Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Методы выявления и изучение молекулярно-генетических свойств изолятов вирусов оспы птиц

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Методы выявления и изучение молекулярно-генетических свойств изолятов вирусов оспы птиц"

На правах рукописи

ЕЛАТКИН Николай Павлович

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСОВ ОСПЫ ПТИЦ

03.02.02 «Вирусология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005060318

Владимир — 2013

005060318

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г.Владимир.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Дрыгин Владимир Викторович

Официальные оппоненты:

Рыбаков Сергей Сергеевич - доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г.Владимир, начальник научно-образовательного отдела;

Балышева Вера Ивановна - доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г.Покров, ведущий научный сотрудник.

Ведущая организация - Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»), г.Москва.

Защита диссертации состоится 2Т апреля 2013 г. в 12 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г.Владимир, мкр. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и на сайте www.arriah.ru

Автореферат разослан 22 марта 2013 г.

Ученый секретарь /

диссертационного совета

Жбанова Татьяна Валентиновна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Оспа птиц (ОП) - вирусное заболевание домашних и многих видов диких птиц, распространенное во многих странах мира с развитым птицеводством. Возбудителем оспы птиц является ДНК-содержащий эпителиотропный вирус рода Avipoxvirus, подсемейства Cha rdop ох viril ше, семейства Poxviridae, в котором насчитывается 10 видов (ICTV, 2012). Наибольший экономический ущерб птицеводству причиняет вирус оспы кур (ВОК, fowlpox), который определен как типичный вид данного рода (Tripathy D.N., 2003).

Оспа кур наносит птицеводческим хозяйствам экономический ущерб, вызывая смертность до 50%, снижение яйценоскости и приводя к вынужденному убою больных и переболевших птиц (S.I. Jarvi, 2008). Специфическая вакцинопрофилактика оспы птиц применяется не во всех хозяйствах, что сохраняет возможность для распространения заболевания.

Эффективность мероприятий по борьбе с оспой птиц во многом зависит от своевременного выявления возбудителя. Диагноз основывается на данных клинических и патологоанатомических наблюдений, оценки эпизоотической ситуации и результатах комплекса лабораторных исследований с выделением вируса.

Лабораторная диагностика оспы птиц включает выделение вируса на хорионаллантоисной оболочке (ХАО) SPF-эмбрионов кур, гистологических исследованиях и электронной микроскопии (Tripathy D.N., 2003). Данные методы хотя и достаточно надежны, но весьма трудоемки и требуют значительного времени.

Лабораторные методы, основанные на выявлении генетического материала вируса оспы птиц (ВОП), обладают более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с другими методами и сокращают время постановки диагноза до 4-5 часов с момента отбора проб. В последнее время появились методы ПЦР для выявления ВОП (Huw Lee & Hwa Lee, 1997; Jarmin S., 2006, Amano et al., 1999; Boulanger et al., 2002;

Батченко, 2006). Сравнительно недавно для выявления ВОП разработан такой метод, как ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) (Hauck, 2009). Метод ПЦР-РВ более чувствителен по сравнению с обычной ПЦР и позволяет проводить количественный анализ исследуемого гена. Одним из недостатков метода ПЦР является возможность ингибирования реакции при исследовании проб патологического материала. Для контроля процесса выделения ДНК и наличия ингибиторов реакции в исследуемой пробе используется внутренний контрольный образец (ВКО), т.е. гетерологичная ДНК, которая добавляется в пробу перед выделением, а также положительный контрольный образец (ПКО).

Известные виды и штаммы ВОП могут значительно отличаться по биологическим и генетическим свойствам (Afonso, 2000), поэтому необходимо не только выделять изоляты, но также проводить их изучение. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов даёт возможность устанавливать филогенетические связи ВОП. Чаще всего для этого анализируют участок гена P4b (fpvl67) и H3L (fpv 140) (Huw Lee L, 2000, Jarmin S, 2006), кодирующие структурные иммунодоминантные белки ВОП. Необходимо отметить, что генетическое разнообразие изолятов ВОП, встречающихся на территории РФ, остаётся в настоящее время малоизученным.

Поскольку используются живые вакцины против оспы кур, необходимо дифференцировать полевые изоляты вируса от вакцинных штаммов. Работа, проведенная Susan A. Jarmin с коллегами (Jarmin S, 2006), позволила выявить генный локус Н9, который может быть использован для различия полевых изолятов оспы кур от вакцинных штаммов.

Имеются свидетельства того, что вирус ретикулозндотелиоза птиц (РЭВ) участвует в патогенезе вируса оспы кур (ВОК), увеличивая его вирулентность за счет подавления иммунного ответа (Singh Р, 2005). РЭВ — иммуносупрессивный ретровирус. Как правило, вирулентные штамма ВОК имеют полногеномную последовательность РЭВ в своём геноме, в то время

как вакцинные штаммы несут только длинные концевые повторы (LTR) (Hauck R., 2009).

Исходя из вышеизложенного, разработка и усовершенствование методов выявления ВОП в пробах патологического материала, дифференциация вакцинных штаммов от полевых изолятов, а также изучение молекулярно-генетических свойств выделенных изолятов ВОП является актуальной задачей.

Степень разработанности проблемы. Отечественными исследователями опубликован ряд рекомендаций по борьбе с оспой птиц (Новочеркасск, 1984; Кишинёв, 1989), разработаны вакцины против оспы птиц и изучены их свойства (Черкезова Т.В., 1989; Бочарников A.B., 2003; Николаева И.П., 2003; Смирнов В.Н., 2003; Черкезова Т.В., 2003; Бочарников A.B., 2004; Похвальный С.А., 2011). Предложены системы ПЦР и ПЦР в режиме реального времени для выявления ВОП (Huw Lee & Hwa Lee, 1997; Hauck, 2009; Jarmin S., 2006). Отечественными исследователями разработан метод гнездовой ПЦР на ген тимидинкиназы для выявления ВОП (Батченко Г.В., 2006).

Цель и задачи исследования. Основной целью данных исследований являлась разработка и усовершенствование методов выявления и дифференциации ВОП, а также изучение молекулярно-генетических свойств выделенных изолятов.

Для достижения поставленных целей было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать метод выявления ВОП на основе полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с рекомбинантными положительным и внутренним контрольными образцами.

2. Определить первичную нуклеотидную последовательность и провести филогенетический анализ фрагментов генов P4b, Fpvl40 и генного

локуса Н9 полевых изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., а также 5 вакцинных и одного полевого штамма ВОК.

3. Разработать метод выявления генома вируса ретикулоэндотелиоза (РЭВ) в геноме ВОП с использованием ПЦР и провести анализ изолятов и штаммов ВОП на наличие встроенной последовательности РЭВ.

4. Изучить молекулярно-генетические свойства изолятов и штаммов

ВОП.

Научная новизна результатов исследования.

1. Разработаны методы выявления ВОП с помощью ПЦР и ПЦР-РВ с рекомбинантными ПКО и ВКО.

2. Определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов Р4Ь, Иру 140 и генного локуса Н9 изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., а также пяти вакцинных штаммов и штамма ВОК для контрольного заражения. Проведен филогенетический анализ изолятов и штаммов ВОП с использованием полученных последовательностей.

3. Разработан метод выявления встройки генома РЭВ в ВОП с использованием ПЦР и проведен анализ изолятов и штаммов ВОП на наличие встроенной последовательности РЭВ.

Практическая значимость работы. С помощью разработанных методов выявления генома ВОП на основе ПЦР исследовано 65 проб патологического материала от кур, голубей и диких птиц, поступивших в 2008-2012 гг. из России, Украины и Казахстана. В 16 пробах от кур и 3 пробах от голубей был выявлен ВОП. Установлено, что из 18 выявленных изолятов 16 являются вирусами оспы кур и 2 - вирусами оспы голубей. Разработаны методы, позволяющие дифференцировать полевые изоляты ВОК, выделенные в России, от вакцинных штаммов. 18 изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., пять вакцинных и один штамм ВОК для контрольного заражения были исследованы на наличие генома вируса ретикулоэндотелиоза птиц. Изучены молекулярно-генетические свойства изолятов и штаммов ВОП.

Научные результаты, выносимые на защиту:

Методы выявления ВОП на основе ПЦР и ПЦР-РВ с рекомбинантным положительным и внутренним контролем.

Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов Р4Ь, Рру140 изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., а также 5 вакцинных и одного штамма ВОК для контрольного заражения.

Способ дифференциации полевых изолятов ВОК от вакцинных штаммов на основе анализа генного локуса Н9.

Результаты анализа изолятов и штаммов ВОП с помощью ПЦР и ПЦР-РВ на наличие встроенной последовательности РЭВ.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальность 03.02.02 Вирусология, охватывает проблемы инфекционности вирусов, разработки мер и средств диагностики вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследования — генной инженерии, изучение генетических и негенетических взаимодействий между вирусами, эпидемиологии и путей распространения вирусных инфекций, изучение путей передачи вирусов, выявление естественных хозяев, разработку мер диагностики вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем. В диссертационной работе проведены исследования по разработке методов ПЦР для выявления ВОП, а так же исследования молекулярно-биологических и филогенетических свойств изолятов ВОП.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 4, 6, 8, 10.

Апробация результатов исследования. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Учёного совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2010-2012 гг., доложены и опубликованы на Международных научно-практических конференциях молодых ученых (Россия, 2010г.; Россия, 2012г.) и Международной научно-практической

конференции «Трансмиссивные болезни животных: актуальные аспекты биобезопасности и контроля» (Крым, Украина, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 работы опубликованы в изданиях, включенных в перечень высшей аттестационной комиссии (ВАК) РФ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, приложения. Список использованной литературы включает 154 источника. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 7 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.

Личный вклад автора в выполнении работы. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ФГБУ «ВНИИЗЖ» к.б.н. Колосову С.Н., вед. биологу Ушаковой А.Н., к.б.н. Зинякову Н.Г., д.б.н. Мудрак Н.С., вед. вет. врачу Похвальному С.А., к.б.н. Андрейчуку Д.Б., к.в.н. Чвале И.А. за помощь в проведении отдельных этапов работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы

Вирусы. В работе использовали изоляты ВОП, выделенные из полевых образцов, отобранных от кур, голубей и диких птиц на территории Российской Федерации в 2008-2012 гг., изоляты ВОП, полученные из ННЦ «ИЭКВМ» (г. Харьков, Украина), штамм для контрольного заражения Кучинский (ФГБУ «ВГНКИ», Москва), вакцинные штаммы ВОП: КЭМ-7 (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), НР-В (AVINOVA), «К» (Авивак), ВГНКИ 3/7 («ПЗБ», Покров), Gibbs (Авивак). Также, в работе использовали штаммы вируса осповакцины, Mycoplasma gallisepticum, вируса болезни Марека, аденовируса, вируса инфекционного ларинготрахеита.

Праймеры. Праймеры, использованные в работе, были синтезированы НПО «Синтол» (г. Москва) и ООО «Бигль» (г. Санкт-Петербург).

Реактивы. В работе были использованы реактивы фирм «Promega», (США), «Fermentas» (Литва), «Invitrogen» (США), «Вектор» (Россия), «Applied Biosystems» (США), «Sigma» (Германия), «BioOptica» (Италия), «Panreac» (Испания), «Stratagene» (США), ООО «Биоком» (Россия), ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Россия).

2.2. Методы

Выделение ДНК. Для выделения ДНК использовали препараты вируссодержащих суспензий ХАО, 5% суспензию тканей исследуемых органов. ДНК выделяли с помощью набора БиоКом (Москва, Россия).

Полимеразная цепная реакция. Реакционную смесь предварительно прогревали при 95°С в течение 5 мин. Сорок циклов ПЦР проводили при следующем температурном режиме: денатурация при 95°С в течение 30 с, отжиг праймеров при 57°С в течение 30 с, элонгация при 72°С в течение 1 мин. на элонгацию 1000 нуклеотидов. Реакции проводили в амплификаторе DNA Engine Dyad Cycler («BioRad», США).

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. Реакцию проводили в амплификаторе Rotor-Gene 6000 («Corbett Life Science», Австралия). Реакционную смесь предварительно прогревали при 95°С в течение 5 мин. Сорок циклов ПЦР проводили при следующем температурном режиме: денатурация при 95°С в течение 15 с, отжиг праймеров при 55°С в течение 30 с, элонгация при 72°С в течение 30 с.

Получение плазмид, несущих последовательности генов Р4Ь и Ml. Для клонирования гена Р4Ь использовали плазмидный вектор pGEM-TEasy («Promega», США). Для наработки кДНК гена Р4Ь использовали штамм вируса оспы кур «КЭМ-7». Для клонирования гена Ml использовали плазмидный вектор рТКР7,5 («Вектор», Новосибирск). Для наработки кДНК гена Ml использовали штамм вируса гриппа птиц A/duck/Novosibirsk/02/05 H5N1.

Определение первичной нуклеотидной последовательности фрагментов кДНК. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов кДНК ВОП осуществляли с помощью набора BigDye Terminator Cycle Sequencing kit («Applied Biosystems», США) на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 («Applied Biosystems», США), согласно инструкции производителя.

Нуклеотидный анализ последовательностей ПЦР-ампликонов. Сравнение последовательностей, полученных из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), и полученных в исследовании, проводили с использованием программы «Clustal W» пакета программ BioEdit 7.0.5.3. Для филогенетического анализа использовали пакет программ MEGA 3.1.

Гистологические исследования тканей. Фиксированные гистологические препараты тканей готовили согласно стандартной методике. Кусочки органов фиксировали в формалине, с последующей заливкой в парафин. Срезы изготавливали по общепринятым методикам, затем окрашивали гематоксилином и эозином (Avian Histopathology, 2008).

Статистическая обработка результатов. Данные обрабатывались с использованием пакета прикладным программ StatSoft, версия 6.0.

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.3.1. Выбор праймеров для ПЦР и ПЦР-РВ. В результате сравнительного анализа опубликованных систем праймеров и их тестирования для проведения ПЦР были выбраны праймеры на участок гена корового белка Р4Ь, предложенные Huw Lee и Hwa Lee (Huw Lee, Hwa Lee, 1997) (Рис.1). Также была разработана система праймеров для проведения ПЦР в режиме реального времени (Рис.1) на последовательность участка данного гена. Помимо этого, для создания тест-системы на основе ПЦР-РВ были выбраны праймеры, предложенные Hauck (Hauck, 2009).

2.3.2 Оптимизация параметров ПЦР и ПЦР-РВ. С использованием различных изолятов и штаммов ВОП методы ПЦР и ПЦР-РВ были

оптимизированы по температурному профилю реакции и составу реакционной смеси.

Рнс.1. Схема расположения праймеров для амплификации фрагмента гена Р4Ь в ПЦР (А) и ПЦР-РВ (Б)

Примечание: Нумерация показана по последовательности гена Р4Ь штамма Fowlpox challenge virus FPV USDA (номер последовательности в GenBank: AF198100). Для продукта амплификации указана длина. Буквами F и R обозначены прямой и обратный праймер, соответственно.

2.3.3. Аналитическая чувствительность ПЦР и ПЦР-РВ.

Аналитическую чувствительность определяли путем постановки реакции с ДНК, выделенной из десятикратных разведений препарата вакцинного штамма вируса оспы кур "КЭМ-7" с известным инфекционным титром, а также при использовании в качестве матрицы рекомбинантной плазмиды pGEMT4BIl, содержащей фрагмент гена Р4Ь известной концентрации. Чувствительность метода ПЦР, определенная с разведениями препарата вакцинного штамма "КЭМ-7" вируса оспы кур, составила 101'4 ЭИД50/мл или 0,125 ЭИД50/реакцию, а при использовании в качестве матрицы рекомбинантной плазмиды - 1620 копии/мл или 8,1 копии/реакцию. Чувствительность метода ПЦР-РВ, определенная с разведениями препарата вакцинного штамма "КЭМ-7", вируса оспы кур составила 1,19 ЭИД50/мл или 0,059 ЭИД50/реакцию, а при использовании в качестве матрицы рекомбинантной плазмиды — 400 копии/мл или 2,0 копии/реакцию.

2.3.4. Разработка положительного контроля для ПЦР и ПЦР-РВ. В качестве положительного контроля была получена рекомбинантная плазмида

pGEMT4BIl со встройкой участка гена Р4Ь вируса оспы птиц размером 1476 п.н., включающая подпраймерные области для диагностических ПЦР и ПЦР-РВ (рис.2.). Для наработки кДНК использовали изолят ВОК Chicken/RusRjazan/ FPV/1641/09.

2.3.5. Разработка внутреннего контрольного образца для ПЦР-РВ. При разработке ПЦР-РВ в качестве ВКО использовали рекомбинантный плазмидный вектор рТКР 7.5/М, содержащий ген М1 вируса гриппа птиц (Рис.2). К преимуществам разработанного ВКО на основе плазмиды следует отнести высокую устойчивость плазмиды к многократным циклам замораживания-оттаивания, а также возможность точной количественной оценки вносимой в реакцию кДНК. Было показано, что внесение ВКО в реакционную смесь практически не снижало эффективность выявления гена

Рис. 2. Схема плазмидных векторов рСЕ1У1Т4ВИ (А) и рТКР 7.5/М (Б) 2.3.6. Оценка эффективности амплификации фрагмента гена Р4Ь в

ПЦР-РВ. Для оценки эффективности амплификации были протестированы десятикратные разведения препарата плазмиды рОЕМТ4В11 с известной концентрацией. Для выявления взаимного ингибирования систем праймеров и зондов при одновременной амплификации двух матриц были протестированы разведения смеси плазмиды рОЕМТ4В11 с плазмидой рТКР7.5/М и разведения плазмиды рСЕМТ4В11 в отдельности.

При одновременной амплификации двух матриц, по сравнению с амплификацией одной матрицы, наблюдали некоторое снижение

Р4Ь ВОП.

А.

disrupted MCR к SP6 promoter

эффективности реакции с 86,5% до 81,2% (Рис.3), которое не оказывало существенного влияния на чувствительность реакции.

25 20 5 15 10 5

1__

30 25 20 "15 10 5

2__

Рис. 10. График определения эффективности амплификации 10-кратных разведений плазмиды pGEMT4BIl при отсутствии (1) и при наличии (2)

ВКО (плазмнда рТКР 7.5/М) Примечание: На графике 1 показаны результаты полученные при амплификации только участка вставки гена 4Ь, на графике 2 - результаты полученные при одновременной амплификации участков вставок генов 4Ь и М.

2.3.7. Специфичность ПЦР и ПЦР-РВ. Для оценки специфичности ПЦР и ПЦР-РВ тестировали 19 различных штаммов и изолятов вируса оспы птиц, вирус осповакцины штамма ЛИВП, а также другие ДНК-содержащие патогены птиц: Mycoplasma gallisepticum, вирус инфекционного ларинготрахеита, аденовирус 4 серотипа, вирус болезни Марека. Положительный результат был выявлен только в реакции со штаммами и изолятами вируса оспы птиц.

2.3.8. Выявление вирусов оспы птиц в пробах биоматериала. С использованием разработанных методов было исследовано 65 проб патологического материала от кур, голубей и диких птиц, поступившие в

период с 2008 по 2012 гг. В результате проведенных исследований методом ПЦР и ПЦР-РВ вирус оспы птиц был выявлен в 16 пробах из 10 регионов России, а также 2 пробах с Украины. Из 18 положительных проб, 15 проб были получены от кур и 3 пробы от голубей. Большинство положительных проб были получены в весенний и осенний период (Рис.4), что может быть следствием сезонности распространения заболевания.

10 -—

9--г-т-

8--- !

7---

6----

5---

4 - -

3--г-т— --'

2--п-1-і— — -

Рис. 4. График зависимости числа случаев выявления ВОП от месяца

года

2.3.9. Выявление ВОП гистологическим методом у экспериментально заражённых птиц. Для проведения гистологических исследований отбирали участок кожных тканей перепонки крыла с характерными поражениями через две недели после внутрикожного заражения вирусом оспы кур изолята СЫскеп/11и5_1уапоуо/ РР\71857/10.

В результате микроскопических исследований окрашенных гематоксилин - эозином препаратов были получены фотографии участков перьевых фолликулов с характерными эозинофильными серповидными тельцами включений. Наблюдали увеличение в размере поражённых клеток в два-три раза по сравнению с отрицательным контролем, и отмечали паутиновидные цитоплазматические структуры.

2.3.10. Анализ вариабельности последовательности гена Р4Ь (Гру167) вируса оспы птиц. На основании выравнивания 107 нуклеотидных

последовательностей была построена дендрограмма, отражающая генетическое родство изолятов и штаммов вирусов оспы птиц по участку гена Р4Ь (Рис. 5) размером 479 п.н.

Подгруппа 3 пингвин, альбатроь сокол, голубь / эдгруппа4

Подгруппа 2 хищные птицы Ю-В Азии

индейки, голуби, перепелка, куропатка и

Pigeon/Ukraine/ PGPV/11 Pigeon/RusVladimir/ PGPV/1846/10

Подгруппа 6 дикие птицы из центра дикой природы в Виргинии

Подгруппа 7 фламинго, голуби, скворец

Подгруппа 1 куры, индейки, перепелки и ДР-

Chicken/RusBelgorod/ FPV/I260/08

Chicken/RusLipetsk/ FPV/1580/09

Chicken/Rus_Primorskiy/FPV/l 648/09

Chicken/Rus_Rjazan/ FPV/1641/09

Chicken/Rusjvanovo/ FPV/1857/10

Chicken/RusJCaluga/ FPV/1871/10

Chicken/Rus Belgorod/ FPV/1982/11

Chicken/Rus_Vladimir/ FPV/2017/11

Chicken/Rus_Vladimir/ FPV/2158/11

Pigeon/Rus_Vladimir/ FPV/2169/11

Chieken/Rus_Amurskaja/FPV/2318/1/

Chicken/Ukraine/ FPV/11

КЭМ-7, HP-B, «К», ВГНКИ 3/7,

Gibbs _____

Подгруптта 11

попугаи

Подгруппа 8 Гавайские дикие

Подгруппа 9 канарейки, воробьи, синицы, вороны и др

Подгруппа 10

японская

перепёлка

Рис.5. Дендрограмма, отражающая филогенетическое родство вирусов оспы птиц по участку гена Р4Ь

Анализ филогенетической дендрограммы, построенной на основе

нуклеотидных последовательностей гена Р4Ь, позволяет выявить наличие

трёх генетических групп среди вирусов оспы птиц: вирусов оспы кур и

схожих с ними вирусов, вирусов оспы канареек (ВОКР) и схожих с ними вирусов и вирусов оспы попугаев. Все выделенные в ходе работы изоляты из России и Украины относились к группе вирусов оспы кур и схожих с ними вирусов. Все изоляты от кур и один изолят от голубя относятся к подгруппе 1, в которой находится все опубликованные последовательности изолятов от кур. Два изолята от голубей, исследованные в ходе работы, из России и Украины объединены в подгруппе 4 вместе с тремя изолятами от голубей из Германии, Индии и Англии.

Чтобы увеличить участок анализируемой последовательности гена Р4Ь были подобраны праймеры, позволяющие амплифицировать участок гена размером 1281 п.н. По результатам филогенетического анализа последовательностей расширенного участка гена Р4Ь изолятов ВОП, была установлена высокая гомология последовательностей (99-100%), за исключением изолята, выделенного от голубя (приблизительно 96%) (Рис.6).

Роум1рох/НР444 ■НР-В

Рсж1рох/РР9 Ром/1рох сИаИепде \лгиэ

Ыапмо/СЫскеп/10/2010 ир<И5к/СЫскеп/09/2009 Рптогьк/СЫскепП1/2009 Ка1ида/СШскеп/10/2010 Ш<ЧтШСЫскеп/11/2009 Ве1догос1/СМскеп/01/2011 Ве1догос1/СЫскеп/03/2011 У!а<ПтШСЫскеп/05/2011 РоуфохЛэо^е НР-438МипюЬ К

VGNKI

Рс»1рохЛзо1а1е СЫпа 1/1асНт1г/Р1деоп/09/2010 РфеопрохЛэоЫеЗапЭг -Сапагурох/АТСС \ZR-111

Рис. 6. Деидрограмма, отражающая генетическое родство вирусов оспы птиц по участку гена Р4Ь

Примечание: Изоляты и штаммы, секвенированные в ходе исследования, обозначены жирным шрифтом и курсивом. Дендрограмма построена с использованием метода присоединения соседей.

2.3.11. Анализ вариабельности последовательности гена НЗЬ

(Гру140) вируса оспы птиц. Был проведен анализ последовательностей гена

fpvl40 изолятов ВОП. При этом наблюдается полиморфизм длины этого

гена. Между исследованными изолятами и штаммами вирусов кур и голубей,

различие составляет 14 п.н. (Рис.7).

и 1530 1540 1550 1560 1570 15* ТСТТвТ---------TTGCTTT7TS<3AAGTSGTTTJLSGWACG<5CS<5---------вГС?«

ИрвЪвк/ сШск еп/ 0 9 рс1»ог9к/сКл.сквп/09 к®1иде/сЫскеп/Ю «1ек8вп4гоу/^«г*п'/сЫскеп/09 кгаапоэ «гихЬ8к/В»1досо(1/сЫскеп/06 КЕМ-7 У0ЮЧЗУ7 НР-В К В6К/Ве1догой/с1и.сквп/11 Л>ис*еуес/У1а(11ш.г/сЬхскеп/11 к1пвяЬта/1гапоуо/сЫ.сквп/10 А1вкя»пагоу/У1ас11яаг/с1и.скеп/11 У1ай1а1г/р1двоп/10 ^^ иксв1пв/р1авоп/10

Рис. 7. Выравнивание участка нуклеотидных последовательностей ВОП,

показывающее различия в длине нуклеотидной последовательности гена

1ру140 у изолятов ВОК и ВОГ, обнаруженные в ходе работы Примечание: последовательности изолятов вируса оспы голубей отмечены стрелками

На основании выравнивания 43 последовательностей была построена дендрограмма, отражающая генетическое родство изолятов и штаммов вирусов оспы птиц по участку гена Гру140 (Рис.8). Анализ нуклеотидных последовательностей гена 1ру140 позволяет выявить наличие трёх генетических групп: вирусов оспы кур и схожих с ними вирусов; вирусов оспы голубей, индеек и схожих с ними вирусов, а также вирусов оспы канареек и схожих с ними вирусов.

Первая группа включает в себя все представленные последовательности изолятов, выделенных от кур, в том числе полученные в ходе работы. Два изолята от голубей из России и Украины относятся к группе вирусов оспы голубей, индеек и схожих с ними вирусов. Анализ данного гена в отличие от гена Р4Ь позволяет дифференцировать вирусы индеек от вирусов голубей (ВОГ).

AM071392/HP-1/Chicken/Germany lipetsk/chicken/09 AI«ksandrov/Vladimir7chicken/11 aleksandrov/Rjazan/chieken/09 Gibbs

kaluga/ehieken/10 FR852587/Turkey/Austria/10 primorsk/chicken/09 HP-B

FR852588/Gallus gallus/Austria/10 HM481410/lndia/golden pheasant/2008 К

VGNK13/7

HM481413/lndiafindian peacock/2008 BGK/Belgorod/chicken/11 Jurevec/Vladimir/chicken/11 AM071393/CVL 174/4/Chicken/UK/04 krasnojaruzhsk/Betgorod/chicken/08 AM071395/Diftosec CT/Chicken HM481414/lndia/silver pheasant/2008 КЕМ-7

AM071394/Nobilis Variole W/Chicken HM481412/lndia/indian peacock/2008 HM481415/India/Sparrow/2009 kineshma/lva novo/chicken/10 HM481411/lndia/golden pheasant/2008

i EF133691/Buteo buteo/PA153/Uaty/05

BOK

Г"1

|AM

99 IAM'

Ю01AM071390/CVL 2/11/66/Tur^ey/UK

"IAM071391/CVL 10/12/Turkey/ltaly/98 J AM071388/CVL 353/albatross/Falkland/87 99 IAM071515/CVL l381/Falcon/UAEmirates/96 AM071389/Pigeon/Peekham/UK

ВО Индеек

i HM481417/lndia/common wood pigeon/2009 1 HM481416/lndia/little brown dove/2009

IVIadimir/pigeon/10 .. Ukrai ne/pi geon/10

65 | GQ855299/Cya nocitta cris tat a/Canada/03 I AM 071513/ Hou bara Bustard/Morocco/04

IAM071512/CVL 1445/Canary/UK/97 AM071510/CVL 23/Sparrow/UK AM071511/CVL 9037/Sparrow/UK

ВОГ

BOKP

Рис. 8. Дендрограмма, отражающая генетическое родство вирусов оспы птиц по участку гена Гру140 Примечание: Последовательности, полученные в ходе работы отмечены синим цветом. Группы вирусов оспы кур, голубей и индеек, канареек обозначены соответственно зелёным, синим и красным цветом. Дендрограмма построена с использованием метода присоединения соседей.

2.3.12. Анализ последовательности генного локуса Н9 вируса оспы

кур. Был проведен анализ нуклеотидных последовательностей генного

локуса Н9 (Рис. 9). ПЦР-продукты были получены для всех изолятов и

штаммов вируса оспы кур. Размер ПЦР-фрагмента составил приблизительно 2200 п.н. за исключением вакцинного штамма «ВГНКИЗ/7», с которым нарабатывается два ПЦР-фрагмента размером 2200 и 1000 п.н., что может быть следствием гетерогенности данного штамма. Анализ показал, что последовательность в 1000 п.н. штамма «ВГНКИ 3/7» идентична с вакцинными штаммами Chick'N'Pox и FPV M и штаммом FPV USDA. Дополнительная последовательность в 1207 п.н., обнаруженная во всех изолятах и штаммах, за исключением штаммов «Кучинский» и «ВГНКИ 3/7», сходна с последовательностями двух европейских полевых (НР1 и FPV 174) и трех вакцинных штаммов: Nobilis Variole W (Nobilis), Diftosec CT (Diftosec), Poxine.

Fnv241 удлинённый

830 п.н. "незначимой" I последовательности

Fpv241

ОРС схожие с начало NPV313.

1,2 т.п.н. дополнительной последовательности

M1396F

400R 400F

замена Л на С

800R 800F

1200R 1200F 1600R I600F M1411R

деления СТАТ

Рис. 9. Схема расположения принтеров для амплификации и секвенирования, ОРС, положения основных замен и вариантов структуры генного локуса Н9

Примечание: Буквами I и К обозначены прямой и обратный праймеры, соответственно. Горизонтальными стрелками обозначены ОРС, жирными вертикальными стрелками показано положение основных замен.

Анализ нуклеотидных последовательностей генного локуса Н9, полученных в ходе работы и имеющихся в базе данных СепВапк позволяет разделить изоляты и штаммы на четыре группы (табл. 1) по отличиям в нуклеотидных последовательностях.

Таблица 1

Группировка изолятов и штаммов ВОП по основным

генетическим маркерам в локусе Н9

Название изолята/штамма Наличие дополнительной последовательности 1,2 т.п.н. Замена А на С Делеция СТАТ

AM396439/Commercial vaccine FPV М (Websters) - - -

«ВГНКИ 3/7» - - -

FPV USD A AF198100 - - -

Chicken/Rus Ivanovo/FPV/1857/10 + - +

Chicken/Rus Lipetsk/FPV/1580/09 + - +

Chicken/Rus_Primorskiy/FPV/1648/09 + - +

Chicken/Rus Kaluga/FPV/1871/10 + - +

Chicken/Rus Rjazan/FPV/1641/09 + - +

Chicken/Rus Belgorod/FPV/1260/08 + - +

Chicken/Rus_Belgorod/FPV/1982/11 + - +

Chicken/Rus_Vladimir/FPV/2017/ll + - +

Chicken/Rus_Vladimir/FPV/2158/ll + - +

AM396441 /Duphar Poxine + - -

AM396438/Commercial vaccine Diftosec (Merial) + - -

A M396440/IIP1 -200/G e rmany + - -

A\1396436/FPV174/04/United Kingdom + - -

HP-B - -

К

Gibbs

KEM-7

Chicken/Ukr/ FPV/11 - -

Примечание: + - генетический маркер присутствует у данного изолята/штамма, — -отсутствует. Полевые изоляты выделены жирным шрифтом

К первой группе относятся три штамма: вакцинный штамм ЯРУ М

(\УеЬз1ег5), патогенный штамм для контрольного заражения РРУ ШЭД и отечественный вакцинный штамм «ВГНКИ 3/7». Во всех этих штаммах не обнаружено дополнительной последовательности 1,2 т.п.н. Ко второй группе относятся все российские полевые изоляты, выявленные в ходе работы. У них отсутствует замена нуклеинового основания аденин (А) на цитозин (С), но есть делеция 4 нуклеотидов СТАТ. Можно предположить, что изоляты, циркулирующие в настоящее время на территории России, генетически родственны. К третьей группе относятся два вакцинных штамма: 01йо5ес

(Merial), Duphar Poxine, и два полевых изолята из Германии и Англии: AM396440/HPl-200/Germany и AM396436/FPV174/04/United Kingdom. У них отсутствует замена основания А на С и нет делеции нуклеотидов СТАТ. К четвёртой группе относятся два зарубежных вакцинных штамма: НР-В («Avinova»), Gibbs («Intervet»), два отечественных вакцинных штамма: «К» («Авивак») и «КЭМ-7» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), а также изолят, выделенный от курицы из птицефабрики Украины. У них есть замена основания А на С и нет делеции нуклеотидов СТАТ.

Таким образом, выявленные различия позволяют проводить дифференциацию полевых изолятов, выявляемых на территории России, от вакцинных штаммов.

2.3.13. Выявление последовательности генома вируса ретнкулоэндотелиоза птиц (РЭВ) в геноме ВОП. Был проведен анализ изолятов и штаммов ВОП методом ПЦР с праймерами, рассчитанными на все гены РЭВ и на область встройки ДНК РЭВ в геном ВОП в гене Fpv202, а также методом ПЦР-РВ на ген gag РЭВ (Рис. 10).

Fpv202 5'-LTR gag pol ertv 3'-LTR

5LTRF1 370n.ii -> ч- gagF2 425п.н ?agRi polF2 320n.ii poIR2 envF2 430n.il envR2

5LTRR1 ' ' Re\ RT-I- Re\ RT-R

i(.vR'l'-l'r

Рис. 10. Схема структуры встроенного в ВОП генома РЭВ и расположения праимеров для амплификации генов РЭВ Примечание: Буквами Р и Я обозначены прямой и обратный праймеры, соответственно. Праймеры для ПЦР-РВ отмечены синим цветом

В ходе проведённого анализа изолятов и штаммов было установлено,

что все полевые изоляты ВОК имеют встройку полного генома РЭВ, в то

время как во всех вакцинных штаммах ВОК есть только длинные концевые

повторы РЭВ. Геном РЭВ не был обнаружен в обоих изолятах вируса оспы

голубей.

Результаты проведенного анализа на наличие последовательности полного генома РЭВ в полевых изолятах ВОК совпадают с анализом генного локуса Н9. Таким образом, проведение молекулярно-генетического анализа данных сайтов генома ВОК позволяет дифференцировать выявляемые полевые изоляты оспы кур от вакцинных штаммов.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы полимеразной цепной (ПЦР) и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с рекомбинантными положительным и внутренним контрольными образцами для выявления ВОП, аналитическая чувствительность которых составила 101'4 ЭИД50/мл (8,1 копийДНК/реакцию) и 1,19 ЭИД50/мл (2,0 копийДНК/реакцию), соответственно. С помощью разработанных методов геном ВОП выявили в 18 пробах.

2. В результате проведенных гистологических исследований эпителиальных тканей кожи кур, зараженных вирусом оспы кур изолята СЫскеп/11и5_1уапоУо/РРУ/1857/10, были обнаружены характерные эозинофильные тельца включений.

3. Определена первичная нуклеотидная последовательность фрагмента гена Р4Ь размером 578 п.н. и гена Рру140 размером 1983 п.н. 18 изолятов ВОП, 5 вакцинных и штамма ВОК «Кучинский». В результате проведённого филогенетического анализа установлено, что 22 изолятов и штаммов ВОП относятся к вирусам оспы кур, в то время как 2 изолята относятся к вирусам оспы голубей.

4. Разработан метод для амплификации участка гена Р4Ь 1281 п.н. на основе ПЦР. По результатам филогенетического анализа изолятов и штаммов ВОП было показано высокое внутривидовое сходство вирусов по этому участку гена.

5. Определены первичные нуклеотидные последовательности генного локуса Н9 14 изолятов ВОП, 5 вакцинных и полевого штамма ВОК

«Кучинский». Анализ последовательностей данного локуса позволяет дифференцировать полевые изоляты от вакцинных штаммов.

6. Разработаны методы ПЦР для выявления генома вируса ретикулоэндотелиза птиц и для выявления сайта встраивания генома РЭВ в геном ВОП. Анализ 18 изолятов ВОП, 5 вакцинных и одного полевого штамма ВОК на наличие встройки генома РЭВ показал, что в геноме всех полевых изолятов ВОК имеется полная геномная последовательность РЭВ, в то время как в вакцинных штаммах - только длинные концевые повторы РЭВ.

5. Практические предложения

В результате проведенных исследований разработаны следуюшие нормативные документы:

- «Методические рекомендации по выявлению вируса оспы кур с помощью полимеразной цепной реакции» (2010 г.);

- «Методические рекомендации по выявлению ДНК вируса оспы птиц методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с рекомбинантным положительным контролем» (2011 г.)

Данные методические рекомендации прошли комиссионные испытания, были одобрены Учёным советом, утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» и рекомендованы для использования при проведении диагностических и научных исследований.

6. Список использованной литературы

1. Бочарников A.B., Ковалишина H.H. К вопросу о продолжительности иммунитета у кур, вакцинированных различными дозами эмбрионвакцины против оспы птиц // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: метериалы Междунар. науч. конф., посвящ. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ», Владимир, 30-31 окт. 2003г. - Владимир, 2003. - С. 366-368.

2. Бочарников A.B., Кулаков В.Ю. Стабильность вакцинных штаммов вирусов инфекционного ларинготрахеита и оспы птиц // Ветеринария. — 2004. - № 3. - С. 22-24.

3. Культуральная вакцина против ньюкаслской болезни и оспы птиц // В.Н. Смирнов, А.Т. Кушнир, Д.В. Колбасов и др. / V Международный конгресс по птицеводству, Москва, 21-24 апреля 2003. - Москва, 2003. - С. 125-129.

4. Методика выявления генома вируса оспы кур методом полимеразной цепной реакции / Г.В. Батченко, С.Н. Колосов, Л.О. Щербакова, В.В. Дрыгин; ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2006. - 6с.

5. Николаева И.П., Седунова А.И., Талыбова О.Н. Культивирование вируса оспы кур // V Международный конгресс по птицеводству, Москва, 2124 апреля 2003. - Москва, 2003. - С. 103-105.

6. Оспа птиц и мероприятия по её профилактике в хозяйствах Ростовской области: рекомендации; Северо-кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт. — Новочеркасск, 1984. — 12с.

7. Похвальный С.А., Кулаков В.Ю. Иммунобиологические свойства аттенуированного штамма «КЭМ-7» вируса оспы кур // Ветеринария и кормление - 2011. - № 6. - С. 42-43.

8. Профилактика оспы птиц: рекомендации; Кишиневский сельскохозяйственный институт. - Кишинёв, 1989. - 8с.

9. Черкезова Т.В. Реактогенность, безвредность и иммуногенность вакцинного штамма «К» вируса оспы кур для цыплят суточного возраста // Деп. рукопись в РЖ сер. Ветеринария ВНИИиТЭИ Госкомпродзаг СМ СССР, ВАСХНИЛ, M., - 1989, № 7. - С. 28.

10. Черкезова Т.В. Формирование иммунитета к оспе у цыплят раннего возраста: автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Москва, 2003. - 18 с.

11. АААР. Avian Histopathology / ed. O.J. Fletcher. - 3rd ed. - Madison, WI: Omni Press, 2008.-438 p.

12. Boulanger, D., Smith T., Skinner M.A. Morphogenesis and release of fowlpox virus // J. Gen. Virol. - 2000. - Vol. 81. - P. 675-687.

13. Diversity, origins and virulence of Avipoxviruses in Hawaiian Forest Birds / S.I. Jarvi, D. Triglia, A. Giannoulis [et al] // Conserv. Genet. - 2008. -Vol. 9,N2.-P. 339-348.

14. Identification of the canarypox virus thymidine kinase gene and insertion of foreign genes / H. Amano, S. Morikawa, H. Shimizu [et al] // Virology. - 1999. - Vol. 256, 280-290.

15. Lee, H.L., Hwa Lee K. Application of the polymerase chain reaction for the diagnosis of fowl poxvirus infection // J. Virol. Methods. - 1997. - Vol. 63. - P. 113-119.

16. Retention of 1,2 kbp of 'novel' genomic sequence in two European field isolates and some vaccine strains of Fowlpox virus extends open reading frame fpv241 / S. Jarmin, R. Manvell, R.E. Gough [et al] // J. Gen. Virol. - 2006. - Vol. 87.-P. 3545-3549.

17. Serologic response against fowl Poxvirus and Reticuloendotheliosis virus after experimental and natural infections of chickens with Fowl Poxvirus / R. Hauck, C. Prusas, H. M. Hafez, D. Luschow // Avian Diseases - 2009. - V. 53. -P. 205-210.

18. The genome of fowlpox virus / C. L. Afonso [et al] // J. Virol. - 2000. -Vol. 74,-P. 3815-3831.

19. Tripathy D.N., Reed W.M. Poxvirus // Diseases of Poultry. — Ames, IA: Iowa State University Press, 2003. - P. 253-269.

20. ICTV avipoxvirus taxonomy. - URL: http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2007 (дата обращения: 22.10.12).

7. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Выявление генома вируса оспы птиц методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени / Н.ГТ. Елаткнн, Д.Б. Андрейчук, Н.С. Мудрак [и др.] // Молекулярная диагностика - 2010: сб. тр. VII Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - 2010. - Т. 2. - С. 95-97.

2. Клонирование генов иммунологически значимых белков вируса гриппа птиц / Н.П. Елаткин, Д.Б. Андрейчук, H.H. Власова [и др.] // Ветеринария и кормление. - 2010. - № 6. - С. 12-14.

3. Конструирование и использование рекомбинантной плазмиды pGEMT4b в качестве положительного контроля в диагностических тест-системах для выявления ДНК вируса оспы птиц методом полимеразной цепной реакции / Н.П. Елаткин, В.В. Дрыгин // Ветеринарна медицина. Вип. 95: міжвід. тем. наук. зб. - 2011. - С. 56-58.

4. Выявление вируса оспы птиц с помощью молекулярно-биологических методов на территории Российской Федерации в 2009-2011 гг. / Н.П. Елаткин, А.Н. Ушакова // Ветеринария и кормление. - 2011. - № 6 (ноябрь-декабрь). - С. 20-21.

5. Эмбриональный штамм "КЭМ-7" вируса оспы кур / С.А. Похвальный, Н.П. Елаткин // Ветеринария и кормление. - 2011. - № 6 (ноябрь-декабрь). - С. 42-43.

Подписано в печать 15 марта 2013-03-21 Формат 60x90 1/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 80 экз Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Елаткин, Николай Павлович, Владимир

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ

«ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ОХРАНЫ ЗДОРОВЬЯ ЖИВОТНЫХ»

04201356056 на правах рукописи

ЕЛАТКИН Николай Павлович

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСОВ ОСПЫ ПТИЦ

03.02.02 «Вирусология»

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -

доктор биологических наук, профессор ДРЫГИН Владимир Викторович

Владимир - 2013

СПИОК СОКРАЩЕНИЙ ВЗВ (IMV) - внутриклеточный зрелый вирус (the intracellular mature virus) ВКО - внутренний контрольный образец

BOB (IEV) - внутриклеточный оболочечный вирус (intracellular enveloped virus)

ВОГ - вирусов голубей ВОК - вирус оспы кур

ВОК (FWPV) - вирус оспы кур (fowl pox virus)

ВОКР (CNPV) - вирус оспы канареек (canary pox virus)

ВОП - вирус оспы птиц

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дПЦР - дуплекс ПЦР

ИФА - иммуноферментный анализ

кДНК - ДНК-копия с РНК матрицы

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

МЭБ (OIE) - международное эпизоотическое бюро

н.п. - нуклеотидные пары

HB (IV) - неинфекционный сферический незрелый вирис (non-infectious spherical immature virus) ОП - оспа птиц

OPC (ORF) - открытые рамки считывания (open reading frame) ПКО - положительный контрольный образец ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

РЭВ - вирус ретикулоэндотелиоза птиц

ТЦД - титр цитопатического действия

ФБР - фосфатно-буферный раствор

ФЭК - фибробласты эмбирионов кур

ХАО - хорионаллантоисная оболочка

ЦПЭ - цитопатогенный эффект

ЭИД - эмбриональное инфекционное действие

EEV - внеклеточный оболочечный вирус (extracellular enveloped virus) FBT - клетки трахеи эмбрионов быка

IMV - внутриклеточный зрелый вирус (intracellular mature virus)

IPTG - Изопропил-P-D-1 -тиогалактопиранозид

LTR (ДКП) - long terminal raped (длинные концевые повторы)

SPF - specific pathogen free (свободные от патогенов эмбрионы кур)

USDA - министерство сельского хозяйства США

VERO - клетки африканской зелёной обезьяны

X-Gal - бромо-хлоро-индоил-бета-О-галактопиранозид

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................7

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................13

2.1 Общая характеристика....................................................................................................................................13

2.2. Морфология......................................................................................................................................................14

2.3. Классификация............................................................................................................................15

2.4. Геном ВОП..........................................................................................................................................................................19

2.5. Морфогенез................................................................................................................................................................21

2.6. Взаимодействие вируса с организмом-хозяином........................................24

2.7. Культивирование ВОП................................................................................................................................25

2.8. ' Патогенез и распространение заболевания..........................................................26

2.9. Заболевание..............................................................................................................................................................29

2.10. Антигенная и генетическая вариабельность и филогения ВОП 32

2.11. Диагностика инфекции, вызываемой ВОП..........................................................35

2.12. Профилактика и лечение........................................................................................................................39

2.13. Вирус оспы птиц и вирус ретикулоэндотелиоза (РЭВ)..............................40

2.14. Вирусы оспы птиц в качестве вакцинных векторов....................................41

2.15. Заключение по обзору литературы........................................................................................44

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................................45

3.1. Материалы............................................................................................................................................45

3.2. Методы..............................................................................................................................................55

3.2.1. Выделение ДНК....................................................................................................................55

3.2.2. ПЦРиПЦР-РВ........................................................................................................................55

3.2.3. Очистка продуктов ПЦР для секвенирования и клонирования.. 57

3.2.4. Получение плазмид, несущих последовательности генов Р4Ь

и М1....................................................................................................................................................57

3.2.5. Определение первичной нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов к ДНК........................................................59

3.2.6. Нуклеотидный анализ последовательностей ПЦР-ампликонов 59

3.2.7. Гистологические исследования тканей..............................................................59

3.2.8. Статистическая обработка результатов........................................................60

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И

ИХ ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................................................................61

4.1. Разработка диагностических методов ПЦР для выявления

В ОП и идентификации вида вируса............................................................................61

4.1.1. Выбор праймеров для ПЦР и ПЦР-РВ................................................................61

4.1.2. Оптимизация параметров ПЦР....................................................................................63

4.1.3. Аналитическая чувствительность ПЦР и ПЦР-РВ......................................64

4.1.4. Разработка внутреннего контрольного образца для ПЦР-РВ.... 69

4.1.5. Оценка эффективности амплификации фрагмента гена Р4Ь в ПЦР-РВ..........................................................................................................................................72

4.1.6. Специфичность ПЦР и ПЦР-РВ..............................................................................................74

4.1.7. Разработка положительного контроля для ПЦР и ПЦР-РВ ... 75

4.1.8. Выявление вирусов оспы птиц в пробах биоматериала.......... 76

4.2. Изучение молекулярно-биологических свойств изолятов вируса оспы птиц.......................................................... 78

4.2.1 Выявление ВОП гистологическим методом у

экспериментально заражённых птиц................................... 78

4.2.2. Анализ вариабельности последовательности гена P4b (fpvl67) вируса оспы птиц........................................................................... 79

4.2.3. Анализ вариабельности последовательности гена H3L (fpvl40) вируса оспы птиц............................................. 91

4.3. Дифференциация полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса оспы кур............................................................. 96

4.3.1. Анализ последовательности генного локуса Н9 вируса оспы кур.............................................................................. 96

4.3.2. Выявление наличия последовательности генома вируса ретикулоэндотелиоза птиц в геноме ВОП.................................. 103

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................ 108

6. ВЫВОДЫ....................................................................... 114

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ................................. 116

8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................. 117

ПРИЛОЖЕНИЕ.............................................................. 131

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Оспа птиц (ОП) - вирусное заболевание домашних и многих видов диких птиц, распространенное во многих странах мира с развитым птицеводством. Возбудителем оспы птиц является ДНК-содержащий эпителиотропный вирус рода Avipoxvirus, подсемейства Chordopoxvirinae, семейства Poxviridae, в котором насчитывается 10 видов [82]. Наибольший экономический ущерб птицеводству причиняет вирус оспы кур (ВОК, fowlpox), который определен как типичный вид данного рода [144].

Оспа кур наносит птицеводческим хозяйствам экономический ущерб, вызывая смертность до 50%, снижение яйценоскости и приводя к вынужденному убою больных и переболевших птиц [66]. Специфическая вакцинопрофилактика оспы птиц применяется не во всех хозяйствах, что сохраняет возможность для распространения заболевания.

Эффективность мероприятий по борьбе с оспой птиц во многом зависит от своевременного выявления возбудителя. Диагноз основывается на данных клинических и патологоанатомических наблюдений, оценки эпизоотической ситуации и результатах комплекса лабораторных исследований с выделением вируса [11].

Лабораторная диагностика оспы птиц включает выделение вируса на хорионаллантоисной оболочке (ХАО) SPF-эмбрионов кур, гистологических исследованиях и электронной микроскопии [144]. Данные методы хотя и достаточно надежны, но весьма трудоемки и требуют значительного времени.

Лабораторные методы, основанные на выявлении генетического материала вируса оспы птиц (ВОП), обладают более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с другими методами и сокращают время постановки диагноза до 4-5 часов с момента отбора проб. В последнее время появились методы ПЦР для выявления ВОП [8, 83, 84, 91, 118]. Сравнительно недавно для выявления ВОП разработан такой метод,

как ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [121]. Метод ПЦР-РВ более чувствителен по сравнению с обычной ПЦР и позволяет проводить количественный анализ исследуемого гена. Одним из недостатков метода ПЦР является возможность ингибирования реакции при исследовании проб патологического материала. Для контроля процесса выделения ДНК и наличия ингибиторов реакции в исследуемой пробе используется внутренний контрольный образец (ВКО), т.е. гетерологичная ДНК, которая добавляется в пробу перед выделением, а также положительный контрольный образец (ПКО).

Известные виды и штаммы ВОП могут значительно отличаться по биологическим и генетическим свойствам [140], поэтому необходимо не только выделять изоляты, но также проводить их изучение. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов даёт возможность устанавливать филогенетические связи ВОП. Чаще всего для этого анализируют участок гена P4b (fpvl67) и H3L (фу 140) [91, 118], кодирующие структурные иммунодоминантные белки ВОП. Необходимо отметить, что генетическое разнообразие изолятов ВОП, встречающихся на территории РФ, остаётся в настоящее время малоизученным.

Поскольку используются живые вакцины против оспы кур, необходимо дифференцировать полевые изоляты вируса от вакцинных штаммов. Работа, проведенная Susan A. Jarmin с коллегами [118], позволила выявить генный локус Н9, который может быть использован для различия полевых изолятов оспы кур от вакцинных штаммов.

Имеются свидетельства того, что вирус ретикулоэндотелиоза птиц (РЭВ) участвует в патогенезе В OK, увеличивая его вирулентность за счет подавления иммунного ответа [126]. РЭВ - иммуносупрессивный ретровирус. Как правило, вирулентные штамма ВОК имеют полногеномную последовательность РЭВ в своём геноме, в то время как вакцинные штаммы несут только длинные концевые повторы (LTR) [121].

Исходя из вышеизложенного, разработка и усовершенствование методов выявления ВОП в пробах патологического материала, дифференциация вакцинных штаммов от полевых изолятов, а также изучение молекулярно-генетических свойств выделенных изолятов ВОП является актуальной задачей.

Степень разработанности проблемы. Отечественными исследователями опубликован ряд рекомендаций по борьбе с оспой птиц (Новочеркасск, 1984; Кишинёв, 1989), разработаны вакцины против оспы птиц и изучены их свойства (Черкезова Т.В., 1989; Бочарников A.B., 2003; Николаева И.П., 2003; Смирнов В.Н., 2003; Черкезова Т.В., 2003; Бочарников A.B., 2004; Похвальный С.А., 2011). Предложены системы ПЦР и ПЦР в режиме реального времени для выявления ВОП (Huw Lee & Hwa Lee, 1997; Hauck, 2009; Jarmin S., 2006). Отечественными исследователями разработан метод гнездовой ПЦР на ген тимидинкиназы для выявления ВОП (Батченко Г.В., 2006).

Цель и задачи исследования. Основной целью данных исследований являлась разработка и усовершенствование методов выявления и дифференциации ВОП, а также изучение молекулярно-генетических свойств выделенных изолятов.

Для достижения поставленных целей было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать метод выявления ВОП на основе полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с рекомбинантными положительным и внутренним контрольными образцами.

2. Определить первичную нуклеотидную последовательность и провести филогенетический анализ фрагментов генов P4b, Fpvl40 и генного локуса Н9 полевых изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., а также 5 вакцинных и одного полевого штамма ВОК.

3. Разработать метод выявления генома вируса ретикулоэндотелиоза (РЭВ) в геноме ВОП с использованием ПЦР и провести анализ изолятов и штаммов ВОП на наличие встроенной последовательности РЭВ.

4. Изучить молекулярно-генетические свойства изолятов и штаммов

ВОП.

Научная новизна результатов исследования.

1. Разработаны методы выявления ВОП с помощью ПЦР и ПЦР-РВ с рекомбинантными ПКО и ВКО.

2. Определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов Р4Ь, Рру140 и генного локуса Н9 изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., а также пяти вакцинных штаммов и штамма ВОК для контрольного заражения. Проведен филогенетический анализ изолятов и штаммов ВОП с использованием полученных последовательностей.

3. Разработан метод выявления встройки генома РЭВ в ВОП с использованием ПЦР и проведен анализ изолятов и штаммов ВОП на наличие встроенной последовательности РЭВ.

Практическая значимость работы. С помощью разработанных методов выявления генома ВОП на основе ПЦР исследовано 65 проб патологического материала от кур, голубей и диких птиц, поступивших в 2008-2012 гг. из России, Украины и Казахстана. В 16 пробах от кур и 3 пробах от голубей был выявлен ВОП. Установлено, что из 18 выявленных изолятов 16 являются вирусами оспы кур и 2 - вирусами оспы голубей. Разработаны методы, позволяющие дифференцировать полевые изоляты ВОК, выделенные в России, от вакцинных штаммов. 18 изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., пять вакцинных и один штамм ВОК для контрольного заражения были исследованы на наличие генома вируса ретикулоэндотелиоза птиц. Изучены молекулярно-генетические свойства изолятов и штаммов ВОП.

Научные результаты, выносимые на защиту:

Методы выявления ВОП на основе ПЦР и ПЦР-РВ с рекомбинантным положительным и внутренним контролем.

Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов Р4Ь, БруМО изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., а также 5 вакцинных и одного штамма ВОК для контрольного заражения.

Способ дифференциации полевых изолятов ВОК от вакцинных штаммов на основе анализа генного локуса Н9.

Результаты анализа изолятов и штаммов ВОП с помощью ПЦР и ПЦР-РВ на наличие встроенной последовательности РЭВ.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальность 03.02.02 Вирусология, охватывает проблемы инфекционности вирусов, разработки мер и средств диагностики вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследования - генной инженерии, изучение генетических и негенетических взаимодействий между вирусами, эпидемиологии и путей распространения вирусных инфекций, изучение путей передачи вирусов, выявление естественных хозяев, разработку мер диагностики вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем. В диссертационной работе проведены исследования по разработке методов ПЦР для выявления ВОП, а так же исследования молекулярно-биологических и филогенетических свойств изолятов ВОП.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 4, 6, 8, 10.

Апробация результатов исследования. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Учёного совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2010-2012 гг., доложены и опубликованы на Международных научно-практических конференциях молодых ученых (Россия, 2010г.; Россия, 2012г.) и Международной научно-практической

конференции «Трансмиссивные болезни животных: актуальные аспекты биобезопасности и контроля» (Крым, Украина, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 работы опубликованы в изданиях, включенных в перечень высшей аттестационной комиссии (ВАК) РФ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, приложения. Список использованной литературы включает 154 источника. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 7 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.

Личный вклад автора в выполнении работы. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ФГБУ «ВНИИЗЖ» к.б.н. Колосову С.Н., вед. биологу Ушаковой А.Н., к.б.н. Зинякову Н.Г., д.б.н. Мудрак Н.С., вед. вет. врачу Похвальному С.А., к.б.н. Андрейчуку Д.Б., к.в.н. Чвале И.А. за помощь в проведении отдельных этапов работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Общая характеристика

Оспа птиц (Variola avium, Fowl pox, Wet pox, Borreliata avium, контагиозная эпителиома, дифтерия птиц, злокачественный катар индеек, синусит идеек, заразная болезнь глаз индеек, кожная бугорчата, ложноперепончатая ангиома, «моллюск» птиц, ОП) - инфекционная болезнь, сопровождающаяся развитием оспенных экзантем на неоперенных участках кожи или дифтеритических поражений слизистой оболочки ротовой полости, либо одновременным проявлением указанных патологий. Впервые оспа ку�