Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологические аспекты диагностики хламидийных и микоплазменных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых коллективах

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологические аспекты диагностики хламидийных и микоплазменных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых коллективах"

На правах рукописи

НОСАЧ Екатерина Сергеевна

Микробиологические аспекты диагностики хламидийных и микоплазменных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых

коллективах.

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

5 ДЕК 2013

Владивосток 2013 005542945

005542945

Диссертация выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, доцент Мартынова Алина Викторовна Официальные оппоненты:

Шубин Феликс Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории молекулярной эпидемиологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт им. Г.П. Сомова» НИИЭМ СО РАМН

Стрельникова Наталья Викторовна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Защита состоится 24 декабря 2013 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета ДКМ 208.007.02 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 690002, г. Владивосток, ГСП, проспект Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Автореферат разослан

2013 г.

Ученый секретарь диссертационного света, Д.м.н, доцент

Скляр Л.Ф.

Общая характеристика работы Актуальность темы: Заболеваемость внеболышчными пневмониями - одна из лидирующих проблем современной медицины. Заболеваемость внебольничными пневмониями (ВП) увеличивается как в мире, так и на территории Российской Федерации. Заболеваемость внеболышчными пневмониями любой этиологии у лиц молодого возраста в Российской Федерации составляет 14-15%о, что составляет более 1,5 млн человек ежегодно (А.И Синопальников,2006, Жестков A.B., 2010). Актуальна проблема внебольничных пневмоний и в других странах: более 4 миллионов человек заболевает внебольничной пневмонией в США, а в странах Евросоюза - более 3 миллионов человек (Benson RE, 2012, Graninger W., 2013). Минздравсоцразвития РФ прг".одит данные о смертности в нашей стране по причине пневмонии на уровне 31 случая на 100 тысяч населения (что в абсолютных цифрах выражается как 44438 человек), что также определяет актуальность внебольничных пневмоний как проблемы в нашей стране. Объективно, противоречивость информации об эпидемиологических аспектах данной нозологии, учет различных факторов риска, данные о микробиологическом спектре этиологически значимых возбудителей, низкая оценка региональных особенностей устойчивости к антибактериальным препаратам, а также отсутствие современных методов лабораторной диагностики определяют основные причины, из-за которых внебольничные пневмонии занимают лидирующую позицию в структуре заболеваемости и смертности. При этом, заболеваемость внеболышчными пневмониями у лиц молодого возраста (18-35 лет) является особенно актуальной, что связано с из особой экономической и социальой активностью. Еще более актуальна проблема заболеваемости внебольничными пневмонями у молодых лиц из организованных военных коллективов, где отмечается тенденция к росту заболеваемости (Огарков П.И., 2006, Жоголев С.Д., 2008). Согласно данным ежегодных отчетов медицинской службы МО РФ, заболеваемость внебольничными пневмониями у военнослужащих срочной службы в период с 2000 по 2006 годы колебалась от 35,3%о до 45,5%о (Редько Н.М., 2009). Очевидно и то, что молодые люди заболевали внебольничными пневмониями в течение первого месяца после прибытия в учебный отряд, когда организм молодого человека проходил период адаптации к новым условиям жизни, преодолевал психологический и физический стресс, подвергался снижению общей иммунорезистентности при активации механизма передачи инфекционного агента.

По данным ряда авторов, заболеваемости внебольничными пневмониями лиц молодого возраста еще в течение первых двух месяцев после призыва достигает 2503 00%о (Мельниченко П.И., 2003, Жоголев С.Д., 2006).

Действительно, при достаточно подробно изученных микробиологических свойствах основных этиологически значимых возбудителей при внебольничной пневмонии, таких как Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae и др., до сих пор остаются не ясными особенности формирования эпидемиологически значимых вариантов возбудителей, большинство которых является условно-патогенными возбудителями, не изучена их молекулярно-генетическая структура. Особенно спорными остаются вопросы об этиологической значимости выделения при внебольничной пневмонии, так называемых «атипичных» сложнокультивиру<. ых возбудителей (Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumohilla, Chlamydophila pneumoniae), не определено значение выделения их в ассоциации с такими возбудителями как S.pneumoniae и H.influenzae.

Не выявлены особенности формирования антибактериальной резистентности у наиболее значимых сложнокультивируемых возбудителей внебольничной пневмонии, таких как M.pneumoniae, C.pneumoniae, не определены молекулярно-генетические распространения, что не позволяет обосновать рациональную антибактериальную терапию. Также не выявлена и молекулярно-эпидемиологическая структура выделенной популяции микроорганизмов, не определена их внутривидовая вариабельность, что не позволяет организовывать рациональные противоэпидемические мероприятия в отношении внебольничной пневмонии.

Цель исследования: изучить микробиологические особенности диагностики хламидийных и микоплазменных возбудителей внебольничных пневмоний на основе этиологической структуры у лиц молодого возраста для разработки рекомендаций по оптимизации диагностики, рационализации антимикробной химиотерапии и обоснования профилактических мероприятий.

Задачи исследования:

1) Изучить этиологическую структуру и оценить роль выявления штаммов C.pneumoniae и M.pneumoniae в развитии внебольничной пневмонии у лиц молодого возраста.

2) Выявить генетические особенности формирования антибиотикорезистентности и патогенности штаммов С.рпеитотае и М.рпеитотае, идентифицируемых в структуре этиологически значимых возбудителей внебольничных пневмоний

3) Изучить эпидемиологические особенности заболеваемости внебольничными пневмониями среди лиц молодого возраста в закрытых коллективах.

4) Оценить влияние фактора нахождения в закрытом коллективе на особенности формирования микробиоценоза дыхательных путей с участием С.рпеитотае и М.рпеитотае и развития внебольничных пневмоний хламидийной и микоплазменной этиологии у лиц молодого возраста.

Научная новизна. Впервые комплексно оценена микробиологическая структура этиологически значимых возбудителей внебольничной пневмонии у лиц молодого возраста с идентификацией как бактериальных, так и вирусных возбудителей. Определена роль идентификации хламидийных и микоплазменных возбудителей, в том числе и при выделении их в ассоциации с другими бактериальными возбудителей.

Оценена роль фактора пребывания в закрытом коллективе для развития внебольничных пневмоний, вызванных «атипичными» возбудителями, у лиц молодого возраста.

Изучены особенности популяционной структуры микроорганизмов, входящих в микробиоценоз дыхательных путей у пациентов внебольничной пневмонией у лиц молодого возраста.

Учитывая различия в генотипических особенностях формирования устойчивости к антибактериальным препаратам класса макролидов, доминирующих в структуре атипичных внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста, предложены рекомендации по коррекции стандарта диагностики и организации эпидемиологического надзора.

Полученные данные об этиологической структуре внебольничных пневмоний хламидийной и микоплазменной этиологии определяют дальнейшие направления изучения проблемы инфекций дыхательных путей, а также предлагают решение теоретических проблем в области медицинской микробиологии, в том числе, в исследовании состояния и механизмов действия факторов патогенности

микроорганизмов, что обусловливает характер микробиоценоза дыхательных путей у пациентов молодого возраста.

Практическая значимость исследований. Результаты изучения структуры этиологически значимых возбудителей внебольничных пневмоний у молодых лиц позволили получить представление об эпидемической ситуации по заболеваемости внебольничными пневмониями у лиц молодого возраста.

Охарактеризованы эпидемиологические аспекты заболеваемости внебольничными пневмониями среди лиц молодого возраста, выявлен фактор влияния закрытого коллектива на формирование заболеваемости.

Анализ спектра этиологически значимых микроорганизмов, идентифицированных в лабораторном материале от больных внебольничными пневмониями, позволил установить значимость выделения микоплазменных и хламидийных возбудителей, а также определил превалирование среди них такого возбудителя как З.рпеитотае.

Проведенный мониторинг антибиотикорезистентности выделенных штаммов, доминирующих в структуре внебольничных пневмоний, позволил получить представление об эффективности антимикробной химиотерапии, а также, учитывая механизм формирования устойчивости к антибактериальным средствам, определить возможность рационализации антибиотикотерапии инфекций дыхательных путей у лиц молодого возраста.

Изучив популяционную структуру возбудителей внебольничных пневмоний, а также определив видовой состав штаммов, выделенных в качестве доминирующих в микробиоценозе дыхательных путей у лиц молодого возраста, стало возможным коррегировать противоэпидемические мероприятия в отношении внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста.

Внедрения: По материалам диссертации изданы методические рекомендации, информационные письма, подготовлена информационная справка.

Результаты исследования использованы в создании рекомендаций по коррекции формуляров антибиотикотерапии и при организации мероприятий эпидемиологического надзора.

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс при подготовке врачей на кафедре эпидемиологии и военной эпидемиологии ГОУ ВПО ТГМУ, в работе пульмонологического отделения Военно-морского клинического госпиталя ТОФ.

Апробация: Материалы научно-исследовательской работы доложены на: постоянно действующих семинарах «Актуальные вопросы госпитальной эпидемиологии» (Главный Госпиталь ТОФ, 2008г), на 10-й , 11-й Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (апрель, 2010 г., апрель, 2011 г, Владивосток), на VI-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009г), на конференции «Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 28-30 сентября, 2009 г), на III международной конференции по инфекционным заболеваниям DITAN (Пекин, июль 2009г), на IV международной конференции по инфекционным заболеваниям DITAN (Пекин, июль, 2010), на Всероссийской научной конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, Военно-медицинская академия, 2009 г), на Всероссийской научной школе для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии» (Владивосток, ноябрь, ДВГУ, 2009 г), на V-й научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (Владивосток, 19-20 мая 2010 г), на Международном симпозиуме по изучению пневмококковых инфекций (Israel, ISPPD 7, Tel-Aviv, 2010), на Европейском Респираторном Конгрессе (Барселона, сентябрь, 201 Ог), на Третьем Съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил РФ «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия ВС РФ» (декабрь, 20 Юг), на Первом Евроазиатском конгрессе «Инфекционные болезни: проблемы, достижения и перспективы» (Санкт-Петербург, декабрь, 20 Юг), в работе 16 Азиатско-Тихоокеанского международного симпозиума по изучению проблем респирологии (Филиппины, Манила, февраль, 2011 г).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ (в журналах, рекомендованных ВАК-3 статьи), из них в центральной печати 5, в зарубежной - 6.

Личный вклад автора: Анализ данных литературы по теме диссертации, бактериологическое обследование, анализ эпидемиологической информации, молекулярно-генетические исследования (80%), статистическая обработка полученных результатов и их анализ, написание диссертации выполнены лично автором.

Объем и структура диссертации традиционная. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами, 23 рисунками, 8 схемами. Список литературы содержит 237 источников, из них 113 принадлежит отечественным, 124 зарубежным авторам.

Исследование одобрено Этическим комитетом ВГМУ (протокол №5, дело №35 от 19 апреля 2010г). Положения вы носимые на защиту:

1)Заболеваемость внебольничными пневмониями является значимой в структуре заболеваемости лиц молодого возраста в закрытых коллективах и составляет от 2,26%о достигает максимума в 6,77%о с умеренным типом прироста 4,9% в год. Фактор пребывания в закрытом коллективе более двух месяцев увеличивает вероятность заболевания ВП бактериальной и вирусно-бактериальной этиологии.

2)Этиологическая структура характеризуется преобладанием таких возбудителей как Б.рпеитотае (26%), Н.'афиетае (18%), при этом, такие сложнокультивируемые возбудители как С.рпеитотае, М.рпеитотае, Ь.рпеиторИИа являются единственными идентифицируемыми возбудителями в 39%, что подтверждает их значимость в развитии внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста.

3)Для идентификации этиологически значимого возбудителя в случае диагностики внебольничных пневмоний, молекулярно-диагностические методы на основе полимеразной цепной реакции представляются наиболее перспективными: чувствительность ПЦР идентификации М.рпеитотае и С.рпеитотае в лабораторном материале составляет 94%, специфичность 86%.

4)Распространенность в геноме маркеров антибиотикорезистентности и патогенности подтверждает возможность формирования моноклональности.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАЛИ РАБОТЫ Объем, материалы и методы исследования

Исследуемая популяция (всего 200 пациентов), средний возраст которой составил 19±1,9 лет - мужчины в возрасте от 18 до 34 лет. Все они являлись военнослужащими по призыву, поступившими в пульмонологическое отделение Главного Госпиталя ТОФ с диагнозом внебольничная пневмония в период с 2008 г. по 2010 г. Для оценки распространенности носительства бактериальных возбудителей инфекций респираторного тракта, в том числе и вызывающих атипичные пневмонии, были обследованы на носительство 200 военнослужащих, проходящих подготовку в одном из учебных отрядов.

Микробиологические исследования проводились в течение всего периода исследования (с сентября 2008 по март 2010гг.) на базе клинической лаборатории Военно-морского клинического госпиталя (заведующий - доктор медицинских наук Андрюков Б.Г). Все экспериментальные и клинические исследования одобрены Этическим комитетом ГОУ ВПО ВГМУ Росздрава (протокол № 5, дело 35 от 19 апреля 2010г.), а при проведении исследования были получены информированное согласие пациентов и обследуемых на проведение исследования. Основным материалом для проводимых исследований у пациентов и обследуемых являлись мокрота, оро- и назофарингеальный мазок, жидкость бронхоальвеолярного лаважа. Исследуемый клинический материал в первые сутки поступления больного в стационар до проведения лечения доставляли в лабораторию. Дальнейшие исследования проводили с учетом рекомендаций Приказа № 535 "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно -профилактических учреждений" от 22 апреля 1985 года. Материал для идентификации атипичных возбудителей (М.рпеитотае, С.рпеитотае, Ь.рпеиторЫИа) собирался согласно методическим рекомендациям «Диагностика хламидийной, микоплазменной и герпесвирусной инфекции методом цепной полимеразной реакции - №95-106», утв. Минздравмедпромом РФ 08.08.1995. Для проведения исследования мы использовали эталонные тестовые штаммы культур и препараты ДНК, полученные кафедрой эпидемиологии Тихоокеанского государственного медицинского университета в Государственном Контрольном институте биологических препаратов им. В.Г. Тарасовича. В данном исследовании для подтверждения видовой принадлежности выделенных штаммов, исследования генетических детерминант факторов их вирулентности, а также проведения серотипирования (и, ответственного за синтез

полисахарида капсулы) был использован молекулярно-генетический метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) [Mullis 1986; Saiki 1988]. Процесс ПЦР автоматизирован и многократно повторяется с помощью специальных программируемых термостатов -термоциклеров (амплификаторов). Исследование проводилось на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (кандидат биологических наук, руководитель проекта грант РФФИ, н.с. Балабанова Л. А.).

Таблица 1

Материалы и методы

№п/п Направления исследований Методы исследования Объем исследов аний

1. Клинико- анамнестический анализ 1. Анализ данных заболеваемости 2.Изучение амбулаторных карт больных внебольничными пневмониями и пациентов соматического стационара; З.Опрос и обследование обследуемых на носительство 400 200 200

2. Микробиологические исследования 1 .Микробиологическое исследование назо- и орофарингеального мазка: 1.1 Экспресс-диагностика по Белобородовой микроскопия мазка с окраской по Граму 1.2 Выделение культур этиологически значимых возбудителей и их идентификация, серотипирование: «Унифицированные микробиологические методы, применяемые в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ» МЗ СССР №535 от 22.04.1985 2.Идентификация С.рпеитотае,М.рпеитотае, Ь.рпеиторЫНа .[Тартаковский И.С.,2000] 200 200 78

3. Иммунологические исследования 1. Идентификация С.рпеитотае, М.рпеитотае, Ь.рпеиторЫНа (ИФА) 78

4. Молекулярно- эпидемиологические исследования 1.ПЦР с праймерами к основным генам факторов вирулентности и антибиотикоустойчивости (гЗБРНК,/^, /мЛ,/мЯ) 2.Сравнительный геномный анализ штаммов С.рпеитотае, М.рпеитотае, Ь.рпеиторЫНа с учетом базы данных ИСВ1 3. Рестршсционный анализ (238РНК, р1, отр2) 35 5 34

5. Статистические исследования 1.Методы вариационной статистики: /Герасимов А.Н., 2007;Петри А.,2009/, 2.Построение и анализ дендрограмм программным пакетом ВютипсНсэ Все цифровые показатели

Результаты исследования и их обсуждение. При анализе данных о заболеваемости внебольничными пневмониями по Дальневосточному Федеральному округу (информация предоставлена Военно-морским клиническим госпиталем, заведующей отделом сбора и обработки информации - Белимовой С.Г.), мы получили данные, согласно которым, что помимо увеличения в летний период заболеваемости внебольничными пневмониями легкой и средней степени тяжести, имеется увеличение удельного веса случаев с отрицательным микробиологическим подтверждением диагноза внебольничной пневмонии в период первого осеннего подъема заболеваемости с августа по сентябрь, что также подтверждает необходимость совершенствования диагностического процесса на уровне рутинной работы клинической микробиологической лаборатории (табл. 2).

Таблица 2

Результаты микробиологической диагностики внебольничных пневмоний

(ретроспективно, п=400).*

Результаты бактериологических исследований август-сентябрь ноябрь-декабрь апрель-июнь Всего

Монокультура 42(21,6%) 126 (51,8%) 65 (39,8%) 233 (38,8%)

Ассоциация микроорганизмов 53 (27,3%) 82 (33,7%) 36 (22,08%) 171(28,5%)

Отрицательный результат 99 (51,03%) 35(14,4%) 62(38,03%) 196 (32,6%)

Всего 194 243 163 600 (100%)

*р<0,05

Таким образом, очевидно, что даже несмотря на определенные недостатки в организации диагностического процесса на уровне клинической микробиологической лаборатории, имеются статистически значимые различия в показателях заболеваемости внебольничными пневмониями, что, скорее всего, обусловлено разнообразной микробиологической структурой этиологически значимых возбудителей.

Для доказательства первого положения, выносимого на защиту, мы приводим наши данные по изучению многолетней динамики заболеваемости внебольничными пневмониями. При этом было определено, что за исследованные 8 лет, заболеваемость колебалась в пределах определённых показателей, верхней границей которых является так называемый эпидемический порог. При этом уровень заболеваемости до 2004 года, и уровень заболеваемости после 2006 года превышают эпидемический порог, что позволяет предполагать эпидемический (вспышечный) характер заболеваемости внебольничными пневмониями в данный период времени. Анализ помесячной динамики заболеваемости показывает, что заболеваемость

характеризуется типичной осеннее-зимней и весеннее-летней сезонностью, общая продолжительность сезонных подъёмов по 3 месяца (рис.1), при этом, заболеваемость достигает среднего максимального значения 6,77%о при средней минимальной заболеваемости в 2,26 %о с умеренным типом прироста 4,9% в год.

Типовая кривая заболеваемости внебольничной пневмонией

0 декабрь январь февраль март апрель май июнь июль asiycT сентябрь октябрь ноябрь

-»-1ср 6,77 4,4 2,76 2,83 2,65 3,08 3,71 2,67 2,91 252 2,26 3,02

-«-In 8,07 5,45 3,76 3,84 3,61 4ДЗ 4,67 3,61 3,89 3,46 3,16 4,06

5,47 3,36 2,02 2,08 1,91 2,3 2,75 1,91 2,13 1Л 1.S9 2.24

НЦп/к 3,02 3,02 3,02 3,02 3,02 3,02 3,02 3,02 3,02_ ЗД2 3,02 3,02

Рис.1. Типовая кривая заболеваемости внебольничной пневмонией (2000-2008гг.)

При анализе эпидемиологических данных об этиологических вариантах внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста с различным сроком пребывания в закрытом коллективе, мы получили следующие данные (таб. 3):

Таблица 3

Этиологические варианты внебольничной пневмонии в группах больных с различным _сроком службы (< и > 2 месяцев)___

Этиология Срок службы <2 месяцев Срок службы > 2 месяцев Всего Р<0,05

М. pneumoniae 7% (14) 2,5% (5) 19 (9,5%) 0,001

C.pneumoniae 3,5% (7) 2% (4) 11 (5,5%) 0,014

M.pneumoniae+ C.pneumoniae 8%(16) 10%(20) 36(18%) 0,01

H.influenzae 6%(12) 12%(24) 18% (36) 0,03

S.pneumoniae 11%(22) 15%(30) 52 (26%) 0,02

Бактериально-вирусные ассоциации 1,5%(3) 3,5%(7) 10(5%) 0,2383

Всего 37%(74) 45%(90)

Таким образом, очевидно, что для внебольничных пневмоний, где основными возбудителями будут являться микоплазмы и хламидии, чрезвычайно важным является пребывание в закрытом коллективе, так как больший удельный вес по развитию случаев внебольничных пневмоний представлен в группе пациентов, заболевших внебольничной пневмонией, находясь в закрытом коллективе менее 2 месяцев (50% ( 37 случаев из 74) по сравнению с 32,2% (29 случаев из 90) среди тех лиц, которые находились в закрытом коллективе более 2 месяцев).

Для обоснования второго положения, выносимого на защиту, можно привести сравнительные данные годовой динамики (табл.3) этиологической структуры атипичной пневмонии по результатам мониторинга возбудителей М. pneumoniae, С. pneumoniae, а также их ко-инфекции, S. pneumoniae.

Согласно представленным данным, пневмококк занимает так же значимую позицию в этиологической структуре возбудителей внебольничных пневмоний, при этом, выделение M.pneumoniae, C.pneumoniae, L.pneumophila представляется более значимым в эпидемиологическом плане, что подтверждается стабильностью идентификации данных возбудителей, как в периоды сезонного подъема, так и в период снижения заболеваемости.

Таблица 4

Этиологическая структура внебольничной пневмонии по данным мониторинга возбудителей (М. pneumoniae, C.pneumoniae, ко-инфекция атипичных возбудителей, S. pneumoniae) в течение года по

месяцам (п=200).

Ко-инфекция "ип. + пневмокока Всего Streptococcus

1 03 о 5 ц о о Я ш о Количество обследованных больных Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumoniae L.pneumophila Ко-инфекция M.pneumoniae+ C.pneumoniae возбуди телей атипичных пневмоний pneumoniae

S <

VI 11 1 1 0,5 1 0,5

VII 7 2 2 1 2 1

VIII 3 2 2 I - 0

IX 3 3 3 1,5 1 00,5

X 7 1 1 0,5 1 0,5

XI 8 I 2 3 6 3 4 2

XII 19 2 1 4 6 13 6,5 10 6,5

I 35 3 3 2 14 22 И 13 4,5

II 49 3 3 2 8 16 8 9 3,5

III 31 4 2 3 9 0,5 7 1

IV 24 1 1 2 1 2 1

V 3 1 - - 1 0,5 2 1

200 19 11 2 10 36 78 39 52 22,0 %

9,5% 5,5% 1% 5% 18% %

Анализ выявления атипичных возбудителей в течение года по месяцам свидетельствует о преобладающем их выделении у больных внебольничной пневмонией с ноября по март включительно. В этот период они обнаружены у 57 человек, что составляет 73,0 % от всех положительных результатов, полученных в течение года (78 человек). Проведенные исследования позволили обнаружить возбудителей атипичных внебольничных пневмоний у 78 (39% от всех обследованных пациентов). В том числе ко-инфекция (Мpneumoniae и C.pneumoniae) выявлена у 36 чел. (18 %), изолировано М. pneumoniae - у 19 (9,5%), а С. pneumoniae — у 11 (5, 5 %) больных. Кроме того, в двух случаях была идентифицирована L.pneumophila 2 пациента (1%).

Для обоснования третьего положения, выносимого на защиту, мы можем отметить, что во всех исследуемых образцах лабораторного материала был идентифицирован какой-либо условно-патогенный или облигатно-патогенный возбудитель, клиническая значимость которого, безусловно, должна быть оценена при оценке клинического процесса. Тем не менее, очевидно, что преобладающими сложнокультивируемыми микроорганизмами, и, соответственно, представляющими наибольшую сложность для врача лабораторной диагностики и для врача-терапевта, являются бактериальные возбудители атипичных пневмоний, к которым относится C.pneumoniae, М. pneumoniae, L. pneumophila.

Проблема становится еще более объективной, когда мы оценили чувствительность и специфичность серологических методов исследования (табл.5), которые тем не менее так же не входят в ежедневную диагностику пневмоний. Таким образом, при идентификации этиологически значимого возбудителя в случае диагностики внебольничных пневмоний, молекулярно-диагностические методы на основе полимеразной цепной реакции представляются наиболее перспективными.

Таблица 5

Чувствительность и специфичность методов диагностики атипичных возбудителей

внебольничных пневмоний

Результаты ПЦР диагностики Результаты серологической диагностики

Позитивный Негативный Всего

Положительные результаты 47 31 78

Отрицательные результаты 3 119 122

Всего 50 150 200

Следовательно, становится очевидной актуальность изучения этиологического спектра именно бактериальных возбудителей атипичных пневмоний, равно как и методов, их диагностики, а также внедрения этих методов в рутинную диагностику (табл.6).

Таблица 6

Бактериальные и вирусные возбудители внебольничных пневмоний (п=200)

Возбудитель ПЦР Рутинные методы диагностики (бактериология ИФА)

Абс % Абс %

Возбудители атипичных пневмоний 78 39 50 25

В т.ч. атпичные возбудители в ассоциации с S.pneumoniae 10 5 4 2

S.pneumoniae 52 26 29 14,5

Н. influenzae 36 18 14 7

Бактериальные ассоциации 10 5 10 5

Вирусно-бактериальные ассоциации 16 8 - -

Возбудитель не выявлен 8 4 - 46,5

Четвертое положение, выносимое на защиту, можно обосновать следующим образом: несмотря на внутривидовое разнообразие как среди штаммов С.рпеитота, так и среди штаммов М.рпеитотае, имеется общая тенденция в распространении генов устойчивости к антибиотикам среди штаммов, выделенных от пациентов с внебольничными пневмониями и у носителей (таблица 7). Генетические детерминанты устойчивости к макролидам (235 г1ША, Ь4, Ь22) распространены в 60% среди штаммов микоплазм, и 80% всех штаммов хламидий. При этом у носителей, генетические детерминанты устойчивости к макролидам также распространены среди штаммов М.рпеитотае в 50%, а в С.рпеитотае -80%, что подтверждает общую тенденцию в формировании устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам.

Таблица 7

Распространенность детерминант устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам в _штаммах, выделенных у пациентов с атипичными ВП и у носителей_

детерминанты макролиды

23SrRNA L4 L22 ругА КУгВ рагС рагЕ

Пациенты с ВП (25)

М.pneumoniae (15) б (40%) 2 (13,3%) 1(6,6%) 100% 100% 100% 100%

C.pneumoniae, (10) 5(50%) 2(20%) 1(10%) 0 100% 100% 100%

Т=4,4; 7,04, р=0,04, 0,018 р>0,05

Носители

M.pneumoniae (Ю) 5(50%) 0(0%) 0 100% 100% 100% 100%

C.pneumoniae (5) 2(20%) 1(10%) 1(10%) 0 100% 100% 100%

F=0,4, р=0,02 р>0,05

Таким образом, нами выявлено, что ген, кодирующий синтез метилтрансфераз, которые способны изменять сайты распознавания антибиотиков - 238 рибосомальную РНК, является определяющим в развитии устойчивости к макролидам, что снижает, в свою очередь аффинность к макролидам, и ухудшает, соответственно, терапевтическую эффективность схем лечения микоплазменных и хламидийных пневмоний. У исследованных 25 образцов ДНК штаммов бактерий,

вызвавших атипичные пневмонии у пациентов с внебольничными пневмониями данный ген был выделен в 40% ДНК микоплазм и 50% хламидий. Это же нашло и подтверждение и в ДНК штаммов, идентифицированных у носителей - у микоплазм он был выделен у 50%, у С.рпеитотае — в 20%. В целом, можно ожидать распространенность данной генетической детерминанты антибиотикорезистентности в 61,7±13,1%. Мутации в генах, кодирующих рибосомальные белки Ь4 и Ь22, встречаются несколько реже: у пациентов с внебольничной пневмонией - 24,0±15,1% (причем при микоплазменных пневмониях- 20,0±2,06%, при хламидийных пневмониях- 30,0±2,45%).

Мониторинг устойчивости к фторхинолонам, по нашему мнению, представляет более сложную задачу и должен решаться методами молекулярно-эпидемиологического анализа с исследованием полиморфизма рестрикционных фргаментов, так как большинство генов, кодирующих устойчивость к данным антибиотикам являются конститутивными. Для изучения возможности поиска единой генетической детерминанты, определяющих первый этап инфицирования макроорганизма хламидиями и микоплазмами, мы провели анализ распространения детерминант адгезии в штаммах микоплазм и хламидий (табл.8) и выяснили, что основной генетической детерминантой факторов адгезии у штаммов М.рпеитотае является белок Р1 (выявлен в 46,6% ДНК, выделенной от пациентов и в 30% ДНК, выделенной от носителей).

Таблица 8

Распространенность генетических детерминант факторов вирулентности, выделенных в штаммах - возбудителях атипичных пневмоний

Генетические детерминанты патогенносги Гены белков-факторов Гены адгезии деления клетки

Пациенты с ВП

М.рпеитотае (п=15) Иту/1 4(26,6%) Р1 7 (46,6%) ¡1зН 8 (53,3%) 1ехА 6(40%)

С.рпеитотае (п=10) орт1 4 (40%) отр2 3(30%) Не уст Не уст

Р<0,05 Р<0,05

Носители

М.рпеитотае (п=10) А/пи'/ 0% р! 3(30%) ¡Ш 0 1ехА 1(10%)

С.рпеитотае (п=5) орт! 4 (80%) отр2 3(60%) /ехА 1ехА

Р<0,05 Р<0,05

Молекулярно-генетический мониторинг детерминант патогенноети на примере факторов, определяющих адгезию, показал, что как в штаммах M.pneumoniae, так и в штаммах C.pneumoniae, несмотря на видовые различия, имеется также общая тенденция к распространенности аллелей генов определяющих адгезию.

Проанализировав вариабельность генетических детерминант устойчивости к макролидам среди выделенных штаммов M.pneumoniae и С. pneumoniae на примере гена 23S rRNA при проведении рестрикционного анализа мы получили следующие данные (рис.2).

Phylogenese tree

-CP-l

СР-4

СР-2

СР—3

-СР—5

-СР-1. 1

-СР-1.2

Рис.2. Результаты рестрикционного анализа (Alul) гена 23SrPHK ДНК C.pneumoniae, выделенных от пациентов ВП (СР-1,СР-4,СР-2.СР-3, СР-5) и от носителей (СР-1.1 йот СР-1.2).

Таким образом, очевидно формирование среди выделенных штаммов микроорганизмов с клональными характеристиками (штаммы C.pneumoniae, выделенные от пациентов с ВП принадлежат к двум клональным группам), выделенные от носителей - к генетически не связанным изолятам.

При проведении рестрикции гена 23SrPHK штаммов M.pneumoniae выделено 2 клональных комплекса (из 6 штаммов, выделенных от пациентов), и отсутствие клонального родства в ДНК микоплазм, идентифицированных от носителей.

МР-1 МР-6 МР-4 MP-1.5 МР-2 МР-3 МР-5 MP-1.3 МР-1.4 MP-1.1 MP-1.2

Рис.3.Результаты рестрикционного анализа (Mnll) гена 23SPHK ДНК M.pneumoniae, выделенных от пациентов ВП (МР-1,МР-4,МР-2,МР-3, МР-5, МР-6) и от носителей (MP-1.1,MP-1.2, МР-1.3, МР-1.4, МР-1.5).

При проведении рестрикционного анализа генетических детерминант, определяющих адгезию у M.pneumoniae и С. pneumoniae, мы также получили подтверждение формированию клональности (клональное родство у штаммов, выделенных отпациентов), что объясняет формирование высокой патогенности у микоплазм и хламидий, проявившейся в развитии патогенетического процесса в легочной ткани (рис.3).

Выводы

1) Микробиологический мониторинг возбудителей внебольничных пневмоний с применением молекулярно-биологических методов исследования, в частности, ПЦР, позволяет установить их роль в развитии заболевания. В структуре внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста, хламидийные и микоплазменные пневмонии сотавляют до 39%., удельный вес других бактериальных возбудителей составляет 26% (S.pneumoniae), 18% (Н. influenzae).

2) Ген, кодирующий синтез метилтрансфераз, которые способны изменять сайты распознавания антибиотиков — 238 рибосомальную РНК, является определяющим в развитии устойчивости к макролидам штаммов хламидий и микоплазм, выделенных у пациентов с внебольничными пневмониями и у носителей.

3) Заболеваемость внебольничной пневмонией в течение анализируемого периода (2000-2008г.) регистрируется постоянно, с неравномерным уровнем в отдельные годы и колебаниями в пределах от 2,26%о до 6,77%о. Наблюдается умеренная тенденция к повышению заболеваемости внебольничной пневмонией со средним темпом прироста 4,9% в год. Рост заболеваемости в анализируемый период обусловлен, скорее всего, снижением эффективности проводимых противоэпидемических мероприятий.

4) Высокий удельный вес в микробиоценозе дыхательных путей штаммов С.рпеитотае и М.рпеитотае у лиц молодого возраста, пребывающих в закрытом коллективе в течение первых 2х месяцев, является прогностически значимым фактором в развитии пневмоний преимущетвенно легкого течения. При этом снижение в микробиоценозе штаммов М.рпеитотае со временем пребывания в закрытом коллективе, можно объяснить образованием ассоциаций данного возбудителя с другим бактериальным возбудителем внебольничных пневмоний- СЫатус1орЫ1а рпеитопше.

Рекомендации для внедрения в медицинскую науку и практическое здравоохранение

1. Необходимо проводить мониторинг сложнокультивируемых возбудителей -С.рпеитотае, М.рпеитотае, Ь.рпеиторЫИа - атипичных пневмоний при изучении эпидемиологии внебольничных пневмоний.

2. Генетические последовательности 23 ЭРИК и Р1 могут служить генетическими детерминантами при проведении молекулярно-эпидемиологического мониторинга при изучении устойчивости микоплазменных и хламидийных пневмоний.

3. При идентификации этиологически значимого возбудителя в случае диагностики внебольничных пневмоний, молекулярно-диагностические методы на основе полимеразной цепной реакции представляются наиболее перспективными.

4. Полимеразная цепная реакция применяемая при идентифировании С.рпеитотае, М.рпеитотае, Ь.рпеиторЫИа позволяет контролировать распространение генетических детерминант устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Этиологическая структура внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых коллективах/ С.В. Скрыль, Е.С.Носач, Н.В.Кулакова, А.В.Мартынова // Вестник Российской академии медицинских наук. 2012. № 7. С. 35-38.

2. Молекулярно-генетический мониторинг основных возбудителей внебольничных пневмоний/ С.В. Скрыль, Е.С. Носач, А.А. Шепарев, А.В. Мартыновой// Вестник новых медицинских технологий.-2012-№4.-С.8-10.

3. Epidemiology of pneumococcal community-acquired pneumonias in different age groups on data of the Far East of Russia/ A. Martynova, E. Nosach, O. Chulakova, A. Pruschinskyi, S. Skril/ The Programm and Abstract Book of ISPPD-7 (Tel-Aviv, Israel, March 16-18, 2010)- P.44. (abstract's).

4. Эпидемиологический анализ заболеваемости внебольничными пневмониями у лиц молодого возраста/ А.Мартынова, Е.Носач, С. Скрыль// Тезисы Третьего съезда военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных Сил Российской Федерации «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия Вооруженных Сил Российской Федерации» (декабрь 2010, Санкт-Петербург)-С.67.

5. Микробиологические аспекты изучения этиологического спектра возбудителей внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста./ А.В.Мартынова, С.В. Скрыль// Тезисы конференции «Инфекционная патология в Приморском крае», май 2010, Владивосток,- С.78-79.

6. Микробиологические особенности диагностики внебольничных пневмоний, вызванных атипичными возбудителями у лиц молодого возраста в закрытых коллективах/ А.В.Мартынова, С.В. Скрыль// Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов X Тихоокеанской науч-практич конф студентов и молодых ученых с международным участием (21 апреля 2010.).- Владивосток: Медицина ДВ, 2010.-С.228.

7. Epidemiology aspects of community-acquired pneumonia morbidity in young adults/ SV Skiyl, ES Nosuch, AV Martynova// Proceedings of the Asian Pacific Respirology Congress, 2010 (November, Manila, Phillipines).-P.45.

8. Etiology of community-acquired pneumonia in young adults/ A. Martynova, E. Nosuch//International Journal of Infectious Diseases.-2010.-Vol.14, Suppl.2.-P.7.

9. Разработка метода идентификации и генотипирования микроорганизмов-возбудителей инфекций респираторного тракта/С.В. Скрыль, А.В. Мартынова,

Е.С. Носач, О.А. Чулакова//Материалы всерос. науч. школы для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии»/ Дальневост. Федер. Ун-т,-Владивосток, 2010.С.70-72. Рус. Деп. В ВИНИТИ.

Ю.Эпидемиологические аспекты заболеваемости впебольничными пневмониями у лиц молодого возраста/С.В. Скрыль, Е.С Носач., А.В.Мартынова // Журнал инфектологии,2010. -Т. 2, №4-, С.95-96.

11. Результаты мультилокусного сиквенстипирования штаммов S.pneumoniae, выделенных у пациентов пожилого возраста на Дальнем Востоке России./ А.В. Мартынова А.А. Шепарев// Сборник Отечественная эпидемиология в 21 веке: приоритетные направления и новые технологии в диагностике и профилактике болезней человека: труды Юбилейной всероссийской научной конференции, посвященной 75-летиго кафедры общей и военной эпидемиологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова и 90 летию со дня рождения академика В.Д. Белякова/ под ред. П.И.Огаркова- Санкт-Петербург, 19-20 апреля, 2012 года. СПб - С.248-249.

12. Устойчивость штаммов Streptococcus pneumonia к антибактериальным химиопрепаратам, выделенных у лиц молодого возраста/ С.В. Скрыль, А.А. Шепарев, О.А. Чулакова// Вестник РГМУ, 2012, Специальный выпуск №1- С. 323.

13.Результаты молекулярно-генетического мониторинга антибиоти-корезистентнсти штаммов S.pneumonia, C.pneumonia, М. pneumonia, выделенных при внебольничных пневмониях у лиц молодого возраста/С.В. Скрыль, Е.С.Носач, А.В.Мартынова// Журнал инфектологии,-2012,- Т.4, №3-С.77.

14. Результаты молекулярно-генетического мониторинга штаммов S.pneumoniae, выделенных у пожилых/ С.В. Скрыль, А.А. Шепарев, Е.С. Носач, А.В. Мартынова// Эпидемиология и вакцинопрофилактика.-2013-Т.70, №3.-С. 42-47.

15. Этиологический спектр возбудителей внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста/ Е.С. Носач, С.В. Скрыль// Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов 12-й Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием ( 14-15 апреля 2011 гг.)-Владивосток: Медицина ДВ, 2011. С.246-247.

16.Внебольничные пневмонии: проблемы современной эпидемиологии. Эпидемиологические аспекты инфекций респираторного тракта/ А.В.Мартынова, Е.С.Носач, С.В. Скрыль// LAP LAMBERT Academic Publishing, 2012. 101 С.

17. Изучение распространенности гомологичных участков в геноме микроорганизмов- возбудителей атипичных пневмоний / Е.С.Носач, А.В. Захаров, А.В. Фисенко// Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов 12-й Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием ( 14-15 апреля 2011 гг.)- Владивосток: Медицина ДВ,- 2011- С.245-246.

18. Etiology pathogens structure in community-acquired pneumonias and COPD exacerbations / E.S. Nosuch, A.V.Martynova, A.A. Sheparyov// Eur Respir J 2011; 38: Suppl. 55-P.549.

19. Epidemiology of community-acquired pneumonias in closed collectives/ ES Nosuch, AV Martynova, SV Skryl//Internal Medicine Journal, 2010, Volume 40, Issue Suppl, SI-P.137.

20. Микробиологические особенности диагностики атипичных внебольничных пневмоний в закрытых коллективах/ Е.С. Носач, А.В. Мартынова// Тихоокеанский медицинский журнал, 2010, № 3, С.98.

21. Ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости внебольничными пневмониями в закрытых коллективах / Е.С. Носач, С.В.Громов, А.В. Мартынова// Тихоокеанский медицинский журнал, 2010, № 3, С.98.

НОСАЧ Екатерина Сергеевна

Микробиологические аспекты диагностики хламидийных и микоплазменных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых коллективах.

03.02.03 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 20.11.2013 г. Формат 60 х 84/ie Бумага писчая. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии ООО "Литера V", 690091, г. Владивосток, ул. Светланская, 31В e-mail: litera_v@mail.ru