Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение состава сообществ бактерий-деструкторов в условиях загрязнения устойчивыми органическими соединениями

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изменение состава сообществ бактерий-деструкторов в условиях загрязнения устойчивыми органическими соединениями"

На правах рукописи

ПАНОВ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА СООБЩЕСТВ БАКТЕРИЙ-ДЕСТРУКТОРОВ В УСЛОВИЯХ ЗАГРЯЗНЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ ОРГАНИЧЕСКИМИ

СОЕДИНЕНИЯМИ

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2013

005535296

Работа выполнена в лаборатории биологии плазмид Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (г. Пущино) и Пущинском государственном университете.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Федерального государственного бюджетного учреждения науки

Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

Российской академии наук Кошелева Ирина Адольфовна

Официальные онпоненты:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

Федерального государственного бюджетного учреждения науки

Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

Российской академии наук Хмеленина Валентина Николаевна

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник

Филиала института биоорганической химии

им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова

Российской академии наук Захарченко Наталья Сергеевна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук

Защита состоится « 26 » сентября 2013 г. в 10:00 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, пр. Науки, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФМ РАН.

Автореферат разослан « 4-1 » 2013г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В процессе деятельности человека производится множество устойчивых органических соединений (УОС), которые попадают в окружающую среду вследствие аварийных выбросов, разливов и непосредственно в виде отходов. Одними из основных загрязнителей окружающей среды являются нефть и нефтепродукты (Израэль и др., 1986).

В сточных водах и газовых выбросах нефте-, газо- и коксохимических производств содержатся наиболее трудноразлагаемые соединения: моно- и полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), такие как бензол, толуол, нафталин, фенантрен и антрацен. Нафталин производят в огромных масштабах (тысячи тонн в год) для получения фталевого ангидрида, красителей, пластиков, взрывчатых веществ, инсектицидов и фармацевтических препаратов. Однако он является канцерогенным соединением, и загрязнение им окружающей среды опасно для здоровья человека (Report on Carcinogens, 2011). При очистке сточных вод нефтеперерабатывающих предприятий формируются нефтешламы, содержащие устойчивые органические соединения, в том числе ПАУ и их метилированные производные, многие из которых также канцерогенны (Русанова, 1999; Якушева и др., 2002).

Наиболее распространёнными способами ликвидации загрязнений УОС являются сжигание и различные физико-химические методы. Однако применение этих технологий приводит ко вторичному загрязнению окружающей среды. Биоремедиация, как in situ, так и ex situ, более эффективный и щадящий подход, поскольку большая часть химических соединений нефти и нефтепродуктов биодеградируема, а микроорганизмы-нефтедеструкторы весьма разнообразны и адаптированы даже к регионам с холодным климатом (Aeckersberg et al., 1998; Chaineau et al., 2000).

Для разработки технологий биоремедиации большое значение приобретает исследование динамики численности аборигенных почвенных бактерий-деструкторов, поскольку необходимо иметь представление о способности почвы к самовосстановлению и необходимости применения биопрепаратов. Такие исследования должны проводиться на стыке микробиологии и молекулярной биологии, так как в загрязнённых сайтах могут присутствовать некультивируемые микроорганизмы, которые обнаруживаются лишь с использованием молекулярно-

генетических методов. Известно, что гены, контролирующие биодеградацию УОС, часто находятся в составе катаболических конъюгативных плазмид, которые играют существенную роль в адаптации микробных сообществ к загрязнению окружающей среды. Путём изучения состава бактериального сообщества (частоты встречаемости тех или иных видов микроорганизмов) и частоты встречаемости ключевых генов биодеградации УОС и катаболических плазмид можно определить адаптационный потенциал бактериального сообщества конкретного загрязнённого сайта.

В случае, когда биодеградативный потенциал почвы низок, используют биопрепараты, включающие микроорганизмы-деструкторы углеводородов (например, штаммы-нефтедеструкторы родов Pseudomonas и Rhodococcus) (Van Hamme, 2003). Для разработки биопрепаратов необходимо детальное исследование бактериальных биохимических путей деградации поллютантов и их генетического контроля. Генетические системы биодеградации нафталина, который используется как модельное соединение при исследовании процессов деструкции углеводородов нефти, особенно начальных этапов его окисления до салицилата (nahl-оперон), у псевдомонад изучены наиболее детально, и являются довольно консервативными. Однако гены салицилатгидроксилаз (в составе иа/г2-оперона) отличаются большим полиморфизмом в пределах рода Pseudomonas, и за последние годы было обнаружено несколько их вариантов (Bosch et al., 2000; Zhao et al., 2005; Camara et al., 2007). Причём различные варианты этого гена могут находиться в геноме бактерий как в сочетании с полным набором генов «классического» оперона деградации нафталина, так и лишь с «а/г/-опероном или даже в отсутствие нафталиновых оперонов.

Салицилат, являясь ключевым интермедиатом в бактериальных путях биодеградации ПАУ, в то же время широко распространён в природе как типичный метаболит растений, участвующий в индукции системной устойчивости к фитопатогенам (Raskin, 1990; Habe, 2003). Обнаружены флюоресцирующие псевдомонады, использующие в качестве источника углерода и энергии салицилат, но не нафталин (Сазонова, 2008). В некоторых случаях эта метаболическая активность сочетается со способностью деградировать капролактам (Kulkarni, 1998; Сазонова, 2008), который широко используется для производства капрона (нейлона-6) и полиамидных пластмасс и является токсичным ксенобиотиком, вызывающим дерматиты и хромосомные аберрации у млекопитающих (Tuma, 1981; Norppa, 1989).

Однако генетические детерминанты биодеградации салицилата и капролактама у таких штаммов не изучены.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в молекулярно-генетическом анализе изменений состава бактериальных сообществ в условиях загрязнения устойчивыми органическими соединениями и исследовании плазмид биодеградации.

В соответствии с целью работы были определены следующие конкретные задачи:

1. Оценить изменение состава сообщества микроорганизмов-деструкторов нефтешламов при их обезвреживании в проточном биореакторе.

2. Проанализировать изменение состава почвенного микробного сообщества после загрязнения почвы различными поллютантами.

3. Исследовать динамику присутствия ключевых генов биодеградации нафталина (паИАс и nahH) в ДНК почвы, загрязнённой модельным соединением (нафталином).

4. Выделить и охарактеризовать штаммы-деструкторы нафталина из образцов загрязнённой почвы и нефтешламов.

5. Выделить и охарактеризовать плазмиды биодеградации нафталина, салицилата и капролактама и провести поиск новых генов салицилатгидроксилазы.

Научная новизна. Метод Box-PCR выявил изменение состава популяции бактерий-деструкторов нефтешламов при их детоксикации в проточном биореакторе. С применением ДГГЭ показано, что в результате загрязнения нефтью, дизельным топливом и диоктилфталатом в почве чаще всего доминируют протеобактерии (в частности, рода Pseudomonas), а при загрязнении нафталином - актинобактерии (в частности, рода Arthrobacter), постепенно замещающие протеобактерий.

Из загрязнённой нафталином почвы впервые выделены две природные ассоциации бактерий родов Paenibacillus и Pseudomonas, в которых псевдомонады являются деструкторами нафталина и содержат NAH-плазмиды P-9-группы несовместимости, а пенибациллы продуцируют естественные носители экзополисахариды (ЭПС), улучшающие выживаемость псевдомонад в неблагоприятных условиях среды.

Впервые описаны плазмиды биодеградации салицилата, поддерживаемые в бактериях рода Pseudomonas, не обладающие nah2-опероном и несущие только «неклассический» ген салицилат-1-гидроксилазы nahlJ.

Впервые установлено, что генетические детерминанты биодеградации капролактама и салицилата у штаммов псевдомонад, способных деградировать оба эти соединения, находятся в составе крупных конъюгативных SAL/CAP-плазмид, часть из которых относится к P-7-группе несовместимости.

В составе SAL/CAP-плазмид обнаружен и частично секвенирован новый ген салицилат-1 -гидроксилазы - scpA, который идентичен известным последовательностям не более чем на 72-74% и филогенетически примерно равноудален от ближайших гомологов - генов nahG (NAH7), salA (P. reinekei MT1) и иаШ (pND6-l).

Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты позволяют расширить знания об адаптационном потенциале незагрязнённых почв и помогают установить закономерности ответа природных сообществ на специфические загрязнения.

Составление лабораторных микрокосмов в комплексе с ДГГЭ-анализом генов 16S рРНК и ПЦР-анализом тотальной ДНК почвы на наличие ключевых генов биодеградации ароматических углеводородов может быть перспективным методом для моделирования природных загрязнённых экосистем и исследования изменений их бактериальных сообществ. Эти подходы вместе со стандартными микробиологическими методами существенно облегчают изучение динамики активной популяции бактерий-деструкторов во время процесса биоремедиации in situ и мониторинг их маркерных метаболических генов, связанных с процессом деградации углеводородов нефти.

Факт существования в природе ассоциаций бактерий родов Paenibacillus и Pseudomonas даёт возможность их изучения на предмет использования пенибацилл в составе биопрепаратов для биоремедиации загрязнённых ароматическими соединениями почв.

Специфические праймеры для детекции генов салицилатгидроксилазы salA и scpA, подобранные в ходе исследования, могут быть использованы для обнаружения и характеристики штаммов-деструкторов УОС, для мониторинга популяций

деструкторов в загрязнённой почве, а также для дальнейшего изучения структуры эа1-оперона плазмид деградации салицилата/капролактама.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи и 7 публикаций в сборниках трудов конференций. Результаты были представлены на 8-й, 13-й и 15-й международных школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2004, 2009 и 2011 гг.), семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2003» (Пущино, 2003 г.), международной экологической школе-семинаре «Экология 2004: эстафета поколений» (Пущино, 2004 г.), всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2010» (Тула, 2010 г.) и всероссийской молодёжной школе-конференции «Актуальные проблемы биологии и химии» (Пущино, 2012 г.).

Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре лабораторий молекулярной микробиологии и биологии плазмид ФГБУН Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы» и «Приложение». Библиография насчитывает 195 наименований. Работа включает 15 таблиц и 21 рисунок.

Благодарности

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю к.б.н. Ирине Адольфовне Кошелевой, а также заведующему лабораторией биологии плазмид чл.-корр. РАН, д.б.н. Александру Михайловичу Воронину, за помощь и конструктивные замечания при обсуждении результатов. Благодарю сотрудников лаборатории за помощь в постановке некоторых экспериментов. Также признателен оппонентам и рецензентам за критические замечания и обсуждение работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изменение состава сообщества бактерий-деструкторов ароматических соединений нефтешламов до и после их обезвреживания в проточном биореакторе

Выделение и характеристика бактерий до и после обработки нефтешламов в ферментёре

При высеве образцов нативных нефтешламов ОАО «Нижнекамскнефтехим» на среду TSA (триптонно-соевый агар) общая численность аэробных культивируемых гетеротрофных микроорганизмов составила 6 х 107 КОЕ (колониеобразующих единиц) /г нефтешламов. Известно, что обезвреживание в биореакторе является эффективным способом биоремедиации ex situ, где оптимальный результат достигается за счёт управления скоростью роста бактерий, пределами роста микробного сообщества и степенью трансформации загрязнителя (Van Hamme, 2003). При этом большой интерес представляет изучение изменения состава популяции бактерий-деструкторов в процессе обработки нефтешламов в биореакторе.

После непрерывного культивирования в ферментёре «АНКУМ ЮМ» в течение 30 суток общая численность аэробных культивируемых гетеротрофных микроорганизмов, выделенных на среде TSA, составила 2><108 КОЕ/мл нефтешламов. Различие на порядок количества высеваемых микроорганизмов по сравнению с нативными нефтешламами, вероятно, связано с аэрацией при культивировании и с образованием интермедиатов в процессе биодеструкции нефтешламов, которые активно утилизировались микроорганизмами, присутствующими в исходных нефтешламах в минорных количествах. При этом происходило увеличение их численности и доли в общей популяции.

Изменения микробного сообщества нефтешламов до и после обезвреживания исследовались на примере культивируемых бактерий-деструкторов нафталина (nah) и БТЭК (смесь бензола (ben), толуола (toi), этилбензола (eb) и кслилолов (m-, p-, o-xyl) ), используемых в качестве единственного источника углерода и энергии. Эти субстраты были выбраны, поскольку входят в состав нефтешламов, причём нафталин относится к классу трудноразлагаемых полициклических углеводородов, а смесь БТЭК - к трудноразлагаемым токсическим моноароматическим углеводородам.

Методом прямого высева из нативных нефтешламов на селективные среды было отобрано 5 морфологически различных колоний с чашек с БТЭК (ВТЕХ1-5) и 5 колоний с чашек с нафталином (Nah 1-5). По результатам анализа штаммов на способность к росту на различных субстратах было выделено две пары фенотипически сходных штаммов: ВТЕХ1 и ВТЕХ4 (eb+, p-xyl+), Nah2 и Nah3 (nah+, tol+, eb+).

Методом прямого высева после ферментации было отобрано 10 морфологически различных типов колоний с чашек с БТЭК (fBTEXl- fBTEXlO) и 5 колоний с чашек с нафталином (fNahl- fNah5). Среди исследованных штаммов было обнаружено несколько фенотипически сходных между собой: fBTEX2, fBTEX3 и fBTEX5 (eb+); fBTEX8 и fBTEX9 (tol+, benz (бензоат)+); fNah4 и fNah5 (nah+).

Молекулярно-генетический анализ штаммов, выделенных из нефтешламов

Для дальнейшей характеристики выделенных штаммов использовали генотипирование (фингерпринтинг) методом Вох-ПЦР с праймером BoxAlR. Данный метод выявил сходство некоторых штаммов в каждой группе (рис. 1). Вох-ПЦР профили идентичных штаммов показаны на дорожках:

- 1 и 4 (штаммы ВТЕХ1 и ВТЕХ4),

- 17 и 18 (Nah2 и Nah3).

Остальные штаммы отличались друг от друга.

Таким образом из нативных нефтешламов получено 4 различных штамма, утилизирующих БТЭК, и 4 различных штамма, растущих на нафталине, после обезвреживания в биореакторе — 10 на БТЭК и 5 на нафталине. То есть из обезвреженных нефтешламов было выделено большее количество микроорганизмов-деструкторов БТЭК и нафталина, чем из нативных нефтешламов. При этом штаммы из обоих сообществ генотипически отличались друг от друга (рис. 1).

Следует отметить, что после обработки нефтешламов в модельной системе были выделены микроорганизмы-деструкторы, отличные от выделенных до культивирования. Видимо, аэрация в биореакторе и добавление источников азота и фосфора позволяют минорной группе микроорганизмов-деструкторов более активно метаболизировать углеводороды нефтешламов и в результате доминировать в популяции.

А Б А Б

БТЭК нлфталнн

Рис. 1. Вох-ПЦР с тотальной ДНК выделенных штаммов. А - штаммы, выделенные до культивирования в ферментёре; Б - штаммы, выделенные после культивирования в ферментёре. М- 1 kb DNA ladder; 1-5 - ВТЕХ1-5; 6-15 - fBTEXl-IO; 16-20- Nahl-5; 21-25 -fNahl-5.

Использованные в работе молекулярные методы анализа позволили наиболее полно охарактеризовать состав бактериальных сообществ нативных и обезвреженных нефтешламов. С помощью Вох-ПЦР удалось разделить штаммы, сходные фенотипически, но имеющие различные генотипы.

2. Влияние загрязнения устойчивыми органическими соединениями на состав почвенного микробного сообщества

Динамика численности аборигенных штаммов в загрязнённой почве

Исследование лабораторных модельных почвенных систем (МПС), или почвенных микрокосмов, даёт возможность понять, как бактериальные сообщества почв отвечают на специфические загрязнения, и помогает устанавливать закономерности в поведении и функционировании природных сообществ при таких загрязнениях.

В качестве «экологически чистой» была взята пойменная почва в окрестностях г.Пущино Московской области. Почву проанализировали на наличие в ней бактерий-деструкторов нефтепродуктов путём высева из стандартных серийных разведений на агаризованные минеральные среды с каждым из поллютантов, использованных в

дальнейших экспериментах в качестве единственного источника углерода и энергии. В результате общая численность аэробных культивируемых гетеротрофных бактерий была определена на уровне 2х10б КОЕ микроорганизмов, из них 1,5Х104 КОЕ -флуоресцирующие бактерии (к которым относятся и псевдомонады). Аборигенных штаммов, способных к утилизации нефтепродуктов, из исследованных проб почвы изолировано не было. По-видимому, их численность составляла менее 102 КОЕ/г почвы, т.е. менее предельной величины детектирования бактерий стандартными микробиологическими методами (Molina et al., 2000).

Эксперимент длительностью 21 день проводили в чашках Петри, содержащих по

20 г почвы. В качестве загрязняющих агентов использовали нафталин (вариант I) - 1 мг/г почвы, дизельное топливо (ДТ, вариант II) - 2 мкл/г почвы, нефть (вариант III) - 2 мкл/г почвы, диоктилфталат (ДОФ, вариант IV) - 2 мкл/г почвы. Каждый вариант был выполнен в трёх повторах. Пробы отбирали в начале эксперимента и далее на 3, 10 и

21 сутки. Нафталин и в дальнейших экспериментах использовали как модельное соединение, поскольку он является низкомолекулярным ароматическим углеводородом, широко распространённым в природе.

Общая численность аэробных бактерий к 21-му дню эксперимента во всех вариантах повысилась и достигла 107-108 КОЕ/г почвы. В ответ на загрязнение численность Nah+ штаммов возрастала уже на третьи сутки более чем на два порядка и достигала 103 КОЕ/г почвы. На 21 сутки численность деструкторов нафталина в вариантах II и IV (почва + ДТ и почва + ДОФ соответственно) поддерживалась на том же уровне, в варианте III (почва + нефть) увеличилась до 104 КОЕ/г почвы, а в варианте I (почва + нафталин) - до 105 КОЕ/г почвы. Численность деструкторов нефти, ДТ и ДОФ в течение эксперимента также возрастала во всех вариантах, однако выше 6,lx10J КОЕ/г почвы к 21 суткам не поднималась. Очевидно, что в исходной почве изначально имелся некоторый низкий пул бактерий-деструкторов разнообразных УОС, не выявляемый стандартными микробиологическими методами. Загрязнение почвы привело к росту численности как специфичных по отношению к использованному в каждом конкретном варианте загрязнителю деструкторов, так и деструкторов других поллютантов, хотя и в меньшей степени. В то же время количество бактерий-деструкторов нафталина значительно возрастало в почвах, загрязнённых как самим нафталином, так и нефтью. Напротив, внесение в почву диоктилфталата и ДТ

одинаково влияло на рост численности деструкторов всех использованных в эксперименте соединений.

Изменение состава почвенного бактериального сообщества в течение эксперимента

Методом, который позволяет с высокой точностью проследить изменения состава бактериальных сообществ в различных экосистемах под воздействием разнообразных стрессовых факторов, является денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ) (Миугег, 1993). С помощью ДГГЭ исследуются гены 168 рРНК всех представителей бактериального сообщества, что даёт возможность определить их родовую принадлежность.

ДГГЭ-анализ 168 рДНК, амплифицированной из тотальной почвенной ДНК, выявил изменение состава почвенных бактериальных популяций под воздействием используемых в работе соединений. В незагрязнённой почве бактериальное сообщество характеризовалось большим видовым разнообразием и отсутствием ярко выраженных доминантных групп (рис. 2). В эксперименте на фоне увеличения общей численности микробной популяции мы обнаружили снижение видового разнообразия.

Рис. 2. ДГГЭ продуктов амплификации генов 16в рРНК из препаратов суммарной ДНК почвы. К - почва (0 день); 1 - почва + нафталин (3 день); 2 - почва + нафталин (21 день); 3 - почва + ДТ (3 день); 4 - почва + ДТ (21 день); 5 - почва + нефть (3 день); 6 - почва + нефть (21 день); 7 - почва + ДОФ (3 день); 8 - почва + ДОФ (21 день).

Мажорные полосы на ДГГЭ-профиле представляют собой 168 рДНК бактерий, доминирующих в популяции в момент отбора проб. Секвенирование ДНК. выделенной из мажорных полос ЛІ, оі, сіоґі (рис. 2), выявило, что в образцах почв, загрязнённых нефтью, дизельным топливом и диоктилфталатом, уже с третьего дня и до завершения

эксперимента доминировали бактерии рода Pseudomonas (сходство последовательности амплифицированного фрагмента 16S рДНК составляло 98% с 16S рДНК штамма Pseudomonas sp. CL1.82). В МПС, загрязнённых нафталином, на третий день в популяции доминировали два рода бактерий - грамотрицательные Pseudomonas (полоса nl, сходство 98% с последовательностью 16S рДНК штамма Pseudomonas sp. CL1.82) и грамположительные Paenibacillus (полоса п2, сходство 99% с последовательностью 16S рДНК штамма Paenibacillus sp. Lai). К 21-му дню эксперимента произошли кардинальные изменения в составе сообщества: доминирующим таксоном являлся уже актинобактериальный род Arthrobacter (полоса пЗ, сходство последовательности амплифицированного фрагмента 16S рДНК составляло 93% с последовательностью 16S рДНК штамма Arthrobacter sp. S6), который, однако, к тому моменту ещё не полностью заместил в популяции протеобактерий, на что указывает присутствие соответствующих им слабых полос на дорожках №2 ДГГЭ-профиля (рис. 2).

Динамика присутствия генов nahAc и nahH в загрязненной почве

Биодеградативный потенциал почвы определяется присутствием в ней бактерий-деструкторов. Поскольку из загрязнённых нефтепродуктами почв часто выделяют микроорганизмы-деструкторы нафталина, на основе консервативных последовательностей ключевых генов деградации нафталина nahAc и nahH были подобраны праймеры, специфичные к генам большой субъединицы нафталин-1,2-диоксигеназы, имеющей обычно широкую субстратную специфичность, и катехол-2,3-оксигеназы большинства штаммов грамотрицательных микроорганизмов (Zhou et al., 2006; Meyer et al., 1999). Авторы этих исследований заключили, что для оценки биодеградативного потенциала микробного сообщества в природных образцах с успехом могут использоваться последовательности указанных генов.

До внесения нафталина в почву ни в одном из экспериментальных вариантов ключевые гены биодеградации нафталина не были обнаружены. В ответ на загрязнение нафталином в почве увеличивалось количество утилизирующих нафталин бактерий. Одновременно увеличивалось и содержание ключевых генов катаболизма нафталина - nahAc и nahH (рис. 3). Данный факт является косвенным свидетельством того, что концентрация обоих катаболических генов увеличивалась в почве за счёт плазмидосодержащих штаммов, поскольку гены мета- пути, как правило,

локализуются на плазмидах биодеградации, тогда как гены «верхнего» оперона пути утилизации нафталина, включая nahAc, могут быть как плазмидными, так и хромосомными (Zylstra. 1997). Гены nahAc и nahH детектировались и на 21 сутки, когда в почве доминировали бактерии рода Arthrobacter, которые содержат гены катаболизма ароматических углеводородов, негомологичные псевдомонадным. Такой результат связан с тем, что к концу эксперимента в почвенном сообществе актинобактерии ещё не полностью заместили бактерий Pseudomonas sp. (дорожки №2 на рис. 2).

Праймеры, использованные в настоящей работе, не позволяют обнаружить гены, неродственные nah- генам флуоресцирующих псевдомонад, в том числе изофункциональные гены бетапротеобактерий (например, рода Burkholderia) и актиномицетов (в частности, бактерий рода Arthrobacter), а также гены анаэробной деградации ароматических углеводородов (Beller, 2002). Поэтому не исключено присутствие в исследованной нами почве других микроорганизмов-деструкторов нафталина, таких как обнаруженный посредством ДГГЭ Arthrobacter sp., содержащих гены нафталин-1,2-диоксигеназы, негомологичные гену nahAc.

А _

■В- ■-

0 3 10 21 К L 0 3 10 21

nahAc nahH

Б

Рис. 3. Электрофореграмма амплификации генов пак Ас и паИН (А) из препаратов суммарной почвенной ДНК, отобранной на 0, 3, 10 и 21 сутки эксперимента из МПС I (почва + нафталин). (Б) ДНК-ДНК-гибридизация продуктов амплификации с ВЮ-мечеными пробами паИАс и пакН. К -рМЧ42.

0 3 10 21 К 0 3 10 21

nahAc nahH

ДГГЭ-анализ генов 168 рРНК в сочетании с ПЦР-анализом тотальной ДНК почвы на наличие основных генов биодеградации ароматических углеводородов позволил установить, что бактериальные сообщества в местах загрязнения менее разнообразны, и их состав и степень разнообразия зависят от вида загрязнителя и от длительности его

воздействия. В эксперименте мы наблюдали увеличение общей численности почвенных микроорганизмов после внесения загрязнителя, что происходило, в том числе, и за счёт бактерий, неспособных к его деградации. Проведённое нами исследование микробных сообществ загрязнённых экосистем выявило тенденцию к доминированию микроорганизмов, способных к утилизации токсических загрязнителей (Pseudomonas sp., Arthrobacter sp.) или, как минимум, к выживанию в их присутствии (Paenibacillus sp.).

Что касается динамики бактериальных сообществ, то на основании полученных нами данных и данных работ (Greene, 2000; Hendrickx, 2005; Gomes, 2005) можно предположить, что при загрязнении среды нефтью, дизельным топливом, БТЭК, бензином, диоктилфтапатом чаще всего доминируют протеобактерии, а в местах, где основными поллютантами являются нафталин и его производные - актинобактерии, постепенно замещающие протеобактерии. При этом в утилизации нафталина существенную роль могут играть плазмиды, содержащие гены биодеградации этого соединения.

3. Бактерии, выделенные из загрязнённой нафталином ночвы

Изоляция и характеристика почвенных бактерий

Выделение штаммов микроорганизмов-деструкторов и их изучение позволяет ответить на вопрос о том, какие генетические системы наиболее распространены в природе. Из варианта МПС I (почва + нафталин) на третьи сутки почвенного эксперимента методом прямого высева из почвы на минеральную среду с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии были выделены два отдельных штамма бактерий-деструкторов нафталина (NZ3.1, NZ3.2) и две трудноразделимые бактериальные ассоциации. После разделения ассоциаций было выяснено, что каждая из них состоит из штамма-деструктора нафталина (N02 и N04) и штамма, не потребляющего нафталин (NOl и N03). Все отобранные штаммы-деструкторы были способны к росту на жидких и агаризованных средах с нафталином и салицилатом, а также флуоресцировали на среде Кинга В. Штаммы N01 и N03 не флуоресцировали на среде Кинга В и росли как на агаризованных средах с нафталином и салицилатом, так и на чистой агаризованной минеральной среде, т.е. потребляли агар в качестве источника углерода и энергии, а ароматические углеводороды в

используемой концентрации для них токсичны не были. В жидких же средах с нафталином и салицилатом данные штаммы не росли.

Видовую принадлежность штаммов предварительно определяли с использованием ARDRA (amplified ribosomal DNA restriction analysis, рестрикционный анализ амплифицированной рибосомной ДНК) продуктов амплификации гена 16S рРНК с использованием ферментов Rsal и Mspl (Hpall). Рестрикционные фрагменты 16S рДНК разделяли электрофоретически в 1,5%-ном агарозном геле. В качестве контрольных видов использовали: Pseudomonas putida, P. fluorescens, P. chlororaphis, P. aeruginosa и P. aureofaciens. На основании ARDRA штаммы-деструкторы нафталина были предварительно отнесены к виду P. fluorescens. Рестрикционные профили штаммов N01 и N03 отличались от профилей псевдомонад, однако продемонстрировали сходство между собой. Для определения родовой принадлежности данных штаммов были секвенированы ПЦР-фрагменты их 16S рДНК размером 838 п.н. (частичная последовательность гена 16S рРНК штамма N01 была депонирована в GenBank под номером JF438971). В результате штаммы были отнесены к роду Paenibacillus (сиквенс ПЦР-продуктов был на 99% идентичен соответствующей области гена 16S рРНК Paenibacillus sp. Lai). Результаты кластерного анализа, который проводили в программе TREECON (Van de Peer, 1994), показали, что штаммы N01 и N03 образуют группу с несколькими штаммами пенибацилл, в том числе и со штаммами вида Paenibacillus humicus (рис. 4).

Для дальнейшей характеристики всех выделенных штаммов использовали метод генотипирования (Вох-ПЦР) с использованием праймера BoxAIR (Dombek, 2000). Вох-ПЦР показала, что штаммы N02 и N04 идентичны, но отличны от других. Все остальные штаммы также отличались друг от друга. Таким образом, вероятно, N02 и N04 представляют собой один штамм вида P. fluorescens.

Как выяснилось, каждая из выделенных бактериальных ассоциаций состоит из штамма-деструктора вида P. fluorescens и штамма, относящегося к роду Paenibacillus, причём штамм псевдомонад в обеих ассоциациях один и тот же, а штаммы пенибацилл - разные.

0.1

ч

13 [

40

Ml' F

Patnibacillus hamicas Fml (CU391497.1) Pamibacillus hamicos PC-147T (AMU1528J) Paenibacillus húmica; PC-142 (AM-111529.2) Paeaibacillus sp. Ijíiy2003-j-«7(AY51í676.1) Paenibacillus sp.Lal (ЛМ906090.1) Paeaibacillus sp. P22 (AM906085.1) PaeQibacillas sp. Ma-2 (AM50Í089.1) Paenibacillus sp. tjsi)2003-f-4 (AYS18675.1)

100|-Paenibacillus sp. GT-L27 (GQ355278.1)

I-Paenibacillus sp. 4GHO«-03(AM162304.1)

98

- Patnibacilfus gioseogaoi(AB271057.1)

Paenibacillus sp. N01 (JT438971)

- Pafnibanllus naphlhaknovoians PR N1 (NK028817.1)

Рис. 4. Дендрограмма, иллюстрирующая эволюционное родство между нуклеотидными последовательностями генов 16S рРНК штамма N01 и других штаммов рода Paenibacillus. График построен в программе TREECON. В скобках указаны номера сиквенсов в GenBank.

Одной из особенностей пенибацилл является продукция экзополисахаридов (ЭПС) (Aguilera, 2001; Kozyrovska, 2005). H.A. Козыровская с соавторами (Kozyrovska, 2005) показали, что в искусственно созданной ассоциации бактерий Paenibacillus sp. IMB G156 и Р. fluorescens АТСС 13525 псевдомонады лучше переживали условия длительного культивирования, а концентрация их клеток после 30-часового выращивания была выше на 2 порядка, чем в монокультуре Р. fluorescens, и на порядок, чем концентрация клеток других видов псевдомонад в смешанной с пенибациллами культуре. Такой эффект был обусловлен тем, что ЭПС, синтезируемые пенибациллами штамма IMB Gl56 в количестве ~10 г/л, являются природным носителем для псевдомонад, позволяя последним лучше переносить неблагоприятные условия среды. Чтобы определить количество ЭПС, вырабатываемых штаммами NOl и N03, мы использовали стандартную методику (Егоров, 1995) и получили следующие концентрации: для штамма NOl - 1 г/л, для N03 - 5 г/л. Выращивание в течение 30 часов каждого из этих штаммов со штаммом Р. fluorescens N02 показало, что концентрация клеток псевдомонад в смешанной с пенибациллами культуре была в

среднем на порядок выше, чем в монокультуре. Таким образом, весьма вероятным является образование природных ассоциаций пенибацилл и псевдомонад именно благодаря наличию ЭПС. Отсутствие литературных данных об обнаружении таких ассоциаций в естественных условиях позволяет утверждать, что природные ассоциации бактерий Paenibacillus sp. и P. fluorescens были выделены нами впервые. Вполне возможно, что использование подобных бактериальных ассоциаций при биоремедиации загрязнённых УОС почв повысит эффективность очистки за счёт лучшей выживаемости P. fluorescens и устойчивости бактерий Paenibacillus sp. к токсическому воздействию УОС.

Генетический контроль биодеградации нафталина у выделенных штаммов

Из штаммов Р. fluorescens N02, N04, NZ3.1 и NZ3.2 были выделены плазмиды размером около 100 т.п.н. На основании данных ПЦР-анализа с праймерами, специфичными к Р-7 и Р-9 репликонам (типичным для NAH-плазмид), изолированные плазмиды были отнесены к Р-9 группе несовместимости. Для определения различий между исследуемыми плазмидами проводили RFLP-анализ (restriction fragment length polymorphism, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов) с использованием эндонуклеазы рестрикции EcoRI. Результаты анатиза показали, что pN02, pN04 и pNZ3.2 — идентичны, но отличаются по рестрикционным профилям от плазмиды pNZ3.1. Путём конъюгации плазмиды были перенесены в штамм P. putida КТ2442. Полученные трансконъюганты обладали способностью к росту на минеральных средах с нафталином, следовательно, исследуемые плазмиды — конъюгативны и несут все необходимые гены деградации нафталина.

Для анализа ключевых генов биодеградации нафталина у исследуемых штаммов были выбраны гены nahAc, nahG, nahH и nahR, кодирующие большую субъединицу нафталин-1,2-диоксигеназы, салицилат-1-гидроксилазу, катехол-2,3-диоксигеназу и регуляторный белок, соответственно. В итоге было выяснено, что исследованные плазмиды содержат все ключевые гены утилизации нафталина. Для определения типов генов большой субъединицы нафталин-1,2-диоксигеназы, которые несут исследуемые плазмиды, проводился гидролиз ПЦР-продуктов размером 865 п.и. ферментом НаеШ. Полученные фрагменты разделяли в 1,5%-ном агарозном геле и сравнивали с картой гидролиза известных последовательностей гена nahAc. Анализ рестрикционных профилей показал, что изучаемые плазмиды содержат ген nahAc, относящийся к типу

С18. Результаты гидролиза ПЦР-продуктов гена nahG размером 893 п.н. эндонуклеазами рестрикции MspI (Hpall) и Rsal показали, что у исследуемых плазмид ген салицилат-1-гидроксилазы подобен гену nahG плазмиды pDTGl (тип pDTGl).

Таким образом, выделенные бактерии-деструкторы нафталина содержали плазмиды группы несовместимости Р-9, несущие все необходимые для утилизации нафталина гены (nahAc, nahG, nahH и nahR), причём три плазмиды из четырёх (pN02, pN04 и pNZ3.2) оказались идентичны. Факт обнаружения одной и той же плазмиды в двух разных штаммах свидетельствует о том, что в почвенном бактериальном сообществе происходит горизонтальный перенос плазмид.

4. SCPA - новый ген салицилатгидроксилазы, локализованный на плазмидах деградации салицилата/капролактама

Плазмиды бнодеградации салицилата

Для экзогенной изоляции конъюгативных плазмид биодеградации салицилата из варианта МПС I (почва + нафталин) на третьи сутки почвенного эксперимента использовали бесплазмидный штамм Pseudomonas putida КТ2442. Данный штамм имеет дефектную систему рестрикции чужеродной ДНК и встроенный в хромосому ген gfp (зелёного флюоресцирующего белка), что позволяет легко отличать его колонии от колоний других бактерий на твёрдых средах (Regenhardt et al., 2002). Культуру Р.putida КТ2442 смешивали с ресуспендированной в среде LB почвой и, подрастив смесь на агаризованной среде LB в течение 24-х часов, высевали на селективные среды. В результате получили пять трансконъюгантов, способных к росту на салицилате, которые в дальнейшем были проверены на способность к росту на различных селективных средах. Выяснилось, что два трансконъюганта в качестве единственного источника углерода и энергии использовали также е-капролактам -КТ2442 (pScpl) и КТ2442 (pScp2), а три штамма КТ2442 (pSl), КТ2442 (pS2) и КТ2442 (pS3) росли исключительно на салицилате. Из всех трансконъюгантов были выделены плазмиды, три из которых (pSl, pS2 и pS3) оказались одинакового размера (более 50 т.п.н.). RFLP-анализ с использованием эндонуклеаз рестрикции EcoRI и BamHl показал, что эти плазмиды сходны, если не идентичны. Плазмиды биодеградации салицилата/капролактама существенно различались по размеру: pScpl - менее 40

т.п.н., pScp2 - более 70 т.п.н. По результатам ПЦР ни одна из пяти выделенных плазмид не была отнесена к 1псР-7 или IncP-9-группам.

Для изучения распространения SAL/CAP-плазмид проводили экзогенную изоляцию плазмид ещё из нескольких образцов почв, загрязнённых нефтепродуктами. В результате были получены три штамма-деструктора салицилата и капролактама Р.pulida КТ2442 с плазмидами рЕх4, pNP6, pNP7. В дальнейшей работе вместе с плазмидами pSl, pS2 и pS3, контролирующими катаболизм салицилата (но не нафталина), и pScpl, pScp2, рЕх4, pNP6 и pNP7, обеспечивающими биодефадацию как салицилата, так и капролактама, были использованы SAL/CAP-плазмиды из коллекции ЛБП ИБФМ РАН (также поддерживаемые в лабораторном штамме КТ2442): pBS270,. pS6f. С помощью ПЦР было установлено, что три из SAL/CAP-плазмид (pBS270, pS6f, рЕх4) принадлежат к P-7-группе несовместимости.

Идентификация гена салицилатгидроксилазы, локализованного на плазмидах биодеградации еалицилата/капролактама

Амплификация «классических» генов плазмидных оперонов биодеградации нафталина и салицилата (nahAc, nahG, nahH и nahR) у всех исследованных плазмид не наблюдалась. Видимо, они кодировали «неклассический» путь биодеградации салицилата, поскольку ПЦР не выявила ни одного из генов оперона nahl. Ранее в нашей лаборатории были подобраны праймеры, специфичные к уникальной последовательности гена салицилатгидроксилазы nahU, находящегося далеко за пределами оперона nah2 плазмиды биодеградации нафталина pND6-l (IncP-7) (Сазонова, 2008). Амплификация с этими праймерами оказалась положительной для трёх плазмид деградации салицилата, исследуемых в данной работе - pSl, pS2 и pS3. Фрагменты размером 654 п.н. были выделены из агарозного геля и подвергнуты гидролизу эндонуклеазой Rsal. Рестрикционная картина всех трёх ампликонов соответствовала таковой nahU pND6-l. Таким образом, нами впервые описаны плазмиды биодеградации салицилата, не содержащие иа/г2-оперон и несущие только ген nahU. Ни на одной из SAL/CAP-плазмид ген nahU не был обнаружен. Достаточно редкий для плазмид псевдомонад (Измалкова, 2005) вариант - ген большой субъединицы салицилат-5-гидроксилазы (nagG), трансформирующей салицилат в гентизат, также не удалось амплифицировать.

Анализ нуклеотидных последовательностей генов салицилатгидроксилаз, депонированных в ОепВапк за последние 2-3 года, выявил филогенетически удаленный от всех известных вариантов ген ха1А штамма Р. ге1пеке! МТ1. На основе сиквенса ад/Л мы разработали праймеры Ба1АР и за1АЯ для поиска соответствующего гена у 8АЬ/САР-плазмид. Амплификация с новыми праймерами оказалась недостаточно специфичной, однако с помощью программы рБЯАШ было установлено, что праймер эа1АР можно при определенных условиях заменить праймером паЬСи_244Г, разработанным для гена паки. Положительный результат амплификации (фрагменты размером около 500 п.н.) наблюдали во всех случаях, где матрицами служили 8АЬ/САР-плазмиды; в то же время, гены паки и паИй (контрольные варианты) с этой парой праймеров не были амплифицированы (рис. 5). Амплифицированные фрагменты плазмид р8ср1, р8ср2 и рВ8270 были выделены из геля и секвенированы в двух направлениях. Обнаруженный ген салицилатгидроксилазы получил название ясрЛ (вер - от «8а1юу1а1е/сарго1ааате р1азт1с1»).

Рис. 5. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами nahGU_244f и salAR. М

- 50 bp DNA ladder; 1 - pN02 (отрицательный контроль, содержит ген nahG)\ 2 - pS3 (отрицательный контроль, содержит ген nahU); 3 - pScpl; 4 - pScp2; 5 - pBS270; 6 - pS6f; 7 -pEx4; 8 - pNP6; 9 - pNP7.

Филогенетический анализ нового гена салицилат-1-гидроксилазы scpA

Точная нуклеотидная последовательность была определена для 440 п.н. гена салицилатгидроксилазы трех SAL/CAP-плазмид - pScpl, pScp2. pBS270 и депонирована в GenBank под номером JQ926744. Оказалось, что внутренние части гена scpA этих плазмид абсолютно идентичны. Кроме того, рестрикционная картина

амплифицированных фрагментов всех SAL/CAP-плазмид, обработанных эндонуклеазой Rsal, была идентична. Интересно, что исследованные плазмиды выделены в разное время из аборигенной микрофлоры удалённых друг от друга регионов и сайтов различной степени загрязнённости, a pBS270 и вовсе «почётный член» первой в мире группы САР-плазмид, выделенных сотрудниками нашей лаборатории более 20 лет назад из почв, загрязнённых отходами предприятий по производству капролактама. Таким образом, ген салицилатгидроксилазы scpA, по крайней мере, его внутренняя часть, выглядит консервативным у целой группы SAL/CAP плазмид, независимо от места и времени выделения этих внехромосомных элементов.

0.1

nahG Pstudomtmtts amtgitiosa ССМСС 1.860 (шиши«] phsmjd). GQ396161.1 nihG Pseudomonuí JlHorfsCfíu A8$. AY433938.1 - nihG Psrudemmes sp. G7 (NAII7). AB2376Í5.1

* - íscpA(pStpl,pScp2, pBS270). JQ926744 )

- 100

- l'mitamonai rrínrírí MT1. ЛУ94Ш?.2

L 94

- DabU Pseiádomoitas sp. ND6 (pND6-l). AY208917.2

-sgpG Pseuóomonüs pulida AK5 (pAKS). FJ859895.1

r70- nihW Pstudomonas smart AMO. АГ039534.1

34

1- n«sG Rahtonia sp. U2 (p\VWT2). АГ036940.2

Рис. 6. Деидрограмма, иллюстрирующая эволюционное родство между нуклеотидпымц последовательностями гена салицилатгидроксилазы scpA плазмнд pScpI, pScp2, pBS270 и генов других штаммов и плазмид. График построен в программе TREECON. После точек указаны номера сиквенсов в GenBank. Тёмным фоном выделена группа гомологичных салицилат-1-гидроксилаз.

При сравнении нуклеотидной последовательности внутренней части scpA с известными сиквенсами других генов салицилатгидроксилаз в программе BLAST N получили следующие результаты: scpA идентичен salA (P. reinekei МТ1) на 73%, nahll (pND6-l) - на 72% и «классическому» nahG (NAH7) - на 74% (рис. 6). Вычисленная аминокислотная последовательность фрагмента ScpA не более чем на 77% идентична соответствующему фрагменту известных салицилатгидроксилаз.

Активность салицилатгидроксилазы ScpA, кодируемой SAL/CAP плазмидами

Для исследования активностей салицилатгидроксилазы ScpA ' использовали штаммы P.putida КТ2442 (pScpl) и P.putida КТ2442 (pBS270). В качестве субстратов

-[ш

использовали салицилат, 3-, 4- и 5-хлорсалицилаты и 3-, 4- и 5-метилсалицилаты. Результаты измерений представлены в таблице 1. Оказалось, что активность фермента БсрА в отношении замещённых салицилатов зависит от типа и положения заместителя в молекуле салицилата. Максимальную активность (даже выше, чем к незамещённому салицилату) исследуемый фермент проявлял к салицилатам с заместителем в положении 4, несколько ниже - к 5-замещённым и минимальную - к 3-замещённым. В целом, активность фермента была ниже по отношению к хлорсалицилатам, чем к метил салицилатам.

Профиль активностей салицилатгидроксилазы БсрА, кодируемой исследуемыми ЯАЬ/САР-нлазмидами, в большей степени схож с таковым ЫаШ. К сожалению, сравнивать абсолютные значения активностей ферментов разных штаммов, причём измеренных в различных условиях, не представляется возможным, т.к. на результат оказывает влияние даже небольшое расхождение в фазе роста культур. Предположительно, синтез салицилатгидроксилазы всрА не требует индукции, поскольку активности БсрА при выращивании на сукцинате с индукцией салицилатом и без оной были сопоставимы как в случае КТ2442 (р8ср1), так и КТ2442 (рВ8270).

Таблица 1. Активность салицилатгидроксилазы всрА (нМхмин'хмг"' белка) штамма Р. рШЫа КТ2442, содержащего плазмиду р8ср1 или рВ8270. Значения получены при использовании экстрактов индуцированных салицилатом клеток. В скобках указан процент (%) от активности по отношению к салицилату.

Субстрат Плазмиды

р8ср1 рВ8270

салицилат 128 (100) 151 (100)

3-хлор-салицилат 40 (31) 81 (54)

4-хлор-салицилат 96 (75) 118(78)

5-хлор-салицилат 62 (48) 88 (58)

3-метил-салицилат 70 (55) 83 (55)

4-метил-салицилат 165 (128) 214(142)

5-метил-салицилат 117(91) 135 (90)

Так как продуктом реакции, осуществляемой салицилат-1-гидроксилазами, является катехол, были измерены и активности катехол-1,2-диоксигеназы и катехол-2,3-диоксигеназы штамма Р. рш'к!а КТ2442 с плазмидами р8ср1 или рВ8270. Активность фермента катехол-2,3-диоксигеназы не фиксировалась, что подтверждает полученные нами отрицательные результаты амплификации гена паЬН. Активность

катехол-1,2-диоксигеназы штамма Р. putida КТ2442 с плазмидами pScpl или pBS270 имела высокие значения - 553 нМхмин'хмг"1 белка и 187 нМхмин"'хмг"' белка, соответственно. ПЦР с праймерами, специфичными к распространенному варианту гена катехол-1,2-диоксигеназы (catA), была позитивной для всех SAL/CAP-плазмид. Однако это не значит, что ген находится на этих плазмидах, поскольку при выделении плазмид из псевдомонад всегда присутствует примесь хромосомной ДНК хозяина, а в составе хромосомы КТ2442 имеются два гена катехол-1,2-диоксигеназы, один из которых - catA (Nelson, 2002). ПЦР с геномной ДНК природного хозяина плазмиды pS6f - штамма P.ßuorescens S6f (pS6f) не выявила наличия nahH (гена катехол-2,3-диоксигеназы) и catA (гена катехол-1,2-диоксигеназы). Из этого следует, что в составе хромосомы штамма S6f или плазмиды pS6f присутствует ген катехолдиоксигеназы, негомологичный catA и nahH. Поэтому существует вероятность, что трансформация катехола у штаммов КТ2442, содержащих SAL/CAP-плазмиды, контролируется не только хромосомными генами, но и находящимися на плазмидах генами катехолоксигеназы, негомологичными nahH и catA.

ВЫВОДЫ

1. В предложенной модельной системе с использованием проточного биореактора достигнута 30%-ая очистка от нефтепродуктов. Обезвреживание нефтешламов сопровождалось полным изменением состава сообщества бактерий-деструкторов нафталина и БТЭК (смеси бензола, толуола, этилбензола и ксилолов).

2. Загрязнение почв дизельным топливом, диоктилфталатом, нефтью и нафталином вызывало увеличение численности бактериальной популяции. ДГТЭ-анализ генов 16S рРНК из тотальной почвенной ДНК выявил снижение видового разнообразия бактерий после внесения в почву поллютантов. В результате загрязнения нефтью, дизельным топливом и диоктилфталатом в почве доминировали протеобактерии (в частности, рода Pseudomonas), а при загрязнении нафталином -актинобактерии (в частности, рода Arthrobacter), постепенно замещающие протеобактерий.

3. В ответ на загрязнение нафталином в почве увеличивалось содержание ключевых генов его биодеградации - nahAc (большая субъединица нафталин-1,2-диоксигеназы) и nahH (катехол-2,3-диоксигеназа) - одновременно с увеличением количества плазмидосодержащих бактерий, утилизирующих нафталин.

4. Из почвы, загрязнённой нафталином в лабораторных условиях, выделены два штамма-деструктора нафталина P. fluoresces (NZ3.1 и NZ3.2) и две природные ассоциации бактерий рода Paenibacillus и бактерий-деструкторов P.fluorescens (N01-N02 и N03-N04). Штаммы пенибацилл N01 и N03 продуцируют экзополисахариды, улучшающие выживаемость псевдомонад в неблагоприятных условиях среды. Выделенные бактерии-деструкторы нафталина содержат плазмиды группы несовместимости Р-9, несущие все необходимые для утилизации нафталина «классические» гены (nahAc, nahG, nahH и nahR), причём три плазмиды из четырёх (pN02, pN04 и pNZ3.2) идентичны.

5. Выделенные из почвы новые плазмиды pSl, pS2 и pS3 относятся к немногочисленной группе SAL-плазмид, не несут гены «классического» nah2-оперона, но содержат ген салицилат-1-гидроксилазы nahU типа pND6-l.

6. Впервые описан новый тип плазмид биодеградации - SAL/CAP, в составе которых обнаружен новый ген салицилат-1-гидроксилазы - sep Л, идентичный известным последовательностям не более чем на 72-74%. Синтез ScpA не индуцируется салицилатом, фермент имеет широкую субстратную специфичность и наибольшую активность проявляет по отношению к 4-метилсалицилату и незамещенному салицилату.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Гафаров А.Б., Панов A.B.. Филонов А.Е., Воронин A.M. Изменение состава сообщества бактерий-деструкторов ароматических соединений в нефтешламах в процессе их обезвреживания в проточном биореакторе // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. № 2. С. 180-186.

2. Панов A.B.. Волкова О.В., Пунтус И.Ф., Есикова Т.З., Кошелева И.А., Воронин A.M. scpA - новый ген сапицилатгидроксилазы, локализованный на плазмидах деградации салицилата/капролактама // Молекулярная биология. 2013. Т. 47. № 1. С. 116-123.

3. Панов A.B.. Есикова Т.З., Соколов СЛ., Кошелева И.А., Воронин A.M. Влияние загрязнения почвы на состав микробного сообщества// Микробиология. 2013. Т. 82. № 2. С. 239-246.

Тезисы конференций:

4. Гафаров А.Б., Панов A.B., Филонов А.Е., Воронин A.M. Изменение состава сообщества бактерий-деструкторов ароматических соединений в нефтешламах, после их обезвреживания в проточной системе // Труды семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2003» (г. Пущино). 2003. С. 102-103.

5. Панов A.B.. Гафаров А.Б., Филонов А.Е., Воронин A.M. Анализ состава микробной популяции деструкторов ароматических соединений в нефтешламах до и после культивирования в проточной системе // Труды III Международной экологической пущинской школы-семинара «Экология 2004: эстафета поколений» (г. Пущино). 2004. С.11-12.

6. Панов A.B.. Гафаров A.B., Филонов А.Е. Выделение и характеристика бактерий-деструкторов ароматических соединений нефтешламов до и после их обезвреживания в проточной системе // Труды 8-й Международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (г. Пущино). 2004. С. 274.

7. Панов A.B.. Кошелева И.А. Влияние загрязнения нафталином на почвенное микробное сообщество // Труды 13-й Международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (г. Пущино). 2009. С. 206.

8. Панов A.B. Влияние загрязнения почвы на структуру почвенного микробного сообщества // Труды Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2010». (г. Тула). 2010. С. 25.

9. Панов A.B.. Кошелева И.А. Микробные ассоциации, выделенные из загрязнённой нафталином почвы // Труды 15-й Международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (г. Пущино). 2011. С. 34.

10. Панов A.B.. Волкова О.В., Кошелева И.А. Новый ген салицилатгидроксилазы, локализованный на плазмидах деградации салицилата/капролактама // Труды Всероссийской молодёжной школы-конференции «Актуальные проблемы биологии и химии» (г. Пущино). 2012. С. 43.

Отпечатано в ООО «Тайм принт», ИНН 3666175538, г.Воронеж, ул.Карла Маркса, д.67,оф.24 Тираж 80 экз. 10.07.2013г. Заказ 072013

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Панов, Андрей Владимирович, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

ИМЕНИ Г. К. СКРЯБИНА ПУЩИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЕСТЕСТВЕННО-НАУЧНЫЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

04201361050

ПАНОВ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА СООБЩЕСТВ БАКТЕРИЙ-ДЕСТРУКТОРОВ В УСЛОВИЯХ ЗАГРЯЗНЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ ОРГАНИЧЕСКИМИ

СОЕДИНЕНИЯМИ

Специальность 03.02.03 - Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук И. А. КОШЕЛЕВА

ПУЩИНО - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ..........................................................5

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................................................................................................7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................................................................................................12

1. Устойчивые органические соединения (УОС) и загрязнение

окружающей среды..................................................................................................................................................................................................12

1.1. Нефтепродукты и загрязнение окружающей среды................................................................................12

1.2. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ)................................................................13

1.3. Деградация устойчивых органических соединений................................................................................16

1.3.1. Абиотические механизмы деградации..................................................................................................................16

1.3.2. Микробная деградация УОС......................................................................................................................................................16

1.3.3. Восстановление загрязненной среды..........................................................................................................................17

1.3.4. Исследование микроорганизмов-деструкторов УОС......................................................................^

2. ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ РАЗНООБРАЗИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ

устойчивых органических соединений и распространения генов

диоксигеназ ароматических соединений..................................................................................................................22

3. Генетический контроль биодеградации УОС................................................................................................26

3.1. Плазмиды биодеградации....................................................................................................................................................................26

3.2. Гены биодеградации нафталина псевдомонад..................................................................................................29

3.3. Биодеградация салицилата..................................................................................................................................................................30

3.3.1. Генетические системы деградации салицилата псевдомонад и

родственных родов..........................................................................................................................................................................................................32

3.4. Регуляция, распространение и эволюция катаболических оперонов........................34

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................................................................................................36

1. Бактериальные штаммы и плазмиды......................................................................................................................................36

2. Среды, источники углерода и антибиотики................................................................................................................39

3.Нефтешлам ы......................................................................................................................................................................................................................40

4. Биореактор (проточная система) и параметры культивирования..........................................40

5. Почвенный эксперимент..............................................................................................................................................................................40

6. Определение содержания нефтепродуктов в нефтешламах............................................................41

7. Определение концентрации нафталина в почве..................................................................................................42

8. Выделение микроорганизмов-деструкторов УОС прямым высевом..............................42

9. Экзогенная изоляция конъюгативных плазмид....................................................................................................42

10. Выделение экзополисахаридов......................................................................................................................................................43

11. Конъюгация....................................................................................................................................................................................................................43

12. Выделение суммарной ДНК из почвы..............................................................................................................................43

13. Выделение тотальной ДНК..................................................................................................................................................................43

14. Выделение плазмидной ДНК............................................................................................................................................................44

15. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)................................................................................................................................45

16. Визуализация ДНК и выделение ДНК из геля....................................................................................................45

17. Денатурирующий градиентный гельэлектрофорез (ДГГЭ)..........................................................45

18. Секвенирование ДНК....................................................................................................................................................................................46

19. ДНК-ДНК гибридизация (блот-гибридизация)..................................................................................................47

20. Рестрикция ДНК......................................................................................................................................................................................................47

21. Индукция салицилатгидроксилазы........................................................................................................................................47

22. Определение активности ферментов..................................................................................................................................48

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ......................................................................................................................................................49

1. Изменение состава сообщества бактерий-деструкторов

ароматических соединений нефтешламов до и после их

обезвреживания в проточном биореакторе................................................................................................................49

1.1. Выделение и характеристика бактерий из нативных нефтешламов............................49

1.2. Выделение и характеристика бактерий после обработки нефтешламов в ферментёре....................................................................................................................................................................................................................................51

1.3. Молекулярно-генетический анализ штаммов, выделенных из нефтешламов..............................................................................................................................52

2. Влияние загрязнения устойчивыми органическими соединениями на

состав почвенного микробного сообщества........................................................................................................55

2.1. Исследование незагрязнённой почвы................................................................................................................................55

2.2. Динамика численности аборигенных штаммов в загрязнённой почве....................55

2.3. Изменение состава почвенного бактериального сообщества в течение

60

эксперимента...............................................................................................................

2.4. Динамика присутствия генов пакАс и пакНъ загрязненной почве................................63

3. Бактерии, вы деленные из загрязнённой нафталином почвы..........................................67

3.1. Изоляция и характеристика почвенных бактерий........................................................................................67

3.2. Генетический контроль биодеградации нафталина у выделенных штаммов 72 4. SCPA - НОВЫЙ ГЕН САЛИЦИЛАТГИДРОКСИЛАЗЫ, ЛОКАЛИЗОВАННЫЙ НА ПЛАЗМИДАХ ДЕГРАДАЦИИ САЛИЦИЛАТА/КАПРОЛАКТАМА................................................................................77

4.1. Плазмиды биодеградации салицилата..............................................................................................................................77

4.2. Идентификация гена салицилатгидроксилазы, локализованного на плазмидах биодеградации салицилата/капролактама..........................................................................................80

4.3. Филогенетический анализ нового гена салицилат-1-гидроксилазы scpA............82

4.4. Активность салицилатгидроксилазы ScpA, кодируемой SAL/CAP

плазмидами....................................................................................................................................................................................................................................84

ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................................................................................................................................................................88

ВЫВОДЫ..........................................................................................................................................................................................................................................92

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................................................................................................94

ПРИЛОЖЕНИЕ......................................................................................................................................................................................................................114

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ДГГЭ денатурирующий градиентный гель-электрофорез

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДОФ диоктилфталат

ДТ дизельное топливо

МГЭ мобильные генетические элементы

НАДН (3-никотинамиддинуклеотидфосфат, восстановленная форма

ПАУ полициклические ароматические углеводороды

ПЦР полимеразная цепная реакция

РНК рибонуклеиновая кислота

РНКаза рибонуклеаза

рДНК рибосомная дезоксирибонуклеиновая кислота

рРНК рибосомная рибонуклеиновая кислота

Трис трис[гидроксиметил]аминометан

т.п.н. тысяча пар нуклеотидов

УОС устойчивые органические соединения

УФ ультрафиолет

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

ARDRA amplified ribosomal DNA restriction analysis

Cap капролактам

DMSO диметилсульфоксид

dNTP дезоксирибонуклеозидтрифосфаты

E среда Эванса

Gfp green fluorescent protein (зелёный флюоресцирующий белок)

Km канамицин

LB среда Лурия-Бертани

Nah нафталин

Phn фенантрен

Rif рифампицин

Sal салициловая кислота

SDS додецилсульфат натрия

Sm стрептомицин

Тс тетрациклин

Тп транспозон

А Т G С

аденин тимин гуанин цитозин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В процессе деятельности человека производится множество устойчивых органических соединений (УОС), которые попадают в окружающую среду вследствие аварийных выбросов, разливов и непосредственно в виде отходов. Одними из основных загрязнителей окружающей среды являются нефть и нефтепродукты [18].

В сточных водах и газовых выбросах нефте-, газо- и коксохимических производств содержатся наиболее трудноразлагаемые соединения: моно- и полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), такие как бензол, толуол, нафталин, фенантрен и антрацен. Нафталин производят в огромных масштабах (тысячи тонн в год) для получения фталевого ангидрида, красителей, пластиков, взрывчатых веществ, инсектицидов и фармацевтических препаратов. Однако он является канцерогенным соединением, и загрязнение им окружающей среды опасно для здоровья человека [153]. При очистке сточных вод нефтеперерабатывающих предприятий формируются нефтешламы, содержащие устойчивые органические соединения, в том числе ПАУ и их метилированные производные, многие из которых также канцерогенны [45; 56].

Наиболее распространёнными способами ликвидации загрязнений УОС являются сжигание и различные физико-химические методы. Однако применение этих технологий приводит ко вторичному загрязнению окружающей среды и довольно часто к выводу больших территорий из хозяйственной деятельности. Биоремедиация, как in situ, так и ex situ, более эффективный и щадящий подход, поскольку большая часть химических соединений нефти и нефтепродуктов биодеградируема, а микроорганизмы-нефтедеструкторы весьма разнообразны и адаптированы даже к регионам с холодным климатом [57; 81; 92].

Для разработки технологий биоремедиации большое значение приобретает исследование динамики численности аборигенных почвенных бактерий-деструкторов, поскольку необходимо иметь представление о способности почвы к самовосстановлению и необходимости применения биопрепаратов. Такие исследования должны проводиться на стыке микробиологии и молекулярной биологии, так как в загрязнённых сайтах могут присутствовать некультивируемые микроорганизмы, которые обнаруживаются лишь с использованием молекулярно-генетических методов.

Известно, что гены, контролирующие биодеградацию УОС, часто находятся в составе катаболических конъюгативных плазмид, которые играют существенную роль в адаптации микробных сообществ к загрязнению окружающей среды. Путём изучения состава бактериального сообщества (частоты встречаемости тех или иных видов микроорганизмов) и частоты встречаемости ключевых генов биодеградации УОС и катаболических плазмид можно определить адаптационный потенциал бактериального сообщества конкретного загрязнённого сайта.

В случае, когда биодеградативный потенциал почвы низок, используют биопрепараты, состоящие из клеток как отдельных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов (например, псевдомонад), так и бактериальный консорциум (например, микроорганизмы-нефтедеструкторы родов Pseudomonas и Rhodococcus) [40, 176]. Для разработки биопрепаратов необходимо детальное исследование бактериальных биохимических путей деградации поллютантов и их генетического контроля. Генетические системы биодеградации нафталина, который используется как модельное соединение при исследовании процессов деструкции углеводородов нефти, особенно начальных этапов его окисления до салицилата (nahJ-оперон), у псевдомонад изучены наиболее детально и являются довольно консервативными. Однако гены салицилатгидроксилаз (в составе nah2-oперона) отличаются большим полиморфизмом в пределах рода Pseudomonas, и за последние годы было обнаружено несколько их вариантов [71; 75; 191]. Причём различные варианты этого гена могут находиться в геноме бактерий как в сочетании с полным набором генов «классического» оперона деградации нафталина, так и лишь с яа/гУ-опероном или даже в отсутствие нафталиновых оперонов.

Салицилат, являясь ключевым интермедиатом в бактериальных путях биодеградации ПАУ, в то же время широко распространён в природе как типичный метаболит растений, участвующий в индукции системной устойчивости к фитопатогенам [104; 150]. Обнаружены флюоресцирующие псевдомонады, использующие в качестве источника углерода и энергии салицилат, но не нафталин [46]. В некоторых случаях эта метаболическая активность сочетается со способностью деградировать капролактам [46; 122], который широко используется для производства капрона (нейлона-6) и полиамидных пластмасс и является токсичным ксенобиотиком, вызывающим дерматиты и хромосомные аберрации у млекопитающих [141; 172].

Однако генетические детерминанты биодеградации салицилата и капролактама у таких штаммов не изучены.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы заключалась в молекулярно-генетическом анализе изменений состава бактериальных сообществ в условиях загрязнения устойчивыми органическими соединениями и исследовании плазмид биодеградации.

В соответствии с целью работы были определены следующие конкретные задачи:

1. Оценить изменение состава сообщества микроорганизмов-деструкторов нефтешламов при их обезвреживании в проточном биореакторе.

2. Проанализировать изменение состава почвенного микробного сообщества после загрязнения почвы различными поллютантами.

3. Исследовать динамику присутствия ключевых генов биодеградации нафталина (.nahAc и nahH) в ДНК почвы, загрязнённой модельным соединением (нафталином).

4. Выделить и охарактеризовать штаммы-деструкторы нафталина из образцов загрязнённой почвы и нефтешламов.

5. Выделить и охарактеризовать плазмиды биодеградации нафталина, салицилата и капролактама и провести поиск новых генов салицилатгидроксилазы.

Научная новизна

Метод Box-PCR выявил изменение состава популяции бактерий-деструкторов нефтешламов при их детоксикации в проточном биореакторе. С применением ДГГЭ показано, что в результате загрязнения нефтью, дизельным топливом и диоктилфталатом в почве чаще всего доминируют протеобактерии (в частности, рода Pseudomonas), а при загрязнении нафталином - актинобактерии (в частности, рода Arthrobacter), постепенно замещающие протеобактерий.

Из загрязнённой нафталином почвы впервые выделены две природные ассоциации бактерий родов Paenibacillus и Pseudomonas, в которых псевдомонады являются деструкторами нафталина и содержат NAH-плазмиды P-9-группы несовместимости, а пенибациллы продуцируют естественные носители - экзополисахариды (ЭПС), улучшающие выживаемость псевдомонад в неблагоприятных условиях среды.

Впервые описаны плазмиды биодеградации салицилата, поддерживаемые в бактериях рода Pseudomonas, не обладающие яд/г2-опероном и несущие только «неклассический» ген салицилат-1-гидроксилазы nahU.

Впервые установлено, что генетические детерминанты биодеградации капролактама и салицилата у штаммов псевдомонад, способных деградировать оба эти соединения, находятся в составе крупных конъюгативных SAL/CAP-плазмид, часть из которых относится к P-7-группе несовместимости.

В составе SAL/CAP-плазмид обнаружен и частично секвенирован новый ген салицилат-1-гидроксилазы - scpA, который идентичен известным последовательностям не более чем на 72-74% и филогенетически примерно равноудален от ближайших гомологов - генов nahG (NAH7), salA (P. reinekei MT1) и nahU (pND6-l).

Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты позволяют расширить знания об адаптационном потенциале незагрязнённых почв и помогают установить закономерности