Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микробная деградация нафталина и фенантрена в модельных почвенных системах
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Микробная деградация нафталина и фенантрена в модельных почвенных системах"

На правах рукописи

РГК од

ПУНТУС ИРИНА ФИЛИППОВНА

МИКРОБНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ НАФТАЛИНА И ФЕНАНТРЕНА В МОДЕЛЬНЫХ ПОЧВЕННЫХ СИСТЕМАХ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2000

Работа выполнена в лаборатории биологии плазмид

Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

РАН

Научные руководители:

чл.-корр РАН,

доктор биологических наук

A.M. Воронин

кандидат биологических наук А.Е. Филонов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С.С. Беляев

кандидат биологических наук А.Н. Шкидченко

Ведущее учреждение:

Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится ///£.£- 2000 г. в //■ час на заседании Совета по защите диссертаций Д 002.69.01. в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: пр. Науки, г. Пущино Московской области, 142290 Россия

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Автореферат разослан •

2000 г.

Ученый секретарь

Совета по защите диссертаций

доктор биологических наук В.М. Вагабов

¡705?,9,0

Актуальность темы. В современной промышленности и сельском созяйстве широко используются разнообразные органические :оединения, в том числе ксенобиотики, многие из которых токсичны, санцерогенны, мутагены, что представляет угрозу для живых организмов i может приводить к сдвигу экологического равновесия в биосфере.

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) являются щассом повсеместно распространенных устойчивых поллютантов, юдержащихся в сточных водах и газовых выбросах коксо-, газо- и гефтехимических производств. Нафталин, фенантрен, антрацен, кризен [вляются компонентами тяжелых фракций нефти и попадают в [кружающую среду в результате аварийных разливов нефтепродуктов, фи сгорании различных видов топлива при неполном доступе лслорода, а также содержатся в выхлопных газах автомобилей. В юследнее время серьезную проблему представляет загрязнение почв и одных систем в индустриально развитых районах мира, поскольку шогие ПАУ относятся к классу канцерогенов и мутагенов (Sutherland et 1., 1995).

Хотя некоторое уменьшение концентрации ПАУ в почве возможно за чет абиотических процессов, основную роль в деградации этих оединений играют микробные популяции. Уникальная способность [икроорганизмов к деградации ПАУ как природного, так и нтропогенного происхождения становится предметом особого внимания сследователей, прежде всего, с точки зрения использования [икроорганизмов - деструкторов для очистки окружающей среды от все олее возрастающего загрязнения антропогенного происхождения.

Известно, что ряд микроорганизмов способен использовать ПАУ как сточники углерода и энергии или трансформировать их (Kiyohara et al., 994; Foght et al., 1996 ). Накоплен значительный экспериментальный атериал, показывающий, что процесс биодеградации ПАУ бактериями асто контролируются плазмидами, большинство из которых обнаружено представителей рода Pseudomonas (Воронин, 1987).

В последнее время возрос интерес к использованию штаммов -гструкторов для очистки окружающей среды от загрязнений in situ. лтродукция микроорганизмов в окружающую среду предполагает роведение предварительных лабораторных исследований штаммов-:структоров. В последнее время исследователи все чаще используют одельные системы, приближенные к естественным условиям, в том «еле и почвенные микрокосмы (Manilal and Alexander, 1991). При оделировании природных процессов в лабораторных условиях )зникает необходимость разработки новых модельных систем, методов жтроля за процессами жизнедеятельности микроорганизмов и ¡градации ксенобиотиков, быстрых методов количественного тределения ксенобиотиков в почве и водных растворах.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работ являлось изучение процесса деградации нафталина и фенантрс! различными штаммами родов Pseudomonas и Burkholderia в модельнь почвенных системах. В соответствии с целью работы были определен следующие конкретные задачи:

1. Выделение и характеристика новых штаммов-деструкторов нафталш и фенакгрена.

2. Разработка модельной почвенной системы для изучения процес< деградации нафталина и фенантрена. Отработка и модификация методе количественного определения нафталина и фенантрена в почве.

3. Изучение процесса деградации нафталина и фенантрена аборигенны\ и ингродуцированными микроорганизмами в модельных почвеннь системах.

4. Оценка эффективности процесса деградации нафталина и фенантре1 различными штаммами в модельных почвенных системах использованием математического моделирования.

Научная новизна. В ходе настоящей работы предложен подход д; предварительной оценки эффективности процесса деградации нафталю и фенантрена бактериями рода Pseudomonas в модельных почвеннь системах, позволяющий сравнить и выбрать наиболее активные штамм] деструкторы перед использованием в системах биоремедиации. Изучен кинетические параметры процесса деградации нафталина и фенантрс; эндогенными и ингродуцированными микроорганизмами в модельш почвенных системах. Проведено сравнение эффективности процес биодеградации нафталина и фенантрена различными штаммами ро, Pseudomonas. Для количественной оценки процесса биодеградащ нафталина и фенантрена разработана математическая модех описывающая рост бактерий и потребление ими субстратов (ПАУ, i производных и органические вещества почвы) в модельных почвенш системах. Предложена экспресс-методика для определения нафталш фенантрена и флуорена в почвенных образцах. Показано, что наибол эффективным штаммом-деструктором нафталина в модельной почвенн системе является BS3701, а фенантрена - BS3702. Изучаемые штат BS3701, BS3702 способны утилизировать в почве с высокой скоросп как нафталин так и фенантрен, что представляет несомненный интерес точки зрения возможности использования данных штаммов-деструктор в системах очистки окружающей среды от загрязнения ПАУ.

Научно-практическая значимость работы. Предложенный подх для оценки эффективности процесса биодеградации нафталина фенантрена может быть использован для выбора наиболее активш штаммов-деструкторов ПАУ, перспективных для использования биотехнологии защиты окружающей среды. Математическая моде] описывающая рост бактерий и потребление ими субстратов (нафтал!

енантрен, их производные и органические вещества почвы) в одельных почвенных системах позволяет оценить эффективность эоцесса деградации не только нафталина и фенашрена, но и ПАУ с злее высоким молекулярным весом. Разработанная в процессе работы хпресс-методика для определения нафталина, фенашрена, флуорена в )чве может быть использована для мониторинга за остаточными грязнениями почв. Созданная коллекция микроорганизмов зедставляет интерес для изучения различных аспектов деградации ПАУ других органических соединений. Наличие плазмид биодеградации в ;следуемых штаммах-деструкторах нафталина и фенантрена создает >едпосылки для дальнейших исследований, направленных на выяснение ¡щих закономерностей структурно-функциональной организации нетических систем биодеградации ПАУ.

Практическое использование результатов.

Штаммы, полученные в ходе работы, модельные почвенные системы экспресс-методика определения нафталина и фенантрена в почвенных ¡разцах используются в ходе работы по гранту "Биотехнология защиты ружающей среды".

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора ггературы, описания материалов и методов исследования, сперимснтальной части, обсуждения результатов, выводов и списка ггературы. Работа содержит 120 страниц машинописного текста, лючая 31 рисунок и 10 таблиц. Библиография включает 177 тературных источников, из них 22 на русском языке.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на: международном нгрессе "Pseudomonas 97" (Мадрид); симпозиуме «Microbial ecology d biotechnology with reflection on extremophiles» (Москва, 1997); на 2-ой 3-ей открытой городской научной конференции молодых ученых г. шшно, 1997 и 1998г.

Материалы и методы истернальные штаммы. Использованные в работе штаммы выделены

почвенных образцов или получены из коллекции лаборатории ологии плазмид ИБФМ РАН.

>еды. В качестве полноценных сред использовали мясо-пептонный льон, агар и среду L (Carhart, Hedeman, 1975), в качестве минимальной реду Эванса (Evans, 1970).

1копительиые культуры инкубировали в жидкой среде Эванса с давлением нафталина или фенашрена в качестве единственного гочника углерода и энергии. Культивирование проводили в эиодических условиях при температуре 24°С в течение 3-5 дней, стые культуры выделяли на агаризованной среде Эванса в парах Jn-алина. Для выделения бактерий, принадлежащих к роду

з

Pseudomonas,, была использована среда Pseudomonas isolation агар ] (Difco) (Stolp, Gadkari, 1981).

Принадлежность бактерий к грамположительным ил: грамотрицательным определяли по Gregersen, 1978. Идентификацию культур проводили общепринятыми методами (Stanic et al„ 1966).

Способность штаммов к трансформации фенантрена определяли п< методу Kiyohara (Kiyohara, 1982; Heitkamp, 1988). Определение максимальной удельной скорости роста периодической культуре на нафталине и фенангрене проводили npi выращивании микроорганизмов в колбах со средой Эванса согласно Pin 1975.

Качественный анализ метаболитов, накапливающихся в культурально; жидкости при росте микроорганизмов на фенантрене, проводил) методом тонкослойной хроматографии и жидкостной хроматографи) высокого давления.

Коныогационный перенос плазмнд осуществляли, использу модифицированный метод Данна и Гонзалеса (Dunn,, Gunsalus, 1973). Для элиминации плазмнд использовали метод Rheinwald et al., 1973. Плазмидную ДНК выделяли методом, описанным Birnboim, Doly, 1978 Определение органического вещества проводили по методу Тюрина ; модификации ЦИНАО (ГОСТ 26213-84).

Для приготовления модельных почвенных систем (МПС использовалась серая лесная почва, взятая вблизи г. Пущино Московско: области.

Перед использованием почву просеивали через сито (2,0 мм), зате? навеску почвы трювды стерилизовали (1 атм. 30 мин) с интервалом в сутки. Почву высушивали в вакуумном шкафу при температуре 85°С д постоянного веса. Для приготовления почвы с нафталино» (фенантреном) использовали 0,2 % раствор нафталина в пенгане. Почв (40 г) с нафталином (фенантреном) помещали в чашки Петри диаметро! 120 мм и высотой 20 мм (толщина слоя почвы около 8 мм). Модельны почвенные системы инкубировали при температуре 24°С в течение i недель. Чашки ежедневно взвешивали для того, чтобы контролироват испарение влаги и при необходимости восполнять ее потерю стерильно; водой.

Для определения общей численности микроорганизмов i концентрации нафталина (фенантрена) отбирали усредненные пробы (0. г и 1 г) из 3-4 разных участков почвы. Пробы весом 0.5 г суспендировал; в 4,5 мл. фосфатного буфера на миксере "Paramix 2" (Германия) течении 2 минут при комнатной температуре и после соответствующи стандартных разведений высевали на чашки с L-агаром. Чашк инкубировали при 24°С в течение суток. Число колониеобразующн единиц рассчитывали на 1 г сухой почвы.

(пределение стабильности признака утилизации нафталина и

алицилата проводили как описано Миллером, 1976.

>ценка эффективности деградации нафталина и фенантрена

азличными штаммами проводилась на основе параметров, полученных с омощью математической модели, описывающей бактериальный рост и отребление субстратов в почве, разработанной A.B. Карповым.

Модель предполагает двухстадийный механизм утилизации ПАУ в очве. На первом этапе бактерии деградируют ПАУ до некоторых ромежуточных продуктов, которые не используются для их роста. На гором этапе бактерии используют эти производные для роста. Кроме )го, почвенный органический материал рассматривается как этенциальный источник углерода и энергии. Исходя из этйх редположений, бактериальный рост описывается следующими ифференцнальными уравнениями: dx/dt = МРх Р + MsxS- ахх, dN/dt = - QnxN - aNN, dS/dt = -Qsx S, dP/dt = QnxN -QpxP. ксь x - концентрация бактерий, N - концентрация нафталина |)енантрена), S - органического материала почвы и Р концентрация эомежуточных продуктов деградации нафталина (фенантрена). араметр Qu характеризует скорость деградации нафталина Фенантрена). Параметры МР и QP характеризуют соответственно ;орость роста и скорость деградации промежуточных соединений ¡градации нафталина (фенантрена). Парметры Ms и Qs характеризуют »ответственно скорость роста и скорость утилизации органического 1териала почвы. Параметр aN - удельная скорость испарения нафталина )енантрена) в МПС.

Результаты и их обсуждение ыделение и характеристика штаммов деструкторов нафталина и енантрена

Из почв, загрязненных нефтепродуктами и отходами мического производства, с территории Московской области было щелено 29 штаммов микроорганизмов, способных использовать [фталин в качестве единственного источника углерода и энергии. На новании морфологических и биохимических свойств 28 штаммов были несены к роду Pseudomonas и один штамм - к роду Burkholderia. >щеленные штаммы отличались по способности утилизировать зличные углеводороды, (табл.1). Известно (Davies, Evans, 1964; )ронин с соавт., 1977; Старовойтов с соавт., 1976; Yen, Gunsalus, 1982; in, Serdar, 1988), что при деградации нафталина изученными к стоящему времени штаммами одним из промежуточных продуктов

является салицилат. Как видно из данных табл.1, все выделенны иггаммы способны к росту на салицилате. Характерной особенностью микроорганизмов, расщепляющих нафталин по мета-пути расщеплени катехола является способность к росту на метилированных производны: нафталина. 16 штаммов росли на 2-метилнафталине, что позволяе предположить наличие функционирующих генов мета-пути окислени катехола у этих бактерий.

Таблица 1. Способность выделенных бактерий к росту на некоторы органических соединениях_

Штаммы

Субстраты BS 3701 BS 3702 BS 3706 BS 37103716 BS 37173718 BS 37193721 BS 37223728 BS 37293730 BS 3731 BS 3732 BS 3733 BS 3734 3703

Nah + + + + + + + + + + + +

Phn + + + - - - - - - - - -

Ant - + - - - - - - - - - -

ZMeNah - + + + + + - - + + - -

Sal + + + + + + + + + + + +

Gnt - - - - - + + + + + -

Ben + - - - + + - - + - +

Phe - + - - - - - - - - -

m-Cre - - - - - - - + + + -

Oct - + - - - - - - - - -

Gdn - + - - - - - - - - -

Nah - нафталин, 2MeNah - 2-метилнафталин, Phn - фенантрен, Ant антрацен, Sal - салицилат, Gnt - гентизат, Ben - бензоат, ш-Сге - мет; крезол,, Phe - фенол, Oct - октан, Gdn - гексадекан

Проверка выделенных штаммов по методу Киохара (КлуоЬата й а1 1994) на способность к трансформации фенантрена показала, что вс выделенные штаммы-деструкторы нафталина образовывали зон

б

фосветления на чашках с фенантреном, что свидетельствует об участии енов "верхнего" пути деградации нафталина в процессе деградации ¡юнантрена. Однако только 3 штамма - BS3701, BS3702 и BS3706, ¡ыделенные из образцов, загрязненных отходами коксохимического фоизводства, бьши способны использовать фенантрен в качестве динственного источника углерода и энергии. Штамм BS3702 был пособен к росту на антрацене, а также на алифатических углеводородах, гто является достаточно редким явлением.

С помощью тонкослойной хроматографии было показано, что одним а метаболитов деградации фенантрена штаммами BS3702 и BS3701 вляется 1-гидрокси-2-нафтойная кислота, что согласуется с иохимическим путем утилизации фенантрена, предложенным {ерниглиа (Cerniglia et al., 1994).

На основании морфологических и биохимических свойств штамм

153701 был идентифицированы как Р. pulida (табл.2), a BS3702 - как turkholderia sp. на основании анализа 16S РНК (Балашова с соавт., 1999).

Для исследуемых штаммов были определены максимальные удельные корости роста в условиях периодического культивирования в среде, одержащей нафталин или фенантрен в качестве единственного сточника углерода и энергии. Наибольшую удельную скорость роста на афталине наблюдали для штамма BS3701 - 0,41 h'1, наименьшую для ггамма BS3702 - 0,21 h'1. При выращивании на фенантрене наибольшая дельная скорость была у штамма BS3702 - 0.12 h'1 . Возможно, штаммы

153702 и BS3701 используют различные пути деградации фенантрена.

В штамме BS3701 бьши обнаружены 2 плазмиды размером 100 и 0 т.п.н. и обозначенные как pBSl 141 и pBS 1142. Путем онъюгащюнного переноса плазмид, трансформации и гибризационного нализа было показано, что плазмида pBSl 141 (100 т.п.н.) контролирует ета-путь окисления катехола, а также содержит "молчащие" гены глицилат гидроксилазы. Плазмида pBSl 142 (50 т.п.н.) не содержит гены иодеградации нафталина и фенантрена. В штамме BS3702 была энаружена плазмида размером 120 т.п.н., обозначенная pBSl 143. [опыгки перенести плазмиду pBSl 143 (120 т.п.н.) путем эньюгационного переноса и трансформации в имеющиеся у нас в эллекции штаммы-реципиенты, а также попытки элиминировать лазмиду не привели к успеху. С помощью гибридизационного анализа ыла показана гомология генов, расположенных на плазмиде pBSl 143, злько с nah К геном плазмиды NAH7, что еще раз подтверждает зедения о том, что генетические системы деградации ПАУ, Знаруженные в микроорганизмах, относящихся к роду Burkholderia, гличаются от "классических" nah систем деградации, описанных для истерий рода Pseudomonas. (Laune, Lloyd-Jones, 1998; Zylstra et al., )91).

Разработка модельной почвенной системы для изучен» процесса деградации нафталина и фенантрена

Для приготовления модельных почвенных систе использовалась серая лесная почва, взятая вблизи г. Пущино Московскс области. Проведена оценка элементного состава почвы: 91,00% зол 2,89% С, 1,05% Н, 0,25% N, 0,06% Р, 0,48% Ca, 0,14% Mg, 1,20% F 2,47% К, 72,5% Si02, pH водной вытяжки: 7,05.

Для оценки влияния стерилизации на органические вещесп почвы определяли процентное содержание органического вещества до после стерилизации почвы. Определение гумуса в почвах по мето/ Тюрина в модификации ЦИНАО (Гост 26213 -84) показало, что образе почвы до стерилизации содержал 4.98% органического вещества, а пос; стерилизации - 4.83% органического вещества, т.е. в процесс стерилизации значительного разрушения органических веществ почвы i происходит. Внесение нафталина и фенантрена в виде порошка не даваг равномерного распределения по всему объему почвы. При измерени концентрации нафталина в почвенных экстрактах, отобранных i различных участков модельной системы, ошибка составляла 30°/ Поэтому для приготовления почвы с нафталином использовали раствс нафталина в легкокипящем растворителе - пентане. Экстракция нафталина и фенантрена из почвенных образцов

Первоначально нафталин и фенантрен экстрагировались i почвенных образцов как описано в работах Коренмана, 1970, Moller ai Ingvorsen, 1993, Banerjee et al., 1995. Однако, методики были трудоемь или не давали воспроизводимых результатов. Поэтому мы предприня; попытку упростить методику. Для этого в качестве экстрагента бь выбран метанол, что позволило провести анализ экстрактов почвы помощью двух разных методов: обращеннофазной жидкостнс хроматографии высокого давления и спектрофлуориметрии, и измене! процедура экстракции. Экстракция нафталина и фенантрена из 1 г почв проводилась в следующих условиях: 1) в аппарате Сокслета щ температуре 65°С в течение 30 минут 40 мл метанола и 2) в 20 ь метанола при комнатной температуре 20-22° С в течение 30 мин; периодически перемешивая содержимое колбы. Анализ эп метанольных экстрактов с помощью ВЭЖХ показал, что концентрат нафталина (фенантрена) идентичны в обоих случаях (0.99 мг/г сухс почвы ± 0.01. в первом случае и 0.98 мг/г сухой почвы ± 0.01 во второ! Упрощение процедуры экстракции позволило быстро и точно оцени концентрацию нафталина и фенантрена в большом количест почвенных образцов.

Разработка экспресс методики для количественного определен! нафталина и фенантрена в почве

В процессе работы было показано, что использование СФ измерения в сочетании с экстракцией почвенных образцов метанолом (1

мл) в колбе можно рекомендовать в качестве экспресс-методики для оценки концентрации нафталина и фенантрена в почве. Для оценки точности спектрофлуориметрического метода для измерения количества ПАУ в почве проводились параллельные измерения метанольных экстрактов, содержащих нафталин, на спектрофлуориметре и жидкостном хроматографе высокого давления (табл.2).

Таблица. 2. Концентрации нафталина в почве, измеренные различными методами

Время Концентрация нафталина в почве с микроорганизмам! (мг/г) Концентрация нафталина в стерильной почве (мг/г)

Дни ВЭЖХ СФМ ВЭЖХ СФМ

0 1.147±0.001 1.174±0.003 1.147±0.001 1.174±0.003

1 0.801±0.001 0.825±0.002 НО НО

2 0.714±0.002 0.740Ю.003 0.842Й.001 0.878±0.002

3 0.671±0.001 0.685±0.003 НО НО

5 0.047+0.001 0 0.664±0.001 0.693±0.002

6 0.010Ю.002 0 НО НО

8 НО НО 0.521±0.002 0.538±0.002

ВЭЖХ - жидкостная хроматография высокого давления,СФМ -спектрофлуориметрический метод, НО - не определяли

Данные измерений хорошо коррелируют между собой. Чувствительность метода составила 0,2 мг ПАУ/л метанола. Спектрофлуориметрический метод позволяет быстро и точно оценить концентрацию нафталина, фенантрена и флуорена сразу в большом количестве почвенных образцов. Результаты измерений метанольных экстрактов почвенных образцов, содержащих нафталин, фенантрен, флуорен на спектрофлуориметре показали характерные пики излучения для каждого субстрата при длине возбуждения 250 нм. Это позволяет измерять концентрацию определенного ПАУ в почве, содержащей смесь нафталина, фенантрена и флуорена.

Определение оптимального уровня влажности для штаммов-деструкторов нафталина в модельной почвенной системе

В экспериментах по определению оптимального уровня влажности использовали штамм Pseudomonas putida PpG7(NAH7), интродуцированный в модельные почвенные системы, с уровнями влажности 20, 40 и 70% и штамм Р. putida BS3701, интродуцированный в МПС с уровнями влажности 20, 30, 40, 50%.

Для определения кинетических параметров роста микроорганизмов в модельных почвенных системах с нафталином в качестве субстрата совместно рассматривались как нафталин, так и доступные почвенные

органические вещества. Оценивались следующие параметры: параметр М, характеризующий скорость роста микроорганизмов; У экономический коэффициент, характеризующий количество выросших микроорганизмов на единицу потребленного субстрата. Показано, что величина параметра М слабо зависит от уровня влажности. В то же время, наблюдается сильная вариация параметра У. Это может объясняться неполной утилизацией субстратов из-за ограниченного транспорта питательных веществ при 20%, 30% влажности и из-за недостатка кислорода при 70% влажности. Наибольший экономический коэффициент и, соответственно, максимальная достигаемая концентрация бактерий наблюдались при 40% влажности. Изучение процесса биодеградации нафталина н фенантрена в модельной почвенной системе.

Деградации нафталина и фенантрена в МПС со стерильной почвой.

Для иследования абиотических процессов использовалась модельная почвенная система со стерильной почвой и уровнем влажности 40%. Показано, что нафталин подвергается испарению и концентрация его к 11 дню составляла 60% от исходной. Концентрация фенантрена практически не изменялась в течение 37 дней.

Время сутки

о X >ч 2,0

и 1,5

5 ¡5

5 ' 1,0

8.2 г 0,5

X « е 0,0

10 20 Время, сутки

30

О

Рис. 1. Концентрация нафталина и фенантрена в стерильной почве

Деградация нафталина и фенантрена аборигенными почвенными микроорганизмами

Нами было показано наличие в почве, взятой вблизи лесной зоны г. Пущино, которая использовалась в модельных почвенных системах, микроорганизмов, способных к деградации нафталина в концентрации 104 кл/ г сухой почвы; деструкторы фенантрена не были обнаружены.

Для изучения процесса деградации нафталина эндогенными почвенными микроорганизмами использовались модельные почвенные системы с нестерильной почвой, содержащей нафталин. Показано, аборигенные микроорганизмы способны утилизировать 2,5 мг/г сухой почвы нафталина в течение 11 дней.

Влияние нафталина на динамику численности интродуцированных штаммов-деструкторов

Для исследования влияния влияние нафталина на численность микроорганизмов, интродуцированных в модельные почвенные системы, использовали МПС с нафталином и МПС без нафталина.

В модельной почвенной системе со стерильной почвой концентрация бактерий достигала высокого уровня 5х108 кл/г сухой почвы. Однако в модельных почвенных системах с нафталином (1 мг/г сухой почвы) численность микроорганизмов в 2-3 раза была выше, что обусловлено потреблением нафталина как дополнительного источника углерода и энергии.

Деградация нафталина иитродуцировапными штаммами-деструкторами

Деградация нафталина в МПС с нафталином изучалась на примере природных штаммов - деструкторов нафталина Р. putida G7, Р. putida BS3701, Р. putida BS3702 и сконструированного штамма Р. putida BS3745. Штамм Р. putida BS3745(pBS216) получен путем коньюгационного переноса плазмиды pBS216, контролирующей полный путь деградации нафталина, из ауксотрофного штамма Р. putida BS3710 (pBS216) в прототрофный штамм Р. putida WD25.

Было показано, что штамм BS3701 способен утилизировать 95% нафталина в концентрации 2,5 мг/г сухой почвы в течение 3 суток (Рис.2).

э.о

2 2,5 о

7 О

5 2,0 О Í.

£ 1,5

. 1, f

/

/

/1 ; I

1.Е+10 1 ,Е +09

2 а

1 ,Е +01 о с >х

1.Е+07 S,

1 ,Е+0 б 5

ш О х

1 ,Е +0 5 1 ,Е+04

10 15 20

Время, сутки

Рис.2. Динамика численности штамма В53701 (ромбы) и концентрация нафталина (квадраты) в модельной почвенной системе: экспериментальные данные (ромбы, квадраты) и решения модели (линии)

Деградация нафталина (2,4 мг/г сухой почвы) штаммом РрС7 наблюдалась на 5 день .Нафталин (2,4 мг/г сухой почвы) в модельной системе со штаммом В83702 утилизировался бактериями в течение 7 суток. Потребление нафталина для штамма ВБ3745 сравнимо со скорость деградации данного субстрата аборигенной микрофлорой (2,5 мг нафталина в течение 11 дней).

В модельных почвенных системах с интродуцированными штаммами (В53701, ВБ3702, РрС7, ВБ3745 (рВ8216)) нафталин подвергался деградации с различной скоростью, но практически во всех системах к 11 дню данный субстрат полностью утилизировался, в то время как в модельной системе со стерильной почвой концентрация нафталина к этому сроку составляла около 60% от исходной.

Влияние салнцилата на процесс биодеградации нафталина в модельных почвенных системах

Известно, что индуктором нафталиндиоксигеназы (первого фермента пути биодеградации нафталина) является салицилат (Вагпзку, 1975). Низкие концентрации салицилата (0,1 мг/ г сухой почвы) использовали для изучения возможности ускорения процесса деградации нафталина в модельной почвенной системе интродуцированными штаммами микроорганизмов. Хотя исследование динамики численности микроорганизмов и характера кривых роста для всех штаммов в МПС с нафталином и в МПС с нафталином и салицилатом не выявило существенных различий, однако, для штаммов с индуцибельным синтезом нафталиндиоксигеназы наблюдали (ВБ202 и ВБ3780) более высокую скорость деградации нафталина в МПС с нафталином в присутствии салицилата (Рис.3). В то время, как для штамма ВБ203 (рВ81181) с конститутивным синтезом нафталиндиоксигеназы такого эффекта не наблюдалось.

(рВ51181) и концентрация нафталина в модельных почвенных системах с салицилатом и без салицилата

Эти отличия в потреблении нафталина в присутствии низких концентраций салицилата, возможно, связаны с различиями в синтезе ферментов деградации нафталина ( индуцибельный для штаммов ВБ202 и ВБ3780 и констутивный для ВБ203 (рВБ! 181) (табл.3 ).

Таблица 3. Активность фермента нафталиндиоксигеназы в различных штаммах Pseudomonas putida

Штамм Ростовой субстрат Удельная активность нафталиндиоксигеназы (нмоль/ мин/ мг белка)

Р. putida Сукцинат <1

BS202 Салицилат 23

Р. putida Сукцинат 4

BS3780 Салицилат 16

Р. putida Сукцинат 3

BS3750 Салицилат 3

Деградация фенантрена интродуцированнымн микроорганизмами

Сравнение скорости утилизации фенантрена в модельных почвенных системах различными штаммами микроорганизмов показало, что наиболее быстро утилизирует фенантрен штамм В53702 (1 мг/ г сухой почвы за 6 дней). Скорости утилизации фенантрена для штамма В53701 и ВБ3745 сравнимы и значительно ниже (1 мг/ г сухой почвы за 28 дней) чем в случае утилизации штаммом В33702 (Рис. 4).

1,Е+10 1,Е»09

2

1 ,Е*08 | >х

1.Е.07 |

1,Е♦06 ^ ш о

1,Е+05 * 1,Е+04

О 10 20 30 40 30

Время, сутки

Рис.4. Динамика численности бактерий ВБ7302 в модельной почвенной системе с фенантреном (ромбы) и без фенантрена (треугольники) и концентрация фенантрена (квадраты): экспериментальные данные (ромбы, треугольники, квадраты) и решение модели (непрерывная и прерывистая линии)

Оценка эффективности деградации нафталина и фенантрена различными штаммами, интродуцированиыми в модельную почвенную систему.

Для оценки эффективности деградации нафталина и фенантрена различными штаммами мы использовали математическую модель. Математическая модель описана в разделе материалы и методы.

Решение модели с учетом экспериментальных данных деградации нафталина и фенантрена в МПС штаммами В53701, В53702, ВБ3745 и в7 осуществлялось в три этапа. На первом этапе параметр ам и начальная концентрация нафталина (фенантрена) оценивались по экспериментальным данным испарения нафталина (фенантрена) в МПС в стерильной почве. На 2 этапе параметры , ах и начальная концентрация бактерий оценивались используя данные роста и снижение концентрации бактерий описываемых штаммов в МПС без нафталина (фенантрена). Финальная оценка этих параметров и параметров МР , QP, проводилась на 3 этапе, используя данные динамики роста соответствующего штамма и концентрации нафталина (фенантрена) в МПС, содержащей соответствующий штамм. Экономические коэффициенты и УР утилизации органического материала почвы и производных нафталина (фенантрена) соответственно были вычислены, использую простые формулы: ^ = М3 /Qs и УР = МР /()Р. Оценка эффективности процесса деградации проводилась на основе следующих параметров, представленных в табл.4.

Таблица 4. Кинетические параметры роста клеток микроорганизмов и утилизации ими ПАУ, их интермедиатов и доступных органических веществ почвы (ДОВП)

Параметр_Физический смысл

Ms Характеризует скорость роста микроорганизмов на ДОВП

Qs Характеризует скорость утилизации ДОВП

Ys Экономический коэффициент утилизации ДОВП

MP Характеризует скорость роста микроорганизмов на шггермедиатах ПАУ

Qp Характеризует скорость утилизации интермедиатов ПАУ

YP Экономический коэффициент утилизации интермедиатов ПАУ

QN Характеризует скорость утилизации ПАУ

mx Удельная скорость гибели микроорганизмов

«N Удельная скорость абиотической деградации ПАУ

xn Эффективная начальная концентрация бактерий

Сравнение кинетических параметров роста микроорганизмов и потребления ими субстратов показало, что наиболее эффективным штаммом-деструктором нафталина из исследованных штаммов является BS3701, а фенантрена - BS3702.

Оценка эффективности деградации нафталина и фенантрена природными н генетически модифицированными вариантами природных штаммов

В работе использовали генетически модифицированные штаммы BS3745(pBS216) и BS203 (pBS1181). BS3745(pBS216) был получен путем конъюгационного переноса плазмиды, контролирующей фенотип Nah+Sal+Phn+, в безплазмидный штамм WD25, производный Р. puíida

mt-2 (TOL). Штамм BS203 (pBS1181) получен путем переноса плазмиды pBSl 181, контролирующей фенотип Nal^Sal^hn1", в безплазмидный штамм BS203, производный BS202 (NPL-1). Так, скорость деградации нафталина генетически модифицированным штаммом BS3745 (pBS216) была в 2-3 раза ниже, чем для природных штаммов BS3701, G7, а скорость деградации фенантрена - в 5раза ниже, чем для штамма BS3702. Низкая скорость деградации генетически модифицированного штамма связана с потерей плазмиды pBS216, несущей гены деградации нафталина и фенантрена по мета-пути. Исследования стабильности признаков утилизации нафталина и салицилата для штаммов BS3745 (pBS216) н BS203 (pBS 1181) в неселективных условиях при культивировании на богатой среде показали, что через 80 генерации только 84% клеток популяции BS3745 (pBS216) сохраняли признаки утилизации нафталина и салицилата, для BS203 (pBSl 181) уже на 64 генерации полностью отсутствовал признак утилизации нафталина при сохранении признака утилизации салицилата. Потеря признаков была связана с утратой плазмид. Показано, что плазмида pBS216, контролирующая индуцибельный синтез нафталиндиоксигеназы, отличается большей стабильностью в неселективных условиях, чем плазмида рВ&1181, контролирующая конститутивный синтез нафталиноксигеназы. По-видимому, при выборе микроорганизмов-деструкторов ПАУ для использования в системах биоремедиации предпочтение надо отдавать штаммам с индуцибельным синтезом ферментов деградации.

Выводы

1. Выделены и охарактеризованы 28 штаммов бактерий рода Pseudomonas, способных к росту на ароматических углеводородах (нафталине, фенантрене, антрацене, феноле и мета-крезоле) в качестве единственных источников углеводорода и энергии. Штамм Burkholderia sp. BS3702 способен к росту как на полицнклических ароматических углеводородах (нафталине, фенантрене, антрацене), так и на алифатических (гексане, октане).

2. Для оценки эффективности процесса биодеградации полициклических ароматических углеводородов аборигенными и интродуцированными микроорганизмами использована модельная почвенная система; подобран оптимальный уровень влажности почвы (40%); оптимизирована экспресс методика определения концентрации нафталина, фенантрена и флуорена в почве.

3. Интродуцированные в модельные почвенные системы активные микроорганизмы-деструкторы полностью деградируют нафталин в концентрации 2,5 мг/ г сухой почвы и фенантрен в концентрации 1 мг/ г сухой почвы в течение 3-4 дней. Внесение салицилата в низких концентрациях вдвое ускоряет процесс деградации нафталина

интродуцированными штаммами-деструкторами с индуцибельным синтезом нафталиндиоксигеназы.

4. Предложена методика для предварительной оценки штаммов-деструкторов в модельных почвенных системах перед использованием их в системах биоремедиации, включающая использование экспресс методики определения концентраций ПАУ в почве и математического моделирования процесса биодеградации этих соединении.

5. Сравнение кинетических параметров роста микроорганизмов и потребления ими субстратов показало, что самым эффективным штаммом-деструктором нафталина является P. putida BS3701, а фенантрена - Burkholderia sp. BS3702, которые предлагается использовать в системах биоремедиации почв, загрязненных ПАУ и не фтепро ду ктам и.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Пунтус И.Ф., Филонов А.Е., Карпов А.В., Кошелева И.А., Гаязов P.P., Воронин A.M. Выделение и характеристика микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов. Микробиология, 1997, т. 66, N. 2, С. 222-225.

2. Filonov А.Е., Puntus I.F., Karpov A.V., Gaiazov R.R., Kosheleva I.A. and Boronin A.M. Growth and survival of Pseudomonas putida strains degrading naphthalene in soil model systems with different moisture levels. 1999, Process Biochemistry, v.34. p303-308.

3. Filonov A.E., Karpov A.V., Kosheleva I.A., Puntus I.F., Balashova N.V., Boronin A.M. The efficiency of salicylate utilization by Pseudomonas putida strains catabolizing naphthalene via different biochemical pathways. 2000, Process Biochemistry. V.35. p. 214-221.

4. Filonov A. E., Karpov A. V., Puntus I. F., Akimenko V. K., Boronin A. M. Microbial degradation of phenantlirene and naphthalene in soil model systems. INTAS Symposium. Moscow. 1997. P. 30.

5. Filonov A. E., Karpov A. V., Puntus I. F., Boronin A. M. Degradation of phenanthrene and naphthalene by Pseudomonas strain in soil model systems. VI International Congress on Pseudomonas: Molecular Biology and Biotechnology. Madrid, Spain. 1997. P. 52.

6. Пунтус И.Ф., Карпов A.B., Филонов A.E. Разработка модельных почвенных систем для изучения микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов. Тезисы докладов 2-ой открытой городской научной конференции молодых ученных г. Пущино, 23-25 апреля 1997, с. 189.

7. Пунтус И.Ф., Карпов А.В., Филонов А.Е. Влияние различной влажности на процессы жизнедеятельности бактерий рода Pseudomonas в модельных почвенных системах. Тезисы докладов 2-

ой открытой городской научной конференции молодых ученных г. Пущино, 23-25 апреля 1997, с. 190.

Пунтус И.Ф., Филонов А.Е. Выделение и характеристика микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов. Тезисы докладов 2-ой открытой городской научной конференции молодых ученных г. Пущино, 1997, с. 193. Пунтус И.Ф., Филонов А.Е. Экспресс-метод для мониторинга полициклических ароматических углеводородов в почве. Тезисы докладов 2-ой открытой городской научной конференции молодых ученных г. Пущино, 1997, с. 192.

0. Пунтус И.Ф., Слепенькин А. В., Козлова Е. В. Процесс деградации нафталина бактериями рода Pseudomonas в модельной почвенной системе в присутствии арсенита. В сборнике тезисов Ш пущинской конференции молодых ученных, Пушино. 1998. С. 32.

1. Пунтус И.Ф., Слепенькин А. В., Филонов А.Е. Деградация фенантрена бактериями рода Pseudomonas в модельной почвенной системе. В сборнике тезисов III пущинской конференции молодых ученных, Пущино, 1998. С. 33.

1 Iaviime ii.uaimc Автореферат И.Ф.ПУНТУС

I la.'ioiонли дышл - общероссийским классифнка юр прод\ кции OK' OOVIH. Kim 2: 953000 - киши и брошюры

Подписью в печать 2(. 0.4 2000 i .Чака i 870,SP Тираж 100 :>к I Усл.псч.л 1.0

Отпечатано с оригинала-макета н Отделе научно-техническом информации Путинского научною астра РАН

142292, i Пущино Москонскон обл., проспект Пауки, .4. ОНТИ.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пунтус, Ирина Филипповна

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность работы.:.

1.2. Цель и задачи исследования.

1.3. Научная новизна.

1.4. Научно-практическая значимость работы. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Деградация ПАУ.

2.1.1. Полициклические ароматические углеводороды как загрязнители окружающей среды.

2.1.2. Абиотическая деградация ПАУ.

2.1.3. Микроорганизмы- деструкторы ПАУ.

2.1.4. Распространение микроорганизмов-деструкторов ПАУ в окружающей среде.

2.1.5. Биохимические пути деградации нафталина.

2.1.6. Плазмиды биодеградации нафталина и их структурно-генетическая организация

2.1.7. Биохимические пути деградации фенантрена.

2.1.8. Участие плазмид деградации нафталина в процессе деградации фенантрена.

2.1.9. Биодеградация ПАУ в природе.

2.2. Использование микроорганизмов для очистки окружающей среды.

2.2.1. Использование генетически модифицированных микроорганизмов в области охраны окружающей среды.

2.2.2. Модельные почвенные системы.

2.2.3. Количественное определение ПАУ в почве.

2.2.3.1. Количественное определение нафталина.

2.2.3.2. Методы количественного определения фенантрена.

2.3. Кинетика роста микроорганизмов.

2.3.1. Математическое моделирование процесса биодеградации.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

3.2. Среды и другие материалы.

3.3. Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов.

3.4. Способность микроорганизмов к деградации ароматических углеводородов.

3.5. Способность штаммов к трансформации фенантрена.

3.6. Способность выделенных культур использовать фенантрен и нафталин в качестве единственного источника углерода и энергии.

3.7. Определение удельной скорости роста культуры микроорганизмов.

3.8. Определение промежуточных продуктов деградации фенантрена.

3.9. Коньюгационный перенос бактериальных плазмид.

3.10. Элиминация плазмид.

3.11. Выделение плазмидной ДНК.

3.12. Визуализация плазмидной ДНК.

3.13. Определение влагоемкости почвы.

3.14. Определение органического вещества в почве.

3.15. Приготовление модельных почвенных систем.

3.16. Внесение инокулята в почву.

3.17. Отбор проб.

3.18. Экстракция нафталина и фенантрена из почвенных образцов.

3.19. Определение концентрации нафталина в почвенных экстрактах.

3.20. Определение содержания фенантрена в почвенных экстрактах.

3.21. Определение стабильности признаков утилизации нафталина и салицилата.

3.22. Математическое моделирование процесса биодеградации нафталина и фенантрена. 46 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Выделение и характеристика штаммов деструкторов нафталина и фенантрена.

4.1.1. Способность штаммов деструкторов нафталина к трансформации фенантрена.

4.1.2. Способность штаммов-деструкторов нафталина использовать ПАУ в качестве единственного источника углерода и энергии.

4.1.3. Ростовые характеристики штаммов-деструкторов нафталина, способных к деградации фенантрена.

4.1.4. Определение промежуточных продуктов деградации фенантрена.

4.2. Разработка модельной почвенной системы для изучения процесса деградации нафталина и фенантрена.

4.2.1. Подготовка почвы для исследований.

4.2.2. Внесение нафталина и фенантрена в почву.

4.2.3. Особенности экстракции нафталина и фенантрена из почвенных образцов.

4.2.4. Содержание нафталина и фенантрена в почве.

4.2.5. Разработка экспресс методики для количественного определения нафталина и фенантрена в почве.

4.2.6. Определение оптимального уровня влажности для штаммов-деструкторов нафталина в модельной почвенной системе.

4.3. Математическое моделирование процесса биодеградации ПАУ в модельных почвенных системах.

4.4. Изучение процесса биодеградации нафталина в модельной почвенной системе.

4.4.1. Деградации нафталина в МПС со стерильной почвой.

4.4.2. Деградация нафталина аборигенными почвенными микроорганизмами.

4.4.3. Динамика численности интродуцированяых штаммов-деструкторов в МПС.

4.4.4. Деградация нафталина интродуцированными штаммами-деструкторами.

4.4.5. Оценка эффективности деградации нафталина различными штаммами, интродуцированными в модельные почвенные системы.

4.4.6. Влияние салицилата на процесс биодеградации нафталина в модельных почвенных системах.

4.5. Изучение процесса деградации фенантрена интродуцированными штаммами в модельных почвенных системах.

4.5.1. Деградации фенантрена в МПС со стерильной почвой.

4.5.2. Деградация фенантрена интродуцированными микроорганизмами.

4.5.3. Сравнение эффективности деградации фенантрена различными штаммами, интродуцированными в модельную почвенную систему.

4.5.4. Кинетика роста и потребления нафталина и фенантрена природными и генетически модифицированными штаммами-деструкторами нафталина и фенантрена

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микробная деградация нафталина и фенантрена в модельных почвенных системах"

1.1. Актуальность работы

В современной промышленности и сельском хозяйстве широко используются разнообразные органические соединения, в том числе ксенобиотики, многие из которых токсичны, канцерогенны, мутагенны, что может приводить к сдвигу экологического равновесия в биосфере и представляет угрозу для живых организмов.

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) являются классом повсеместно распространенных устойчивых поллютантов, содержащихся в сточных водах и газовых выбросах коксо-, газо- и нефтехимических производств. Нафталин, фенантрен, антрацен, хризен являются компонентами тяжелых фракций нефти и попадают в окружающую среду в результате аварийных разливов нефтепродуктов, при сгорании различных видов топлива при неполном доступе кислорода, а также содержатся в выхлопных газах автомобилей. В последнее время серьезную проблему представляет загрязнение почв и водных систем в индустриально развитых районах мира, поскольку многие ПАУ относятся к классу канцерогенов и мутагенов.

Хотя некоторое уменьшение концентрации ПАУ в почве возможно за счет абиотических процессов, основную роль в деградации этих соединений играют микробные популяции. Уникальная способность микроорганизмов к деградации ПАУ как природного, так и антропогенного происхождения становится предметом особого внимания исследователей, прежде всего с точки зрения использования микроорганизмов - деструкторов для очистки окружающей среды от все более возрастающего загрязнения антропогенного происхождения.

Известно, что ряд микроорганизмов способен использовать ПАУ как источники углерода и энергии или трансформировать их. Накоплен значительный экспериментальный материал, показывающий, что процесс биодеградации ПАУ бактериями часто контролируются плазмидами, большинство из которых обнаружено у представителей рода Pseudomonas. Псевдомонады способны к утилизации самых разнообразных органических соединений, в том числе неприродных. Однако данные, касающиеся биохимических путей , генетического контроля и физиологических аспектов утилизации ПАУ микроорганизмами в основном получены при изучении процесса катаболизма нафталина и относительно мало известно о катаболизме и трансформации ПАУ с более высоким молекулярным весом, таких как фенантрен, антрацен h др. Процесс деградации этих соединений в природных условиях протекает весьма медленно. Это обусловлено, в частности, низкой растворимостью ПАУ в воде, что резко снижает их биодоступность для микроорганизмов.

В последнее время возрос интерес к использованию штаммов - деструкторов для очистки от загрязнений окружающей среды in situ. Интродукция микроорганизмов в окружающую среду предполагает проведение предварительных лабораторных исследований штаммов-деструкторов. Исследователи все чаще используют модельные системы, приближенные к естественным условиям, в том числе и почвенные микрокосмы. При моделировании природных процессов в лабораторных условиях возникает необходимость разработки новых модельных систем, методов контроля за процессами жизнедеятельности микроорганизмов и деградации ксенобиотиков, быстрых методов количественного определения ксенобиотиков в почве и водных растворах. Изучение процесса деградации ПАУ различными штаммами микроорганизмов предполагает развитие и совершенствование подходов для оценки эффективности этого процесса с целью выбора наиболее активных штаммов-деструкторов для биоремедиации загрязненных территорий. Оценка эффективности процесса деградации предполагает определение количественных характеристик роста микроорганизмов и потребления субстратов с использованием математического моделирования.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Пунтус, Ирина Филипповна

6. выводы

1. Выделены и охарактеризованы 28 штаммов бактерий рода Pseudomonas, способных к росту на ароматических углеводородах (нафталине, фенантрене, антрацене, феноле и мета-крезоле) в качестве единственных источников углеводорода и энергии. Штамм Burkholderia sp. BS3702 способен к росту как на полициклических ароматических углеводородах (нафталине, фенантрене, антрацене), так и на алифатических (гексане, октане).

2. Для оценки эффективности процесса биодеградации полициклических ароматических углеводородов аборигенными и интродуцированными микроорганизмами использована модельная почвенная система; подобран оптимальный уровень влажности почвы (40%); оптимизирована экспресс методика определения концентрации нафталина, фенантрена и флуорена в почве.

3. Интродуцированные в модельные почвенные системы активные микроорганизмы-деструкторы полностью деградируют нафталин в концентрации 2,5 мг/ г сухой почвы и фенантрен в концентрации 1 мг/ г сухой почвы в течение 3-4 дней. Внесение салицилата в низких концентрациях вдвое ускоряет процесс деградации нафталина интродуцированными штаммами-деструкторами с индуцибельным синтезом нафталиндиоксигеназы.

4. Предложена методика для предварительной оценки штаммов-деструкторов в модельных почвенных системах перед использованием их в системах биоремедиации, включающая использование экспресс методики определения концентраций ПАУ в почве и математического моделирования процесса биодеградации этих соединений.

5. Сравнение кинетических параметров роста микроорганизмов и потребления ими субстратов показало, что самым эффективным штаммом-деструктором нафталина является Р. putida BS3701, а фенантрена - Burkholderia sp. BS3702, которые предлагается использовать в системах биоремедиации почв, загрязненных ПАУ и нефтепродуктами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пунтус, Ирина Филипповна, Пущино

1. Борисоглебская А.Н., Воронин А.М. 1983. Популяционные изменения штамма Pseudomonas putida BSA202, содержащего плазмиду NPL-1, по способности к катаболизму нафталина. Микробиология, 52: с.301.

2. Воронин А. М. 1987. Плазмиды резистентности и биодеградации бактерий рода Pseudomonas. Диссертация докт. биол. наук. М. 500 с.

3. Воронин А.М., Борисоглебская А. Н., Старовойтов И.И. 1977а. Мутанты плазмиды NPL-1, контралирующей окисление нафталина. Докл. АН СССР, 235: 494.

4. Воронин А.М., Кочетков В.В. Старовойтов И. И., Скрябин Г.К. 19776. Плазмиды pBS2 и pBS3, контролирующие окисление нафталина у бактерий рода Pseudomonas. Докл. АН СССР, 237: 1205.

5. Воронин А.М., Скрябин Г.К, Кочетков В.В. Старовойтов И. И, Еремин A.A., Перебитюк А.Н. 1980. pBS4- новая плазмида биодеградации нафталина. Докл. АН СССР, 250: 212.

6. Воронин А.М., Филонов А.Е., Балакшина В.В., Кулакова А.Н. 1985. Стабильность плазмид био деградации нафталина NPL-1 и NPL-41 в популяциях Pseudomonas putida в условиях непрерывного культивирования. Микробиология. 4: 610-615.

7. Воронин А.М., Цой Т.В. 1990. Генетика деградации у псевдомонад и других грамотрицательных бактерий. Генетика промышленных микроорганизмов и биотехнология. М. :Наука, с. 123-128.

8. Вадюнина А.Ф., Корчагина З.А. 1961. Методы определения физических свойств почв. М: Высшая школа, с. 345

9. Ю.Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. 1990. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов. М. :Высшая школа, с.295.

10. П.Доналдсон Н. 1963. Химия и технология соединений нафталинового ряда. М.: Наука, с.655.

11. Коренман И.М. 1970. Фотометрический анализ. М.: Химия, с. 375.

12. Кочетков В.В., Старовойтов И.И., Воронин А.М., Скрябин Г.К. 1985. Плазмида pBS241 Pseudomonas putida, контролирующая деградацию бифенила. Докл. АН СССР, 226: 241.

13. Кошелева И.А. 1989. Молекулярно-генетическая организация илазмид биодеградации нафталина. Диссертация канд. биол. наук. М. 182 с.

14. Кошелева И.А., Цой Т.В., Ивашина Т.В., Селифонов С.А. Старовойтов И.И., Воронин A.M. 1988. Мутации плазмиды pBS286, блокирующие первичные этапы окисления нафталина, индуцированные Тп5. Генетика, 24:396.

15. Кошелева И.А. Цой Т.В., Кулакова А.Н., Воронин A.M. 1986. Сравнительный анализ организации плазмиды NPL-1, контролирующей окисление нафталина клетками Pseudomonas putida и ее производных. Генетика, 22:2383.

16. Малашенко Ю.Р.Мучник Ф.В., Романовская В.А., Садовников Ю.С. 1980. Математические модели и ЭВМ в микробиологической практике. Киев: Наукова думка. 195 с.

17. Миллер Дж. 1976. Эксперименты в молекулярной генетике. М. :Мир. С.392-398.

18. Перт С.Дж. 1978. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир. 331 с.

19. Скрябин Г.К, Старовойтов И.И. 1975. Альтернативный путь катаболизма нафталина Pseudomonas fluorescens. Докл. АН СССР, 221: 493.

20. Старовойтов И. И, Воронин A.M., Скрябин Г.К. 1976. Сравнительное изучение путей катаболизма нафталина у двух штаммов Pseudomonas putida .Докл. АН СССР. 228:228.

21. Цой Т.В., Кошелева И.А., Воронин A.M. 1986. Nah-гены Pseudomonas putida. Молекулярно-генетический анализ плазмиды pBS286. Генетика, 22: 2702.

22. Ashok, В.T., Saxena, S., Singh, К.Р. and Musarrat, J. 1995. Biodégradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil around Mathura oil refinery, India. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 11: 691-692.

23. Atlas, R. M. 1981. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective. Microbiol. Rev. 45:180-209.

24. Atlas, R. M. And Busdosh, M. 1976. Microbial degradation of petroleum in the Arctic, p.79-86. In J.M. Sharpley and A.M. Kaplan (ed.), Proceeding of the 3rd International Biodégradation Symposium. Applied Science Publishers Ltd., London.

25. Atlas, R. M., and Bartha, R. 1972. Degradation and mineralization of petroleum in seawater: limitation by nitrogen and phosphorus. Biotechnol. Bioeng. 14:309-317.

26. Atlas, R. M., and Bartha, R. 1973. Stimulated biodégradation of oil slicks using oleophilic fertilizers. Environ. Sci. Technol. 7: 538-541.

27. Bailey, N.J.L., Jobson, A.M. and Rogers, M.A. 1973. Bacterial degradation of crude oil: comparison of field and experimental data. Chem. Geol. 11: 203-221.

28. Balashova, N.V., Kosheleva, I. A., Golovchenko, N.P., Boronin, A.M. 1999. Phenanthrene metabolism by Pseudomonas and Burkholderia strains. Process Biochemistry. 35:291-296.

29. Banerjee, D.K., Fedorak, P.M., Hashimoto, A., Masliyah, J.H., Pickard, M.A. and Gray, M R. 1995. Monitoring the biological treatment of anthracene-contaminated soil. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43:521-528.

30. Barbas, J.T., Sigman, M.E. and Dabestani, R. 1996. Photochemical oxidation of phenanthrene sorbed on silica-gel. Environ. Sci. and Technol. 30: 1776-1780.

31. Bark ay, T., Navon-Veneria, S., Ron, E.Z. and Rosenberg, E. 1999. Enhancement of solubilisation and biodégradation of polyaromatic hydrocarbons by the bioemulsifier alasan. Appl. environ. Microbiol. 65:2697-2702.

32. Barnsley, E.A. 1983. Bacterial oxidation of naphthalene and phenanthrene. J. Bacteriol. 153: 1069-1071.

33. Bauer, J.E. and Capone, D.G. 1985. Degradation and mineralization of the polycyclic aromatic hydrocarbons anthracene and naphthalene in intertidal marine sediments. Appl. Environ. Microbiol. 50:81-90.

34. Bej, A.K., Perlin, M. and Atlas, R. M. 1991. Effect of genetically engineered microorganisms on soil microbial community diversity. FEMS Microboil. Ecol. 86: 169176.

35. Bergstein, P.E. and Vestal, J.R. 1978. Crude oil biodégradation in Arctic tundra ponds. Arctic. 31:158-169.

36. Bertrand, J.-C., Bonin, P., Goutx, M., Gauthier, M. And Mille, G. 1994. The potential application of biosurfactants in combatting hydrocarbon pollution in marine environments. Bioremediation: Scientific and Technological Issues. 53-56.

37. Birnboim, H.C. and Doly, J.A. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmids DNA. Nucl. Acid. Res. 7: 1513.

38. Boldrin, B., Tiehm, A. and Fritzsche, C. 1993. Degradation of phenanthrene, fluorenee, fluoranthene and pyrene by a Mycobacterium sp. Appl. Environ. Microbiol. 59: 19271930.

39. Boronin, A.M. 1992. Diversity of Pseudomonas plasmids: To what extent? FEMS Microbiology Letters. 100:461-468.

40. Bossert, I. and Bartha, R. 1984. The fate of petroleum in soil ecosystems. In R.M. Atlas (ed.), Petroleum microbiology. Macmillan Publishing Co., New York, p. 434-476.

41. Bossert, I., Kachel, W.M. and Bartha, R. 1984. Fate of hydrocarbons during oily sludge disposal in soil. Appl. Environ. Microbiol. 47: 763-767.

42. Carhart, G. and Hegeman, G. 1975. Improved method of selection for mutants of Pseudomonasputida. Appl. Microbiol. 30:1046.

43. Cerniglia C.E., Sutherland J.B., Crow S.A. 1992. Fungal metabolism og aromatic hydrocarbons. IN Winkelmann G (ed): Microbial gedradation of narural products. Weinheim, Germany: VCH Verlagsgesellschft, p.226-232.

44. Cerniglia, C.E., Freeman, J.P. and Evans, F.E. 1984. Evidence for an arene oxide-NIH shift pathway in the transformation of naphthalene to 1-naphthol in Bacillus cereus. Arch. Microbiol. 138: 283-286.

45. Colla, A., Fiecchi, A. and Treccani, V. 1959. Recerche sul metabolismo ossidativo microbico dell anthracene e del fenantrene. Ann. Microbiol. 9: 87-91.

46. Connors, M.A. and Barnsley, E.A. 1982. Naphthalene plasmid in Pseudomonas. 149:1096.

47. Cooney, J.J. 1984. The fate of petroleum in soil ecosystems, p. 399-434. In R.M. Atlas (eds), Petroleum microbiology. Macmillan Publishing Co., New York.

48. Cooney, J.J., Silver, S.A., and Beck, E. A. 1985. Factors influencing hydrocarbon degradation in three freshwater lakes. Microb. Ecol. 11:127-137.

49. Coover, M.P., Sims, R.C. 1987. The effect of temperature on polycyclic aromatic hydrocarbons persistence in an unaclimated soil. Hazard. Waste. Mater. 4: 69-82

50. Dagley S., Evans W.C., Ribbone D.W. 1960. New pathwaysin the oxidative metabolizm of aromatic compounds by microorganisms. Nature. 188: 560.

51. Davies, J.I. and Evans, W.C. 1964. Oxidative metabolism of naphthalene by soil Pseudomonas: The ring-fission mechanism. Biochem. J.91: 251-261.

52. Demone, S.A., Stanley, D.C., Olson, E.S., Young, K.D. 1993. Metabolism of dibenzothiophene and naphthalene in Pseudomonas strains. I. Bacteriol. 175: 6890-6901.

53. Dibble, J.T. and Bartha, R. 1976. Effect of iron on the biodégradation of petroleum in seawater. Appl. Environ. Microbiol.31:544-550.

54. Dibble, J.T. and Bartha, R. 1979. Effect of environmental parameters on the biodégradation of oil sludge. Appl. Environ. Microbiol. 37:729-739.

55. Dua, R.D. and Meera, S. 1981. Purification and characterization of naphthalene oxygenase from Corynebacterium renale. Eur. J. Biochem. 120:461-465.

56. Dunn N.W., Dunn H.W., Austen R.A. 1980. Evidence for the existence of two catabolic plasmids coding for the degradation of haphthalene. J. Gen. Microbiol. 117:529.

57. Dunn, N.W. and Gunsalus, I.C. 1973. Transmissible plasmid coding early enzymes of naphthalene oxidation in Pseudomonas putida. J. Bacteriol. 114:974-979.

58. Eckhardt, T. 1978. A rapid method for the identification of plasmid desoxyribonucleic acid in bacteria. Plasmid. 1:584.

59. Evans, C.G.T., Herbert, D., Tempest, D.B. 1970. The continiuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a Chemostat. Methods in Microbiology. 2: 277-327.

60. Evans, W.C., Fernley, H.N. and Griffiths, E. 1965. Oxidative metabolism of phenanthrene and anthracene by soil pseudomonads; the ring fission mechanism. Biochem. J. 95:819-821.

61. Floodgate, G. 1984. The fate of petroleum in marine ecosystems, p. 355-398. In R.M. Atlas (ed.), Petroleum microbiology. Macmillan Publishing Co., New York.

62. Foght, J.M. and Westlake, D.W.S. 1988. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and aromatic heterocycles by a Pseudomonads species. Can. J. Microbiol. 34: 1135 1141.

63. Foght, M.J. and Westlake, D.W.S. 1996. Transposon and spontaneous deletion mutants of plasmid-born genes encoding polycyclic aromatic hydrocarbon degradation by a strain of Pseudomonas fluorescens. Biodégradation. 1996. 7.: 353-366.

64. Fry J.D. and Day M.L. 1990. Bacterial Genetics in Natural Environments. (Eds.) Chapman and Hall, London.

65. Garcia-Valdes, E, Cozar, E., Rotger, R., Latucat, J. and Ursing, J. 1988. New naphthalene-degrading marine Pseudomonas strains. Appl. Environ. Microbiol. 54: 24782485.

66. Ghosh, D.K. and Mishra, A.K. 1983. Oxidation of phenannthrene by a strain of Micrococcus: evidence of protocatechuate pathway. Curr. Microbiol. 9: 219-224.

67. Goyal, A.K. and Zylstra, G.J. 1996. Molecular Cloning of Novel Genes for Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Degradation from Comamonas testosteroni GZ39. Appl. Envir. Microbiol. 1: 230-236.

68. Gregersen, T. 1978. Rapid method for distinction of Gram-negative from Gram-positive bacteria. Eur. J. Appl. Microbiol, and Biotechnol. 5:123.

69. Griffol, M., Casellas, M., Bayona, J.M. and Solanas, A.M. 1992. Isolation and characterisation of a fluerene-degrading bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 58: 29102917.

70. Grand, E., Denecke, B. and Eichenlaub, R. 1992. Naphthalene degradation via salicylate and gentisate by Rhodococcus sp. strain B4. Appl. Environ. Microbiol. 58: 1874-1877.

71. Guerin, W.F. and Jones G.E. 1988. Mineralization of phenanthrene by a. Mycobacterium sp. Appl. Environ. Microbiol 54: 937-944.

72. Guerin, W.F. and Jones G.E. 1989. Estuarine ecology of phenanthrene-degrading bacteria. Estuarine coastal Shelf Sci. 29: 115-130.

73. Guerin, W.F. and Jones, G.E. 1988. Two-stage mineralization of phenanthrene by estuarine enrichment cultures. Appl. Environ. Microbiol. 54: 929-936.

74. Hambrick, G.A., DeLaune, R.D. and Patrick, W.H. 1980. Effect of estuarine sediment pH and oxidation-reduction potential on microbial hydrocarbon degradation. Appl. Environ. Microbiol. 40: 365-369.

75. Heitkamp, M.A. and Cerniglia, C.E. 1988. Mineralization of polycyclic aromatic hydrocarbons by a bacterium isolated from sediment below an oil field. Appl. Environ. Microbiol. 54: 1612-1614.

76. Heitkamp, M.A., Franklin, W., Cerniglia, C.E. 1988. Microbial metabolism of PAH: isolation and characterization of pyrene-degrading bacterium. Appl.Environ. Microbiol. 54: 929-936.

77. Hinchee R.E., Anderson D.B., Metting F.B., Sayles J.G.D. (Eds.). 1994. Applied Biotechnology for Site Remediation.Lewis Publishers. Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo.

78. Horowitz, A. And Atlas, R.M. 1977. Continuous open flow-through system as a model for oil degradation in the Arctic Ocean. Appl. Environ. Microbiol. 33: 647-653.

79. James F., Roos M. 1975. MINUIT a system for function minimization and analysis of the parameters errors and correlation. Comp. Phys. Commun. 10:343-367.

80. Jamison, V.M., Raymond, R.L. and Hudson, Jr. 1975. Biodégradation of high-octane gasoline in groundwater. Dev. Ind. Microbiol. 16: 305-312.

81. Jeffrey, A.M., Yeh, H.J.C., Jerina, D.M., Patel, R.T., Davey, J.F. and Cibson, D.T. 1975. Initial reactions in the oxidation of naphthalene by Pseudomonas putida. Biochemistry. 14: 575-584.

82. Jerina, D.M., Sclander, H., Yagi, H., Wells, M.C., Davey, J.F., Mahadevan, V. and Gibson, D.T. 1976. Dihydrodiols from anthracene and phenanthrene. J. Am.Chem.Soc. 98: 5988-5996.

83. Jones, S.H. and Alexander, M. 1988. Phosphorus enhancement of mineralization of low concentrations of p-nitrophenol by Flavobacterium sp. in lake water. FEMS Microbiol. Lett. 52: 121-126.

84. Kastner, M., Breuer-Jammali M. And Mahro, B. 1994. Enumeration and characterization of the soil microflora from hydrocarbon-contaminated soil sites able to mineralize polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH). Appl. Mocrobiol. Biotechnol. 41: 267-273.

85. Keck, J., Sims, R.C., Coover, M., Park, K, Symons, B. 1989. Evidence for cooxidation of polynuclear aromatic hydrocarbons in soil. Water Res. 23: 1467-1476.

86. Kelley, I., Freeman, J.P. and Cerniglia, C.E. 1991. Identification of metabolites from the degradation of naphthalene by a Mycobacterium sp. Biodégradation. 1: 283-290.

87. Kerr, R.P. and Capone, D.G. 1988. The effect of salinity on the microbial mineralization of two polycyclic aromatic hydrocarbons in estuarine sediments. Mar. Environ. Res. 26:181-198.

88. Keuth, S. and Rehm, H.J. 1991. Biodégradation of phenanthrene by Arthrobacter polychromogenes isolated from a contaminated soil. Appl. Microbiol. Biotechnol. 34: 804-808.

89. Kiyohara, H and Nagao, K. 1978. The Catabolism of Phenantrene and Naphthalene by Bacteria . J. Gen. Microbiol. V.105. P.69-75

90. Kiyohara, H., Nagao, K. and Nomi R. 1976. Degradation of phenanthrene through 0-pthalate by an Aeromonas sp. Agric. Biol. Chem. 40: 1075-1082.

91. Kiyohara, H., Nagao, K., Kouno K. and Yano, K. 1982. Phenanthrene degrading phenotype of Alcaligenes faecalis AFK2. Appl. Environ. Microbiol. 43: 458-461.

92. Kiyohara, H., Nagao, K., Yana, K. 1982. Rapid screen for bacteria degrading water-insoluble, solid hydrocarbons on agar plates. Appl. Envir. Microbiol. 2: 454-457.

93. Kiyohara, H., Takizawa, N., Date, H., Torigoe, S. and Yano, K. 1990. Characterization of a phenanthrene degradation plasmid from Alcaligenes faecalis AFK2. Ferment. Bioeng. 69: 54-56.

94. Krieg, N.R., Holf, Y.G. (eds) 1984. Bergey,s Manual of Sistematic Bacteriology. Baltimore; London: Williams and Wilkins, 1: 154.

95. Kuhm, A.E., Stolz, A. and Knackmuss, H.J. 1991. Metabolism of naphthalene by the biphenyl-degrading bacterium Pseudomaspaucimobilis Ql. Biodégradation. 2: 115-120.

96. Laurie, A.D., Lloyd-Jones, G. 1999. The phn genes of Burkholderia sp. Strain RP007 constitute a divergent gene cluster for polycyclic aromatic hydrocarbon catabolism. J. Bacteriol. 2: 531-540.

97. Leahy, J.G. and Colwell, R.R. 1990. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment. Microb. Reviews. 54: 305-315.

98. Lee, R. F. and Silva, M. 1994. Polycyclic aromatic hydrocarbon removal rates in oiled sediments treated with urea, ureaifish protein, or ammonium nitrate, pp. 320-326. In:

99. Applied Biotechnology for Site Remediation. (Eds.) R.E. Hinchee, D.B. Anderson, F.B. Metting, J.G.D. Sayles. Lewis Publishers. Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo.

100. Lehrbach P.R.,McGregor J., Ward J.M., Broda P. 1983. Molecular relationships between Pseudomonas IncP-9 degradative plasmid TOL, NAH and SAL. Plasmid. 10:164.

101. Lehtomaki, M. and Niemela, S. 1975. Improving microbial degradation of oil in soil. AMBIO 4:126-129.

102. Levy S.B. and Miller R.D. (eds) 1989. Gene Transfer in the Environments. Mc Graw-Hill, New York.

103. Lewis, D.L., Kollig, H.P. and Hodson, R.E. 1986. Nutrient limitation and adaptation of microbial populations to chemical transformations. Appl. Environ. Microbiol. 51: 598603.

104. Madsen, E. L., Billota-Best, S.E. and Ghiorse, W.C. 1995. Development of a rapid 14C-based field method for assessing potential biodégradation of organic compounds in soil and sediment samples. J. of Microbial. Methods. 21: 317-327.

105. Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. 1982. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. P. 480.

106. Manilal, V.B. and Alexander, M. 1991. Factors affecting the microbial degradation of phenanthrene in soil. Appl. Microbiol. Biotechnol. 35: 401-405.

107. Maue, G., Dott, W. and Kampfer, P. 1994. Detection of PAH degrading bacterial isolates using a rapid fluorometric method. J. Of Microbial. Method. 19: 189-196.

108. Menn, F.M., Applegate, B.M. and Sayler, G.S. 1993. NAH plasmid-mediated catabolism of anthracene and phenanthrene to naphthoic acids. Appl. Environ. Microbiol. 59: 2415-2423.

109. Mihelcic, J.R. and Luthy, R.G. 1988. Microbial degradation of acenaphthene and naphthalene under denitrification conditions in soil-water systems. Appl. Environ. Microbiol. 54: 1188-1198.

110. Moller, J., Ingvorsen, H. 1993. Biodégradation of phenanthrene in soil microcosms stimulated by an introduced Alcaligenes. sp. FEMS Microbiol. Ecology. 102: 271-278.

111. Monod J., 1942. The growth of bacterial cultures. Ann. Rev. of Microbial. Ill: 371394.

112. Monticello D.J., Bakker D., Schell M, Finnerty W.R. 1985. Plasmid-borne Tn5 insertion mutation resulting in accumulation of gentisate from salicylate. Env. Microbiol. 49: 761.

113. Park, K.S., Sims, R.C. Dupont, R.R„ Doucette, W.J. and Matthews, J.E. 1990. Fate of PAH compounds in two soil types: Influence of volatilization, abiotic loss and biological activity. Environ. Toxicol. Chem. 9:187-195.

114. Perry, R.H., Chilton, C.H., Kirkpatrick, S.D. (eds). 1963. Chemical engineers handbook. McGraw-Hill, New York.

115. Pirt, S.J. 1975. Principles of microbe and cell cultivation. Blackwell Scientific Publication. Oxford., p.274.

116. Rheinwald, J., Chakrabarty, A.M. and Gunsalus, I.C. 1973. A transmissible plasmid controlling camphor oxidation in Pseudomonas putida. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 70:885.

117. Ryu, B.H., Oh, Y.K. and Bin, J.H. 1989. Biodégradation of naphtalene by Acinetobacter calcoaceticus R-88. Kor. Agric.Chem. Soc.32: 315-320.

118. Sanseverino, J., Applegate, B.M., Henry King, J.M. and Saler, G.S. 1993. Plasmid-Mediated Mineralization of Naphthalene, Penanthrene, and Anthracene. Appl. Environ. Microbiol. 6: 1931-1937.

119. Savino, A and Lollini, M.N. 1977. Identification of some fermentation products of phenanthrene in microorganisms of the genus Arthrobacter. Boll. Soc. Ital. Biol. Sper. 53: 916-921.

120. Schell M.A. 1985. Transcriptional control of the nah and sal hydrocarbon-degrative opérons by the nahR gene product. Gene. 36: 301.

121. Shiaris, M. P. 1989. Seasonal biotransformation of naphthalene, phenanthrene and benzoa.pyrene in surficial estuarine sediments. Appl. Environ.Microbiol. 55: 1391-1399.

122. Shuttle worth, K.L. and Cerniglia, C.E. 1996. Bacterial Degradation of Low Concentration of Phenanthtrene and Inhibition by Naphthalene. Microb. Ecol. 31: 305317.

123. Sims, J.L., Sims, R.C. and Matthews, J.E. 1990. Aproach to bioremediation of contaminated soil. Hazard. Waste Hazard. Mater. 7:117-149.

124. Stewart-Tull, D.E.S. and Sussman, M. (eds). 1995. The Release of Genetically Modified Microorganisms REGEM2, Plenum, New York.

125. Stolp, H. and Gadkari, D. 1981. Nonpathogenic members of the genus Pseudomonas. In: Prokaryotes. Berlin. 1:719.

126. Stotzky, G.and Babich, H. 1986. Survival of, and genetic transfer by genetically engineered bacteria in natural environments. Adv.Appl. Microbiol. 31: 73-743.

127. Strandberg, G.W., Abraham, T.J. and Frazier, G.C. 1986. Phenanthrene degradation by Beijerinckia sp. B8/36. Biotechnol. Bioeng. 28: 142-145.

128. Stucki, G and Alexander, M. 1987. Role of dissolution rate and solubility in biodégradation of aromatic compounds. Appl. Environ. Microbiol. 53: 292-297.

129. Tagger, S., Bianchi, A., Julliard, M., Le Petit, J. and Roux, B. 1983. Effect of microbial seeding of crude oil in seawater in a model system. Mar. Biol. 78: 13-20.

130. Tempest, D.W. 1970. The continuous cultivation of microorganisms. 1. Theory of a chemostat. Methods Microbiol. 2: 259-276.

131. Treccani, V., Walker, N. and Wiltshire, G.H. 1954. The metabolism of naphtalene by soil bacteria. J. Gen. Microbiol. 11: 341-348.

132. Trevors, J.T., Barkar, T. and Bourquin, A.W. 1988. Gene transfer among bacteria in soil and aquatic environments. Areviw. Can. J. Microbiol. 42: 717-743.

133. Trower M. K., Sariaslani F.S., KitsonF.G. 1988. Xenobiotic oxidation by cytochrome P-450 enriched extracts of Streptomyces griseus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 157: 1417-1422.

134. Van Elsas, J.D., Govaret, J.M. and van Veen, J.A. 1987. Transfer of plasmid pFT30 between bacilli in soil as influenced by bacterial population dynamics and soil conditions. Soil. Biol. Biochem. 19: 639-647.

135. Van Elsas, J.D., Trevors, J.T., Starodub, M.E. and van Overbek, L.S. 1990. Transfer of plasmid RP4 between Pseudomonads after introduction into soil. FEMS Microbiol. Ecol. 73:1-13.

136. Volkering, F,. Breure, A.M., Sterkenburg, A. and van Andel, J.G. 1992. Microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons: effect of substrate availability on bacterial growth kinetics. Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 548-552.

137. Volkering, F., Breure, A.M. and van Andel, J.G. 1993. Effect of microorganisms on the bioavailability and biodégradation of crystalline naphthalene. Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 535-540.

138. Yon Vedel, R.J., Mosquera, J.F., Goldsmith, G.R. and Wiegand, J.W. 1988. Bacterial biodégradation of petroleum hydrocarbons in groundwater: in situ augmented bioreclamation with enrichment isolates in California. Water Sci. Technol. 20: 501-503.

139. Walker, J.D. and Colwell, R.R. 1974. Microbial degradation of model petroleum at low temperatures. Microb. Ecol. 1:63-95.

140. Walter, U., Beyer, M., Klein, J. and Rehm, H.J. 1991. Degradation of pyrene by Rhodococcus sp. UW1. Appl. Microbiol. Biotechnol. 34: 671-676.

141. Wang, X., Yu, Y., Bartha, R. 1990. Effectof bioremediation on polycyclic aromatic hydrocarbon resudues in soil. Environ. Sci. Technol. 24: 1086-1089.

142. Ward, D.M. and Brock, T.D. 1978. Anaerobic metabolism of hexadecane in marine sediments. Geomicrobiol. J. 1:1-9.

143. Weissenfels , W.D., Beyer, M. and Klein, J. 1990. Degradation of phenanthrene, fluorene and fluoranthene by pure bacterial cultures. Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 479-484.

144. Weissenfels, W.D., Beyer, M. and Klein, J. 1991. Isolation and identification of ring fission products. Appl. Microbiol. Biotechnol. 34: 528-535.

145. Wellington, E.M.H., Cresswell, N. And Sauders V. A. 1990. Growth and survival of Streptomycete noculans and extent of plasmid transfer in sterile and nonsterile soil. Appl. Environ. Microbiol. 56: 1413-1419.

146. Yang, Y., Chen, R.F. and Shiaris, M.P. 1994. Metabolism of Naphthalene, Fluorene, and Phenantrene: Preliminary Characterization of a Cloned Gene Cluster from Pseudomonasputida NCIB 9816. J.Bacteriol. 176; 8: 2158-2164.

147. Yen, K.M. and Serdar, C.M. 1988. Genetic of naphthalene catabolism in pseudomonads. CRC Crit. Rev. Microbiol. 15:247-268.

148. Yen, K.M., Gunsalus, I.C. 1982. Plasmid gene organization: naphthalene/salicylate oxidation. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79:874.

149. Zylstra, G.J., Kim, E., Goyal, A. K. 1997. Comparative molecular analysis of genes for poly cyclic aronatic hydrocarbon degradation. In: Genetic Engineering. Selton, J.K. (eds). Plenum Press. New York. 257-269.

150. Zylstra, G.J., Wang, X. P., Kim, E. and Didolcar, V.A. 1994. Cloning and Analysis of the genes for Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Degradation. In: Recombinant DNA Technology II. Annals of the New York Academy of Sciences. 721: 386-398

151. Автор выражает благодарность научному руководителю чл.-корр., д.б.н. A.M. Воронину за предоставление возможности выполнения диссертационной работы и обсуждение результатов.