Е. Л Тверская С М , Зинченко Р А , Абрукова А В , Г интер Е К Поляков А В (2006) "Экспрессионный анализ мутации с 807+5g>a в гене TCIRG1, ответственной за остеопетроз в Чувашии " Медицинская генетика 22- 6 Близнец Е. А , Зинченко Р А , Тверская С М , Никулин М В , Кириллов А Г , Гинтер Е К , Поляков А В (2006) «Популяционная частота и возраст мутации в c807+5G>A, являющейся причиной аутосомно-рецессивного остеопетроза в Чув2ипкк»^Медицинская генетика 2006, т 5, № 9(51), с 9-14 7 Е Bliznetz, RZinchenko, S Tverskaya, А Polyakov Estimating the gene frequency of malignant autosomal recessive osteopetrosis in Volga-Ural region populations of Russia and dating the mutation in Chuvashiya European Journal of Human Genet-

ics,y 14 Supp I May 6-9, 2006 Амстердам, P 0226, p 149 8 Близнец Е.А , Вассерман Н Н , Поляков А В (2006) «Молекулярные методы диагностики распространенных наследственных чувашских болезней» Меди цинская генетика 2006,т5, Приложение 1, с 10-13 9 Зинченко Р Л Ельчинова Г И , Тимковская С Е , Петрова И В , Шокарев Р А , Близнец Е.А, Тверская С М, Поляков А В Дифференциация этнических групп России по генам наследственных болезней Медицинская генетика 2005, т 4, № 4 , с 190 10 Кириллов А Г, Близнец Е.А., Поляков А В , Гинтер Е К «Аутосомно рецессивный остеопетроз» гл в коллективной монографии «Генетическая структура и наследственные болезни Чувашской популяции» под редакцией Гинтера Е К и Зинченко Р А Издательский дом "Пегас", Чебоксары 2006, 232-