Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культуры клеток трансгенных животных и тестирование физиологически активных веществ (соматотропин, интерферон) иммуноферментным методом

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Культуры клеток трансгенных животных и тестирование физиологически активных веществ (соматотропин, интерферон) иммуноферментным методом"

ГП

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я.Р.КОВАЛЕНКО

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

На правах рукописи

МУСИШКО МАРИН ИВАНОВНА

КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ТЕСТИРОВАНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕ2ЦЕСТВ (СОМАТОТРОПИН, ИНТЕРФЕРОН) ИШНОФЕРМЕНШШ .МЕТОДОЙ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степе;-!;! кандидата биологических наук

Москва - 19° '

Работа выполнена в отделе клеточной биотехнологии и технологии питательных сред Всесоюзного научно-исследовательского института экспериментальной-ветеринарии имени Л.Р.Коваленко.

Научный руководитель - заслуженный деятель науки РСФСР, дситор биологических наук, профессор Л.П.Дьяконов

Официальные оппоненты:

1. Д'сктор медицинских наук,профессор А.С.НобохатскиЙ

2. Кандидат биологических наук Н.Л.Соколова

Ведущее учреждение - Московская ветеринарная академия

13 "часов на заседании спец

К 020.28.01 ко защите диссертаций на соискекие ученой степени кандидата наук при Всесоюзном научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко по адресу: 105472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

О диссертацией можно ознакомиться и научной библиотеке ВИЭВ.

имени К.И.Скрябина

Защита диссертации состоится

и

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Ф.Г.Терешков

и

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБО'П!

АктИ2^ьмость_темьт. П последние годы интенсивно разрабатываются методы направленного изменения генетических свойств'бактерий и клеток животных с целью получения антигенов и физиологически активных веществ методами биотехнологии. В частности,, таким образов были получены бактериальные клетки и клетки животных, продуцирующие интерфероны, интерлейкины, антигены вирусов и бактерий, а также трансгенные животные (мыши, кролики, овцы, свиньи и др.) - продуценты интерферонов., интерлейкинов, соматотропинов и других физиологически активных веществ (Reiland-3., Ordell П., 1978; Brinater R.L, , 1982; Brinater R.L., ChenH.Y., 1985; Uichalska Л.IS., 1968; Waighart U., Hoover J., 1988; Дыбан A.II. , Городецкий С.И., 1987; Ениколопов Г.Н., 1987; Добровольский В.Н., Ларионов О.А., 1990). Нвработка генно-инженерных интерферонов в количествах, достаточных для широкого практического применения, остается актуальной проблемой. Тс же относится и к соматотропину, который используется для повышения продуктивности животних (З^нст Л.К., 1990).

Однако, несмотря на достигнутые в этой области успехи, промышленное производство генно-инженерных продуктов, в т.ч. интерфе-ронов и соматотропинов связано с целсм рядом трудно расрешимых задач. Среди основных проблем мошо отметить:

1) нестабильность большинства плаэмиц и линий трансформированиях клетс.

2) сложность получения высокоочищенпых препаратов физиологически активных веществ, свободных от примесей бактериальных белкой;

3) неразработанность методов получения культур клеток от тропот:-иых мивотн'.к и их применения длч проиэводотзн кнтигеиор и физиолог« теки активных пче^отв in vi fci'y.

Существует определенные трудности, связанные с тестированием физиологически активных веществ в биологических препаратах и в организме животных. Содержание соматотропина определяют дорогостоящим радиоиммунньм методов (Матвеев В.А. с соавт., 1990). Основным методом определения ак ивностц интерферонов человека является метод титрации их антивирусного действия в диплойдных культурах, в частности M-I9 (Соловьев В.Д., 1980; Кузнецов В.П., 1987) либо применительно к интерферонам животных в культуре клеток СПЭВ (Селиванов A.B., Груздев К.Н., 1985; Назарук М.И.,1988; Наунец 3.11., 1989; Дудар Л.Н., 1990 и др.) относительно вируса везикулярного стоматита (ВВС) и'в меньшей мере с использованием других вирусов и клеточных культур. Вместе с тем широкое применение "естественных" и генно-инженерных интерферонов в практике борьбы с инфекционными заболеваниями требует совершенствовать методы определения их антивирусной активности in vitro применительно к конкретному вирусу в чувствительных культурах клеток сельскохозяйственных животных, но проведение работ с вирусами требует особых условий, которые часто невозможно создать в биологических' лабораториях. В связи с этим представляет научный и практический интерес разработка метода тестирования соматотропина и интерферо-,нов в иммуноферментном анализе с использованием как поли-, так и моноклональных антител (Рыжавская A.C., Изотове Л.С. с соавт., 1990).

Однако, получение гибридом, продуцирующих моноклональные ан- • титела к гормонам, ферментам, интерферонам животных разработано недостаточно, что не позволяло использовать такие моноклональные антитела для отработай метода иммуноферментного анализа с целью тестирования соматотропина и интерферонов (Forsyth I., Holder А., Pell Y., 19S3).

y§2b_ga6oTbt., Получить' культуры клеток от трансгэнных животных и разработать иммуноферментный метод тестирования интерферо-нов и соматотропинов на основе поли- и моноклональных антите'л.

1. Получить культуры клеток от трансгенных животных (кроли-йов, свиней), изучить их культурально-морфологические и биологические свойства.

2. Изучить экспрессию гена поверхностного антигена вируса гепатита В человека и гена бычьего соматотропина в культурах клеток la vitro.

3. Разработать схеки иммунизации мышей интерферонами человека и животных с целью получения гипершмунных сывороток.

4. Получить гибридомы-лродуценты моноклональных антител к генно-инженерному бычьему соматотропину и разработать иммунофер-ментный метод определения бычьего, соматотропина на основе полин моноклональных антител.

5. Отработать метод постановки иммуноферментного анализа для определения активности интерферонов и провести исследования по тестированию активности интерферонов животных в гомологичных и ге-терологичных клеточных системах.

Научная_новизна

I. Впервые получены первичные культуры и субкультур« клеток из органов и тканей трансгенных животных: почки хряка (с встроен ным геном поверхностного антигена вируса гепатита В человека) и легочной ткани кролика (с геном гормона роста быка).

Установлено, что полученные культуры продуцируют in vitro поверхностный антиген вируса гепатита человека и бычий ссматотро--пин.

Л -

Разработан метод гипериммуниэоции мышей генно-инженерным соматотропином быка и получены гибридош, продуцирулцие иояокло-нвльные антитела к бычьему генно-инженерному соматотропину.

3. Разработан метод ИФА на основе поли- и ко оклональных антител для тестирования соматотропина в биологических жидкостях и определения титра антител к соматотропину в крови мышей и в куль-турадьной жидкости гибридом.

•4. Показана возможность определения активности интерферонов животных'по подавлению размножения вируса везикулярного стоматита п гомологичных и гетерологичных культурах клеток животных, а также методом иммунофермент'ного аначиза. Вирусспецифическая активность свиного интерферона может быть определена по отношению к парвовирусу свиней в культуре С-ПС.

Практическая_значимость_работы

1. Полученные культуры клеток от трансгенных животных, продуцирующих поверхностный антиген вируса гепатита В человека и бычий соматотропьд, рекомендованы ,гля использования в биотехнологии.

2. Гибридсмы, продуцирующие моноклональные антитела к бычьему соматотропину депонированы во Всесоюзной коллекции клеточных культур ВСКК (Институт цитологии АН СССР, г.Ленинград). Оформляется заявка на патент. &

3. Разработанный иммунсферментный метод на основе поли- и моноклональных антител рекомендуется для определения соматотропина в биологических жидкостях. Предложен метод иммуноферментного анализа для тестирования активности интерферонов животных 11 человека.

4. Гомологичные и гетерологичные культуры клеток животных пригодны для тестирования антивирусной активности интерферонов.

- & -

Предложена модельная система для определения действия интерферона -на парвовирус свиней.

Апробауия_работы

Материалы диссертации изложены и обсуждены на Ш Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека", Пущино, 1990 г., на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", Пущино, 1990 г., на конференциях молодых ученых ВИЭВ (1990, 1991),-на Ученом совете ВИЭВ (1991), на межлабораторном совещании ВИЭВ (1991).

Публикации. Материалы диссертации опубликоьины в 4 работах.

Структура_и_объем_работы. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводи и практические предложения, список литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 7 таблицами, 4 графиками и I. рисунками. Список литературы содержит 176 источников.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в период с 1988 по 1991 гг. ч отделе клеточной биотехнологии и технологии питательных сред ВИЗВ, часть исследований проведена в Институте гормональных препаратов и Институте иммунологии (г.Москва).

В работе использовали перевиваете линии клеток сельскохозяйственных животных ПТ-80, Г'Р, ЛЭК, С-СТ, СПЭВ, С-ПС, полученные из криобанка Коллекции перевиваемых клеточных линий сольскехознй-ственных и промысловых животных (ВСШС СХШ ВАСХНИЛ); мышиная м^е-ломная линия клеток X63.Ag8.653.

- б -

В опытах по получению иервично-трипсинизированных культур клеток использовали органы трансгенных животных (хряк М9, кролик №60, подсвинки -Ш8,19,20,21)',полученных в "отделе биотехнологии ЕШа.'

Дезагрегация ткани проводили 0,1 - 0,25%'раствором трипсина (фирм "Дифко","$ерак").Культивирование к субкультивирование клеток проводили с использованием гидролиэатных питательный сред - ' 0,Ъ% гИдролизата лактальбумина (ГЛА) на растворе Хечкса, 0,3% ферментативного гидролизата кшечНых бглков (5П.5-С) и синтетических сред - ИГЛА,ИГЛА - КЕМ,199,ИГО - 1640. ("Сигма"),'сыворотки крови телят,эмбриональной бычьей сыворотки (фирм"Сигма","Серва").Для сня- : ^ия.клеток при. пересеве применяли 0,2% раствор ЭДТА (версен).

Цитологические исследования,криогенизвцию проводили согласно методикам,описанных Дьяконовым Л.П. с соавт.(1980,1986,1958).

Цитологические препараты фиксировали раствором Буэна,метиловом' спиртом или жидкостью Карнуа.Окрашивание препаратов проводили Гематоксилин-эозином или азур-оезином по Романовскому-Гимзв.

Крис кос ерлацгсо клегск проводили в ср(?ди,содержащей 90« эмбрионально;'! бртьеП сыворотки и 1075 диметилсулытсксида (ДМСС).

Хромосомные препараты получали по методу Мурхеда ¡> саевтсра-:/и (1960). ' - -

, Для определения присутствия встроенных генов в культурах клеток использовали метод ДНК - ДНК гибридизации по Саузерну.

, Горуонпгодуиируо'цую активность культур клеток трансгенного' ■кролика определяли иетодем радиоиммунного анализа на базе НИЙгХиЯ! . логмеотно с профессором '.'атзеевнм В.А. Продукция культурами клеток из органов транг.геннего хряка поверхностного антигена вируса гепатите В •телевеха ( НВУАл) пределялк им:.*уно'|ерментн!-'м'анализом нз

б.азе лаборатории клеточной'инженерии Института вирусологии (зав. лабораторией доктор биол.наук Кущ А.А.).

Получение_гибридом. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к бычьему генно-инженерному ссматотропину (фирма "Мон-санто", США), получали методом соматической гибридизации по методике Кёллера и Милыптейна (1975) в некоторой модификации. Иммунные лимфоциты мышей сливали с клетками мышиной миеломы X63-.Ag8.653. В качестве сливающего агента использовали 5СЙ раствор полиэтилен-гликоля (М.М. 4000). Все получению гибридные клоны были клонированы методом предельных разведений'на фидерном слог;, в качестве которого служили макрофаги неиммунных мышей Ва1в/с.

Для получения асцитных препаратов мышам линии Ва1в/с внутри-бршинно инокулировали взвесь гибридных клеток в концентрации 1,0-Г,5х10^/мл. Предварительно за 7-21 суток мышам вводили пристал - 0,5 мл.

Активность и специфичность асцитных и культуральных препаратов моноклональных антител к соматотропину определяли специально отработанным методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа.

Изучение противовирусной активности гамма-интерферонов крупного рогатого скота, свиньи и кролика проводили з стандартной тест-системе против 100 ТЩ^о вируса везикулярного стоматита итамм "Индиана" в культурах клеток сельскохозяйственных животных Ш'-80, ТР, ЛЭК, С-СТ, СПЭВ, Пкр (почка кролика).

Действие гамма-интерферона на ларвовирус сзиней в культуре С-ПС определяли по снижению титра гемагглютининов, Работу проводили на базе лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики болезней свиней ВИЭВ совместно с профессором В.Г.Орлянкишгм.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Культуры клеток из органов и тканей трансгенных ' животных и определение экспрессии, встроенных генов

В процессе работы были получены первичные культуры и субкультуры клеток из органов и тканей трансгенных животных.

Трансгенными .свойствами обладали хряк № 49 с встроенным геном поверхностного антигена вируса гепатита В человека и кролик № 80 с интегрированным геном бычьего соматотропина." ■

Культура клеток почки трансгенного хряка с встроенным геном поверхностного антигена в.ируса гепатита В 'человека представлена : клетками эпителиоподобноготипа. Культивирование эпителиоподобных клеток проводили 6 мес. без пересева с периодической сменой 50% ростовой среды. За последующие б мес. культивирования было проведено 15 пассажей. По скорости роста полученный штамм клеток относится к медленнорастущим.

Морфологически культура клеток однородна, границы клеток четки«, ядра овальные или округлые, содержат 1-3 плотных ядрышка. : Исследование культуры клеток на экспрессию поверхностного антигена вируса гепатита В человека проводили в Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского нммуноферментным методом (д.б.н. Кущ A.A.). Результаты исследований подтвердили трансгенность культуры и экспрессию гена по присутствию в культуральной жидкости поверхностного антигена вируса гепатита В человека.

Культура клеток легкого трансгенного кролика на уровне 5-го

пассата представлена преимущественно клетками эпителиоподсбного

»

типа различной величины, полигональной или округлой формы.

Исследование окрашенных гоматоксилин-эозином клеток культуры яагкбР.о тузнегатото кролика с встроенным гоном бычьего ссиатотро-

- Lí -

пина na первых пассажах культивирования показало, что в цитоплас -мэ .некоторых эпителиоподооиых клеток тлеются включения розового цвета, окруженные светлым орзолом. !3 культуре легкого кролика отмечаются симпласти (2-5-яперные) и отдельные крупные зпителиопо-добные клетки с внутрицитоплазматичееккми включениями.

культура клеток легкого кролика поддерживалась в течение 13 пассажей, на протяжении 60 дней. Пролиферативнал активность клеток была невысокой и срок» формирования монослоя составлял!! от 5 до 10 дней при посевной концентрации 100 тыс./мл.

В процессе культшпроввния Исследование продукции гормона роста клетками легочной ткани трансгенного кролика проводили ра-диоиммуннкм анализом во ВНИНВи'МШ (д.б.и. 1,'ятвееп В.Д.).

Максимальная продумал соматотропина клетками легкого кроли ¡ta с встроенным геном бычьего соматотропина составляла 7 нг/мл ь достигалась на 5-7 пассаге. Затем, происходило сн .тонне синтетичо--ской активности клеток, что, очевидно, связано с состоянием клеточной культ,урн, поскольку н дальнейшем яр исходила частзчлвя дс генерация клетог:.

Кроне того, провелм-.и опыты по получению культур клеток на органов и гкячзЯ жквотнкх, трансформированиях гена«»» рилиэинг гормона и аитисшсловой RÍU к агеновирусу человека однако результаты определения &кспррссь . геаов т vivo и »itro о'ыги отркц»-

ТРТЬНЫМИ i).

2.2.2. Получение про\уцирупч!СС ноноюмхюлыи:*

антитела ч ür-'bc-.'v еоматотпопгну

С цель'з лолучгат wvh.mx лип)зо»<тч», н<гоо'>содимну для гип|» i дизйшш, htctoiÍ пинии Нг socom ТЛ-ÜD г к^у^'зг-спн.";; ге-гг4

"(енерньгм coi ..l'lOTpOniiMO" JÜ.I'KVV' ' :rl ЙЧР'-.Ч "Чгн 'ЯМ то" ' O'l"

Таблица I. Характеристика культур клеток, полученных из органов и тканей тпансгенных животных

Животное

лсяк

! Возраст яизстног.о (мое.)

Встроенный ген

Орган, из которого получена культура клеток

18 поверхностного антигена вируса гепатита В человека

почка

Тип культуры¡Экспрессия встроенных

- Г____генов

! в~культураяьРв~клётках !ной жидкости! ■

диплоидная

Свинья

Кюолик Кролик

-новорожденный

рилизинг гормона

бычьего сомато-тропина

антисмысловой РНК к аденовирусу человека

почка

сердце

тестихулы

селезенка

лимфоузлы

гипофиз

легкое

почка кожа

селезенка сердце

субкультура

диплоидная

субкультура

0

1

4

8

Иммунизацию 'мышей проводили по трем схемам.

. Первая схема - антиген вводили в подушечки задних лапок. Антиген в дозе 100 мкг смешивали с равным объемом полного адъютанта Фрейнда (ПАФ) (0,1 мл) и вводили по 0,1 мл в каждую лапду. Через 14 дней мышей убивали с целью получения иммунных лимфоцитов.

Вторая схема - антиген в дозе 100 мкг в смеси с равным объемом ПАФ вводили внутрибршинно по 0,1 мл три раза с интервалом в две недели. Еустерную дозу антигена без ПАФ в объеме 0,1 мл в дозе 10 мкг вводили внутривенно за три дня до взятия материала.

Третья схема-- антиген вводили внутрибршинно в дозе 100 мкг с равным объемом ПАФ по 0,1 мл четыре раза е интервалом в две ие-дели. Спустя 30 дней мышам дополнительно, вводили на I, 7, 10, 12,^ 13-й Дни по 100 мкг антигена внутрибргошинно в объеме 0,1 мл. Еустерную дозу по 10 мкг вводили внутривенно в объеме 0,1 мл за три дня до получения иммунных лимфоцитов и спленоцитов.

Эффективность иммунизация мышей генно-инженерным соматотро-пином определяли по титру антител в крови подопытных мышей в непрямом твердофазном иммуноферментном анализе. Для получения иммунных лимфоцитов брали лимфатические узлы и селезенку от мышей с наибольшим титром антител к бычьему генно-инженерному соматотропину.

Титр антител достигал независимо от использования схемы иммунизации до 1:10000. С учетом этого наиболее удобной для практического пользования является первая (короткая) схема введения антигена, поскольку требует минимального расхода соматотропина и времени от начала до окончания иммунизации (14 дней).

Поставлено 5 опытов по получению гибридом. Слияние иммунные лимфоцитов, полученных из паховых и подколенных лимфоузлов милей, з клетками мышиной миеломн Х63-Ае8.653 производили по описанной

выше методике. В результате гибридизации получено 685 первичных гибридных культур, из которых моноклональные антитела к бычьему еоматотропину продуцировали лишь 56 клонов. В массовую культуру выделено 5 клопов (CTK-I, С'Ш-8, СТК-20, CTK-2I, СТК-22), обладавших наибольшей продукцией моноклональных антител класса иммуноглобулинов М и хорошими ростовыми свойствами. Все клоны были 3 раза реклонированы методом предельных разведений на фидерном слое мышиных макрофагов. На все:" стадиях получения стабильных клонов'гибридом'образцы культур криоконсервировали и закладывали в криобанк.

Результаты положительных -экспериментов обобщены в табл.2, '

'' Таблица 2

Характеристика клонов гибридом, продуцирующих MICA к еоматотропину и определение класса иммуноглобулинов

Название !■ Антиген (Число рекло+% положите-!Титр МКА Шзоткп

гибридомы! (нирований !льных клонов!в культу-!иммуно-

! ! ! после рекло4ральной !глоб.у-

! ! !нирования !жидкости !линов

CTK-I бычий сома-тотропин 3 1(;0 I:(ООО IgM

СТК-8 бычий сома-тотропин ó j 00 I:1000 Igli

С'ГК-20 бычий сома-тотропин 3 ico 1:1000 IgM

П'|'К-?1 бычий сома-тотронин 3 1 со I:1000 IgU

С'Ж-22 С'ьпии ссма-готропин ICO 1:100(1 Igli

Три охарактеризованных клона депонированы во Всесоюзной коллекции клеточных культур ВСКК (Институт цитологии'ЛИ СССР, г.Лв-[¡чнгряп).

Для получения асцитных препаратов моноклональных антител ги-

п

бриднне клетки в концентрации 1-1,5x10 кло,ток на мьппь в объеме I м прививали внутрибрюшинно мшам линии Baln/c, предварительно обработанных пристаном.

Результаты опытов по получению асцитных препаратов моноклональных антител приведены в табл.3.

. Таблица 3

Получение асцитных препаратов и титр моноклональных антител к еоматотропину

Название!К-во мышей, Юрок образования асцитаЮбъем ¡Максимальный

клона ¡взятых для !____сутки _ _ _!асцита!титр антител

'прививки ¡первичное I ! мл ! в И4А

! F ¡введение ! пеР®в™ка \ !

СТК-20 Ю 14-18 9-10 7-10 5 X 10°

CTK-2I 10 15-18 10-II 5-10 I X Ю5

СТК-22 10 14-19 10-12 6-9 I >' Ю5 '

Асцитные опухоли образовывались у мытой в'течение 14-18 суток после инъекции клеток, причем образование опухолей отмечалось у 100% привитых животных. Количество асцитнои жидкости составляло в среднем 7,9 мл .от одной мыши. Все клоны обладали способностью перевиваться от мши к мыши, при этом з первом не пассаже формирование асцитных опухолей ускорялось до 10 сут. Максимальный титр моноклональных рлтитэл в асцитной жидкости достигал 1:500 тыс.

'¿..2,3. Определение специфичности моноклональных антител методом непрямого ТЕердофазного имцуноферментного анализа

(.'чутфтюеть впэииодействия моноклональных антител серий С'П{ . была и^уиеня имчуноферь.ентньм методом по отношение к геннг -инже-

нерным соматотропинам быка, свиньи и человека, пролактину человека, .человеческому гонадотропину, фолликулостимулирущему гормону, тироксину, а также к инсулину крупного рогатого скота и человека 1рис.1). , . 1

- ОН 26

2 1.6 1

О,Б О

с 1 1

15h

ш II ............. шт ШйТа Шшь

2.6 2 1.6 1

0,6

10mke

Imke qimlfl qo/mKe

о

АГ.

Рис Л. Титрование дозы антигена и определение специфичности моноклональных антител к соматотропину методом ИФА.

Разведение культуральной жидкости с моноклональными антителами 1:100.

ЕЭ - бычий соматотропин; Ш- свиной соматотропин;

QXD- человеческий соматотропин; иа - тироксин человека; еш - рилизинг гормон человека; гонадо-тропин человека; ga - фолликулостимулирукций гормон человека; gg - бычий сывороточный альбумин.

В качестве отрицательного контроля для подтверждения отсутствия связывания полученных ыоноклоналгныХ антител с белками E.coli, которые могли присутствовать в антигенном материале, были использованы препараты генно-инженерного интерферона человека, полученные в аналогичной системе, а также чистые препараты инак-

тивированной бактериальной культуры В.coli. В качестве дополнительного контроля использовали бычий сывороточный альбумин.

Для избежания неспецифических реакций культуральную жидкость с моноклональными антителами использовали в разведении 1:100, а препараты исследуемых антигенов сорбировали в концентрации от . 1000 мкг до 0,001 мкг на лунку.

'В результате проведенных исследований была показана.специфичность моноклональных антител к бычьему соматотропину, однако с со-матотропинами свиньи и человека получены перекрестные реакции, что может быть обусловлено наличием общих антигенных детерминант ( Fhlppa R., Baker D., 1989>;с другими исследованны?.™ гормонами и контрольными антигенами реакция была отрицательной (на уровне фоновой).

2.2.4. Определение противовирусной активности илтерферонов животных в гетерологичнгсх и гомологичных системах

Проведены исследования по изучению противовирусной активности гамма интерферонов крупного рогатого скота, свиньи и кролика в культурах клеток ПТ-80, TP, ЛЭК, С-СТ (сосуды сердца теленка), СПЭВ, Пкр (почка кролика) против 100 ЩД50 вируса везикулярного, ^стоматита. Интерфероны различались по проявлению противовирусной активности в гетерологичных культурах клеток. Титр интерферонов в гомологичных культурах значительно превышали их активность в гетерологичных культурах. В то же время свиной гамма-интерферон , был одинаково активен в гетерологичных культурах клеток ЛЭК, С-СТ, ПТ-80, TP и гомологичной культуре СПЭВ, но в культуре клеток почки кролика его активность была на порядок ниже (табл.4).

Проведены также исследования по' изучению антивирусной активности свиного гамма-интерферона с применением реакции гёмагглюти-

Таблица 4

1 Определение противовирусной активности интерферонов животных в гомологичных и гетерологичных клеточных системах по отношению к вирусу везикулярного стоматита ■

Интерферон ! Титр противовирусной активности интерферонов

!___2_куль_7;грах_клеток_|е^ш1_)_____________________

!~ПТ-80 ! TP ~"Т С-СР Г'Пкр" !~СПЭВ_ Г ЛЭК

Крупного рога- 512 512 1024 64-12.8 128-256 1024 того скота

Свиной 512-1024 512 512-1024 64-128 1024 1024

Кроличий 64-128 64-128 64 1024 64-128 128

нации по отношению к параовирусу свиней на модели сублинии клеток С-ПС, обладающей высокой чувствительностью к вирусу.

Интерферсш получали в отделе вирусологии Украинского филиала ЬГНКИ, активность которых в стандартной тест-системе на клетках СПЭВ против 100 'ЩЦ50 вируса везикулярного стоматита штамма "Индиана" составила 512 ед/мл.

В результате проведенных экспериментов по определение чувствительности парвовируса свиней к антивирусному действии свиного интерферона было показано, что uepej 24 ч после сбработкч клеточной' линии С-ПС интерфероном в разведении 1:125 наблюдалось подавление репродукции парвовируса (табл.5).

Проведеиныз исследования полазали, что титраци:; антивирусной активности интерферонов .по отношения к вирусу везикулярного стоматита возможна в различных культурах клеток сельскохозяйствен»!!-: кивотных, что позволяет использовать эти культурч Апя опре^лмиш пряного деГттвия интерферонов на конкретные вируса.

I Таблица 5

Определение действия гамма-интерферона14на1 парвовирус свиней в культуре С-ПС по снижению титра гемагглютининов

Разведение интерферона

________"_______________

Время_вдльтивирования_(ч)_____________

!

24 ! 48 ! 72 ! 96 •

<2 <2 <2

<2 <2 <2 <2

<? <Г2 <2 <2

1:32 1:64 . 1:128 1:128

1:64 , 1:256 1:4096 1:2048

1:5

1:25

1:125

1:625

'игр парвовируса

контрольной ультуре

Выявленная в наших опытах возможность титрования антивирус-ой активности интерферонов по подавлению титра гемагглютининов арвовируса в чувствительной культуре С-ПС имеет научное и прак-ическое значение.

2.2.5. Получение гипериммунных поликлональных сывороток для иммуноферментного метода тестирования интерферонов

Несмотря на то, что метод прямого антивирусного действия по-воляет определить активность интерферонов, проведение таких ис-ледований требует специальных условий. Поэтому представляет инте-. ее разработка "неинфекционного" метода тестирования интерферонов. Антисыворотки к интерферонам крупного рогатого скота (КРС),.

виньи и человека получали путем гипериммунизации мышей линии • -

в"

а1в/с- В ходе выполнения работы были испытаны две схемы имчуни- . ации.

По первой схеме мышей иммунизировали соответствующими антигенами в дозе 100 мкг с равным объемом полного адъвзванта Фрейнда по 0,1 мл внутрибршинно четыре раза с интервалом в две недели. Бустерную дозу антигена вводили внутривенно в дозе 10,0 мкг без адъюванта в объеме 0,1 мл за три дня до взятия крови.

По'второй схеме антигены вводили внутрибршинно в дозе 100 мкг с равным объемом полного адъиванта Фрейнда на I, 7, 10, 12, 13 дни и через сутки брали кровь для получения сыворотки.

С использованием гипериммунных сывороток к интерферонам КРС, свиньи и человека были подобраны оптимальные условия иммунофермен-тного анализа для определения специфичности и активности полученных поликлональных антител.

При исспедовании гипериммунных сывороток к интерферонам КРС, свиньи и человека иммуноферментным методом было показано, что наиболее эффективной схемой иммунизации с целью получения гиперим-мунн-пс сывороток является 4-кратная внутрибрюшинная иммунизация с интервалом в две недели и с последующим внутривенным введением бустерной дозы антигена (табл.6).

Таблица 6

Титр антител к интерферонам в гипериммунных сыворотках, определенный в ИФА

Ант::ген ! Схема ! Титр антител в г ип ер иммунн ых_ с ыв ср о т к ах _ ! иммтаи-! 7 " 7

' КГС ! свиньи I.

человека

Интерферон I 1:6400 -1:12800 1:400 1:400

КРС 2 1:2200-1:6400 1:200-1;400_ 1:200-1:400

Интерферон I Г:400 1:12800.. 1:800

свиньи 2 1:400 1:6*00 1:400-1:800

Интерферон I 1:400 • 1:400 1:6400-1:12800

человека 2 1:400 Р.400 1:3200-1:6400

Как видно из табл.б, титр антител в гипериммунных сыворотках «шей, иммунизированных интерфероном KFC, составил 6400-12800, штерфероном свиньи - 12800 и человеческим интерфероном 6400-'2800. Во всех случаях отмечены перекрестные взаимодействия между '.кворотками крови и интерферонами KPG, свиньи и.человека, однако, мсокий титр в гомологичных системах позволяет дифференцировать :ак интерферона разных видов животных, так и определять диагности-:еский титр.

'ВЫВОДЫ

1. Впервые установлена возможность получения первичных куяь-ур и субкультур клеток из ткани легкого трансгенного кролика со строенным геном бычьего соматотропина и ткани Лочки свиньи с ветре-ннчм геном поверхностного антигена вируса гепатита В человека

нвз Ag). Изучены культурально-морфологические свойстга течетичес- ' л трансформированных культур. ;

2. Генетически трансформированная культура клеток из -ткани згкого трансгенного кролика обладала способностью продуцировать 1 vitro соматотропин крупного рогатого скота в концентрации до нг/мл питательной среды. •

3. Бычий генно-инженерный соматотропин (производства, фирмы 1лнсанто", (Ж) в дозе 100 мкг, введенный однократно в подушечки ,цних лапок мышей Ва1в/с, пригоден для иммунизации с'целью полу-ния иммунных лимфоцитов из периферических лимфоузлов для гибри-эации. : |. •' ,'

4. Отработан метод и ммун офермснтног о анализа для•определения тра антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных генно-: женерным соматотропином и культуральной жидкости гибридом и зтирования соматотропинов животных и человека в биологических цкостях. ;

5. Впервые получены мышиные гибридомы, продуцирующие монокло-нальные антитела к бычьему соматотропину специфично;взаимодействующие с антигенной детерминантой, общей для бычьего, свиного и человеческого соматотропинов, а также асцитные препараты монокло-' нальных антител с максимальным титром в иммуноферментном анализе

41:500 тыс.

6. Предложены схемы иммунизации мышей гамма-интерферонами крупного рогатого скота, свиньи и альфа-интерфероном человека с целью получения гипершмунных поликлональных сывороток и иммуно-ферментныЯ метод для тестирования интерферонов животных и человекг

7. Гомологичные и гетерологичныз культуры клеток крупного рогатого скота и свиньи (ПТ-80, TP, С-СТ, ЛЭК, СПЭВ) пригодны для определения активности гамма-интерферонов животных по отношении к вирусу везикулярного стоматита свиней.

8. Разработана модельная система прямого определения активности свиного гаша-интерферона против параовируса свиней в культуре С-ПС по снижению титра гемагглютининов, определяемого в реакции гемагглютинации. .

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Гибридомы - продуценты моноклональных антител к соматс-тропину рекомендованы для использования в биотехнологии.

2. Метод иммуноферментного анализа с использованием моно- и поликлональных сывороток для определения соматотропинов в биологических жидкостях и антител к ним в крови иммунизированных.мышей,

а также выявления in vitro продукции момоклональных антител гибрид омами.

3. Предложены схемы иммунизации мышей генно-инженерным сома-тотропином и интерфероками животных.

4. Гомологичные и гетерологичные клеточнке культуры сельскохозяйственных животных рекомендованы для определения активности интерферонов по отношению к вирусу везикулярного стоматита свиней. Предложен метод прямого определения акгшлости гамма-ингер-ферона свиньи против парвовируса в культуре C-I1C с последующим определеннее титра гемагглютининов в .реакции непрямой гемагглюти-наиии. '

' 5. Разработаны "Методические рекомендации по получению гибридом, продуцирующих моноклональнне антитела к бычьему соматотропи-ну". Утверждены дирдктором'ВЛЭВ академиком ВАСХШЛ Г.й.Коромысло-

BUM. ,

СПИСОК ОПУБЛИКОВЛННИХ РАБОТ

1. Мусиенко М.И. Тестирование антивирусной активности свиного

« *

^-спленоферона в реакции гемагглгатинации. 1'езиси докладов. В :КН.: Ы Всесоюзное совещание: Культивирование клеток животных ' и человека. М., 1990; С. 23.

2. Мусиенко М.И.,. Дьяконов Д.П., Лобунцова Д.В. Культурально-мор-фологическая характеристика культуры почки трансгенного хрлка (ген HBS). Тезисы докладов. Всесоюзная конференция: Новые направления в биотехнологии, Пущино, 1990, С.ЗО.

3. Эрнст Л.К., Муменко М.И. и др. Продукция сома.отропина б:ла культурами клеток легкого трансгенного кролика. Тезисы дскла-

' дов. Всесоюзная конференция: Новые направлетя биотехнологии,. Рущино, 1990, С.31-32. ' . '

4. Мусиенко М.И., Макарев^ч A.B., Эрнст Л.К. и .др. Культура клеток из ткани легкого трансгенного кролика - продуцент гормона роста крупного рогатого скота. Доклады ЙАСХНИЛ. М., 1991, С.28-32. ■