Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ЛИЛИЙ

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ЛИЛИЙ"

Я'З^бЩ

На правах рукописи

ПУГАЧЕВА Галина Михайловна

МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ЛИЛИЙ

Специальность 06,01.05 — селекция и семеноводство

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Мичуринск — 2005

Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт садоводства им И.В. Мичурина

Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук старший научный сотрудник Киреева Маргарита Филипповна

Официальные оппоненты; доктор сельскохозяйственных наук,

профессор

Усова Галина Северьяковна; кандидат биологических наук Соловых Наталья Владимировна

Ведущее учреждение - ФГОУ ВПО Воронежский государственный аграрный университет им. К Л- Ггшнки

Защита диссертации состоится 26 мая 2005 п в 13м на заседании диссертационного совета Д220.041.01 при Мичуринском государственном аграрном университете по адресу: 393760, Тамбовская обл., г. Мичуринск,

ул. Интернациональная, 101.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Мичуринского государственного аграрного университета.

Автореферат разослан "Л0" Ош^е^АЗ 2005г.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные и скрепленные гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю совета.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д220.041.0), кандидат сельскохозяйственных наук

Н.М. Соломашн

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальности темы.

Лилии (рол ЫПиш Ь.) • многолетние луковичные декоративные растения. Среди цветочных культур им принадлежит одно из ведущих мест. В настоящее время число сортов Трубчатых лилий по количеству уступает лишь сортам Азиатских гибридов. Ряд декоративных качеств - чистота окраски, красота форм цветков, а также их аромат неизменно привлекают внимание, а потенциальные генетические возможности делают виды, раз нов чин ости и гибриды ценным материалом для селекции.

За последние годы интерес к этой культуре вырос за рубежом и в России. Селекционерами Голландии, США и Австралии получены перспективные вы со ко декоративные отдаленные гибриды между Трубчатыми, Восточными, Ддинноцветковыми и Азиатскими гибридами, которые начали завоевывать рынок.

Условия России, в частности обширной ее центральной зоны, существенно отличаются от более благоприятных условий западных стран, поэтому необходимы собственные исследования и свои новые сорта.

Значительный интерес для селекции лилий представляет отдаленная гибридизация, которая является одним из главных методов изменения наследственной природы растительных организмов. При межвидовых скрещиваниях на пути селекционера часто становится проблема несовместимости. Метод выращивания гибридных зародышей на искусственных питательных средах позволяет преодолеть постгамную несовместимость и создать исходный материал для селекции.

Решающее значение в создании новых сортов отводится также экспериментальной алло и аутополиплоидии, так как это эффективный метод получения новых форм с измененным геномным составом.

Семенное размножение - один из основных способов получения массового посадочного материала, приспособленного к условиям местного климата, и является самым простым и экономичным способом размножения Трубчатых гибридов. При этом происходит не только ускорение воспроизводства, но и оздоровление растений, так как при семенном размножении вирусные заболевания потомству практически не передаются.

Цель исследований:

С использованием методов отдаленной гибридизации, эмбриокультуры и полиплоидии создать исходный материал Трубчатых гибридов лилий и подобрать родительские пары для получения однородного семенного потомства.

В связи с этим решались следующие задачи:

1. Определить степень совместимости ряда сортов и видов лилий.

2. Разработать способы преодоления постгамной несовместимости при отгсалеинму гкретчнянчах с иг-пол кчгтаиием эмбриокультуры.

ЦН5 МСХА фонд нзччнойлитера

№.

ц:

3. Изучить эффективность колхицинирования.

4. Подобрать исходные формы для получения однородного семенного потомства.

Научная новизна и практическая значимость.

В результате проведенных исследований получен и изучен гибридный фонд из 5700 сеянцев, из них отобрано около 100 перспективных для селекции.

Разработаны способы преодоления постгамной несовместимости при отдаленных скрещиваниях лилий с помощью методов культуры in vitro, в том числе через культуру каллуса получены полноценные растения от аномальных проростков.

Разработан метод создания амфидн плоидн ых форм лилий в условиях in vitro.

Впервые в России начата работа по поучению сортов-линий Трубчатых гибридов.

Апробация работы

Результаты исследований докладывались на заседаниях Ученого совета, на Всероссийской научно-практической конференции «Повышение эффективности садоводства в современных условиях» {Мичуринск, 2003), были представлены на Международной конференции «Генетические ресурсы растениеводства Дальнего Востока» (Владивосток, 2004),

Публикация результатов исследований

По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Объем it структура диссертации

Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, состоит из введения, S глав, выводов, практических рекомендаций, содержит 18 таблиц и 58 рисунков. Список использованной литературы включает 166 наименование, в том числе 63 на иностранных языках.

Методика н условия проведения исследований

Экспериментальная работа проведена на базе отдела декоративного садоводства н лаборатории биотехнологии В НИИ С им. И.В.Мичурина в течение 1988 - 1992 и 1998 - 2004 гг. Исследования выполнены на гибридном фонде, созданном М.Ф. КмреевоЙ, Н.Г. Коршиконой.

Работа выполнена в Мичуринском районе Тамбовской области, на территории on ытно-гтронзводственного хозяйства Всероссийского научно-исследовательского института им. И.В.Мичурина. Участок, на котором

посажены лилии, расположен на пологом юго-восточном склоне террасы реки Лесной Воронеж. Почва участка - мощный глубоковыщелоченный чернозем, сформированный на лессовидной песчаной шине, по механическому составу суглинистый. По ресурсам тепла, влагообеспеченности и климатическим особенностям Тамбовская область благоприятна для возделывания цветом но-декоративных культур, в частности лилий.

Материал исследований:

Вид: L. heniyi Baker, 1888 - л. Генри - 9 раздел Международной классификации гибридных лилий.

Сорта: Black Beauty (Блэк Бьют»), Rodeo (Родео), Royal Grace (Роял Грейс)- 8 раздел

Утренняя Звезда - раздел 1.

Star Gazer (Стар Гейзер) -раздел 7.

Lenipe (Лерупе) и 58 гибридов - 6 раздел.

Методика исследований.

Полевые опыты проводили согласно "Программе и методике отдаленной гибридизации плодовых и ягодных культури( 1972 г.) с небольшими изменениями применительно к культуре лилий.

Для преодоления нескрещиваемости использовали укорачивание пестика, постгамной несовместимости - культивирование зародышей in vitro, no общепринятой методике культивирования растительных тканей (Бутен-ко.1964 г.). Культивирование изолированных зародышей в условиях in vitro включало несколько этапов:

1. введение в культуру in vitro, получение проростков,

2. размножение гибридов методом чешуевания и через культуру каллуса.

Обработку проростков колхицином и подсчет хромосом в клетках (в меристеме корешков) проводили по методике Н.П. Чу ваш иной (Программе и методике отдаленной гибридизации плодовых и ягодных культур, 1972 г.).

Для получения полиплоидов в условиях in vitro использовали каллус и чешуйки микролуковичек, которые обрабатывали водными растворами колхицина. Предварительную идентификацию полиплоидов проводили измерением величины устьиц по методике Бреславец (1963).

При изучении отборных сеянцев была использована "Методика первичного сортоизучения цветочных »культур" (Бол го в, 199S),

Статистическую обработку полученных данных проводили методом дисперсионного анализа (Доспехов, Б .А., 1979) с использованием компьютерной программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Степень совместимости ряда сортов и видов лилий.

По данному разделу исследований ставилась цель выявить границы скрещиваемости ряда сортов и видов лилий и сгруппировать их по степени совместимости. Эксперимент проводился в полевых условиях в период с 1998 по 2002 год. В гибридизации использовали: Трубчатые, Восточные, Азиагские и ЛА (Лонгифлорум х Азиатские) гибриды. Ежегодно опылялось 150 - 200 цветков в 25 -29 скрещиваниях. Гибридизацию проводили с укорачиванием пестика и без. Семена с зародышами были получены только в варианте с укорачиванием пестика. За все годы осуществили 125 скрещиваний, из них семена были получены в 19 (табл. 1).

1, Выход гибридных сеянцев в результате отдаленной гибридизации

(1998-2002ГГ.)

№ Комбинация скрещивания Гиб ридных семян Сеянцев

всего, шт. с зародышем шт. %

шт. %

1 153-52 х Crap Гейзер 249 37 14,9 7 18,9

2 153-52 х Стар Гейзер 330 44 13,3 0 0

3 156 - 68 - 1 х Стар Гейзер 318 33 10,4 15 45,5

4 156-63 - 1 х Стар Гейзер 760 245 32,2 31 12,6

5 153- 118-3 хСтар Гейзер 286 21 7,3 1 4,7

6 114 х Стар Гейзер 648 1 0,15 0 0

7 114 х Стар Гейзер 244 4 1,6 0 0

8 162- 175 -1х Утренняя Звезда 382 2 0,5 0 0

9 161-114-1 хРоял Грейс 29 5 17,2 0 0

10 161-131-1 х Роял Грейс 190 13 6,8 0 0

И 153-126-2 х Роял Грейс 123 6 4,9 2 33,3

12 Блэк Бьюти х Генри 505 5 1,0 0 0

13 Родео (J1A) х Азиатские (смесь пыльцы) 386 14 3,6 0 0

14 153-40 х Генри 892 5 0,6 0 0

15 !53-40хГенрн 148 22 14,9 2 9,1

16 190 х Генри 321 110 34,3 13 11,8

17 Т10 х Генри 321 27 8,4 1 3.7

18 Т10х Генри 619 230 37,2 32 13,9

19 153 - 40 х Блэк Бьюти 493 13 2,6 0 0

Таким образом, проводя отдаленные скрещивания, разделили изученные сорта и виды на две группы: несовместимые и частично совместимые,

К первой группе относятся комбинации скрещивания: Трубчатые х Азиатские, Генри х Восточные, Генри х Азиатские, при использовании Восточных гибридов в качестве материнского растения.

Ко второй группе относятся комбинации скрещивания: Трубчатые х Восточные, Трубчатые х Генри, Трубчатые х ЛА, J1A х Азиатские, Восточные х Генри, в которых удалось получить гибридные семена. Несовместимость проявилась на уровне потомства. В этой группе перспективно использование метода искусственного выращивания зародышей на питательных средах.

В результате экспериментов установлено, что данные сорта и виды по степени скрещиваемости между собой, в полевых условиях, являются практически несовместимыми.

Для определения выхода жизнеспособных растений в зависимости от условий выращивания (при посеве в почву, проращивании в чашках Петри, выращивании в условиях in vitro) использовали семена первого и второго поколения отдаленных скрещиваний:

• F| - 156 — 68 - ! х Стар Гейзер-(Трубчатый х Восточный)

* F2 - 161—103—4 х (Генри х Олимпнк) - (Трубчатый х (Генри х Трубчатый»

Установлено, что первое поколение отдаленных скрещиваний можно получить с помощью эмбриокультуры. При посеве в почву семена не проросли, в чашках Петри выход жизнеспособных растений составил 0,9 %. Однако, проращенные семена, высаженные в почву, погибли. Второе поколение более жизнеспособно, и даже при посеве в почву вырастает незначительное количество сеянцев.

Культивирование незрелых гибридных зародышей на искусственной питательной среде.

Изучением вопросов эмбриокультуры начали заниматься в 2000 году. Зародыши извлекали из семян через 40 - 60 дней после опыления, при первых признаках засыхания коробочек. В исследованиях были использованы зародыши от отдаленных и близкородственных (в пределах одной семьи) скрещиваний. Вырезанные зародыши с частью эндосперма, высаженные на питательную среду, через 14-30 дней начинали развитие.

В наших исследованиях для стерилизации использовали 0,04% раствор нитрата ртути и 96 % этиловый спирт. Стерилизация растительных объектов 96% этиловым спиртом, в который погружалась коробочка, а затем обжигалась над пламенем спиртовки, дала лучшие результаты. Это дешёвый, нетоксичный и досту пный антисептик, который обеспечивает достаточно качественную стерилизацию объекта и не повреждает зародыши.

Последовательность выращивания гибридных растений из зародышей с образованием проростка и луковички, а также через культуру каллуса и последующую регенерацию растений представлены на рисунке 1.

Развитие зародышей шло двумя путями:

1). образование проростка it луковички;

2). возникновение различных отклонений в процессе развития, образование каллус ной ткани.

Аномалии при формировании растений выражаются в отсутствии или резком ослаблении ростовых процессов, отсутствии роста корня или роста корня без развития семядольною листочка, нарушении полярности, образовании этиолированных или спирально скрученных листочков, возникновении некротических участков тканей и последующем усыхании, образовании каллуса. В среднем 56,6 % проростков имели нормальное развитие, 43,4 - с отклонениями. Проценты эти сильно менялись в зависимости от скрещивания.

Высокий процент регенерации был отмечен в скрещиваниях:

• в нервом поколении отдаленных скрещиваний (156-68-1 х Стар Гейзер) -38,5;

• во втором поколении отдаленных скрещиваний (161-103-4 х (Ген-рнхОлимпик)н 153-17-11 х (Генри х Олимпик) -41,5 и 66,6;

• при близкородственных скрещиваниях (156-28-6 х 156-27-1 и 15627-2 х 151-19-1)-66,6 и 34,8.

Для сохранения отдаленных гибридов брали участки ткани без признаков некроза от аномальных, отмирающих гибридных проростков, высаживали на улучшенную среду Мурасиге и Скуга и индуцировали рост каллу си ой ткани с последующей регенерацией побегов.

За годы исследований нам удалась получить 106 сеянцев от различных скрещиваний (табл. 2). Это составило 28,7% от введенных в культуру зародышей.

Этац размножения лнлнП,

Главная задача этого этана - добиться максимально быстрого размножения гибридов, полученных с помощью эмбриокультуры.

Каллусогенез и органогенез

Каллусные клетки при определенных условиях могут перейти к организованному росту и формированию побегов, но при этом часто возникают явления, нежелательные при микроразмножении растений, а именно изменение плоидности культивируемых клеток; структурные перестройки хромосом; потеря морфогенстического потенциала культивируемыми клетками.

Изменения, происходящие при культивировании каллусов, позволит получить дополнительный исходный материал для селекции.

В наших исследованиях для получения каллуса использовали в качестве эксплантов семядольный и первый настоящий лист. Высаживали на среду Мурасиге и Скуга, дополненную регуляторами роста; 6-БАП - 1 мг/л, ИМК — 0,3 мг/л. Образование каллуса наблюдали через 20 - 30 дней после посадки.

Возможная реакция изолированного экс план та: некроз, отсутствие изменений, образование каллуса и в некоторых случаях наблкщали органогенез. В наших исследованиях каллус не удалось получить в скрещивании 153-40 х Генри.

Для индукции морфогенеза каллусы пересаживали на среду Мурасиге и Скуга, обогащенную витаминами, сахарозой и регуляторами роста. Культуры содержали при г 22 - 25 °С, освещенности 1000 лк и 16- часовом фотоперио-

де, Спустя 14-20 дней наблюдалось образование хлорофиллоносных зон, а через пять-шесть недель - образование луковичек или чешуек луковичек.

гибридные семена

проростки

каллус или проростки с аномальным развитием

доращивание

микроразмножение и укоренение

обработка колхицином

микроразмножение и укоренение

Ч\\Ч\\\Ч пересадка в открытый грунт

Рис.1. Способ преодоления постгамной несовместимости и стерильности межвидовых гибридов лилий

2. Результаты эмбриокульгуры

Комбинация скрещивания Введено в культуру Процент регенерации Развитие зародышей

нормальное с отклонениями

шт. % шт. %

156-68-1 х Стар Гейзер 120 38,5 19 41,4 27 58,6

162-175-1 х Утренняя Звезда 2 0 - - - -

153-52 х Стар Гейзер 27 18,9 3 42,8 4 57,2

153-118-3 х Стар Гейзер 17 5,9 0 0 I 100

Т 10 х Генри 257 12,8 21 63,6 12 36,4

153-40 х Генри 21 9,1 1 50 1 50

161—103—4х (Генри х Олнмпик) 77 41,5 16 50 16 50

153-17-И х | з (Генри х Олимпнк) ; 66,6 2 100 0 0

153-126-2 х Роял Грсйс 6 33,3 0 0 2 100

161-114-1 хРоял Грейс 3 0 - - - -

161-131-1 хРоял Грейс 8 0 - - - -

162-173-4 .хЛерупе 12 8,3 0 0 1 100

153-75-5 хЛерунс 7 0 - - - -

Родео х смесь азиатских 14 0 - - - -

156-28-6 х 156-27-1 6 66,6 4 100 0 0

156-27-2 х 151-19-1 23 34.8 6 75 2 25

153-40 х Блэк Бьюти 13 0 - - - -

Всего: 369 28,7 60 56,6 46 43,4

Влняшк углеводного питания на процесс роста.

Размер луковичек, полученных с помощью каллусогенеза, колебался от нитевидных (0,05см) до 0,5см в диаметре. Мелкие луковицы не подходят для дальнейшего размножения и адаптации. Необходимо добиться регенерации максимально крупных луковичек. Так как рост практически всех изолированных культур обеспечивается за счет углеводов среды, был поставлен опыт, целью которого было подобрать концентрацию сахарозы, оптимальную для роста микролуковичек.

Для эксперимента использовали гибриды:

6(5) - 153-52 х Стар Гейзер - (Трубчатый х Восточный)

6(1) - 153-52 х Стар Гейзер - (Трубчатый х Восточный)

2(1) - 153-17-11 х (Генри х Олимлик) - (Трубчатый х (Генри х Трубчатый)).

Рост луковиц оказался прямо пропорционален концентрации сахарозы в среде для гибридов 6(5) и ¿(1). При концентрации 30 г/л размер луковичек составил 0,18 и 0,2 см, 90 г/л - 0,41 и 0,36. У гибрида 2(1) от скрещивания 153-17-11 х (Генри к Олимпик), при увеличении концентрации сахарозы до 90 г/л, размер луковиц уменьшился, и был на уровне контроля. При концентрации 60 г/л - размер луковичек существенно отличался от контроля и составил 0,32см,

Однако повышение концентрации сахарозы в среде неблагоприятно влияло на регенерацию луковичек, и при содержании сахарозы в среде 90 г/л, наблюдали самый низкий его процент. Оптимальным для роста и развития является концентрация сахарозы - 60 г/л, при этом происходит незначительное уменьшение процента регенерации и значительное увеличение размера луковичек.

Влияние периода покоя на органогенез.

Для увеличения коэффициента размножения при длительном культивировании в условиях in vitro провели подбор оптимальной концентрации 6-бенз>1ламинопурина (6-БАП) и выяснили роль периода покоя. Для постановки этого опыта, часть пробирок содержали при t 22 - 25 0 С, освещенности 2000 лк и длине дня 16 часов, дру|ую - в течение 8 недель при t +4 0 С, в бытовом холодильнике.

Проведенные нами исследования показали, что развитие адвентивных луковичек идет более активно после периода покоя. Образование луковиц шло на безгормональной среде. Повышение концентрации БАП до 2- 3 мг/л. подавляло образование луковичек. Содержание БАП в среде также влияло на размер образовавшихся луковичек. Максимальный размер луковичек наблюдали на среде с БАП 0,5 —1,0 мг/л.

Укоренение и адаптация растений.

Пересадка растений - регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс микроклонального размножения. На этом этапе наблюдался значительный выпад растительного материала. Для снижения потерь в период адаптации были поставлены опыты по влиянию периода покоя, субстрата на адаптацию, с учетом состояния растения на этот период.

Наиболее благоприятное время для пересадки растений март-апрель. Луковички, посаженные в этот период, к августу достигают размеров 0,8-1,2 см в диаметре и вполне благополучно переносят пересадку в полевые условия. При более поздних сроках луковички не успевают вырасти, и пересадка переносится на май-июнь следующего года.

Укоренение микролуковичек проводили на среде Мурасиге - Скуга, с добавлением ИМК- 0,1-0,3 мг/л. При этих концентрациях ИМК процесс ризо-генеэа проходил успешно.

Период стратификации необходим почти для всех групп лилий. Азиатским гибридам достаточно 8-10 недель, Восточным - 10-12, а Трубчатым-4-6. Проведенные нами исследования показали, что рост луковичек возможен и без периода стратификации, однако рост и развитие растений были лучше после охлаждения.

Для лилий даны следующие рекомендации почвенных субстратов: В.В. Француэенок (1997) - смесь торфа с песком или перлитом (1:1) для лилий Азиатской группы; I. Zhola и др, (1993), A. Evans (1995) - указывают просто удобренный субстрат, не уточняя какой именно; D. Egger (1988) -почву, торф и вермикулит в различных сочетаниях.

Трубчатые гибриды плохо переносят кислую реакцию почвы, наиболее подходящим для них являегся нейтральная или даже слабощелочная. Поэтому в качестве субстрата использовали перегной, песок и дерновую землю (1:1:1) (контроль), а в опыте использовали тот же субстрат с добавлением измельченною сфагнового мха.

Проведенные исследования показали, что размер луковичек и субстрат существенно влияют на их приживаемость в нестерильных условиях. Адаптация значительно лучше прошла при использовании мха. Сфагновый мох. обладая антибиотическими свойствами (Жизнь растений, 1978), помогает выжигь луковичкам. При высадке крупных (03-0,6 см) луковичек в опыте приживаемость составила 82- 85, а в контроле - 20-26%.

Использование мелких луковичек для адаптации нецелесообразно, так как потери при высадке значительные: в контроле — 81-83 %, в опыте- 36-49 от высаженных растений. Использование мха немного смягчает эту неприглядную картину, однако, работая с отдаленными гибридами, жалко терять уникальный генофонд.

Экспериментальное получение полиплоидов лилий.

Для получения полиплоидных форм использовали 30-дневные проростки от скрещиваний: гибрид 112 х гибрид 109 и 153-17-1 х гибрид Т 28.

Сеянцы обрабатывали 0,5 и 1% водными растворами колхицина в течение 15, 20, 24,48 и 72 часов, по 60 штук в каждом варианте. Во время обработки размер луковичек у всех сеянцев был приблизительно одинаковым - 0,2 см.

После обработки колхицином растения около месяца находились в угнетенном состоянии. Гибель исходного материала составила от 20 до 95% в зависимости от варианта обработки и генотипа. В контроле растения через 1014 дней после посадки пошли в рост. Приживаемость их составила 100% (табл. 3).

3. Действие колхицина на сеянцы лилий (1999 — 2000 гг.)_

Режим обработки Процент Средний размер луковичек, см.

экспозиция, час концентрация колхицина, % выживших растений измененных от числа

обработанных выживших

112х 109

15 контроль 100 0 0 0,86

0,5 66,6 5,0 7.5 0,54

1,0 53,3 3,3 6.2 0,64

24 контроль 100 0 0 0,74

0,5 56,6 8,3 14,7 0.53

1,0 51,6 3,3 6.5 0,50

48 контроль 100 0 0 0,91

0,5 10 1,6 16,6 0,58

1,0 8,3 0 0 0,56

72 контроль 100 0 0 1,27

0,5 8,3 0 0 0,6

1,0 5,0 0 0 0,58

НСРщ =0,17

153-17-1 х Т 28

15 Контроль 100 0 0 1.0

0,5 73,3 5,0 6,8 1.0

1,0 80 3,3 4,2 0,84

20 Контроль 100 0 0 1,32

0,5 66,6 6,6 10 0,99

1,0 65 3,3 5,1 0,98

24 Контроль 100 0 0 1,38

0,5 75 10 13,3 0,87

1,0 68,3 1,6 2,4 0,83

43 Контроль 100 0 0 1,4

0,5 48,3 1,6 3,4 0,75

1.0 25 0 0 0,78

НСРо, = 0,22

Учет размера луковиц проводили при высадке растений в почву, через год после обработки. Луковицы, обработанных колхицином растений, были намного меньше и существенно отличались от контрольных растений.

В контроле этот показатель был напрямую связан с экспозицией: чем дольше растения находились в воде и эксикаторе вместе с обрабатываемыми растениями, тем крупнее были луковички. Можно предположить, что пары алкалоида колхицина стимулировали рост растений. Как отмечает Бреславец

(1963), существует много фактов, свидетельствующих о стимуляции ростовых процессов под влиянием колхицина. Изменения, которые происходят при действии колхицина в молодых растущих частях, сходны с изменениями, вызываемыми некоторыми ростовыми веществами группы ауксина или гетероа-уксина.

Плондиость определяли подсчетом хромосом в клетках (ь меристеме корешков). Фиксацию материала проводили через год после обработки. Опытные и контрольные луковицы сильно отличались не только размером, но и внешним видом. При обработке 0,5% колхицином при экспозиции 24,48 и 72 часа встречались растения без точек роста и без корней. Луковичка была измененной, и напоминала чешуйку, на шторой образовалась другая чешуйка. Проверить плоидность таких растений не было возможности.

Установлено, что лучшие результаты получены при 24-часовой экспозиции в 0,5 % растворе. В скрещивании 112x109 обнаружили 5 полиплоидных растений, 153-17-1 х Т 28 - б, что составило 14,7 и 13,3 % измененных от числа выживших. Использование 1% раствора колхицина нецелесообразно из-за низкого выхода полиплоидных растений.

Всего было обработано 1440 сеянцев и получено 32 полиплоидных растения. В 2004 году наблюдали первое цветение. Зацвело 56% диплоидных форм, из полиплоидных только 1 растение.

Гибридный сеянец № 26. Тетраплоидная форма гибрида, полученного от скрещивания 153-17-1 х Т 28. Окраска околоцветника розовато-белая, с зелеными пыльцевыми нитями, пыльники - желтые. По высоте растения разницы между полиплоидной формой и диплоидной замечено не было. Длина замыкающих клеток устьиц диплоидных форм Трубчатых гибридов составляет 90 - 110 мкм (в среднем- 98), у полиплоидных форм — 105 - 125 мкм (средний показатель- 118), т.е. в 1,2 раза больше, чем диплоидных. Примерно на такую же величину различается размер пыльцевых зерен. Варьирование данного признака у диплоидных форм — 80 - 100, тетраплоидной - 95- 120 мкм. Было отмечено различие между диплоидными и тетраплоидными формами по срокам цветения. Тетраплоидная форма зацвела на 10 дней позже, когда дпплоидные лилии уже отцвели.

Скрещивание тетраплоидов и днплоидов является одним из самых эффективных способов получения трнгелоидов. Для получения мейотических полиплоидов провели 1S скрещиваний между диплоидными формами и тет-раплоидным сеянцем. Несмотря на то, что 2004 год был благоприятным для завязывания семян, в данных скрещиваниях семян с зародышами было очень мало.

Получение полиплоидных форм у сеянцев неперспективно по следующим причинам:

1. Гибель исходного материала составляет от 20 до 95 %.

2. Выход ценных сеянцев в гибридных семьях обычно низок, поэтому слишком мала вероятность получения ценных гибридных форм при колхицин ировани и.

Однако не исключается возможность использования данного метода при обработке проростков видовых лилий или уже апробированных скрещиваний.

Получение полиплоидов в условиях In vitro.

Для межвидовых гибридов лилий характерно проявление стерильности, что в значительной мере ограничивает использование их в селекции. Для ускорения селекционного процесса и преодоления стерильности межвидовых гибридов проводили полиплоизацию тканей гибрида в условиях in vitro с последующей регенерацией растений (рис. 1). В научной литературе вопросы колхицинирований в условиях in vitro практически не обсуждаются. И.В. Титова (1989), для преодоления стерильности гибридов F] А.сера х A.nutans использовала методику, разработанную Полу мордвиновой и Марьях иной. Основой их метода является поли плои дшация ткани гибрида in vitro, на питательной среде, содержащей колхицин. Отличиями в нашей работе было исключение колхицина из среды и использование большей концентрации колхицина при небольшой экспозиции.

Для эксперимента использовали гибриды:

♦ 6(5) - 153-52 х Стар Гейзер - (Трубчаггый х Восточный)

• Белый 1-Трубчатый.

Обработку проводили 0,05, 0,1 и 0,2% растворами колхицина с экспозицией 1, 2 и 3 часа. В стерильных условиях луковички, размер которых был ие менее 0,5 см в диаметре, извлекали из пробирок, снимали 3-4 чешуи. Чешуйки и каллус помещали в стерильный водный раствор колхицина, с последующей промывкой в стерильной воде. В контроле обрабатываемые ткани на такое же время помещали в воду. Регенерацию тканей проводили на среде Мураснге и Скуга, содержащей ИМК - 0,1 мг/л и БАП- 0,5 мг/л.

Реакция тканей на обработку была различной.

Самым чувствительным оказался каллус. После обработки в течение 2 и 3 часов каллус оставался без изменений 7-10 дней, затем потемнел и погиб. Гибель составила 100%. В контроле из каллуса были получены растения нормальной морфологии.

Выживаемость эксплантов в контроле составила 59-63%, при колхи-плоидии - 13-25%. Повышение концентрации колхицина было обратно пропорционально проценту регенерации. Коэффициент размножения во всех вариантах, кроме одного, существенно не отличался и составил 3,5-4 луковички на эксплант, При концентрации колхицина 0,2% и экспозиции 1 час, данный показатель был равен ОД5 штук на эксплант. Повышение концентрации колхицина привело к уменьшению количества регенерировавших луковичек. Образовавшиеся луковички были небольших размеров (0,1 - 0,2 см) и были пересажены на новую среду для доращивання.

Длину замыкающих клеток устьиц измеряли при пересадке луковичек в стерильную почвенную смесь. П. Шенк (Schenk, 1987) рекомендует использовать данный косвенный признак для ранней диагностики полиплоидных растений.

Для измерения брали листья одинакового размера. Эпидермис снимали с нижней стороны средней части листа. Было отмечено, что этот признак почти во всех вариантах не изменяется и средний размер устьиц равен 59,3 - 60,5 мкм. При режиме обработки 0,05% колхицином в течение I часа этот показатель составил 64,2 мкм. В этом варианте были растения с более крупными устьицами, однако количество их было незначительно.

Использование каллуса для получения полиплоидов нецелесообразно из-за болыиой гибели исходного материала и низкого выхода тетраплоидкых растений.

Эксперименты по обработке чещуй микролуковиц показали, что даже незначительное повышение концентрации колхицина и длительности экспозиции приводит к полному угнетению регенерационных способностей чешуй и развитие идет только через культуру каллуса.

Реге нерацио иные способности во многом зависят от генотипа растений: Трубчатый гибрид Белый I перенес отравляющее действие холхицина легче, чем межвидовой гибрид. При экспозиции 1 час процент регенерации гибрида Белый 1 в опытных вариантах был достаточно высоким и существенно не отличался от контроля, гибрида 6(5) - при концентрации колхицина 0,1% выживаемость эксплантов составила 54%. В контроле процент регенерации обоих гибридов был достаточно высоким. Адвентивные луковички развивались нормально с коэффициентом размножения 2,75 — 3,75 у гибрида Белый 1 и 2,0 - 3,5 у гибрида б (5).

Графики (Рис.2-4) показывают варьирование длины замыкающих клеток устьиц при различных экспозициях. В контроле размер устьиц варьирует от 48 до 72 мкм. По сравнению с контролем в опытных вариантах встречаются растения с размерами устьиц от 48 до 88 мкм.

Измерение величины устьиц показало, что если использовать только один критерий: длину замыкающих клеток устьиц, то разница между контролем и опытом существенна в трех вариантах. Однако если брать в расчет длину и ширину устьиц и вычислить их площадь, то разница существенна во всех вариантах по сравнению с контролем. По мнению Бреславец (1963), многие замыкающие клетки устьиц межвидовых гибридов, и полиплоидов развиваются больше в ширину, чем в длину и вычисление площади дает несравненно более чувствительный показатель.

Критерием полиплоидного состояния при предварительном отборе кол-хицинированных растений является комплекс морфо-анатомических признаков - больший в сравнении с диплоидами размер устьиц, листья с плотной текстурой или с волнистой поверхностью листовых пластинок.

Распознавание полиплоидов на ранних стадиях развития играет большую роль, так как позволяет расширить опыты за счет браковки диплоидов. Однако окончательный вывод о плоидности того или иного растения можно сделать только на основании подсчета хромосом.

Рис. 2, Варьирование размера устьиц гибрида Белый ] при экспозиции 1 час

Изучение самосовмести мости Трубчатых гибридов.

Изучение самоопыления у лилий представляет интерес в связи с разработкой линейной селекции этой культуры, поскольку первое требование метода инбридинга, при котором используют самоопыление внутри перекрестноопыляющихся форм, - наличие индивидуумов с определенной способностью к самофертильности.

Проведенные исследования в течение 1989-1992 и 1998-2002гг. показали, что некоторые сорта » гибриды Трубчатых лилий способны образовывать семена при принудительном самоопылении. Завязываемость семян очень низкая (0,84 - 15,7%), в зависимости от гибридной формы. Все изученные гибриды лилий можно разделить на две группы: самостерильные и с низкой степенью самофертильности. Большинство гибридов, кроме 13-196-5 и 15340 показали себя самофергтильиыми один раз за все годы.

При перекрестном опылении во всех случаях получены более высокие результаты, чем при самоопылении. Семена от само- и перекрестного опыления ничем не отличались. Зародыш хорошо просматривался. Однако при посеве в почву всхожесть их была различной. От самоопыления был получен только один сеянеи, который так и не удалось довести до цветения.

Растения склонные к самофертильности у Трубчатых лилий встречаются редко. Для этой культуры, как перекрестника, наиболее типична самостерильность растений, служащая основным препятствием на пути создания гомозиготных линий. Поэтому для создания инбредных линий наиболее подходящим способом являются сестринские скрещивания.

Подбор исходных пар для получения стрейнов - один из самых ответственных моментов гибридизации. На первом этапе работы одним из основных условий, которых мы придерживались, было фенотипическое сходство родителей. Для гибридизации использовали формы, отобранные по комплексу признаков: декоративности, устойчивости к болезням и неблагоприятным условиям среды.

Расшепленне по окраске околоцветника было отмечено во всех скрещиваниях. Родительские формы, которые дали достаточно выровненное потомство и гибридные формы от этих скрещиваний использовали для получения второго поколения.

При внутрисемейных скрещиваниях процент жизнеспособных семян и сеянцев, был не ниже, чем в межсортовых скрещиваниях. В первом поколении от близкородственных скрещиваний признаков дегенерации не наблюдалось.

Депрессия при самоопылении и сестринских скрещиваниях наступает не в одно время. При самоопылении уже в первом поколении не удалось получить нормальных сеянцев. При сибс скрещиваниях всхожесть сеянцев была такой же, как при межсортовых. Этому явлению можно дать следующее объяснение. Инбридинг в форме сестринских скрещиваниях является не столь резкой формой как самоопыление, а так как для скрещиваний отбирались лучшие растения, то угнетающее действие инбридинга не было заметно.

Оценку экономической эффективности размножения лилий

В условиях рыночных отношений экономическая эффективность возделывания сельскохозяйственных культур является первостепенным фактором, определяющим целесообразность закладки промышленных насаждений.

Цветоводство — одна из наиболее развитых и высокодоходных отраслей сельского хозяйства в большинстве стран мира. При этом она продолжает развиваться очень высокими темпами, особенно в европейских странах. К сожалению, в России почти нет хозяйств, занимающихся размножением лилий. Продуктивность цветочных кулмур определяется сортовыми особенностями, природно-климатическими условиями произрастания, уровнем агротехники и другими факторами.

Расчет экономической эффективности выращивания посадочного материала выполнен на основе технологической карты, учитывающей агротехнические требования культуры. Нами учитывались нормы посадки на 1 га площади, комплекс материально-денежных затрат, выход стандартного посадочного материала.

При закладке участка луковичками, полученными методом чешуевания, большие затраты приходятся на содержание маточника.

Семенное размножение не только ускоряет производство посадочного материала Трубчатых гибридов, но при этом происходит оздоровление посадочного материала.

При выращивании луковиц из семян себестоимость одной луковицы составила б,60, вегетативном - 10,60 рублей (табл. 4). Спрос на луковицы Трубчатых лилий высокий и это определяет цены (средняя цена реализации -25 рублей). При этом рентабельность производства луковиц из семян в два раза выше, чем при вегетативном. Прибыль на 1 га насаждений при семенном размножении- 1470 тыс. руб.

4. Экономическая эффективность выращивания Трубчатых лилий

Показатели Способ размножения

вегетативный семенной

Выход стандартных луковиц с 1 га. тыс. шт. 80 80

Прямые затраты на 1 га насаждений, тыс, руб. 850 530

Себестоимость 1 луковицы, руб. 10,6 6,60

Средняя цена реализации луковиц, руб. 25 25

Чистый доход с 1 га. тыс. руб. 1150 1470

Уровень рентабельности, % 135 277

выводы

1. Применение межвидовой гибридизации, культивирования гибридных зародышей и экспериментальной полиплоидии перспективно для получения исходного селекционного материала, необходимого для создания высокодекоративных, зимостойких и устойчивых сортовлилий.

2. Скрещивания между Трубчатыми, Восточными, Азиатскими и Лонги флорум-Аз натеки ми гибридами, проведенные в полевых условиях, являются, как правило, несовместимыми.

3. Для преодоления постгамной несовместимости при отдаленных скрещиваниях, повышения фертильностн полученных межвидовых гибридов следует использовать метод культуры in vitro.

4. Получение жизнеспособных растений от аномальных проростков возможно посредством культуры каллуса и последующей регенерации растений,

5. При длительном культивировании в условиях in vitro на формирование адвентивных луковичек на чешуях лилий стимулирующее действие оказывает охлаждение растений в течение восьми недель при температуре +4 °С.

6. Повышение концентрации сахарозы до 60 г/л на этапе дсращивания луковиц при культивировании лилий способствует значительному увеличению размера луковичек.

7. Выявлено, что высокая приживаемость растений в условиях in vivo достигается при высадке луковичек размером не менее 0,3 см и при использовании в качестве субстрата дерновой земли, перегноя, песка в соотношении (1:1:1) с добавлением сфагнового мха.

8. Экспериментальное получение полиплоидов возможно всеми изученными способами колхицинирования. Наиболее эффективным методом получения полиплоидных форм является обработка чешуй луковиц 0,05 % водным раствором колхицина в течение одного часа.

9. Использование каллуса для получения полиплоидов и обработка сеянцев лилий 0,5 и 1% водными растворами колхицина с экспозицией 48 и 72 часа нецелесообразно из-за большой гибели исходного материала и низкого выхода тетранлоидных растений.

10. По степени самосовместимости Трубчатых гибридов выделено две труппы: самостерильные и с низкой степенью самофертильности.

11. Трубчатые гибриды гетерозиготны по признаку окраски венчика.

12. Установлено, что семьи: 116 х 117,123 х 124,124 х 123,126 х 127,127 X 126, ТЗ X Т4, Т4 х ТЗ, 142 х 141,152 х 151,132 х нежно-розовый, Т34 х Т28, 144х роз.1 имеют довольно выровненное потомство. Исходные формы и гибриды, полученные в результате этих скрещиваний, рекомендуются для использования в селекционной работе.

13. Исходные формы: 104,105,119,118,Т7,Т8,Т 1,Т2,Т39,Т24 нецелесообразно использовать для получения сортов - линий, постольку в их потомстве наблюдается значительное расщепление по окраске околоцветника и срокам цветения.

14. Выявлена высокая рентабельность выращивания луковиц Трубчатых гибридов из семян.

15. В процессе работы выделены формы с оригинальной окраской околоцветника, слабым ароматом, с направленными вверх цветками, устойчивые к заболеваниям.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Для получения исходного селекционного материала лилий с помощью межвидовой гибридизации и эмбриокультуры отдаленных гибридов рекомендуется следующая последовательность операций:

1. Коробочки перед вычленением из них зародышей промываются в мыльном растворе и прополаскиваются в проточной водопроводной воде. Для стерилизации используется 96% этиловый спирт, в который погружается коробочка, а затем обжигается над пламенем спиртовки,

2. Изоляция и культивирование зародышей, вырезанных с кусочком эндосперма, проводится на среде Мурасигс и Скуга.

3. Культивирование изолированных зародышей целесообразно проводить в пять этапов:

1 этап - введение в культуру и получение проростков или каллуса, при % 22 - 25 °С, в темноте, в печение 3-4 недель.

2 этап - дорашиванне луковиц до размеров 5-10 мм при г 22 - 25 0 С, освещенности 1000 лк и 16- часовом фотопериодс.

3 этап — размножение гибридов методом чешуевания луковичек и использования листовых эксплантов. Дорашиванне луковиц до размеров 5-10 мм при 122 - 25 освещенности 1000 лк и 16- часовом фотопериоде.

4 этап - укоренение луковичек на среде Мурасиге и Скуга, ИМК - 0,10,3 мг/л, при 122 - 25 0 С, освещенности 1000 лк и 16- часовом фотопериодс, прохождение периода покоя в бытовом холодильнике - в течение восьми недель при I +4 0 С.

5 этап — для адаптации растений лучше использовать перегной, песок и дерновую землю в соотношении (1:1:1) с добавлением измельченного сфагнового мха.

Луковички высаживаются в пластмассовые контейнеры или ящики и прикрываются полиэтиленовой пленкой на 2*3 недели.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Иванова, H.D. Микроклональное размножение азиатских гибридов лилий./ Н.В. Иванова, Г,М. Пугачева// Основные итоги и перспективы научных исследований ВНИИс и м.И. В .Мичурина: Сб. науч. тр., / Тамбов: издательство ТГТУ, 2001. - Т.1 - С. 199-203.

2. Пугачева, Г.М. Межвидовая совместимость при скрещивании в роде LUitim./ Г.М. Пугачева, М.Ф.КирееваЛ Повышение эффективности садоводства в современных условиях: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, Мичуринск, 22- 24 декабря 2003. / МичГАУ.-Мичуринск, 2003.-t.3. — С. 255- 259.

3. Пугачева, Г.М. Эмбриокультура отдаленных гибридов лилий,/ Г.М. Пугачева // Повышение эффективности садоводства в современных условиях: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, 22- 24 декабря 2003/ МичГАУ,- Мичуринск, 2003,-tJ - С. 260- 265.

4. Пугачева, Г.М, Клональное микроразмножение отдаленных гибридов лилий./ Г.М. Пугачева Я Генетические ресурсы растениеводства Дальнего Востока: Международная конференция, Владивосток: Дальнауха, 25-27 августа 2004,- С. 393-397.

5. Пугачева, Г.М, Лилии Трубчатые Гибриды / Г.М. Пугачева // Цветоводство №2,2005.-С. 24,

Отпечатано в типографии ФГОУ ВПО МичГАУ Подписано в печать 12.04.05. г. Формат 60x84 '/16, Бумага офсетная № 1. Усл.печл. 1,27 Тираж 100 экз. Ризограф Заказ № 11522

Мичуринский государственный аграрный университет 393760, Тамбовская обл., г.Мичуринск, ул. Интернациональная, 101, тел. +7 (07545) 5-26-35 Е-таП: wdem@mgau.ru

» - 7 5 4 8