Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Локализация в геноме вируса осповакцины областей, природных для встраивания и экспрессии чужеродной генетической информации

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Локализация в геноме вируса осповакцины областей, природных для встраивания и экспрессии чужеродной генетической информации"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ ИМЕНИ Д. И. ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи

УДК 577.21: 578.821 : 578.5

ИВАНОВА Ольга Николаевна

ЛОКАЛИЗАЦИЯ В ГЕНОМЕ ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ ОБЛАСТЕЙ, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ВСТРАИВАНИЯ И ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ

(03.00.03 — молекулярная биология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в институте вирусных препаратов АМН СССР.

Научный руководитель доктор медицинских наук В. И. Черное.

Консультант кандидат биологических наук В. Н. Лопарев.

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Р. А. Гибадулин, доктор медицинских наук Г. Р. Мацепич

Ведущая организация — ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Мннмедпром СССР.

Защита диссертации состоится « . . . » . . . . 1991 г.

в «... » часов на заседании специализированного совета

Д 001.20.01 при Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР (Москва, 123098, ул. Гамалеи, 16).

Автореферат разослан « . . . ».....1991 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

А. М. Жуковский

Дкуу^ндста^оддадоравдз.

Вирус осповакцины - это наиболее изученный из всех вирусов, использовавшихся в качестве живых вакцин. С применение:/, вируса ос-ковавдины связана самая успешная из всех массовых кампаний вакцинации, приведшая к полной ликвидации оспы .) мире. Вируо осповакци-[•ш не встречается в природе и но способен вызывать какое-либо эпидемическое заболевание. Неконтролируемого распространения вируса от привитых людей не происходит. Отсутствие онкогенных и терзтогои-:шх свойств подтверждается многолетней практикой применения г-того зируса. 3 связи с этим одним из основных направлений использования вируса осповакцины стало создание на еЛ> основе живых рекомбинант-тх вакцин. Общий принцип получения таких вакцин заключается в сле-хущом. В качестве ооновы генно-инженерной живой вакцины использу-ат хорошо изученный и прошедший апробации штамм вируса осаовакци-ш,' в геном которого встраивается чужеродный ген с таким расчетом, иобы но нарушалась инфекционность иоходного вируса и чтобы полугенный рекомбинант обладал способностью индуцировать в зараженном >рган2зме наряду о собственными антигенами антигенный продукт ис- \ <усственно встроенного чужеродного гена. Поскольку в.геном вируса (сповэкцины можно включать несколько чужеродных генов, открывает-1Я возможность для создания живых поливакцин, направленных сразу гротив нескольких- инфекций человека или животных. Кроме того, имейся хорошо разработанная технология широкомасштабного производ-ива вируса ооповакданы. Таким образом, об использовании покс-юрусных векторов можно говорить как об особом направлении в био-'ехнологии. •

К настоящему времени в сачзи с отменой оспопрививания в ми-1в накапливается все большее количество людей не вакцинированных | детском возрасте. Наиболее частым и серьезным аргументом гротив спользования вируса ооповакцины в качестве вектора для создания ивнх вакцин является опасение возникновения поствакцинальных сложнений. Основной проблемой, от успешного решения которой запои? практическое использование вируса осповакцины в качестве ектора, является проблема безопасности и, в первую очоредь, поучение надежно аттенуированных штаммов вируса, сохранивших л{-игенную и. иммуногенную активность на достаточно высоком'уровне.

Одним из подходов к получению дополнительно аттенуированных штаммов вируо осповакцины является идентификация т.н. носуществашпсс ,,< генозз в геноме вируса, без которых вирус'сохраняет способность размножаться в культуре клеток, но специфически снижает патогенно с г ь для лабораторных аивотных в приобретает свойства дополнительно аттенуированных штаммов. Возможность применения вируса оо-повакцинн в качестве основы при получении живых рекомбинантных вакцин делает работу над созданием дополнительно аттенуированных штаммов актуальной.

Генно-инженерные поксвирусные рекшбинанты открывают принци-гглздъно новые возможности для изучения генетика поксвирусов, биологических функций поксвзруснвх генов и их рогуляторных элементов, а также для изучения экспрессии чужеродных генов в поковиру-оном геноме и их влияния на свойства рекомбинантннх вирусов.

Дальнейшее развитие работ по исследование структурно-функциональной организация генома поксвирусов позволит расширять возможности конструирования рвкоибинантнах вирусов и использовать вирус осповакцины для получения качественно новых, высокоэффективных и безопасных поливалентных вакцин как для человека, так и для животных.

Цель и задачи исследования.

Цель работа заключалась в изучении структурио-фуякциошяь-хшх особенностей организации генома вируса осповакцины, позволяющих оптимизировать использование этого вируса в качестве вектора чужеродной генетической информации.

. В процессе работа предстояло решить следующие задачи:

- отработать систему поиска областей генома вируса вакцяни пригодных для встраивания к экспрессии чужеродной генетической информации; локализовать такие области в центральной частя генома;

- создать эффективную систем встраивания чужеродной информации в различные участки генома вируса осповакцины;

- оценить возможность использования локализованных несущественных облаете® для получения дополнительно аттенуированных шта»-

в вируса вакцины.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В результате экспериментальной работы было клонировано 85J5 (нома вируса ооповакцины штамма ЛИШ.

Получены несколько вариантов специальных генно-инженерных шструкцзй (зондов), содержащих ген ß-галактозадазы Е. coli >д контролем промотора гена белка вируса ооповакцины и преднаэ-¡чонных для картирования несущественных областей в геноме впру-I осповакцини. Эти конструкции, отличающиеся типом используемо) промотора, наличием гена бактериальной устойчивости к канада-!ну л фланкирующими полилинкерными последовательностями, позво-гат осуществлять широкий спектр экспериментов по созданию реком-шантннх вирусов ооповакцины, экспреосирувдих чужеродную генети-)скуш информацию.

G помощью этих зондов было исследовано 12 неизученных обла-гей центральной части генома вируса ооповакцины штамма ЛИЕП. 06-фужено, что 4 из них ( E1L, E5R, E5R + ЕОЕРВ, E7R ) являются эсущественными для размножения рируса в культуре клеток, т.е. эгут быть использованы для.встраивания и экспрессии _чужеродной шетической информации.

В настоящей работе удалось получить рекомбинантныв вирусы зповакцины вакцинного штата (ЛИШ), содержащие зонд в 9 разлитых областях генома. Использование полученных рекомбинантов, со-аржащих в несущественной области легко детектируемый ген (ген > -галактозидазы), позволяет значительно упростить процесс вот-аивания неселективного чужеродного гена в геном вируса.

Показано, что вирусы, содержащие зонд в открытых чэмках счи-*вания E7R и DSL генома вируса ооповакцины штамма ЛИШ, морг быть основой при получении дополнительно аттенуированныт ва-зантов вируса.

Полученные результаты представляют практический интерес при энструировании поксвирусных рекомбинантов, предназначенных дл.1 зпользования в качестве основы живых вирусных вакцин или для на-зботки биологически активных веществ.

Оонорнне положения, выносимые на запит?.

I. Получена библиотека Hind, ill и Sal I фрагментов генома вируса осповзкцинц штамма ЛИШ, в которой представлено 8555 ге-т

нома.

?.. Получено 5 вариантов специальных генно-инженерных конст-ру:ш'/.:, содержащих ген ß -галактозидазы Е. coli под контролем промегорз гена белка вируса осповакцины в предназначенных для картирования несущественных областей в геноме вируса осповакцины.

3. Получены рекомбинантные вирусы осповакцины вакцинного -штамма (ЫВП), содержание экспрёссирувднйся. ген ^-галактозидазы E.qoli в 9 различных областях генома ( K1L, КАЪ, ЩЪ, E1L, Е5Н, E5R+308F3, Е7К , D3L, A56R ). Четыре из них не были описаны ранее как области несущественные для размножения вируса в культуре клеток (E1L, Е5К, E5R + E0RPB, E7R)«

4. Показано, что инсерционная инактивация отбытых рамок считывания Е7К и D8L генома вируса осповакцины штаила ЛИШ шкот быть основой при получения дополнительно агтенуяровакннх вариантов вируса.

Апробация.

Материалы диссертации были доложены и обсувдены на конкурсе научных работ молодых ученых института вирусных препаратов (Д., 1987), Мэвдународном симпозиума по предупреждению и лечению вирусных инфекций (Чехословакия, .1988), конференциях молодых ученых НШЭМ им. Гамалеи (1989) и НИИ вирусных препаратов (1988), Всесоюзном семинаре "Молекулярная биология и медицина" (Ленинград,' 1990)

Диссертация-апробирована и рекомендована к защите на обце-

апсгэтугокой конфепзпцл::

института вирусных препаратов АМН СССР от об .мал 1991 года.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура тойоты. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методический раздел, результата собственных исследований с их od-

суждением, заключения и выводов, а также раздела библиографии. Материал диссертации изложен на III страницах машинописного текста, включая 2 таблицы а 21 рисунок. Библиография -.165 источников отечественной и зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ' При проведении работ, сгязанных с изучением структурно-функциональной организации генома вируса осповакцины (БОБ), как впрочем и других вирусов, существенным этапом является получение библиотеки генов этого вируса. Ранее проводились работы по созданию коллекции, а также клонированию отдельных фрагментов ДНК ВОВ штамма WR ( lele н.в. , 1981, Филатов Ф.П. и др., 1985; Денисова Г.Ф. И др., 1985) и Copenhagen ( Drillien R. et al. , 1983). Для расширения круга молекулярно-биологических работ с геномом ВОВ нами были клонированы Hind III и Sal I фрагменты генома ВОВ штамма ЛИБО, который много лет успешно применялся в СССР для вакцинации лвдей и в настоящее время используется для создания живых рекомбинантных вакцин против"различных инфекций человека я сельскохозяйственных животных.

Использование стратегии статистической встройки Hind ni и Sal фрагментов ДНК ВОВ штамма ЖЕП в векторную плазмиду обеспечивает возможность клонирования 93$ вирусного генома. При этом 1% вирусной ДНК, включающей в себя концевые фрагменты, имеющие терминальные шпилечные структуры, и те из внутренних фрагментов, которые имеют слишком большой размер («30 т.п.н.) могут быть клонированы с помощью других специальных методов. Используя статистический подход нам удалось клонировать 10 Hind ii¿ фрагментов размером от 1,5 до 17,5 т.п.н. (. с, Б, F, н, I, J, L, и, о, р ) и 7 sal i фрагментов размером от 0,3 до 29,5 т.пл. , соответствующих Sal I фрагментам ДНК ВОВ штамма Copenhagen : A+J, с, Е, Р, о, I, м . В результате была получена библиотека HinJ( ш и Sal i фрагментов генома ВОВ штамма ЛИВП, в которой представлено 85% генома (рис. I), что являлось достаточным для проведения сравнительного рестрикционного анализа центральных фрагментов генома трех штаммов BOB, а также для встраивания и экспрессии чуне-

з m f £ pjxMf г с A a ¿ ß

"" 1 " 1 " i „i...........i и i i

LPMK&Q С A 3 ЭМА> A 7£ FlíPl

6. . i i ii Ii i i '111, ii Ulf.....ill I

Рис. I а - карта локализации Hind III фрагментов ДНК BOB штамма ЛИШ (Рязанкина О.И. и др., 1990); б'- карта локализации sai i фрагментов ДНК ВОВ штал ма Copenhagen ( Drillien R. at al.' , 1983); заштрихованы фрагменты, соответствующие которым клонированы из генома ВЭВ штамма ЛИБП, •

родной генетической информации в генома ВОВ.

Одним из направлений данной работы является поиск несущественных областей, встраивание в который чунеродной генетической ин формации позволяет получить стабильные рекомбинантные вирусы. В данной работе исследована возможность встраивания в определенные области фрагментов центральной части генома, вируса осповакцины: Hind, ine, Hind hie и Hind hip . Это связано с тем, что конце вые участки генома являются высоковариабелышми (т.к. изменения нуклеотидных последовательностей наблюдаются тем чаще, чем ближе они расположены к концу генома ВОВ), тогда как цонтральная часть консервативна и мало изменяется'от штамма к штамму ( Mackett ц. at al,,1979, Espsito j.J. at al,,1985, Рязанкина О.И. и др., 1990 Приходько Г. Г. 1990). Таким образом, именно центральные участки являются перспективными для встраивания и экспрессии чужеродной генетической информации. Проведенный анализ физической карты этих фрагментов подтвердил их высокую консервативность.

Сравнительный рестрикционный анализ Hind ШС фрашента )В штамма ЛИШ и соответствующих ему Hind IIID фрагментов штам->в та и Copenhagen показал, что при гидролизе пятно реотрик-ззаш ( Hind III, Bam HI, Bgl II, Pst I, Sal I ) различия были вязаны исключительно о ориентацией фрагг/ _ :;та ДНК ВОВ по отношэ-т к векторной плазмиде и с типом используемой плазмида. Раэли-¡ю физических карт были обнаружены лишь при анализе количества размеров субфрагмантов, полученных о помощью рестриктазы Eco Hî. га реотриктаза имеет много сайтов узнавания в ДНК ВОВ, что связа-о с низким процентом содержания gc пар в генома (33,0-36,8) Joklik w.K. at ах. , 1964) и AT богатой структурой сайта узна-эняя ростриктазы ( оааттс ). Расположение сайтов узнавания рест-иктазы Eco RI в исследуемых фрагментах штаммов ЛИШ и Сореп-agen оказалось идентичным. При этом, в отличие от фрагмента гамма WR имеющего концевой левый Всо RI -субфрагмеит 1,5 т.п.н., рагменты штаммов ЛИШ и Copenhagen несут дополнительный сайт, асщепляющий этот субфрагмент на фрагменты 0,7 и 0,8 т.п.н. Кроме ого, центральный Eco Ri субфрагмент размером 4,3 т.п.н. штам-ов ЛИШ и Copenhagen расщепляется у штамма WR w фрагменты азмером 3,5 и 0,8 т.п.н. (рис. 2 а).

Сравнительный анализ физической карты HindlllE фрагментов НК ВОВ штаммов ЛИШ, Copenhagen и WR по 4 рестриктазам ( Bgl , Baa HI, Kpn I, Eco Ri ) также показал высокую их консерватив-ость. По расположению сайтов рестриктаз Bgl п и Eco ri Hind S фрагмент штамма wr отличается*от тех же фрагментов штаммов ИБП и Copenhagen отсутствием I и 9 сайтов Bglïll , расположен-ого на расстоянии 4,5 т.п.н. от левого Hind III с&..га и нали-ием дополнительного сайта рестриктазы Eco ri , расположенного а расстоянии 3,7 т.п.н. от левого Hind'ni сайта (рис. ~ б).

Таким образом, проведенный нами сравнительный рестрикционный нализ Hind Ill-C и -Е фрашентов генома штамма ЛИШ и соответ-твующих им Hind III -D и -Е фрагментов штаммов '"R и Copen.ía-;еп подтвердил высокую их консервативность. Это позволило наденься на получение в дальнейшем стабильных рекомбинантных ВОВ, со-

а елш, 4Со/> tf £т/1, £ Сор

£Wg '

EJUS/7, £ Гор £w/? . '

Г-/7.//.

am гг jr.jr , ,.

»-1 U " 1

2,3 •'

1

J2

■ I. I ■

—H—tt-

4, ** ' ,

û г

£co#I

â s /а -/г /4

Рис, 2. Расположение сайтов узнавания для рестриктаз Eco 1Гх и Bgl II в Hind 1110(a) и -В (б) фрагментах ДНК ВОВ ЖШ и соответствующих им Hind ïli-D (а) в -Е (б] фрагментах шгашов we и Copenhagen,

держащих в этих фрагментах чужеродную генетическую информацию, Кроме того, плззмида для встраивания чужеродной генетической информации, созданная на основе центрального фрагмента одного штамма ВОВ, может быть использована в том же качестве для другого штамма. .>,

Общий подход к картированию несущественных областей в геноме ВОВ заключается в получении жизнеспособных вирусов,' имеющих либо делецшо части•генома, либо вставку чужеродной ДНК. В*данной работе поиск несущественных областей в геноме ВОВ проводили через получение рекомбинантов, содержащих в несущественной области экс-прессирувдлеiмаркерный ген. В качестве маркерного гена.использовался ген J> -галактозидазы, продукт экспрессии которого легко выявляется в эукариотических клетках, зараженных рекомбинантным вирусом.

Поэтапная схема эксперимента по картированию несущественных

5ластей (но) в геноме ВОВ представлена на рисунке 3.

I. Создание специальной генно-инженерной конструкции (зонда), одержащей экспрессируюпуйлмаркерный ген (структура зондов и их элучение описаны ниже).

П. Внедрение зонда в состав отдельны.. фрагментов вирусного энома. Эти эксперименты проводили с помощью фрагментов ДНК ВОВ, локированных предварительно в составе плазшдных векторов в клет-ах Е.соИ.

• Ш. Введение рекомбинантных плззмид в клетки куриных змбрио-ов, зарашпше ВОВ. Следует отметить, что клетки куриных эмбрио-ов, зараженные ВОВ, не обладают р -гад-активностью. Поэтому реком-инантше штаммы ВОВ, содержащие в гономэ экстре ссиругацяйся маркер-ий ген р-галактозидазы можно легко обнаружить с помощью инди— аторного реактива Х-гал, т.к. в присутствии этого реактива данные ирусы образуют бляшки, окрашенные в синий цвет. Зонд и окружающие го последовательности нуклеотидов в районе несущественной области ;огут быть выделены из генома рекомбинантного вируса с помощью со-тветствующих рестрикционных эндонуклеаз а клонированы в бактеря-льной системе в составе плазшд (рис. 3,17). Этот этап необходим ;ля дальнейшего анализа первичной структуры несущественной облас-и, идентификации конкретного гена и продуктов его экспрессии. Дан-:ая схема картирования несущественных областей, кроме решения сво-Л основной задачи, позволяет получить базовый материал для прове-;ения других молокулярно-биологических исследований (например, ютраивания и экспрессии другой чужеродной генетической информации), а именно штамм ВОВ, зкспрессирующий маркерный ген. В дальне-¡шем маркерный ген этого вируса можно заменить на люо^л другой чу-;еродный ген. При этом генно-инженерная работа может быть проверена о помощью уже готовых рекомбинантных векторных плазми; - ис-юльзованных для интеграции зонда в вирусный геном.

В ходе работы было сконструировано несколько вариантов стегальных генно-инженерных конструкций (в дальнейшем называемых* зон *ами), содержащих ген ^-галактозидазы под контролем промотора ЮВ. Эти конструкции, различающиеся между собой типом использу:- ■■ ."•о промотора, наличием гена бактериальной устойчивости к ка^ау-

' Лгг *

—СТ-Т

I ¡7

Рис. 3. Локализация НО в геноме ВОВ. Р - цромотор гена бедка ВОВ; | - положение зонда; - -последователь? нооти генома, фланкирующие НО; I - изображен один из вариантов зонда; П - внедрение зонда в состав клонирова

ных фрагментов, генома ВОВ; Ш - получение рекомбинаитного ВОВ 1&о! в результате гомологической рекомбинации между фрагментами ДЕК ВОВ с внедренными в них зондами в гомо логичными последовательностями генома исходного ВОВ 1й021 37 - "спасение" зонда из генома ВОВХас! о окружающими его последовательностями НО.

цину и фланкирующими полилинкерными последовательностями позволяют осуществлять широкий спектр экспериментов, связанных о создали ем рекомбинантных ВЭВ, экспресоирующих чужеродную генетическую ин формацию. При проведении генно-инженерных работ по встраиванию зонда в состав клонированных фрагментов генома ВОВ существенно об легчается селекция рекомбинантных плазмид за счет экспрессия гена бактериальной устойчивости к канамицину. Векторная пйаздада, содержащая' зоцд в составе картированной несущественной области, может быть превращена в интеграционную о полной или частичной заменой зонда на любую другую чужеродную генетическую информацию. В первом случае селекция рекомбинантнов, обеспечиваемая заменой зон дат лгсбой чухводкй ген, соагагз спор.- злрусов,не слсабкых продуцировать р -галактозидазу (псго^ши вирусом при проведении транс-

» . /tas лег i

г ^ZZZZZZZH^^S^S^S^ '

3

„i,.,,-,,»/ _ 7 ?f У --■

5" Jtififrs/yrttss

Рис. 4. Схематическое изображение подученных зондов, где Kmr -ген бактериальной устойчивости к канамицину; LaoZ - кодирующая часть гона!'1 р -гал е. coli ; Р7 5 - промотор рэнно-поздного белка ВОВ Г, 5К; Pg 5 - промотор раиного белка БОВ 9,5К; буквами обозначены сайты растриктаз: S - Sal Ij В - Bam HI; R - Е сой I; t - Set Ij К - Kpn 1} m * Sma I; X - ХЪа I; P - Pat Ij h - Spb I; H - Hind IIIj О - Xho I.

щин будет служить рекомбинантный вируо, содержащий зовдв несу- ■ зтвеяной области); во втором случае селекция реяомбинзнтов обе-зчивается коэкспрессией чужеродного гена и гена маркерного (р -юктоэидазы). Использование разных промоторов в составе зондов ! экспрессии р -галактозидазы позволяет избежать нестабильно-j структуры, содержащей одинаковые последовательности при ко-шрэссни двух генов в одной несущественной области. Предвари-1ЬШ9 расчеты, опирающиеся на данные о первичной последователь-зтд генома ВОВ ( Goebel з. at el. , 1990), показывают, что зон-ыогут быть встроены в геном ВОВ через каждые 300-500 нуклео-

тедов, т.е. практически в каждый ген.

В дальнейшем было получено 25 рекомбинантных плазыид, сод аащпх зонд в составе отдельных фрагментов генома ВОВ н направ; ющнх его в 21 область генома, из которых 7 - это описанные pai несущественные области и 14 - неизученные в этом отношении oöj те центральной части генома.

Используя эти конструзсции при проведении вирусологически: экспериментов, направленных на получение рекомбинантных вирус! экспрассирущих ß -галактозидазу, удалось получить ракомбина) содержащие зонд в 9 различных областях генома ( K1L, К4Ь, E1L, Е5Л( E5R + EORFB, E7R, D8L, A56R ) (рис. 5, а). В табЛИ! обобщены результаты экспериментов по встраиванию в геном BOB ] дальнейшей экопрессии маркерного гена. Критерием несуществен}!! области является возможность получения рекомбинантного вируса держащего в этой области зонд. Для всех областей, отмеченных : таблице как .СО (существенная область), получить рекрмбинантш: рус (с помощью соответствующих плазмид), экспрессируюпцй р -лактозидазу,*не удалось. Так, при исследовании 12 неизученных ластей центральной части генома ВОВ обнаружено, что 8 из них, роятнее всего', являются существенными для размножения вируса культуре.клеток куриных эмбрионов. В них входят открытые рамк считывания P9L, F10L (кодирует протеинкиназу (Goebel S. at 1990), Р13Ь (поверхностный антиген 37К ( Hirt Р. at al;( 198 E3L, E6R, E9L (II0K субъединицу ДЕК полимеразы (Earl Р. at е 1986), D4R, D121 ( и-РНК кэпирующий белок (Nilea Е. at al. 1989)(см^ табл. I и рис. 5, б). Показано, что 4 из.анализируе областей генома (Е1Х, E5R» E5R + ЕОЕРВ, E7R ) являются несут венными, т.е. могут быть использованы для встраивания и экспр сии чужеродной генетической информации. .

Использование полученных рекомбинантных вирусов, содержа в несущественной области легко детектируемый маркерный ген, л зволяет значительно упростить процесс встраивания неселектирз мого чужеродного гена в геном ВОВ. Это осуществляется путем г мощения маркерного гена полученных рекомбинантов на неселектя емый ген и последующего отбора интересующих рекомбинантов по

Табл. I. Результаты анализа ряда открытых рамок считывания генома ВОВ

,о. по- :Существен-: Характеристика о.р.с. по'данным лите-вдепная :ность облз* ратуры

дом ( по :сти для ;

6- а*о.1размножен.: )) : вируса в :

_* КЭ3^ :_'

, но Roet range function

но Высокая гомология о.р.о. P13L {повзрх-ност. AT 3.7К) НО Ркбонуклеотидродуктаза

в но но

со На С-крнцо гидрофобн. обл.'

L . со Протеийкиназа

L со Новархйост. AT, 37К

но

со -Г

но -i

♦EORFB но со но -

со jDIIK полимераза (ИСК)

со

но Гомолог карбоангидразы НО, трансмембр. белок. Белок связыв. с поверхностью клетки

Ь со и-РНК кэшгрующйй белок

а но Гемагглютинян НО Гидрофобный С-конец

СО и НО - области существенные и несущественные соответственно.

энию р-гал фенотипа. При этом генно-инженерная работа может» ь проведена о помощью уга готовых рекомбинантных плаздад, ис-ьзованннх для интеграции зонда в вирусный геном.

а

ш I етглг^т

ш

Л—гА

fjiW Ш AfL ASSR

5

/' с I fi I 9 Д

vn

т лвс&г шел -¿Ж

Рис. 5. а - несущественные области (обведены на известные ранее);

6 - существенные области генома ВОВ для разшоае-ния вируса в культуре клеток куриных эмбрионов.

Кроме того, получение вирусов, содержащих встройку чужерод ной генетической информации в определенной области генома, откр вавт возможность изучения функциональной роли конкретных вирусн генов. В ходе работы были изучены некоторые биологические свойс ва рекомбинантяых вирусов, содержащих зонд в открытых рамках сч тыванвя E7R и D8L . Белок, кодируемый геном E7R в литерату ре.не описан. Известно, что полноразмерный белок D8L. не являв ся необходимым для размножения вируса ia vitro . Было показано что сдвиг рамки считывания нуклоотидов, кодирующих 56 С-концеви аминокислот этого белка не влияет на репликацию вируса в. культу ре клеток ( Hileo Е. at al., 1988).

Наш было установлено, что инсерционная инактивация этих i нов ( в D8I. на уровне 77 аминокислоты) по-разному влияет на i мэнение биологических свойств различных штаммов ВОВ (табл. П). Так инактивация гена D8L у БОБ штамма ш практически не вл! яла ш на титр вируса в культуре клеток, ни на размер бляшек, i на патогенность вируса при внутримозговом заражении мышей (таб; П, 3). 'У штамма ВОВ ЛЙВП инактивация того же гена мало влияя;

Табл. П. Некоторые биологические свойства рекомбинантных вирусов, содержащих зовд в открытых рамках считывания е7н ( 2 ) и шх. ( 3 ) .

£с//>ус Гс/лу* ¿орусО' /Ъз/ъе^ ¿¿ггжел-

ЛС/в/7

/0 •

/г*'* ¿04

гж

»ям •

■ 0*'*

»эмнояение вируса в культуре клеток, но снижала патогенность ;а при внутршозговом заражении машай шнвдум в 1000 раз. Сходный результат был получен при инактивации гена В7Н . г штамма та , так и у штамма ЛЙШ инсерционная инактивация е7й никак не влияла на способность вируса размножаться в гуре ткани. Штамм ВОВ та не снизил иейропатогенности при зимозговом заражении мышей, в то время как у штамма ЛИШ она дась, как и в случае инактивации гена ШЬ , более чем в раз (табл. П, 2).

Дальнейшие исследования показали, что цри инактивации как

мь , так и гена е7н у штамма т , вирус сохраняет спо-зсть размножаться в мозгу зараженных мышей почти до того же ш, что и исходный "дикий" тип. Инактивация этих та генов змш ЖШ снижает репродуктивную активность вируса в 100-раз по сравнении с исходным вирусом.

Полученный результат существенен по ряду причин. ХГредставля-гататольный научный интерес выясните за счет каких факторов

(генов) штамм Y/R сохраняет неизменной вейровирулентность при 'инактивации генов E7R и D8L . В то же время резкое снижение нейровирулентности у закци иного штамма ЛИШ при инактивации те ке генов дает возможность дополнительной аттенуации этого штамм без существенного изменения его культуральных свойств. Таким об разом, вирусы V тшщл и v JMHID BamZjs26( содержащие, зовд в открытых рамках считывания 127Л и D81 соответственно, могут быть основой" при получении дополнительно аттенуированных вариантов ЕОВ, пригодных для вакцинации и создания новых живых генно-инженерных вакцин.

ВЫВОДЫ

1. Получена библиотека Hind их и Sal I фрагментов ген ' uä. вируса вакцины штамма ЛИШ, в которой представлено 85$ гено

ма; сравнительный рестрикционный анализ фрагментов центральной ■ ■ ста гааа вируса осповакцины 3-х штаммов ( Hind Ш-с и -Е штамм ЛИШ и соответствующих им Hind ill-D и -Е фрагментов штаммов и Copenhagen) показал высокую их консервативность.

2. Получено 5 вариантов зондов, пригодных для картирования несущественных областей в геноме вируса осповакцины, которые отличаются типом используемого промотора, контролирующего экспрессию р-галактоэидаэы, наличием гена бактериальной устойчивости : канамицину и фланкирующими конструкцию полилинкерными последовательностями. Эти конструкции позволяют осуществлять широкий cnei экспериментов по созданию рекомбинантйых вирусов осповакцины, экспреосирующих чужеродную генетическую информацию.

3. Исследовано 12 неизученных областей центральной части г» нома вируса осповакцины штамма ЛИШ. Обнаружено, что 4 из них яз ляются несущественными для размножения вируса в культуре клеток куриных эмбрионов ( EIL, E5R, E5R + EORPB, E7R ), т.е. могут бы'

' использованы для встраивания и экспрессии чужеродной генетической информации.

"4. Сконструированы векторные плазмиды для встраивания чужеродной генетической информации в 9 несущественных областей гено-

вируса осповакцины ( 'К1Ь» К4Ь, P4L, E1L, E5R, E5R E0RFB, г, D8L, A56R ).с их помощью получены рекомбинантные штаммы ви-S0B, содержащих зонд в соответствующих областях генома вируса ювакцпны.

5. Установлено, что инактивация "несущественных" генов E7R кзь по-разному влияет на биологические свойства различных штам-> вируса осповакцины. Так штамм осповакцины с инактивиро-[ными генами E7R или саь не снижал нейропатогенности для мы-i, в то время как инактивация тех же генов у-штамма ЛИШ снижа-его нойропатогенность для мкпей в 1000 раз.

Показано, что области центральной части генома E7r и d8l "ут бить использованы д;ш получения дополнительно аттенуирован-: вирусов осповакцины штамма ;ЛИВП. ?

1

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТИЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лопарев В.Н., Бездетнова О.Н., Черное З.И. Картирование ущэствениых областей в генома вируса осповакцины. - Молеку-пая генетика, микробиология и вирусология. - IS88. - № 12. -33-38.

2. Chernoa V.I., Bezdetnova О.Н., Ьорагэу V.H. The use of -galactooidaoe gene to study the proaotors end to detect the essential regions in vaccinia viruo genoae. - Inx Abstracts of • iere of the eimposium on prevention and treatment of viral infec-ne. Behym castle, Chechoslovakia* - 1333. - P. 7.

3. Ivanovo O.H., Araolanov R.R., boparev V.N. Use of marker terial p-galactoaidaee gene for the conotruction of vaccinia uabased eucaryotic vectors expressing aaveral heterologous as.- In; Abstracts of papers of let Iberoaaerican congress on technology, Havana, Cuba. - 1939. - P. SO6-021.

4. Araelanov R.R., Ivanova 0.11,, boparev V.H. The cloning and

dy of poxvirus promoters useful for efficient expression of . erologoue genee in eucaryotic cells with the help of vaccinia us. - Ins Abstracts of papers of 1st Iberoaaerican congress biotechnology, Havana, Cuba. - 1989. - P. 206-324.

• 5. Лопарев В.Н., Бездетнова О.Н., Вовк Т.С., Митина И.В., Челяпов В.Н., Черное В.И. Использование гена р -галактозидааы для изучения структурно-функциональной организации генош вирус; осповакцины. - В кн.: Республиканский межведомственный сборник "Вирусы и вируоше заболевания", вып. 18. - Киев: Здоровье, 1991 С. 41-43.

6. Иванова О.Н.,-Лопарев В.Н., Создание и использование аоз дов для поиска несущественных областей в геноме вируса осповакц ш. - В кн.: Молекулярная биология и медицина. Тезисы докладов Всесоюзного семинара. - Ленинград, 1990. - С, 70.

7. Лопарев В.Н., Митина Й.В., Арасланов P.P., Иванова О.Н. Челяпов В.Н., Лотте В.Д., Черное В.И. Получение рекомбинантного штамма вируса, ооповакцины, содержащего пре $ 2-область поверхно ного антигена вируса гепатита Б в составе вириона. - ДАН СССР. • 1989. - Т. 306. - JJ 5. - С. 1250-1252.'

Автор приносит искреннюю благодарность сотрудникам лаборат рии генетики ДНК-содержащих вирусов Научно-исследовательского и ститута вирусных препаратов АМН СССР за постоянную поддержку пр проведении работ.