Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Изучение первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1, выделенных на территории Российской Федерации

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Изучение первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1, выделенных на территории Российской Федерации"

На правах рукописи

¡Ф

НОВИКОВА Мария Викторовна

ИЗУЧЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ВЫСОКОПАТОГЕННОГО ГРИППА ПТИЦ А/Н51Ч1, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

3 1Ш

Покров-2012

005019009

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»),

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор (Россельхознадзор)

Официальные оппоненты:

Доктор ветеринарных наук, профессор

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ)

Власов Николай Анатольевич

Кушнир Анатолий Тимофеевич

Ярыгина Елена Игоревна

Ведущая организация - Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (ГНУ ВНИТИБП), г. Щелково.

Защита диссертации состоится «_24_» мая 2012 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская область, г. Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Тел./факс: 8 (49243) 6-21-25.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « 19 » апреля 2012 г.

Размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniivvim.ru и на официальном сайте ВАК России www.vak2.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, кандидат биологических наук

Е.А. Балашова

1. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность темы

Высокопатогенный грипп птиц - высококонтагиозное вирусное генерализованное заболевание птиц, характеризующееся высокой смертностью, сопровождается кровоизлияниями и воспалительными процессами во внутренних органах, мозге и коже, гибель птицы может достигать 100%. Высокопатогенный грипп птиц (ВПГП) относится к болезням, подлежащим обязательному уведомлению Всемирной организации здравоохранения животных [3, 6,12].

В 2003-2004 гг. резко обострилась ситуация в странах Юго-Восточной Азии и Дальнего Востока в связи с возросшим количеством случаев регистрации вспышек ВПГП подтипа Н5М1 среди домашних птиц [9]. В результате эпизоотии ВПГП Н5Ы1 2003-2004 гг. погибло 60 человек, потери среди домашних птиц составили 150 миллионов голов [7]. С начала 2005 г. случаи выявления ВПГП регистрировали в Китае, Таиланде, Вьетнаме, Гонконге, Индонезии и Камбодже [7, 9,15].

Вирус гриппа (ВГ) подтипа Н5Ы1 является патогенным для широкого круга диких, в том числе водоплавающих птиц [4, 8, 14, 15]. Данный факт был установлен в течение эпизоотии гриппа птиц А/Н5М1 в странах юго-восточной части Азии, а затем и Европы в 1996-2007 гг. Особенно масштабной была вспышка ВПГП Н5Ш в популяции диких водоплавающих птиц провинции СНг^Ьа1 (северо-запад Китая) [4]. Вирус генетически близкородственный штаммам, выделенным в северо-западном Китае, вызвал вспышки болезни среди диких и домашних птиц в России в 2005-2007 гг., а так же странах Европы и Африки. [1,2, 11, 13].

В период с 2008 по 2010 годы на территории Российской Федерации (РФ) спорадически выявляли изоляты вируса ВПП1/Н5Ы1, генетически отличные от изолятов подгруппы (З^Ьаь При этом в 2009-2010 гг. ВПГП/Н5Ы1 регистрировали только у диких птиц в Республике Тыва.

Следует отметить, что для детального молекулярно-генетического анализа изолятов вируса гриппа птиц (ВГП) необходимо определить полную первичную структуру генома, что является достаточно трудоемким и длительным процессом. Однако далеко не всегда требуется столь детальная генетическая характеристика. При этом, в литературных источниках, посвященных генетическому анализу изолятов ВПГП/[15Т\П, неоднократно описаны молекулярные детерминанты,

определяющие такие важные биологические свойства вируса, как рецепторную специфичность, патогенность для различных видов животных, резистентность к медицинским препаратам, применяемым для профилактики и лечения гриппа в здравоохранении [5, 7, 16, 17].

Тем не менее, до настоящего времени не разработаны методы, позволяющие при проведении эпизоотологического расследования охарактеризовать ключевые свойства исследуемых изолятов ВГП в достаточно сжатые сроки, без проведения полного сиквенса генома изолята. Такая экспресс-характеристика «полевых» штаммов ВГП позволит своевременно корректировать планы противоэпизоотических мероприятий и избежать необоснованных финансовых расходов, что особенно важно в условиях рыночной экономики.

Для осуществления молекулярно-генетической характеристики целесообразно разработать и применять на практике методы по определению первичной структуры генома исследуемых изолятов ВГП, а также определению нуклеотидных последовательностей фрагментов генов (РВ2, Н, N. М, N8), включающих генетические маркеры, обуславливающие биологические свойства изолятов вируса ВПГП А/Н51Ч1, выделенных на территории РФ в последние годы (2005-2010 гг.). В зависимости от поставленной задачи, использование данных методов позволит с максимальной степенью эффективности охарактеризовать молекулярно-генетические свойства исследуемых изолятов вируса ВПГП/Н5Ы1.

1.2. Степень разработанности проблемы.

В результате многочисленных исследований установлено, что генетические маркеры, влияющие на биологические свойства изолятов вируса ВПГП Л/Н5Ы1, выделенных на территории РФ в последние годы определены нуклеотидными последовательностями генов РВ2, Н, 14, М и N8.

Всемирной организацией здравоохранения животных рекомендованы к применению в диагностической практике утвержденные и соответствующие ее стандартам протоколы ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ, позволяющие быстро выявить и идентифицировать ВГП [12]. Среди них указаны несколько систем для индикации ВГП с праймерами на ген М, а также системы идентификации различных подтипов, особенно Н5, Н7.

В то же время определение полных нуклеотидных последовательностей генома изолятов ВГП и их детальная молекулярно-генетическая характеристика

являются приоритетными задачами для референтных лабораторий, осуществляющих диагностику ГП. Кроме того, для обеспечения возможности принятия своевременных мер по профилактике и ликвидации ГП необходимо на основании данных о молекулярных детерминантах определяющих биологические свойства ВГП разрабатывать методы, позволяющие делать прогнозы развития эпизоотической ситуации.

1.3. Цели и задачи исследований

Изучить молекулярно-генетические свойства вирусов гриппа птиц, выделенных на территории РФ, с помощью оптимизированного метода определения первичной структуры генома и разработать метод определения молекулярных детерминант патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса гриппа.

В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:

- оптимизировать метод определения первичной структуры генома изолятов ВГП/Н5Ы1 генетической подгруппы (^¡гщЬа! на основе ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования;

- определить полные нуклеотидные последовательности генома изолятов ВГП/Н5Ш, выделенных в 2005-2006 гг. и изучить их молекулярно-генетические свойства;

- осуществить сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генома изолятов вируса ВПГП/Н51Ч1, выделенных в 2008-2010 гг. в России, с таковыми изолятов ВГП подтипа Н5№, выявленных и выделенных в странах Евразии в течение 2008-2011 гг.

- разработать метод, позволяющий охарактеризовать молекулярные детерминанты патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса ВПГП А/Н5Ш с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

1.4. Научная новизна исследований

Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома 5 изолятов ВГП/Н5Ы1, выделенных на территории РФ в течение 2005-2006 гг., и изучены их молекулярно-генетические свойства.

Оптимизирован метод определения первичной структуры генома изолятов ВГП/Н5Ы1 генетической подгруппы СНгщЬа! на основе ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

Разработан метод определения молекулярных маркеров патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса ВПГП А/Н5Ы1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования с оригинальной системой праймеров.

1.5. Практическая значимость работы

Получены малекулярно-генетические характеристики 5 изолятов вируса гриппа птиц, выделенных на территории Российской Федерации.

Разработаны «Методические положения по определению первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц А/Н51\П генетической подгруппы О^гщЬа! с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования», которые утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 19.01.2012 г.

Разработаны «Методические положения по определению молекулярных детерминант патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц А/Н5Ы1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования», которые утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 19.01.2012 г.

1.6. Соответствие диссертации паспорту научной специальности

В соответствии с формулой специальность 06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» представляет собой область науки, изучающая систематику, структуру, физиологию, биохимию, генетику, экологию патогенных микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов), имеющих ветеринарное значение, эпизоотологические и экологические закономерности возникновения, распространения инфекционных болезней и иммунологию сельскохозяйственных, домашних и диких животных, изучающая и разрабатывающая методы, средства и организационные основы диагностики, лечения, профилактики и ликвидации этих болезней. В диссертационной работе приведены результаты исследований по разработке методов определения полных нуклеотидных последовательностей изолятов вируса ВПГП/П5Ш, а также генетических маркеров, обуславливающих биологические свойства вируса, на основе ПЦР, их применению в лабораторной диагностике болезни, а также изучению молекулярно-биологических свойств изолятов ВГП.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам 1, 4, 5 паспорта специальности.

1.7. Апробация результатов работы

Результаты исследований по теме диссертации заслушаны и обсуждены на заседаниях учёного совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2008-2011 гг. Основные материалы диссертации были опубликованы и доложены на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (г. Москва, 2010 г.), Международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2010 г.).

1.8. Публикации научных исследований

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 2 работы опубликованы в изданиях, включенных в перечень ВАК РФ.

1.9. Основные положения, выносимые на защиту:

Метод определения первичной структуры генома изолятов ВГП/Н5Ы1 генетической подгруппы на основе ОТ-ПЦР и нуклеотидного

секвенирования, позволяющий сократить количество амплифицируемых фрагментов генома.

Первичная структура генома изолятов ВГ11/Н5Ж генетической подгруппы (З^Ьа!, выделенных в РФ в 2005-2006 гг.

Результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генома изолятов вируса ВПГП/Н5Ы1, выделенных в 2008-2010 гг. в России, с таковыми изолятов ВГП подтипа Н5Ы1, выявленных и выделенных в странах Евразии в течение 2008-2011 гг.

Метод определения молекулярных маркеров патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса ВПГП А/115141 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования, позволяющий охарактеризовать ряд молекулярно-генетических свойств вируса данного подтипа в сжатые сроки.

1.10. Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения.

Список литературы включает 172 источников. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 19 таблицами.

Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2008-2011 гг. в ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

1.11. Личный вклад соискателя

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывал к.б.н. Андриясов A.B. Автор выражает искреннюю благодарность коллективу лаборатории «Диагностики болезней сельскохозяйственных животных» за помощь и консультации при проведении исследований и оформлении отдельных глав диссертации.

2. Собственные исследования

2.1. Материалы и оборудование

2.1.1. Вирус гриппа птиц

В работе использованы изоляты (21 изолят) вируса Bnm/H5N1, выделенные из проб патологического материала, отобранных в различные промежутки времени в период с 2005 г. по 2010 г. Изоляты были отобраны на территории различных регионов Российской Федерации (республики Адыгея, Дагестан, Калмыкия, Тыва, Алтайский, Краснодарский и Приморский края, Волгоградская, Курганская, Новосибирская, Ростовская, Тульская и Тюменская области) и Украины (Крым) от различных видов домашних (гусь, индейка, курица, утка) и диких птиц (голубь, дикая утка, лебедь, пеганка, чомга) с целью последующей оценки изменений в структуре изолятов вируса, произошедших за указанный период времени.

2.1.2. Нуклеотидные последовательности ВГП

Для сравнительного и последующего филогенетического анализов были использованы полноразмерные нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные последовательности изолятов и штаммов вируса ВПГП подтипа H5N1 восьми сегментов генома, выделенных в период с 1996 г. по 2011 г. и опубликованные в международной базе данных GenBank электронного ресурса NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html).

2.1.3. Коммерческие наборы, ферменты

В процессе выделения РНК из образцов патологического материала, постановки ОТ-ПЦР, очистки наработанных ДНК-фрагментов, нуклеотидного секвенирования применяли коммерческие наборы следующих производителей: ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Qiagen, Applied Biosystems, Promega, Fermentas.

2.1.4. Растворы, буферные смеси, реагенты

Для приготовления растворов использовали химические реактивы компаний "Promega" (США), "Sigma" (США), а также отечественные реактивы категорий х.ч., о.с.ч.

2.1.5. Пранмеры

В работе использовали оригинальные системы праймеров (таблицы 1 и 5) для определения полной нуклеотидной последовательности генома изолятов вируса ВПГП подтипа H5N1 генетической сублинии Qinghai (генетический клад 2.2.); праймеры для амплификации и определения первичной структуры фрагментов генома изолятов высокопатогенного Bm/H5N1, выделенных в 20082011 гг. (генетический клад 2.3.2.).

2.2. Методы исследования

2.2.1. Подбор праймеров для ОТ-ПЦР

Выбор праймеров проводили с помощью сравнения и анализа полных нуклеотидных последовательностей штаммов и изолятов вируса ВПГП подтипа H5N1 генетической линии A/goose/Guangdong/96, кладов 2.2., 2.3.2., опубликованные в базе данных GenBank электронного ресурса NCBI и программы BioEdit.

2.2.2. Экстракция суммарной РНК

Вирусную РНК выделяли из ЭЭЖ, содержащей ВГП с помощью набора для выделения РНК/ДНК РИБО-сорб-ЮО согласно инструкции производителя.

2.2.3. Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция

Реакцию обратной транскрипции и собственно ПЦР проводили в одну стадию с использованием набора Qiagen OneStep RT-PCR Kit.

При адаптации метода ОТ-ПЦР для выявления генома вируса BniTI/H5Nl были оптимизированы концентрации компонентов реакционной смеси, температурно-временной режим реакции. Реакцию проводили с использованием 25 мМ р-ра хлорида магния (Promega) и олигонуклеотидных праймеров.

Реакционная смесь для проведения ОТ-ГТЦР в расчете на одну реакцию (V= 20 мкл) состоит из 9,75 мкл деионизованной воды, 5,0 мкл буфера 5х для ОТ-ПЦР, 1,25 мкл раствора MgCh 25мМ, 1,0 мкл раствора dNTP 10 мМ, 1,0 мкл раствора прямого праймера Юпмоль/мкл, 1,0 мкл раствора обратного праймера Юпмоль/мкл, 1,0 мкл смеси ревертазы и полимеразы. В приготовленную для ОТ-ПЦР смесь вносили 5,0 мкл выделенной РНК. Амплификацию проводили при следующих температурных режимах: 50°С - 30 мин., 95°С - 10 мин., и 37 циклов: 95°С - 40 с, 55°С - 40 с, 72°С - 1 мин, по окончании всех циклов 72°С - 7 мин.

2.2.4. Учет результатов ОТ-ПЦР

Результаты исследования учитывали путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в 2 % агарозном геле, окрашенном 0,001 % раствором бромида этидия.

2.2.5. Очистка продуктов ПЦР

По окончании электрофоретической реакции и анализу ее результатов фрагменты кДНК генома ВГП вырезали непосредственно из геля скальпелем и очищали с помощью набора ДНК-сорб-В согласно модернизированной нами инструкции производителя.

2.2.6. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов кДНК

Прямое секвенирование фрагментов кДНК ВГП осуществляли с помощью набора BigDye Terminator Cycle Sequencing kit («Applied Biosystems», США) согласно инструкции производителя.

Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов генома проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 согласно рекомендациям производителя (Applied Biosystems).

Амплифицированные фрагменты имели размер от 680 до 1080 п. н. При этом применение метода автоматического секвенирования позволило «прочитывать» нуклеотидные последовательности изолятов ВГП длиной 700-800 н. о. Для получения нескольких перекрывающихся фрагментов и более достоверного прочтения последовательности, для секвенирования использовали дополнительно подобранные внутренние праймеры.

2.2.7. Компьютерный анализ и сравнение первичных структур нуклеиновых кислот

Анализ нуклеотидных последовательностей ВГП проводили с помощью программы BioEdit версия 7.0.5.3. Выравнивание последовательностей осуществляли посредством программы множественного выравнивания ClustalW. Построение филогенетических деревьев проводили с помощью алгоритма NJ (в том числе с использованием метода численного ресэмплинга «бутстреп») в реализации пакета MEGA, версия 3.1. Для поиска наиболее близких последовательностей к последовательностям изучаемых в работе изолятов пользовались электронным ресурсом Megablast NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Для сравнения выбирали опубликованные ранее в международной базе GenBank последовательности изолятов ВГПШ5Ы1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/).

3. Результаты собственных исследований

3.1. Оптимизация метода определения первичной структуры генома изолятов вируса ВПГП A/H5N1 генетической подгруппы Qinghai с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования

В двухлетний период с 2005 по 2007 гг., прошедший с момента проникновения вирусов ВПГП H5N1 за пределы восточной и юго-восточной Азии, с различной полнотой были определены нуклеотидные последовательности нескольких сот изолятов вируса. Неоднократно проводили филогенетический анализ этих последовательностей [8, 11]. Результаты этого анализа показали, что все изоляты вируса ВПГП/Н5Ы1, выделенные в России, Европе, Африке и западных регионах Азии, относятся к азиатской генетической линии A/Goose/Guangdong/1/96 ВГП H5N1, сублинии Qinghai, впервые выделенных от диких водоплавающих птиц в северо-западном Китае в 2005 году [4]. Нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные последовательности ВГП этой сублинии, выделенных в различных странах и континентах, широко представлены в международной базе GenBank.

В результате анализа нуклеотидных последовательностей изолятов вируса ВПГП A/H5N1 генетической линии A/goose/Guangdong/1/96, сублинии Qinghai были выбраны необходимые для амплификации и последующего секвенирования фрагменты восьми генов. Методом сравнительного анализа последовательностей

определили консервативные участки, фланкирующие выбранные фрагменты генома, и осуществили дизайн олигонуклеотидных праймеров, таким образом, чтобы они были полностью идентичны консервативным участкам.

В результате проведенных исследований были выбраны системы праймеров для амплификации фрагментов полного генома в ОТ-ПЦР и последующего секвенирования (табл. 1).

Выявление генома вируса ВПГП/Н5Ы1 в пробах аллантоисной жидкости эмбрионов 8РР кур и последующее определение нуклеотидных последовательностей включает четыре этапа: выделение суммарной РНК из вируссодержащего материала, амплификацию фрагментов генома с помощью ОТ-ПЦР, детекцию амплифицированных фрагментов методом электрофореза, секвенирование.

В качестве исходного материала для выделения суммарной РНК вирусов ВПГП/НЗШ использовали вируссодержащую аллантоисную жидкость эмбрионов 8РР кур.

При адаптации метода ОТ-ПЦР для выявления генома вируса ВПГП/Н5Ш и последующего нуклеотидного секвенирования с целью повышения чувствительности, специфичности и скорости анализа были так же оптимизированы следующие параметры реакции: концентрации компонентов реакционной смеси, температурно-временной режим реакции.

Оптимизированный вариант ОТ-ПЦР за счет подбора системы праймеров и изменения вышеуказанных параметров реакции позволил на 29 % сократить количество амплифицируемых 22 фрагментов генома (в исходном варианте 31), а так же сэкономить время постановки реакции и сократить расходы на реагенты.

В ходе реакции амплифицировали фрагменты кДНК размером 640 - 1080 п. н. Анализ продуктов амплификации проводили электрофорезом в 2 % агарозном геле, окрашенном 0,001 % раствором бромида этидия.

Оптимизация условий выделения РНК и постановки ОТ-ПЦР проведена с использованием изолятов вируса ВПГП А/Н5Ы1, выделенных в различных регионах Российской Федерации и Автономной Республики Крым, в период с 2005 по 2007 гг.

Олигонуклеотидные пары праймеров, используемые для амплификации фрагментов генома изолятов вируса ВПГП А/Н5Ш _генетической подгруппы Ош^Ьа! в ОТ-ПЦР _

Ген Пары праймеров для ОТ-ПЦР (праймеры для секвенирования) Длина фрагмента н.п. Кол-во фраг-ов

РВ2 QPBA1F- QPBA1077R (324F, 657F, 399R, 732R) 1080 4

QPBA657F- QPBA1404R (1077R, 996F) 750

QPBA996F- QPBA2057R (1327F, 1683F, 1404R, 1758R) 1050

QPBA1683F- QPBA2319R (1986F, 2057R) 640

РВ1 QPBB1F- QPBB1039R (314F, 652F, 385R, 727R) 1040 4

QPBB652F- QPBB1402R (970F, 1039R) 750

QPBB970F- QPBB2044R (1333F, 1669F, 1402R, 1744R) 1070

QPBB1669F- QPBB2319R (1970F, 2044R) 650

РА QPA1F- QPA826R (371F, 455R) 825 4

QPA746F- QPA1543R (1125F, 1196R) 800

QPA1125F- QPA1916R (1472F, 1543R) 800

QPA1472F- QPA2212R (1846F, 1916R) 740

Н QHA1F- QHA767R (359F, 449R) 770 3

QHA683F- QHA1421R (1013F, 1082R) 750

QHA1013F- QHA1760R (1349F, 1421R) 750

NP QNP1F- QNP835R (415F, 487R) 835 3

QNP415F- QNP1216R (775F, 835R) 800

QNP775F- QNP1556R (1149F, 1216R) 780

N QNA20F- nl nov 934r (358F, 698F, 427R, 769R) 915 2

QNA698F- QNA1387R (1051F, 1120R) 700

М | QMP20F- QMP1022R (358F, 665F, 415R, 715R) | 1000 | 1

NS | QNS20F-NS878R (322F, 625F, 385R, 694R) | 860 | 1

*В скобках указаны праймеры, используемые дополнительно для секвенирования соответствующих фрагментов генома изолятов вируса ВПГП/115М1.

Применение метода автоматического секвенирования с использованием наборов BigDye Terminator Cycle Sequencing kit позволило «прочитывать» нуклеотидные последовательности изолятов ВГП длиной 700-800 н. о. Однако, для секвенирования фрагментов генома дополнительно использовали праймеры с целью получения нескольких перекрывающихся фрагментов для более достоверного прочтения последовательности.

В некоторых случаях максимальное число перекрывающихся фрагментов достигало шести. Минимальное количество перекрывающихся фрагментов равнялось двум. С помощью внутренних праймеров определяли последовательности фрагментов длиной 400-450 н. о., в некоторых случаях с генами М и NS - менее 350 н. о. и таким образом, повышали надежность исследований.

С использованием разработанной методики по определению первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 генетической подгруппы Qinghai с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования достоверно определены последовательности всех генов пяти изолятов вируса ВПГП A/H5N1 (A/goose/Altai/0318/05, A/swan/Kalmykia/0540/05, A/turkey/Tula/0551/05, A/wild_duck/Tumen/0233/05, A/grebe/Tyva/0805/06).

3.2. Генетический анализ изолятов вируса ВПГП/Н51Ч1

С помощью разработанного метода для детальной молекулярно-генетической характеристики вируса и изучения его биологических свойств проведен анализ полноразмерных нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей генома пяти изолятов вируса Bnm/H5N1, выделенных в различных регионах РФ на протяжении второй половины 2005 г. и в 2006 г.

В результате проведенного филогенетического анализа было установлено, что ближайшими аналогами исследуемых изолятов по всем сегментам генома, являются высоковирулентные ВГП, выделенные в мае-июне 2005 г. во время вспышки Bnm/H5N1 у диких птиц водного и околоводного комплексов (гуси, чайки) в северо-западном Китае [4]. В работе представлено филогенетическое древо по последовательностям гена Н (рис. 1).

В результате проведенного сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей изученных изолятов установлено, что отличия между ними находятся в пределах 0,14-1,39%.

Последовательности вирусов, выделенных в 2005 г., гомологичны между собой более чем на 99% по всем сегментам генома. По генам РВ2, РВ1, PA, NP, N изолят A/grebe/Tyva/0805/06 сходен с остальными исследованными вирусами на 99% и более, однако по генам М, NS и особенно Н наблюдаются несколько большие отличия (максимальное для Н — 1,39%).

Наиболее гомологичными являются аминокислотные последовательности белков РВ2 (по одной замене), за исключением изолята A/turkey/Tula/0551/05, у которого выявлено пять замен по сравнению с другими характеризуемыми ВГП, РА (2-3 замены), NP (1-2 замены), М1 (0-1 замены), М2 (0-2 замены). Аминокислотные последовательности белка М1 полностью идентичны у четырех изолятов кроме А/swan/Kalmykia/0540/05. Наибольшей степенью отличия обладают последовательности белка NS1 (3-5 замен).

, A/mallard/Bavaria/1/2006 |L A/duck/Switzer1and/V389/2006 ~Т- A/duck/Hungary/11804/2006 I— A/mallard/ltaly/835/2006 4— АЛигкеуЯигкеу/1/2005 " A/pigeon/Crimea/624/05 — A/chicken/Sudan/2115-9/2006 A/goose/Chelyabinsk/490/05 A/chicken/Nigeria/641/2006 A/chicken/Kurgan/427/05

t:

A/swan/Kalmyfcfa/aS40/0S

p M L A/cat/[

-Г

A/Cygnus olor/Czech Republic/10662/06 r- A/chicken/Krasrtodar/01/2006

A/chicken/Domodedovo/MK/2007 A/chicken/Rostov-on-Don/35/2007 A/cat/Dagestan/87/06 p- A/common gulJ/Chany/P/2006 —U A/grebe/Tyva/805/06

i-A/chicken/Krasnodar/300/07

r A/wild duck/Tumen/0233/05 A/Bar-headed Goose/Qinghai/5/05 ■ A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05

— A/goose/Altai/318/05

- A/duck/Nlovosibirsk/02/05 г A/goose/Crimea/615/05 1— Afturttey/Tula/0551/05

- A/chicken/Korea/ES/03

- A/Ck/lndonesia/4/2004 A/Ck/Thailand/73/2004

- A/ck/Vietnam/NCVD09/05

-A/chicken/Hubei/327/2004

-A/duck/Guangdong/22/2002

— A/duck/Guangxi/22/2001 A/Duck/Hong Kong/ww487/2000 A/goose/Hong Kong/437-8/99 A/ctiicken/Hubei/wt/97

A/Chicken/Hong Kong/220/97 A/Goose/Guangdong/1/96 A/Goose/Guangdong/3/97

- A/turKey/England/50-92/91

Рис. 1. Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена Н штаммов и изолятов ВГП генетической линии А/Соо5е/Соа1^с1о1^/1/96 (Н51Ч1)

"Цифрой 1 обозначены изоляты и штаммы генетической сублинии (^¡гщЬа!, выделенным шрифтом - изоляты, описываемые в работе.

Проведен сравнительный анализ аминокислотных остатков белков изолятов ВГП, определяющих степень патогенности, рецепторную специфичность вируса и его чувствительность к некоторым лекарственным препаратам в соответствии с известными данными литературы.

Гемагглютинин является одним из основных белков, определяющих видовую специфичность вируса гриппа и его патогенность. Рецепторная специфичность ВГ варьирует в зависимости от вида организма, от которого выделили вирус. ВГ человека распознают сиалилолигосахариды, заканчивающиеся N-ацетилсиаловой кислотой, связанной с галактозой а2,6 связью (Neu5 аса 2-6Gal), вирусы гриппа птиц и лошадей распознают N-ацетилсиаловую кислоту, связанную с галактозой а2,3 связью (Neu5 аса 2-3Gal). Наличие глутамина (Q) в позиции 226 и глицина (G) в позиции 228 (нумерация указана по последовательности подтипа НЗ) указывает на то, что вирус несет сайт, который связывается с поверхностным рецептором Neu5 аса (2-3)- Gal, характерным для клеток птиц [5]. В рецептор-связывающем участке гемагглютинина исследуемых изолятов в указанных позициях находятся аминокислотные остатки, характерные для ВГП.

Согласно данным литературы в структуре гемагглютинина есть несколько аминокислот, расположенных в области связывания с рецепторами, и являющиеся консервативными для изолятов от птиц и отличающиеся от соответствующих аминокислот у изолятов тех же подтипов, выделенных от млекопитающих [1, 2]. Предположительно, даже минимальные изменения в молекуле гемагглютинина могут привести к изменению спектра хозяев вируса [1].

В табл. 2 указаны аминокислотные остатки белка гемагглютинина, определяющие рецепторную специфичность, характерную для вирусов гриппа птиц подтипа Н5 и ВГ человека. В исследованных изолятах во всех указанных позициях находятся аминокислотные остатки, характерные для ВГП.

Вирусы ВПГП H5N1 способны инфицировать человека, не смотря на то, что их гемагглютинин преимущественно взаимодействует с а2,3 клеточными рецепторами [1, 17]. Существует предположение, что инфицирование человека изоля-тами от птиц определяется не только изменениями в рецептор-связывающем домене НА, но и в структуре других белков вируса. В табл. 3 указаны аминокислотные остатки белков, определяющие спектр хозяев ВГ человека и ВГП [1, 13].

Аминокислотные остатки белка гемагглютинина, определяющие __^_рецепторную специфичность вируса гриппа _

№ (по НЗ подтипу) Altai/ 318/05 Tumen/ 233/05 Tula/ 551/05 Kalmykia/ 540/05 Tyva/ 805/06 ВГ птиц/ H5 ВГ человека

136 S S S S S S T

153 W W W W W W -

158 N N N D N N/D N

159 N N N N D N S

183 H H H H H H -

190 E E E E E E D

194 L L L L L L I

221 S S S S S S P

222 К R К К К К -

225 G G G G G G/N D

226 Q Q Q Q Q Q L/I

227 S S S S S s A

228 G G G G G G S

У всех исследованных изолятов в трех позициях (627К белка РВ2, за исключением изолята А/шгксу/Ти1а/0551/05, 331 белка ИР, 28У белка М2 кроме А/5\уап/Ка1ту1аа/0540/05) находятся аминокислотные остатки, характерные для ВГЧ. Во всех остальных позициях отмечены аминокислотные остатки, характерные для ВГП.

Полученные данные указывают на то, что описываемые в работе изоляты ВГП/Н5Ш обладают выраженным тропизмом к клеткам птиц и практически не имеют аминокислотных замен, связанных с инфекционностью для человека.

В результате сравнительного анализа аминокислотной последовательности гемагглютинина характеризуемых изолятов было установлено, что сайт протеолитического разрезания белка имеет структуру БРСЗОЕКМЖКК, характерную для высоковирулентных изолятов ВГП.

Аминокислотные остатки, определяющие спектр хозяев вируса гриппа

Белок/№ позиции Altai/ 318/05 Turnen/ 233/05 Tula/ 551/05 Kalmykia/ 540/05 Tyva/ 805/06 ВГ птиц ВГ человека

РВ2

44 А А А А А А S

81 Т Т Т Т Т Т М

199 А А А А А А S

271 Т Т Т Т Т Т А

588 А А А А А А 1

613 V V V V V V I

627 К К Е К К Е К

661 А А А А А А Т

674 А А А А А A/S т

701 D D D D D D N

702 К К К К К К R

РА

28 Р Р Р Р Р Р L

55 D D D D D D N

65 S S S S S S L

100 V V V V V V А

356 К К К К К К R

382 Е Е Е Е Е Е D

400 S S S S S Q/T/S L

409 S S S S S S N

552 т т т т т Т S

NP

33 I I I I I V I

61 I I I I I I L

100 R R R R R R V

109 1 1 I 1 I I V

136 L L L L L L М

214 R R R R R R К

283 L L L L L L р

293 R R R R R R к

313 F F F F F F Y

375 D D D D D D G/E

Ml

137 Т Т Т Т Т Т А

М2

16 Е Е Е Е Е Е G

20 S S S S S S/N N

28 V V V F V I I/V

55 L L L L L L F

78 Q Q Q Q Q Q К

NS1

227 Е Е Е Е Е Е G

NS2

70 S S S s S s G

С использованием методов обратной генетики было показано, что единичная аминокислотная замена Е (глутаминовая кислота) на К (лизин) в позиции 627 в белке РВ2 приводит к увеличению вирулентности для млекопитающих [17]. Вирусы ВПГП H5N1 с К627 в РВ2 проявляли нейровирулентные свойства при заражении мышей, тогда как вирусы с Е627 не являлись летальными и их распространение ограничивалось легкими животных.

У четырех исследованных изолятов в позиции 627 в РВ2 расположен лизин. У изолята A/turkey/Tula/0551/05 в описываемой позиции - глутаминовая кислота.

Белок нейраминидаза играет существенную роль в освобождении новообразованных вирусных частиц от поверхностных сиаловых кислот зараженной клетки. У всех представленных в исследовании изолятов вируса ВПГП/Н5Ы1 выявлена 20-аминокислотная делеция в позициях (49-68) в структуре ножки нейраминидазы.

Делеция в гене нейраминидазы описана Matrosovich и соавт. [19], как следствие адаптации вируса ВПГП H5N1 водоплавающих птиц к наземной домашней птице.

Делеция 5 аминокислот в белке NS1 в позициях 80-84, а также ранее описанная 20-аминокислотная делеция в позициях 49-68 нейраминидазы указывают на то, что исследуемые изоляты относятся к генотипу Z вирусов Bnrn/H5N1, выделенных позднее 2000г [7]. К данному генотипу относятся практически все вирусы ВПГП H5N1, выделенные в странах Азии, Европы и Африки в 2005-2007 гг. Предполагалось, что констелляция генов вирусов генотипа, Z еще не полностью адаптирована к клеткам организма домашних птиц, что возможно повлечет за собой дальнейшую эволюцию ВГП генотипа по средствам мутаций или реассортаций в геноме [9].

Присутствие в исследуемых вирусах в позиции 92 аспарагиновой кислоты (D) в белке NS1 указывает на их способность подавлять противовирусный ответ на основе интерферонов в организме хозяина [2]. Аспарагиновая кислота в данной позиции ассоциирована с резистентностью к антивирусным цитокинам в клетках организма свиней [16].

Наличие аминокислотных остатков L26 (лейцин), V27 (валин), А30 (аланин), S31 (серин), G34 (глицин) в белке М2 исследуемых изолятов ВГП указывает на их потенциальную чувствительность к амантадину и римантадину [1, 2]. В позиции

275 белка NA расположен гистидин, указывающий на чувствительность вируса к озельтамивиру - ингибитору нейраминидазной активности вируса, применяемому для профилактики и лечения гриппа [13].

3.3. Разработка метода определения генетических маркеров изолятов вируса ВПГП/Н51Ч1, выделенных в России

На первом этапе разработки метода было необходимо определить филогенетические связи вирусов ВПГП/Н5>11, выделенных в России в 2008-2010 гг., и азиатских изолятов 2007-2011 гг. Изоляты, выделенные в России в 20082010, принадлежат кладу 2.3.2 азиатской линии A/Gs/Gd/96 вируса ВПГП/Н5Ы1 по гену Н (рис. 2).

áA/ducK/Fukush¡ma/2/2011 (H5N1) A/whooper swan/Hokkaido/4/2011(H5N1) k/peregrine falcon/Tochigi/15/2011 (H5N1) „ ..hooper swan/Mongolia/2/2009(H5N1) A/grebe/Tyva/0100/2009(H6N1) A/grebe/Tyva/2/2010(H5N1) A/whooper swan/Mongolia/1/2010(H5N1) A/great crested-grebe/Qinghai/1/2009(... A/Iittle egret/Hong Kong/8863/2007(H5N1) I— A/chicken/Hunan/3/2007(H5N1)

-l-A/chicken/Hunan/8/2008(H5N1)

i I— A/whooper swan/Hokkaido/1/2008(H5N1) Ц- A/chlcken/Primorsky/86/2008(H6N1) ' A/chicken/Korea/lSQ250/2008(H5N1) _

■c

- A/grey heron/Hong Kong/3088/2007(H5N1)

1-A/grey heran/Hong Kong/779/2009(H5N1)

A/Uar-headed goose/Qinghai/F/2007(H5N1) p A/chicken/Kuwait«ISR2/2007(H5N1)

■ A/iaicon/Saudi Arabia/6732-2/2007(H5N1) ■ A/chicken/Fujian/1/2007(H5N1)

-A/chicken/Tlbet/6/2008(H5N1)

- A/duck/Laos/A0301/2007(H5N1)

• A/chicken/Hubei/2856/2007(H5N1) — A/chicken/Hunan/1/2009(H5N1)

-A/mallard/Hokkaido/24/2009(H5N1)

0.01

Рис. 2. Дендрограмма, построенная по последовательностям гена Н изолятов вируса ВПГП/Н51Ч1

*Цифрой 1 обозначены изоляты генетического клада 2.3.2. линии АЛ35/ОС1/96.

Появление этого клада относится к 2003-2005 гг. и был представлен изолятами из южного Китая (в т.ч. Гонконга) и Вьетнама. Предположительно, в

2007 году произошла реассортация генов Н и NP клада 2.3.2 с остальными сегментами другого широко распространенного в это время в Китае клада 2.3.4 [10]. Такая констелляция наблюдалась у изолятов из Японии, Южной Кореи и России (A/chicken/Primorsky/85/08), выделенных в 2008 г.

В 2009 г. в провинции Qinghai западного Китая [18], Монголии [10] и России от диких перелетных птиц были выделены вирусы клада 2.3.2, которые по 7 сегментам генома были близки вирусам 2008 года, но значительно отличались от последних по сегменту РА. Вычисленные значения различий нуклеотидных последовательностей изолятов A/chicken/Primorsky/85/08 и A/grebe/Tyva/100/09 представлены в табл. 4.

Таблица 4

Отличие нуклеотидных последовательностей сегментов генома изолятов

Primorsк/85/08 и Tyva/100/09 (в%).

Название РВ2 РВ1 РА Н NP N М NS

A/chicken/Primorsky/85/08 - - - - - - - -

A/grebe/Tyva/100/09 2.3 1.0 5.4 2.0 1.0 0.9 1.4 1.85

К сформированной в 2009 году констелляции генов относятся вирусы ВПГП/Н5Ы1, выделенные в Монголии и России в 2010 г., а так же в 2011 г. в Японии среди диких водоплавающих птиц.

На основании литературных данных было определено, что генетические маркеры, влияющие на биологические свойства изолятов вируса ВПГП А/Н5Ы1, расположены в генах РВ2, Н, М, М, N8.

С учетом этого был осуществлен подбор праймеров (таблица 5) для ОТ-ПЦР и последующего нуклеотидного секвенирования фрагментов генома изолятов ВПГП/Н5Ы1.

Преимущественно для анализа привлекали последовательности ВГП генетического клада 2.3.2., поскольку именно изоляты данного клада широко распространены в странах юго-восточной части Азии и потенциально могут быть занесены на территорию РФ с мигрирующими на большие расстояния водоплавающими птицами.

Праймеры для амплификации и определения первичной структуры _фрагментов генов вируса ВПГП А/Н51Ч1 кладов 2.2., 2.3.2._

Обозначение Ген Длина фрагмента н.п. Цель использования

APBA1683F PB2 450 маркер вирулентности для млекопитающих (позиция аминокислоты: 627)

2135RPB2

aivH5_av_667F H 530 сайт разрезания белка гемагглютинина для определения потенциальной патогеиности вируса для птиц

aivH5_av_l 197R

AAH410F 690 определение видовой специфичности вируса по аминокислотам в рецепторсвязывающем участке НА (позиция аминокислот: 226,228)

H5gg_1100R

nl_nov_450f N 650 маркеры резистентности к озельтамивиру (тамифлю (позиция аминокислот: 275, 293,295)

AAN1100R

MP665F M 330 маркеры резистентности к препаратам (амантадин, ремантадин (позиция аминокислот: 26, 27, 30,31,34)

MP1003R

NS20F NS 540 маркер регуляции экспрессии белков в инфицированных клетках, влияет на вирулентность вируса (позиция аминокислоты в белке NS 1: 92)

NS563R

Оптимизацию параметров реакции проводили по тому же принципу, что и для методики определения первичной структуры генома изолятов вируса ВПГП/Н5Ы1 сублинии с использованием изолятов вируса ВПГП А/Н5Ы1

различных генетических подгрупп, выделенных в регионах Российской Федерации и Автономной Республике Крым в период с 2005 по 2010 гг.

С помощью оптимизированной ОТ-ПЦР проводили амплификацию фрагментов генома изолятов вируса ВПГП/Н5>П (6 фрагментов, включающих основные молекулярные детерминанты) и после этапов секвенирования и компьютерного анализа в краткие сроки (1-2 суток) получали информацию о молекулярных маркерах, определяющих эпизоотологически значимые свойства вируса.

4. Выводы

1. Оптимизирован метод по определению первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц А/Н5М1 генетической подгруппы р1гщ1ш с помощью ОТ-ПЦР и секвенирования, с помощью которого определены

полные нуклеотидные последовательности генома пяти исследуемых изолятов вируса ВПГП/Н5Ы1.

2. Проведен детальный молекулярно-генетический анализ полных нуклеотидных последовательностей пяти исследуемых изолятов вируса ВПГП/Н5М1, в результате которого установлено, что отличия между ними находятся в пределах 0,14-1,39%, а их ближайшими аналогом являются высоковирулентные ВГП, выделенные в мае-июне 2005 г. во время вспышки ВПГП/Н5>П у диких птиц водного и околоводного комплексов (гуси, чайки) в северо-западном Китае.

3. Проведенный филогенетический анализ по гену Н изолятов ВГП Н5№, выделенных на территории Российской Федерации в 2008-2010 гг. показал, что все они относятся к генетическому кладу 2.3.2 азиатской линии вируса А^оо8е/Оиагщс!оп|*/1/96 ВПГП/Н5М1.

4. Результаты филогенетического анализа исследуемых изолятов наглядно демонстрируют, что степень изменчивости вирусов гриппа, распространявшихся по территории Российской Федерации в 2005 -2006 году была незначительной.

5. Проведенный в ходе исследований анализ генетических маркеров вирулентности, рецепторной специфичности и резистентности к препаратам, применяемым для профилактики и лечения гриппа у человека, показал, что изученные изоляты вируса гриппа, за исключением изолята АЛигкеу/Ти1а/0551/05, обладают высокой инфекционностью и вирулентностью для домашних кур и индеек, а также потенциально вирулентны для млекопитающих. Установлено, что все исследованные изоляты обладают маркерами чувствительности к препаратам, применяемым для лечения и профилактики гриппа в здравоохранении.

6. Применение в диагностике разработанного метода по определению генетических маркеров патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц А/Н5Ы1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования позволяет охарактеризовать ряд молекулярно-генетических свойства вирусов данного подтипа в сжатые сроки (1-2 суток).

5. Практические предложения

Метод по определению первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц А/Н51М1 генетической подгруппы (Зт§Ьа1 с

помощью ОТ-ПЦР и секвенирования может быть использован в лабораторной практике для последующей подробной характеристики нуклеотидных последовательностей.

Применение в диагностике метода по определению генетических маркеров патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования рекомендуется для характеристики ряда молекулярно-генетических свойств вирусов данного подтипа.

«Методические положения по определению первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 генетической подгруппы Qinghai с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования» и «Методические положения по определению молекулярных детерминант патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования», утвержденные директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 19.01.2012 г., рекомендованы для практического применения в научно-исследовательских и диагностических лабораториях.

6. Список использованной литературы

1. Изоляты вируса гриппа подтипа H5N1, выделенные от домашней птицы в Курганской области в 2005 году: молекулярно-генетическая характеристика / О. И. Киселев, В. М. Блинов, M. М. Писарева [и др.] // Молекулярная биология. - 2008. - Т.42, №1. - С.78-87.

2. Изоляция и молекулярная характеристика вирусов гриппа A/H5N1, выделенных во время вспышек гриппа у птиц в 2005 г. в европейской части России: выделение штамма вируса с мутацией устойчивости к озельтамивиру / С.Б. Яцышина, A.M. Шестопалов, В.А. Евсеенко [и др.] // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2008. -№ 1. - С. 26-34.

3. Alexander, D. J. A review of avian influenza in different bird species // Vet. Microbiol. - 2000. - Vol. 74. - P. 3-13.

4. Avian flu: H5N1 virus outbreak in migratory waterfowl / H. Chen, G.J. Smith, S.Y. Zhang [et al.] // Nature - 2005. - Vol. 436. -P. 191-192.

5. Avian influenza a viruses differ from human viruses by recognition of sialyloligosaccharides and gangliosides and by a higher conservation of the HA receptor-

binding site / M.N. Matrosovich, A.S. Gambaryan, S. Teneberg [et al.] // Virology. -1997.-Vol. 233.-P. 224-234.

6. Avian influenza in Italy 1997-2001 /1. Capua, S. Marangon, M. dalla Pozza [et al.] // Avian Dis. - 2003. - Vol. 47. - P. 839-843.

7. Evolution and adaptation of H5N1 influenza virus in avian and human hosts in Indonesia and Vietnam / G. Smith, T. Naipospos, T. Nguyen [et al.] // Virology. - 2006. - Vol. 350. - P. 258-268.

8. Feare, C. J. The role of wild birds in the spread of HPAI H5N1 // Avian Dis. - 2007. - Vol. 51. - P. 440-447.

9. Genesis of highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in Eastern Asia / K.S. Li, Y. Guan, J. Wang [et al.] // Nature. - 2004. - Vol. 430. -P. 209-213.

10. Genetic analyses of H5N1 avian influenza virus in Mongolia, 2009 and its relationship with those of eastern Asia / H.M. Kang, D. Batchuluun, M.C. Kim [et al.] // Vet. Microbiol. - 2011. - Vol. 147. - P. 170-175.

11. Genome analysis linking recent european and african influenza (H5N1) viruses / S. L. Salzberg, C. Kingsford, G. Cattoli [et al.] // Emerging Infect. Dis. - 2007. -Vol. 13.-P. 713-718.

12. Highly pathogenic avian influenza // Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines/ O.I.E. - 2009.

13. Highly pathogenic avian influenza subtype H5N1 in Africa: a comprehensive phyligenetic analysis and molecular characterization of isolates / G. Cattoli, I. Monne, A. Fusaro [et al.] // PLoS. - 2009. - Vol. 4. - P. 1-9.

14. Highly pathogenic H5N1 influenza virus infection in migratory birds / J. Liu, H. Xiao, F. Lei [et al.] // Science. - 2005. -N 309. - P. 1206.

15. Investigation of outbreaks of highly pathogenic H5N1 avian influenza in waterfowl and wild birds in Hong Kong in late 2002 / T. M. Ellis, R. B. Bousfield, L. A. Bissett [et al.] // Avian Pathol. - 2004. - Vol. 33. - P. 492-505.

16. Lee, C.W. Avian influenza virus: prospects for prevention and control by vaccination / C.W. Lee, D.L. Suarez //Anim. Health. Res. Rev. - 2005. - № 6. - P. 1-15.

17. Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses / M. Hatta, P. Gao, P. Halfmann, Y. Kawaoka // Science. - 2001. - Vol. 293, № 5536.-P. 1773-1775.

18. New avian influenza virus (H5N1) in wild birds, Qinghai, China / Y. Li, L. Liu, Y. Zhang [et al.] // Emerging Infect. Dis. - 2011. - Vol. 17. - P. 265-267.

19. The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties / M. Matrosovich, N. Zhou, Y. Kawaoka, R. Webster // J. Virol. - 1999. - Vol. 73, № 2. - P. 1146-1155.

7. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Молекулярная характеристика гемагглютинина изолятов вируса гриппа птиц A/H5N1, выделенных на территории Российской Федерации в 2005 году / А.В. Андриясов, М.В. Новикова, И.П Пчёлкина, J1.0. Щербакова, С. Н. Колосов, Н.Г. Зиняков, И.А. Чвала, Т.Б. Манин, Н.С. Мудрак, В.В.Дрыгин // Ветеринария и кормление. - 2010. -№ 6. - С. 8-10.

2. Молекулярная характеристика изолята вируса гриппа птиц A/H5N1, выделенного в Республике Тыва в 2009 году / А.В. Андриясов, М.В. Новикова, Н.Г. Зиняков, И.А. Чвала, И.П Пчёлкина, Н.С. Мудрак, В.В.Дрыгин // Молекулярная диагностика - 2010: сб. тр. VII Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - М., 2010. - Т. 2. - С. 42-44.

3. Новикова, М.В. Идентификация подтипа изолятов вируса гриппа птиц, выделенных в Российской Федерации в 2005-2007 годах / М.В. Новикова, А.В. Андриясов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. -Владимир, 2011. - Т. 9. - С. 75-84.

4. Новикова, М.В. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1, выделенных в России в 2005 году / М.В. Новикова, А.В. Андриясов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2011. - Т. 9. - С. 63-74.

5. Изучение молекулярно-биологических свойств изолятов вируса гриппа птиц A/H5N1, выделенных в Российской Федерации и Республике Крым в 2005 году / М.В. Новикова, А.В. Андриясов, И.А. Чвала, Н.Г. Зиняков, Н.А. Власов // Ветеринария. - 2011. - № 10. - С. 30-33.

8. Список сокращений

ВГ - вирус гриппа

ВГП - вирус гриппа птиц

ВПГП - высокопатогенный грипп птиц

ГП - грипп птиц

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота н. о. - нуклеотидное основание

ОТ-ПЦР - обратно транскриптазная полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ЭЭЖ - экстра эмбриональная жидкость

8РР - свободный от специфических патогенов

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области Тираж 80 экз.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Новикова, Мария Викторовна, Покров

61 12-16/93

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ

«ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ОХРАНЫ ЗДОРОВЬЯ ЖИВОТНЫХ»

На правах рукописи

Новикова Мария Викторовна

ИЗУЧЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ВЫСОКОПАТОГЕННОГО ГРИППА ПТИЦ А/Н5Ш, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени !

кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель -

доктор биологических наук, профессор ВЛАСОВ Николай Анатольевич

Покров - 2012

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а. о. - аминокислотный остаток АР - автономная Республика ВГ - вирус гриппа ВГП - вирус гриппа птиц

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения ВПГП - высокопатогенный грипп птиц ГП - грипп птиц

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - ДНК-копия с РНК матрицы

КЧП - классическая чума птиц

КЭ - куриный эмбрион

н. п. - нуклеотидная пара

н. о. - нуклеотидное основание

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

ОТ - обратная транскрипция

ОРС - открытая рамка считывания

п/ф - птицефабрика

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

РНП - рибонуклеопротеин

РСС - рецептор связывающий сайт

ФБР - фосфатно-буферный раствор

ЭЭЖ - экстра эмбриональная жидкость

dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфаты

НА - белок гемагглютинин

NA - белок нейраминидаза

OIE - всемирная организация здравоохранения животных

SPF - свободный от специфических патогенов

VLA - Ветеринарное лабораторное агентство, г. Вейбридж, Англия

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................................6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................12

1.1. Историческая справка о вирусе гриппа птиц........................................................12

1.2. Распространение высокопатогенного гриппа птиц в мире......................14

1.3. Классификация и номенклатура вируса гриппа птиц....................................18

1.4. Структура вириона вируса гриппа птиц......................................................................19

1.5. Репликация вируса гриппа птиц......................................................................................22

1.6. Вирус гриппа у диких водоплавающих птиц........................................................25

1.7. Вспышки ВПГП/ШМсреди диких и домашних птиц в России.... 27

1.8. Клинические признаки, патологоанатомические изменения и патогенез при гриппе птиц......................................................................................................31

1.9. Биологические свойства вируса гриппа птиц......................................................34

1.9.1. Молекулярные детерминанты хозяйской специфичности

вируса гриппа птиц............................................................................................................35

1.9.2. Гемагглютинин как генетический маркер патогенности..................37

1.9.3. Использование данных о структуре белков вируса для профилактики высокопатогенного гриппа птиц Н5Ш......................38

1.10 Молекулярная диагностика гриппа птиц................................................................39

1.10.1. Диагностика гриппа птиц с помощью классической ОТ-ПЦР 41

1.10.2. Диагностика гриппа птиц с помощью ОТ-ПЦР в режиме

| реального времени............................................................................................................44

1.11. Заключение по обзору литературы..............................................................................46

I 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................................................48

2.1. Материалы и оборудование................................................................................................48

2.1.1. Вирус гриппа птиц..............................................................................................................48

I

2.1.2. Нуклеотидные последовательности ВГП......................................................48

2.1.3. Коммерческие наборы, ферменты..........................................................................48

2.1.4. Растворы, буферные смеси, реагенты................................................................50

2.1.5. Праймеры......................................................................................................................................50

2.1.6. Оборудование и расходные материалы.............................. 55

2.2. Методы исследования........................................................ 56

2.2.1. Подбор праймеров для ОТ-ПЦР.................................... 56

2.2.2. Экстракция суммарной РНК......................................... 56

2.2.3. Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция...... 56

2.2.4. ОТ-ПЦР в режиме реального времени............................. 57

2.2.5. Учет результатов ОТ-ПЦР............................................ 58

2.2.6. Очистка продуктов ПЦР.............................................. 59

2.2.7. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов к ДНК............................ 60

2.2.8. Компьютерный анализ и сравнение первичных структур нуклеиновых кислот.................................................... 60

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ..................................................................... 62

3.1. Определение первичной структуры генома изолятов вируса ВПГП А/Н5Ш генетической подгруппы с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования.............................................. 62

3.2. Выбор праймеров для амплификации фрагментов генома изолятов вируса ВПГП/Н5М1 подгруппы (^т^ш.................................... 64

3.3. Оптимизация метода определения первичной структуры генома изолятов вируса ВПГП А/Н51Ч1 генетической подгруппы (^п^а! с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования................... 69

3.4. Генетический анализ изолятов вируса ВПГП/Н5№..................... 73

3.5. Разработка метода определения генетических маркеров изолятов вируса ВПГП/Н5К1, выделенных в России................................. 91

3.5.1. Филогенетический анализ вирусов ВПГП/Н5№, выделенных

на территории РФ в 2008-2009гг...................................... 92

3.5.2. Выбор праймеров для амплификации фрагментов генома изолятов вируса ВПГП/Н5К1.......................................... 101

3.5.3. Оптимизация метода определения генетических маркеров

изолятов вируса ВГТГП A/H5N1...................................... 101

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................... 105

5. ВЫВОДЫ............................................................................. 110

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.................................................... 111

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................... 112

ПРИЛОЖЕНИЯ.......................................................................................... ... 130

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Высокопатогенный грипп птиц -высококонтагиозное вирусное генерализованное заболевание птиц, характеризующееся высокой смертностью, сопровождается кровоизлияниями и воспалительными процессами во внутренних органах, мозге и коже, гибель птицы может достигать 100%. Высокопатогенный грипп птиц (ВПГП) относится к болезням, подлежащим обязательному уведомлению Всемирной организации здравоохранения животных [3, 6, 11].

В 2003-2004гг. резко обострилась ситуация в странах Юго-Восточной Азии и Дальнего Востока в связи с возросшим количеством случаев регистрации вспышек ВПГП подтипа H5N1 среди домашних птиц [9]. В результате эпизоотии ВПГП H5N1 2003-2004гг. погибло 60 человек, потери среди домашних птиц составили 150 миллионов голов [7]. С начала 2005г. случаи выявления ВПГП регистрировали в Китае, Тайланде, Вьетнаме, Гонконге, Индонезии и Камбодже [7, 9, 14].

Вирус гриппа (ВГ) подтипа H5N1 является патогенным для широкого круга диких, в том числе водоплавающих, птиц [4, 8, 13, 14]. Данный факт был установлен в течение эпизоотии гриппа птиц A/H5N1 в странах юго-восточной части Азии, а затем и Европы в 1996-2007 гг. Особенно масштабной была вспышка ВПГП H5N1 в популяции диких водоплавающих птиц провинции Qinghai (северо-запад Китая) [4]. Вирус, генетически близкородственный штаммам, выделенным в северо-западном Китае, вызвал вспышки болезни среди диких и домашних птиц в России в 2005-2007гг., а также странах Европы и Африки. [1,2, 10, 12].

В период с 2008 по 2010 годы на территории Российской Федерации (далее - РФ) спорадически выявляли изоляты вируса ВПГП/Н5]Ч1, генетически отличные от изолятов подгруппы Qinghai. При этом в 20092010гг. Bnrn/H5N1 регистрировали только у диких птиц в Республике Тыва.

Следует отметить, что для детального молекулярно-генетического анализа изолятов вируса гриппа птиц (ВГП) необходимо определить полную

первичную структуру генома, что является достаточно трудоемким и длительным процессом. Однако далеко не всегда требуется столь детальная генетическая характеристика. При этом в литературных источниках, посвященных генетическому анализу изолятов ВПГП/Н5Ш, неоднократно описаны молекулярные детерминанты, определяющие такие важные биологические свойства вируса как рецепторную специфичность, патогенность для различных видов животных, резистентность к медицинским препаратам, применяемым для профилактики и лечения гриппа в здравоохранении [5, 7, 15, 16].

Тем не менее до настоящего времени не разработаны методы позволяющие при проведении эпизоотологического расследования охарактеризовать ключевые свойства исследуемых изолятов ВГП в достаточно сжатые сроки, без проведения полного сиквенса генома изолята. Такая экспресс-характеристика «полевых» штаммов ВГП позволит своевременно корректировать планы противоэпизоотических мероприятий и избежать необоснованных финансовых расходов, что особенно важно в условиях рыночной экономики.

Для осуществления молекулярно-генетической характеристики, целесообразно разработать и применять на практике методы по определению первичной структуры генома исследуемых изолятов ВГП, а также определению нуклеотидных последовательностей фрагментов генов (РВ2, Н, Ы, М, N8), включающих генетические маркеры, обуславливающие биологические свойства изолятов вируса ВПГГТ А/Н51М1, выделенных на территории РФ в последние годы (2005-20Югг). В зависимости от поставленной задачи, использование данных методов позволит с максимальной степенью эффективности охарактеризовать молекулярно-генетические свойства исследуемых изолятов вируса ВПГП/Н5Ы1,

Степень разработанности проблемы. В результате многочисленных исследований установлено, что генетические маркеры, влияющие на биологические свойства изолятов вируса ВПГП А/Н5Ы1, выделенных на

территории РФ в последние годы определены нуклеотидными последовательностями генов РВ2, Н, К, М и N8.

Всемирной организацией здравоохранения животных рекомендованы к применению в диагностической практике утвержденные и соответствующие ее стандартам протоколы ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ, позволяющие быстро выявить и идентифицировать ВГП [11]. Среди них указаны несколько систем для индикации ВГП с праймерами на ген М, а также системы идентификации различных подтипов, особенно Н5, Н7.

В то же время определение полных нуклеотидных последовательностей генома изолятов ВГП и их детальная молекулярно-генетическая характеристика являются приоритетными задачами для референтных лабораторий, осуществляющих диагностику ГП. Кроме того, для обеспечения возможности принятия соевременных мер по профилактике и ликвидации ГП необходимо на основании данных о молекулярных детерминантах определяющих биологические свойства ВГП разрабатывать методы, позволяющие делать прогнозы развития эпизоотической ситуации.

Цель и задачи исследований. Изучить молекулярно-генетическе свойства вирусов гриппа птиц, выделенных на территории РФ, с помощью оптимизированного метода определения первичной структуры генома и разработать метод определения молекулярных детерминант патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса гриппа.

Задачи:

- оптимизировать метод определения первичной структуры генома изолятов ВГП/Н5М1 генетической подгруппы на основе ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования;

- определить полные нуклеотидные последовательности генома изолятов ВГПУН5>П, выделенных в 2005-2006гг. и изучить их молекулярно-генетические свойства;

осуществить сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генома изолятов вируса ВПГП/Н5М1, выделенных в

2008-2010гг. в России, с таковыми изолятов ВГП подтипа H5N1, выявленных и выделенных в странах Евразии в течение 2008-2011гг.

- разработать метод, позволяющий охарактеризовать молекулярные детерминанты патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса ВПГП A/H5N1 с помощью ОТ-ГЩР и нуклеотидного секвенирования.

Научная новизна исследований. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома 5 изолятов ВГПУН51чГ1, выделенных на территории РФ в течение 2005-2006гг., и изучены их молекулярно-генетические свойства.

Оптимизирован метод определения первичной структуры генома изолятов BFn/H5N 1 генетической подгруппы Qinghai на основе ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

Разработан метод определения молекулярных маркеров патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса ВПГП A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования с оригинальной системой праймеров.

Практическая значимость работы. Получены малекулярно-генетические характеристики 5 изолятов вируса гриппа птиц, выделенных на территории Российской Федерации.

Разработаны «Методические положения по определению первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 генетической подгруппы Qinghai с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования», которые утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 19.01.2012 г (Приложение № 1).

Разработаны «Методические положения по определению молекулярных детерминант патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования», которые утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 19.01.2012 г (Приложение № 2).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальность 06.02.02 «Ветеринарная

микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» представляет собой область науки, изучающая систематику, структуру, физиологию, биохимию, генетику, экологию патогенных микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов), имеющих ветеринарное значение, эпизоотологические и экологические закономерности возникновения, распространения инфекционных болезней и иммунологию сельскохозяйственных, домашних и диких животных, изучающая и разрабатывающая методы, средства и организационные основы диагностики, лечения, профилактики и ликвидации этих болезней. В диссертационной работе приведены результаты исследований по разработке методов определения полных нуклеотидных последовательностей изолятов вируса ВПГПУН5]Ч1, а также генетических маркеров, обуславливающих биологические свойства вируса, на основе ПЦР, их применению в лабораторной диагностике болезни, а также изучению молекулярно-биологических свойств изолятов ВГП.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам 1, 4, 5 паспорта специальности.

Апробация результатов работы. Результаты исследований по теме диссертации заслушаны и обсуждены на заседаниях учёного совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2008-2011 гг. Основные материалы диссертации были опубликованы и доложены на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2010» (г. Москва, 2010г.), Международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2010г.).

Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 2 работы опубликованы в изданиях, включенных в перечень ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

Метод определения первичной структуры генома изолятов ВГПУН5Ш

генетической подгруппы Qinghai на основе ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования, позволяющий сократить количество амплифицируемых фрагментов генома.

Первичная структура генома изолятов ВГП/Н5Ш генетической подгруппы Qinghai, выделенных в РФ в 2005-2006гг.

Результаты сравнительного анализа нуклеотидных

последовательностей генома изолятов вируса ВПГП/Н5Ш, выделенных в 2008-201 Orr. в России, с таковыми изолятов ВГП подтипа H5N1, выявленных и выделенных в странах Евразии в течение 2008-2011 гг.

Метод определения молекулярных маркеров патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса ВПГП A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования, позволяющий охарактеризовывать ряд молекулярно-генетических свойст вируса данного подтипа в сжатые сроки.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения. Список литературы включает 172 источника. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 19 таблицами.

Личный вклад соискателя. Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывал к.б.н. Андриясов A.B. Автор выражает искреннюю благодарность коллективу лаборатории «диагностики болезней сельскохозяйственных животных» за помощь и консультации при проведении исследований и оформлении отдельных глав диссертации.

Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 20082011 гг. в ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

1. Обзор литературы.

1.1. Историческая справка о вирусе гриппа птиц