Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Коррекция функциональных и органических дефектов при возрастной инволюции тимуса, экспериментальном сахарном диабете, энкопрезе путем пересадки аллогенных тканей

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Коррекция функциональных и органических дефектов при возрастной инволюции тимуса, экспериментальном сахарном диабете, энкопрезе путем пересадки аллогенных тканей"

005003084

(/

Куликов Дмитрий Александрович

КОРРЕКЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ И ОРГАНИЧЕСКИХ ДЕФЕКТОВ ПРИ ВОЗРАСТНОЙ ИНВОЛЮЦИИ ТИМУСА, ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ, ЭНКОПРЕЗЕ ПУТЕМ ПЕРЕСАДКИ АЛЛОГЕННЫХ ТКАНЕЙ

03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 1 ДЕК 2011

Москва-2011

005003084

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Евгений Ильич Маевский

Официальные оппоненты:

■ доктор медицинских наук, профессор Бояринцев Валерий Владимирович

доктор медицинских наук Чекмарев Виктор Максимович

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии Наук Институт Биофизики Клетки РАН, г. Пущино Московской области

диссертационного совета Д 002.111.01 в Учреждении Российской Академии Наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН по адресу 123007, Москва, Хорошевское шоссе, д. 76 А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ-ИМБП РАН.

часов на заседании

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

М.А. Ленинских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Поддержание постоянства внутренней среды организма на всех стадиях развития обеспечивается за счет слаженного функционирования различных его систем. Современная медицина обладает значительным арсеналом фармакологических средств, которые при необходимости могут быть назначены для сохранения здоровья человека. В то же время активация процессов физиологической и репаративной регенерации может быть достигнута путем применения трансплантологических методик.

Пересадка различных тканей в медицинских целях имеет длительную историю: в 1884 году Вильяме подкожно имплантировал больному сахарным диабетом фрагменты ткани поджелудочной железы, в 1906 году впервые была выполнена успешная пересадка роговицы, в 1907 первое успешное переливание АВО-совместимой крови и т.д. (Репин, 2007).

Уже на заре физиологических исследований в работах Van Dooremaal (1873), Thomson (1890), Saltykov (1905), а позже Dunn (1917), May (1930), May (1954) было отмечено, что трансплантат, помещенный в некоторые области организма (центральная нервная система, включая переднюю камеру глаза и др.), способен к длительному выживанию (Росин, 1977; Виноградова, 1984). Много позже эти области назовут иммунопривилегированными.

В экспериментальной физиологии наиболее часто используются такие иммунопривилегированные зоны, как центральная нервная система и семенник (Дендеберов, Кирпатовский, 1994, 2001; Каитова, 2003; Куликов, 2004; Александрова, 2007, 2009; Анисимов, 2009; Gores et al., 2003; Mimura, 2004; Ermakova, 2006; Anderson, Caldwell, 2007; Lagali et al., 2009; Politis et al., 2010; Cantarelli, Piemonti, 2011; Jahnukainen, Ehmcke et al., 2011).

Большая часть настоящего исследования посвящена разработке и усовершенствованию методов пересадки тканей в тс участки организма (передняя камера глаза, семенник), которые в силу физиологических и анатомических особенностей ограждены от взаимодействия с иммунной системой. Связано это с наличием специфических гисто-гематических барьеров, функционированием Fas/Fas-L - системы, что в норме не позволяет иммунокомпетентным клеткам проявлять свою активность и дает возможность значительно продлить срок функционирования трансплантата без применения иммунодепрессантов (Bellgrau et al., 1995; Griffith et al., 1995; Shin et al., 2002; Qian, 2003; Choi et al., 2004).

Нами также показана возможность ускоренной регенерации тканей без образования рубца при экспериментальном энкопрезе путем пересадки аллогенной ткани костного мозга в участки, не обладающие свойством иммунологической привилегированности (без использования

иммунодепрессантов).

Разработка методов, позволяющих пролонгировать выживание трансплантата без применения, как правило, высокотоксичных иммунодепрессантов,

представляет собой задачу, успешное решение которой будет полезным для практической трансплантологии и клеточной биологии.

В рамках представленной работы изучалась динамика физиологической возрастной инволюции тимуса, разрабатывались трансплантационные способы воздействия на этот процесс. Также разрабатывались методы для исследования возможности восстановления остаточной гормонообразующей функции поджелудочной железы при сахарном диабете, коррекции структурных и функциональных изменений при экспериментальном энкопрезе. Следует отметить, что с возрастом увеличивается частота инфекционных, аутоиммунных, онкологических и др. заболеваний, аналогичная ситуация имеет место в отношении сахарного диабета и энкопреза (Palsson, Turner et al., 2009; IDF, 2009). Актуальность изучения процессов морфо-функционального изменения иммунной системы с течением времени, создания методов профилактики и лечения «возрастных» заболеваний, в том числе, обусловлена интересами медицинского обеспечения авиационных и космических полетов, поскольку в процессе профессиональной деятельности летчики и космонавты испытывают влияние комплекса факторов, которые вызывают изменения физиологических процессов в организме (Газенко и др., 1990) и могут привести к его ускоренному старению.

Работа является продолжением исследований, проводимых в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН уже более 20 лет (Виноградова, 1984; Брагин, 1990; Куликов, 2004).

В ходе выполнения работы поставлены задачи, которые до сих пор не были решены методами пересадки адекватных тканей. В результате проведенных исследований предложены оригинальные модели компенсации возрастной дегенерации тимуса, экспериментального диабета, энкопреза.

Цель работы

Исследование возможности коррекции функциональных и органических отклонений при возрастной инволюции тимуса, экспериментальном сахарном диабете, энкопрезе путем пересадки аллогенных тканей.

Задачи исследования

1. Разработать способы стимуляции остаточных функций иммунной и эндокринной тканей при необратимой возрастной инволюции тимуса, экспериментальном сахарном диабете путем аллотрансплантации адекватных тканей в иммунопривилегированные области организма.

2. Исследовать возможность увеличения средней и максимальной продолжительности жизни крысы путем Трансплантации ткани тимуса в переднюю камеру глаза.

.3., . Исследовать возможность восстановления эндокринной функции поджелудочной железы реципиента, нормализации основных физиологических и биохимических показателей при экспериментальном сахарном диабете путем трансплантации инсулинпродуцирующей ткани в иммунопривилегированные области организма.

4. Разработать метод, моделирующий развитие травматического энкопреза.

5. Изучить функциональное состояние и анатомическую целостность запирательного аппарата прямой кишки после пересадки аллогенных тканей костного мозга при экспериментальном энкопрезе.

Научная новизна работы

1. Разработаны и усовершенствованы методы трансплантации ткани в переднюю камеру глаза (ПКГ) и семенник. Модификации, внесенные в процессе экспериментального использования методов, снижали процент животных, выводимых из эксперимента вследствие выдавливания трансплантата за пределы иммунопривилегированной области, а также сокращали время введения трансплантата, что позволило снизить дозу наркотизирующего воздействия.

2. Впервые показана возможность увеличения средней и максимальной продолжительность жизни крысы путем пересадки аллогенной ткани тимуса в переднюю камеру глаза.

3. Показано, что аллогенная трансплантация тканей костного мозга позволяет восстановить структурную целостность и функциональную полноценность запирательного аппарата прямой кишки после хирургически инициированного экспериментального энкопреза.

Положения, выносимые на защиту

1. Аллогенная пересадка тканк тимуса в переднюю камеру глаза крысы позволяет замедлить темп необратимой возрастной инволюции тимуса, увеличить среднюю и максимальную продолжительность жизни экспериментальных животных.

2. Трансплантация аллоганой ткани (фетальной либо неонаталыюй) поджелудочной железы в иммунопривилегированные области (ПКГ, семенник) при экспериментальном сахарном диабете приводит к нормализации основных физиологических и биохимических показателей на сроках, соизмеримых с естественной продолжительностью жизни крысы, и способствует восстановлению инсулинпродуцирующей функции собственной поджелудочной железы реципиента.

3. Пересадка ткани костного мозга в'область хирургического дефекта при экспериментальном энкопрезе приводит к ускоренному восстановлению целостности запирательного аппарата прямой кишки без образования рубца.

Научно-теоретическое и практическое значение работы

На примере возрастной инволюции тимуса, сахарного диабета, энкопреза показана возможность модуляции функциональных и структурных изменений путем трансплантации аллогеннкх тканей уяу. в иммунопривилегированные области, так и зоны, не обладающие . свойством иммунологической защищенности. Важно отметить, что ни до, ни после операции иммуподспрсссанть' ле использозались.

Исследована динамика возрастной необратимой инволюции тимуса. Эти данные могут служить контрольными при лзучении воздействия различных факторов на возрастные.изменения иммунной системы.

Разработанные модели могут быть использованы при проверке влияния лекарственных препаратов в период проведения их доклинических испытаний.

Отсутствие значительного воздействия • трансплантации неонатальной поджелудочной железы в семенник на фертильность позволяет предположить возможность разработки метода для применения в клинической практике.

Результаты 'экспериментального применения оригинального метода восстановления целостности ткани без образования рубца при энкопрезе дают основания полагать, что после соответствующей модернизации данный подход может быть использован при лечении различных состояний, связанных с дефектом большого массива тканей (ожоги, травмы, косметологические операции и др.).

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на секции «Медико-биологических проблем» ученого совета ИТЭБ РАН, а также более чем на 20 конференциях, симпозиумах, съездах. Некоторые из них: конференция «Боевой стресс: механизмы стресса в экстремальных условиях» (Москва, 2005); I Научно-практическая геронтологическая конференция с международным участием, посвященная памяти Э.С. Пушковой (Санкт-Петербург, 2005); конференция «Война и здоровье: боевой стресс» (Москва, 2006); Всероссийская конференция «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006); XX Съезд физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); Международная научно-практическая конференция «Отдаленные последствия воздействия ионизирующего излучения» (Киев, 2007); научно-практическая конференция «Инновации РАН» (Черноголовка, 2007); Международная конференция «Bioligical motility: achievements and perspectives» (Пущино, 2008); VIII международный симпозиум «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2008); LXX научно-практическая конференция «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины - 2009» (Санкт-Петербург, 2009); 14 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 научных статёй, в т.ч. 6 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных ВАК РФ.

Структура и объеде диссертации

Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания Материалов и методов исследования, глав с результатами, обсуждения результатов, заключения, выводов, списка сокращений и списка литературы. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 27

рисунками. В списке цитируемой литературы 369 источника (130 в отечественных и 239 в зарубежных изданиях). - ;

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили по протоколам, одобренным Комиссией по этике Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Животные

Эксперименты выполняли на крысах Вистар. Ткань тимуса для трансплантации забирали от крыс-самцов препубертатного возраста, массой 110130 г. В качестве реципиентов использовали животных разного возраста (от 1 до 20 мес) и массы (100-450 г.).

Ткань поджелудочной железы получали от 17-18-дневных эмбрионов, новорожденных крыс (возраст 1 сутки). Для операции по пересадке ткани поджелудочной железы в качестве реципиентов отбирали животных-самцов одного возраста, как правило, с начальной массой 200-230 г.

Ткань костного мозга забиралась от животных массой 250-300 г. Реципиенты - крысы массой 200-230 г.

Условия содержания, выполнения операций и послеоперационного ухода соответствовали правилам гуманного обращения с животными.

Трансплантация ткани тимуса в переднюю камеру глаза животных

Ткань тимуса выделяли от крыс-самцов Вистар препубертатного возраста, массой 110-130 г. В чашке Петри со средой Игла ткань тимуса измельчали до размера примерно 1 ммЗ.

Трансплантацию проводили под эфирным наркозом. Крысам-реципиентам на глаз наносили по 1 капле 0,1%-раствора атропина с тем, чтобы максимально раскрылся зрачок и уменьшилась площадь радужной оболочки. Эта манипуляция помогает избежать последующих повреждений богатых капиллярами структур. Через 5 минут на глаз наносили по 1 капле 0,5%-раствора дикаина для большего снижения чувствительности глаза при операции.

Забирали материал из чашки Петри и трансплантировали его в переднюю камеру глаза модернизированной микропипеткой с изменяющимся объемом. На роговице делали разрез длиной 1,5-2 мм на «13 часов» по «воображаемому циферблату» в 1-2 мм от края роговицы. Ранее разрез выполнялся на «17-18» часов по «воображаемому циферблату», что в 25-30% случаев приводило к выдавливанию трансплантата при умывании экспериментальных животных. Вследствие выдавливания трансплантата, которое, к?.к правило, происходило в первые сутки после операции до закрытия раны, животных выводили из эксперимента, либо переводили в группу контроля. В разрез роговицы вводили трансплантируемые кусочки ткани сбщим объемом 3-5 мм3 (Куликов, 2004).

Иммунодепрессантов не использовали ни до, ни после операции. Прооперированных животных содержали на стандартной диете. .

В процессе экспериментального использования внесены изменения, позволяющие повысить эффективность трансплантации:

- на роговице делали разрез длиной 1,5-2 мм в области «13 часов» по «воображаемому циферблату» в 1-2 мм от края роговицы (ранее выполнялся в области «17-18 часов» по «воображаемому циферблату»),

- дополнительно осуществляли отсос глазной жидкости, эквивалентной объему трансплантата, после разреза роговицы,

- фиксировали инструмент (микропипетку) к внутренней поверхности роговицы в процессе введения трансплантата,

- трансплантат помещали непосредственно на радужную оболочку.

Определение количества тимоцитов

Под эфирным наркозом животных декапитировали гильотиной, затем вскрывали грудную полость, извлекали тимус и помещали его в солевой раствор Хенкса без фенолового красного с глюкозой (5 ммоль/л) и антибиотиком (гентамицин, 10 мкг/мл), содержащий 20 ммоль/л HEPES ("Serva", США) рН 7,2, температуры 37°С. Суспензию клеток тимуса объемом 5-7 мл фильтровали через капроновый фильтр под легким механическим давлением, однократно отмывали после центрифугирования (700 g, 5 мин) и ресуспендировали в растворе Хенкса или RPMI-1640 ("Serva", США) до разной концентрации в интервале 105-108 клеток в 1мл. Концентрацию клеток определяли подсчетом в камере Горяева (Корыстов и др., 2003).

Получение экспериментального сахарного диабета

Модель экспериментального сахарного диабета (ЭСД) у крыс получали путем однократного внутрибрюшинного введения аллоксана фирм «Sigma», «Jinan Great Chemical Industry Co., Ltd», обладающего избирательным токсическим действием на /'-клетки островков Лангерганса. Крысам-самцам Вистар массой 200-230 г внутрибрюшинно вводили 5%-раствор токсина, из расчета 22-23 мг сухого вещества на 100 г массы тела животного.

Пересадка аллогенной ткани поджелудочной железы в переднюю камеру

глаза крысы

Животными-реципиентами являлись крысы с сахарным диабетом, у которых через 2 недели после введения аллоксана гликемия была не менее 20 ммоль/л, а глюкозурия, как правило, февышала 2%. В большинстве случаев гликемия составляла 20,5-25 ммоль/л. Ткань' поджелудочной' железы пересаживали в стерильных условиях. Стерильность достигали за счет облучения специально оборудованной операционной комнаты ртутно-квЪр'цевой лампой в течение 2 часов, а также обработкой операционного поля и инструментов этиловым спиртом непосредственно перед операцией.

В работе использовали крыс-доноров с 17-18-дневной беременностью, для чего предварительно за 17-18 дней в клетку попарно ссаживали самок и самцов на

6 часов. В некоторых случаях в качестве доноров поджелудочной железы использовали новорожденных крысят.

Под нембуталовым наркозом из беременных самок через разрез белой линии живота извлекали зародыш, промывали его в дистиллированной воде и спирте, переносили в стерильный раствор Игла. Поджелудочную железу выделяли у эмбрионов под стереомикроскопом МБС-9. От железы отрезали 1-2 кусочка объемом 0,8-1 мм3, которые переносили в чашку Петри со стерильной средой Игла. Каждый последующий зародыш извлекали у донора только после того, как был отпрепарирован предыдущий. Такая последовательность процедуры обеспечивала для каждого зародыша соблюдение оптимального температурного режима и поддержание естественного питания.

Техника введения трансплантата ткани поджелудочной железы в ПКГ аналогична описанной ранее для трансплантации ткани тимуса. Иммунодепрессантов не использовали ни до, ни после операции. Прооперированных животных содержали на стандартной диете.

Подготовка микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы крысы для трансплантации под белочную оболочку семенника

Трансплантат подготавливали из ткани поджелудочной -- железы новорожденных крысят. После вскрытия брюшной полости поджелудочную железу удаляли и помещали в раствор Хэнкса, где при ■ помощи микрохирургического пинцета и ножниц ее механически измельчали до микрофрагментов 1-3 мм в диаметре. Для одной пересадки использовали микрофрагменты поджелудочной железы общей массой 25-30 мг, выделенные от 3-4 доноров. Для введения микрофрагментов под белочную оболочку семенника использовали дозатор «MICROMAN».

Микрохирургический метод аллотраисплаитации микрофрагментов

ткани неонатальной поджелудочной железы под белочную оболочку

семенника

Для трансплантации микрофрагментов неонатальной ткани поджелудочной железы в семенник применяли разработанный в ИТЭБ РАН совместно со специалистами кафедры оперативной хирургии и клинической анатомии РУДН (Кистнер, Кирпатовский, Куликов и др., 2003) метод с модификациями.

Операцию проводили под общей анестезией парами эфира. По средней линии живота выполняли разрез длиной 2 см. Левый семенник выводили в рану. Прокалывали белочную оболочку в дистальном полюсе семенника. Под белочную оболочку, поверх семенных канальцев, поочередно вводили микродилататоры различного диаметра, по ходу паравазальной клетчаточной щели субкапсулярного сосудистого сплетения семенника, не проникая в паренхиму органа. В результате формировали искусственный карман, расположенный поверх семенных канальцев. Затем в созданный карман паравазальной клетчаточной щели вводили микрофрагменты ткани поджелудочной железы массой 25-30 мг с помощью дозатора «MICROMAN».

После пересадки прокол белочной оболочки ушивали атравматичной иглой с нитью 6/0. Семенник обрабатывали антисептическим раствором мирамистина и помещали в мошонку. Операционную ралу ушивали через все слои узловыми швами нитью 2-3/0,

За счет модификации, внесенной в процессе экспериментального использования метода, а кмснко помещения инсулккпродуцкр/ющей ткани не в дистальный, а в проксимальный полюс семенника, трансплантат-под действием сил гравитации не выдавливался за пределы белсчлок оболочки. Е результате не требовалось наложения швов на белочную оболочку.

Тестирование уровня глюкозы в биологических жидкостях экспериментальных животных

Концентрацию глюкозы в моче определяли с помощью диагностических полосок «Урикет», «Uriskan». Концентрацию глюкозы крови измеряли системой «Glucometer Elite®» и «Contour TS» с соответствующими тест-полосками (сенсорами) фирмы Bayer (Германия).

Определение потребления воды

Животных помещали в клетки по 3-5 шт. По градуированным поилкам определяли количество потребляемой воды за сутки. Сопоставляя результат с общим весом животных в клетке, вычисляли объем среднего потребление воды на 100 г веса животного.

Тест на фертильность

Для изучения фертйльности крыс-самцов после аллотрансплантации микрофрагментов ткани поджелудочной железы под белочную оболочку семенника (операция выполнялась на левом семеннике) пересекали выносящий проток правого интактного семенника. В результате семенная жидкость отводилась только из левого яичка, в которое ранее был помещен трансплантат ткани поджелудочной железы. Было важно оценить влияние самой пересадки микрофрагментов неонатальной поджелудочной железы под белочную оболочку семенника на фертильность крыс, поэтому использовали животных без сахарного диабета. Одного самца подсаживали к 5 половозрелым самкам на 21-й, 63-й дни после трансплантации, На каждый срок по 5 самцов (всего 10). Оценивали количество покрытых самок (Западнюк и др., 1974).

Ложныё операции

В качестве контроля проводили ложные операции. После наркотизирования выполняли разрез роговицы глаза либо белочной оболочки тестикул. Далее животное выводили из наркоза 'без трансплантации ткани. В ряде случаев пересаживалась ткань ' легкого (объем соответствовал -¡рансплантатам поджелудочной железы или тимуса).

Методика хирургической инициации экспериментального энкопреза

Крысам Вистар массой 200-230 г в стерильных условиях под эфирным наркозом клиновидно иссекали участок прямой кишки размером 20-25% от общей окружности кишки с захватом мышц наружного сфинктера. Глубина иссечения тканей составляла 1,0-1,5 см. Операционную рану не ушивали. Для снижения риска инфицирования раневой поверхности полностью исключалась дефекация (либо в значительной степени уменьшался объем каловых масс) в течение 2 суток после операции. Для этого экспериментальных животных лишали корма за 2 дня до и на 2 дня после операции,-либо содержали на глюкозной диете (10% глюкоза в питье) в те же сроки. '

Методика забора ткани костного мозга

Ткань костного мозга выделяли из бедренной кости крыс-доноров массой 250-300 гр. Под эфирным наркозом животных декапитировали гильотиной, затем обнажали бедренную кость, рассекали компактное костное вещество, костный мозг выделяли с помощью стерильных шприцов с иглами, ложки Фолькмана и помещали в среду Хэнкса.

Пересадка ткани костного мозга при экспериментальном энкопрезе

Известно, что клетки-предшественники различных тканей, обладающие высоким регенераторным потенциалом, способны к направленному перемещению в области организма с низким напряжением кислорода в тканях - гипоксией (Шварцбурд, 2006, 2007; Borue et al., 2004; Ceradini et al., 2004; Abbody et al., 2006; Alison et al., 2006). С целью повышения эффективности использования трансплантируемых в структуре тканей костного мозга клеток-предшественников экспериментальным животным на 2-е сутки после хирургической инициации энкопреза циркулярно (перианально) наносили проколы кожи (с помощью инъекционной иглы), что приводило к усилению гипоксии. "

На 3-й сутки после хирургической инициации энкопреза пересаживали аллогенную ткань костного мозга. Трансплантируемый материал забирали согласно описанной ранее методике в день операции и после предварительной мягкой гомогенизации в 3 мл раствора Хэнкса вводили перианально на глубину 1-'1,5 см с помощью шприца объемом 2,0 мл (использовали инъекционные иглы от шприцев большего диаметра). Объем пересаженного материала на каждое животное составлял 0,2-0,3 мм3, общее количество пересаженных клеток на каждое животное достигало 30-32 млн.

Гистологические исследования ткани

Исследуемые ткани фиксировались в растворе Боуэна в течение суток. Затем осуществлялась проводка по спиртам возрастающей концентрации с последующей заливкой ткани в парафиновые блоки. Серийные парафиновые срезы толщиной 3-4 мкм окрашивались гематоксилином и эозином (Меркулов, 1969), галлоцианин-хромовыми квасцами (Пирс, 1962).

Иммуногистохимические исследования

Для выявления инсулинпродуцирующих оотровковых клеток е пересаженном трансплантате использовали «сэндвич»-метэд (Угрюмов, Î95i). В этих целях депарафинированные срезы толщиной 6-7 мкм с помощью обычной нисходящей гистологической проводки доводили до забуфгренного физраствора. После блокирования эндогенной пероксидазы з течение 15 минут смесью абсолютного метанола с перекисью водорода на срезы в • разведении ? : 100 наслаивали моноклональные антитела 'против инсулина свиньи, перекрестно реагирующие с инсулином крысы. После этого срезы инкубировали зо влажной камере при температуре 4°С в течение 16 часов. Затем трижды отмывали забуференным физраствором и наслаивали меченые пероксвдазой хрена атфинные кроличьи антитела, имеющие сродство к иммуноглобулину мь.ши (1:20). После 1-часовой инкубации' при комнатной температуре визуально регистрировали проявление пероксидазы с помощью диамкнобензхдика, раззеденного в 0,1%-перекиси водорода. Срезы заключали в канадский бальзам и изучали под световым микроскопом.

В результате развивалась высокоселективкая коричневая окраска клеток, содержащих секреторные гранулы с инсулином (ß-клетки). Остальные клетки, входящие в состав ткани, не окрашивались и выглядели бесцветными. В некоторых случаях использовали дополнительную подкраску гематоксилином для выявления ядер других клеток. Гистологические исследования проводили совместно с сотрудниками Института морфологии человека РАМН Рябчиковым О.П., Шмелевой С.П.

Подсчет количества и определение размеров островков Лангерганса

Под световым микроскопом при увеличении 10x8 исследовали гистологические препараты поджелудочной железы. Подсчитывали количество островков Лангерганса в поле зрения, в каждом препарате исследовали 4-6 полей зрения. Далее определяли размер островков с помощью счетной сетки, закрепленной на объективе (при увеличении 20x15 одно деление на сетке соответствовало - 6 мкм).

Статистика

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программ Статистика 6.0, Microsoft Office Excel 2007. Для полученных величин проводился подсчет среднего значения, среднеквадратической ошибки. Различия средних величин признавалось достоверным при уровне значимости' р<0,05. Для отнесения наблюдений к одному из двух возможных классов при небольших выборках исследовали непараметрические критерии статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИЯ ТКАНИ ТИМУСА В ПЕРЕДНЮЮ КАМЕРУ ГЛАЗА КРЫСЫ

Исследование динамики возрастной инволюции тимуса крысы

С течением жизни у незимнеспящих млекопитающих уменьшается количество тимоцитов (необратимая возрастная инволюция тимуса). Очевидно, в связи с этим с возрастом происходит увеличение заболеваемости аутоиммунными, онкологическими, инфекционными и др. патологиями (Walford, 1969; Miller, 1999; Nikolich-Zugich, Messaoudi, 2005). Однако показано, что различные иммуномодулирующие воздействия могут приводить к восстановлению функции иммунных клеток в стареющем организме (Морозов, Хавинсон, 1996; Лабунец и др., 1997; Морозов, Хавинсон, 1997; Anisimov et al., 1982; Anisimov et al., 1998; Анисимов, 2008).

В эксперименте на 117 крысах мы проследили динамику возрастной

Показано, что количество тимоцитов у 19,5-месячных крыс по сравнению с 2,5-месячными уменьшается в 65±2 раза. Наиболее выраженное снижение количества тимоцитов приходится на период полового созревания.

С целью модуляции процесса возрастной инволюции тимуса нами разработана оригинальная методика аллотрансплантации ткани тимуса в иммунопривилегированную переднюю камеру глаза крысы. Аллотрансплантация тимоцитов от молодых крыс в ПКГ 7-месячных животных приводит к достоверным положительным сдвигам. Уже через месяц после пересадки ткани количество собственных тимоцитов реципиента превышает таковое у интактных крыс на 36%. Этого времени обычно хватает для полной элиминации тканевого или клеточного трансплантата, помещенного без иммуносупрессии в области организма, не относящиеся к иммунопривилегированным. В нашей модели у всех

оперированных животных трансплантаты сохранялись и визуально определялись в ПКГ на всех сроках наблюдения (более 20 мес).

Следующей задачей была прозерка способности трансплантатов тимуса предотвращать возрастную деградацию собственного тимуса у крыс разного возраста на более отдаленных сроках.

Через 3 месяца после трансплантации ткани тимуса в ПКГ количество собственных тимоцитов крыс (в сравнении с интактным контролем) составило: 295% у 5-месячных животных, 225% у 7-месячных и 272% у 8-месячных крыс, тогда как через 1 месяц после аллотрансплантации у 7-месячных этот показатель составил 136%.

10 крысам вместо фрагментов ткани тимуса трансплантировали равные им по объему фрагменты легкого (контроль на специфичность ткани), что не вызывало увеличения количества собственных тимоцитов реципиента.

Увеличение средней и максимальной продолжительности жизни крысы за счет трансплантации иммунокомпетентной ткани

Исходя из результатов предыдущих экспериментов, мы предположили наличие положительного влияния замедления скорости необратимой инволюции тимуса на продолжительность жизни организма. Косвенным подтверждением тому могут служить данные о том, что применение некоторых иммуномодуляторов способно восстанавливать компетентность иммунных клеток в стареющем организме и увеличивать продолжительность жизни животных (Морозов, Хавинсон, 1996; Лабунец и др., 1997; Агшшоу й аЦ 1998; Анисимов, 2008).

Для проверки высказанной гипотезы в следующую серию экспериментов было включено 50 животных. На сроке жизни до 14-17 месяцев умерло 8 крыс. С 17-го месяца жизни оставшиеся животные были разделены на 2 равные группы (по 21 шт.). Первой группе проведена аллотрансплантация ткани тимуса в ПКГ, вторая группа представлена интактными животными (рис 2)._

■В. «Я Л. Л, я

26 28,5 30,5 31 31,$ 33 34,5 35,5 37,5 и

□ контрольная групп» (п-21) ■ опыт, трянсплшгтяцпя тимуса (н-21)

Рис. 2. Динамика выживаемости аллотрансплантации ткани тимуса в ПКГ.

животных в контроле и после

Аллотрансплантация ткани тимуса в ПКГ крысы приводит к увеличению средней (на 19±5%) и максимальной (на 21%) продолжительности жизни экспериментальных животных.

Мы также пересаживали ткань тимуса молодым половозрелым животным (возраст 3,5 мес.), однако, это не вызывало значимого увеличения продолжительности жизни.

Таким образом, мы пришли к выводу, что трансплантация ткани тимуса именно животным зрелого возраста может оказать наибольшее влияние на увеличение продолжительности жизни.

II. АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИЯ ТКАНИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ

ЖЕЛЕЗЫ С ЦЕЛЬЮ КОМПЕНСАЦИИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ОТКЛОНЕНИЙ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

Отбор животных для трансплантации

Диабетогенная доза аллоксана для крысы при внутрибрюшинном введении по разным литературным источникам составляет от 150 до 230 мг/кг веса (McEvoy, Hegre, 1977; Caterson et al., 1982; Пальчикова и др., 1987; Кухарчук, 1994; Архипова, 2002). В наших экспериментах сахарный диабет инициировали однократным введением в брюшную полость крысы Вистар аллоксана в дозе 220230 мг/кг веса.

В результате многолетних исследований, проведенных Куликовым А.В. (2004), было показано, что для получения устойчивого сахарного диабета с концентрацией глюкозы в крови более 20 ммоль/л требуются подходы, наиболее полно учитывающие массу, пол и возраст животных. Немаловажным.фактором является и время года. Так как эксперимент проводился в оптимальный, летне-осенний сезонный, период, доза однократно вводимого аллоксана была высока и составила 220-230 мг/кг массы тела. В наших экспериментах на 82 крысах Вистар после введения аллоксана всех животных можно было разделить на 4 неравные группы. Первую группу составили 49 животных (59,8%) - крысы, которые погибли в течение первых 7 дней. Вторая группа состояла из 10 животных (12,2%) с уровнем сахара 10-17 ммоль/л. Третья группа, 7 животных (8,5%), оказалась резистентна к действию аллоксана в указанной дозе. И, наконец, четвертая группа - 16 особей (19,5%) с содержанием глюкозы в крови более 20 ммоль/л. Для последующих экспериментов по пересадке тканей поджелудочной железы в иммунопривилегированные области организма отбирали животных с гликемией, превышающей 20 ммоль/л, поскольку в этой группе не наблюдалось самопроизвольной компенсации углеводного обмена. Следует отметить, что такой относительно высокий процент животных с гликемией более 20 ммоль/л - 19,5% удается получить далеко не всегда: наилучший результат, как в данном случае, получается в летне-осенний период; в зимне-весенний сезон эта цифра не превышает 10-15%.

Средняя продолжительность жизни животных с острым аллоксановым сахарным диабетом (из группы № 4) составляет только 25 дней (п=171). Эти данные согласуются с результатами других исследователей (Кирпатовский, Дендеберов, 1994; Кистнер и др., 2003).

Трансплантация ткани фетальной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза крыс с экспериментальным сахарным диабетом

Под полной компенсацией мы принимали снижение глюкозы крови с более чем 20 ммоль/л до 4-8 ммоль/л, под частичной - до 8,1-14 ммоль/л (табл. 1).

Таблица 1

РЕЗУЛЬТАТЫ АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИИ ТКАНИ ФЕТАЛЬНОЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПЕРЕДНЮЮ КАМЕРУ ГЛАЗА ЖИВОТНЫМ _С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ_

Реципиент Донор КОМПЕНСАЦИЯ ДИАБЕТА,

(шт) (шт) шт (%)

Полная Частичная Декомпенсация ВСЕГО

Крысы Крысы 160 133 40 333

Вистар Вистар (48%) (40%) (12%) (100%)

Время наблюдения - не менее 3 месяцев после трансплантации.

Пересадка ткани фетальной поджелудочной железы в ПКГ крысам с экспериментальным сахарным диабетом приводила к полной либо частичной компенсации углеводного обмена в 88% случаев. Для того чтобы иметь прямые доказательства участия трансплантата в компенсации метаболических отклонений, характерных для сахарного диабета, 17 крысам с хорошо оформленными аллотрансплантатами и компенсированным диабетом провели удаление оперированных глаз с трансплантатами. У всех 17 животных наблюдали рецидив диабета, развивавшийся в течение 2-7 недель и приведший к их гибели в течение последующего месяца..

Содержание глюкозы в крови диабетических, интактных животных и крыс с компенсированным трансплантацией диабетом на разных сроках

жизни

Согласно данным литературы в мире существует значительное количество трансплантологических способов компенсации тех или иных патологических состояний (Угрюмов, 1998; Шумаков, Тоневицкий, 1999, 2000; Kopyov et al., 1997; Von Mach et al., 2003; Anderson, Caldwell, 2007; Darsalla et al., 2007; Politis et al., 2010). Наиболее часто пересаживаемый материал помещают в неиммунопривилегированные области организма. Иммунологическая несовместимость ткани донора и реципиента в подавляющем большинстве случаев сопровождается плохим функционированием и ранним (обычно в течение 1-2 недель) отторжением трансплантата.

В представленной работе показано длительное (более 18 месяцев) функционирование трансплантата в ПКГ без использования иммунодепрессантов (рис. 3). После операции гликемию контролировали 1 раз в неделю.

14

25

20 ■

У

15 ■

I 10 ■

I 5

5

3

0

5,7 ± 0,1

Л

п=10

□ ннтпкшныи кокпроль и содержание глюгЬал перед операцией а компенсированный ¿пшбеш

п»52 р<0,001

Рис. 3. Сопоставление уровня гликемии 20-месячных животных в контроле и через 18 месяцев после трансплантации ткани поджелудочной железы в ПКГ при экспериментальном сахарном диабете, а также 2-месячных крыс через 2 недели после инициации диабета (без лечения средняя продолжительность жизни животных этой группы - 25 дней).

Компенсация гликемии сопровождалась нормализацией таких показателей, как: глюкозурия, масса тела, потребление жидкости, выпадение шерсти.

3 крысам с сахарным диабетом вместо ткани поджелудочной железы трансплантировали равные им по объему фрагменты легкого (контроль на специфичность ткани), животные погибли при высоком уровне гликемии (более ;» 20 ммоль/л) и глюкозурии (более 2%) через 7, 19 и 23 дня соответственно. 10 животным после наркотизирования выполняли разрез роговицы глаза. Далее животных выводили из наркоза без трансплантации ткани поджелудочной железы. Все крысы умерли в течение 25 суток.

Энуклеация глаз вместе с трансплантатами вызывала рецидив сахарного диабета, что свидетельствует о ключевой роли трансплантата поджелудочной железы в компенсации углеводного обмена. Ранее в нашем подразделении были проведены работы, показавшие, что трансплантация ткани поджелудочной железы в ПКГ при экспериментальном сахарном диабете способствует восстановлению концентрации иммунореактивного инсулина (ИРИ) в крови. При этом количество инсулина, выделяемого из известного объема трансплантата, не могло оказать достаточного эффекта на компенсацию сахарного диабета. Было сделано предположение, что трансплантация фрагментов ткани поджелудочной железы должна стимулировать частичное восстановление продукции инсулина собственной поджелудочной железой реципиента. Сопоставление содержания ИРИ в тканях поджелудочной железы крыс после введения аллоксана и последующей трансплантации инсулинпродуцирующей ткани в ПКГ подтвердило это предположение (КиПкоу, АгЬигоуа е1 а1., 1998; Куликов, 2004).

Гистологические исследования поджелудочной железы животного-реципиента после инициации экспериментального сахарного диабета и последующей трансплантации инсулинпродуцирующих тканей

После трансплантации ткани поджелудочной железы в переднюю камеру глаза крысам с экспериментальным сахарным диабетом (ЭСД) значимо увеличивается площадь (более чем в 2 раза) островков Лангерганса в собственной поджелудочной железе реципиента, отмечается тенденция к увеличению количества островков на 17% (табл. 2).

Таблица 2

КОЛИЧЕСТВО ОСТРОВКОВ ЛАНГЕРГАНСА И ИХ РАЗМЕР

У ЖИВОТНЫХ РАЗНЫХ ГРУПП __

Параметр Крысы с ЭСД Крысы с компенсированным диабетом через 3 недели после трансплантации

Количество островков в п/з 4,06±0,28 4,88±0,77

Размер островков, мкм2 28,54±4,5 68,53±13,11*

*р<0,05

Основная масса островков располагалась вокруг выводных протоков поджелудочной железы, либо в непосредственной близости от них (рис. 4).

«л -

г ^г-

.... : .. ,1:. ■ , 'Д.

Рис. 4. Ув. 40x7. Препарат поджелудочной железы. 1 - скопления эндокринных клеток; 2 - проток железы. Окраска гематоксилин-эозин.

Было показано, что после аллотрансплантации инсулинпродуцирующих тканей в ПКГ регенерация эндокринного аппарата поджелудочной железы крысы происходит даже при субкомпенсации углеводного обмена (гликемия 8-14 ммоль/л), однако, этот процесс протекает менее интенсивно.

Таким образом, можно сделать вывод, что пересадка аллогенных тканей поджелудочной железы в переднюю камеру глаза крысам с экспериментальным сахарным диабетом ведет к улучшению углеводного обмена, в том числе, за счет восстановления эндокринного аппарата собственной поджелудочной железы реципиента. Увеличение количества и размеров островков Лангерганса сопровождается повышением продукции инсулина собственной поджелудочной железой.

Аллотрансплантация микрофрагментов ткани неонаталыюй поджелудочной железы под белочную оболочку семенника крыс с экспериментальным сахарным диабетом

В эксперименте использовали 42 крысы опытной серии со стойким сахарным диабетом: уровень гликемии перед операцией от 20 до 33,3 ммоль/л (максимальное заачекие, регистрируемое применяемым нами методом), глюкозурия не менее 2%.

В результате аллотрансплантации микрофрагментов неонатальной ткани поджелудочной железы под белочную оболочку семенника значимо снижается уровень смертности крыс со стойко выраженным экспериментальным сахарным диабетом и увеличиваются сроки выживания животных. К 4-ой неделе после введения аллохсана без последующей трансплантации умерли все животные. Когда после введения аллоксама под белочную оболочку семенника пересаживали ткань неонатальной поджелудочной железы, к 4-ой неделе выжило 91,5%, а к 5-ой - 88,5% животных (пересадку выполняли через 2 недели после введения аллоксана).

После операции происходило постепенное снижение уровня гликемии, что сопровождалось нормализацией таких показателей, как: глюкозурия, масса тела, потребление жидкости. Наряду с этим происходило улучшение общего состояния крыс, что выражалось в повышении активности животных, уменьшении выпадения шерсти.

12 животным с экспериментальным сахарным диабетом после наркотизирования выполняли разрез белочной оболочки яичка. Далее животных выводили из наркоза без трансплантации ткани поджелудочной железы. Все крысы умерли в течение 25 суток.

Через 3, 6 и 9 недель после трансплантации забирались животные для морфологического исследования семенников. Показано отсутствие патологических изменений при макроскопическом исследовании, наличие аллотрансплантата во всех случаях при микроскопическом исследовании. Иммуногистохимическое исследование с моноклонапьными антителами против инсулина подтверждает наличие инсулинсодержащих клеток в трансплантате к концу срока наблюдения (9 недель).

Тест на ферпиьность после аллотрансплангации микрофрагменгов ткани неонаталыюй поджелудочной железы под белочную оболочку семенника

В результате экспериментов с пересечением семявыносящего протока интактного семенника, показана сохранность фертильности всех оперированных животных. К одному самцу на сроках 3, 9 недель после трансплантации подсаживали 5 половозрелых интактн'ых самок. На каждый срок спаривание проводили у 5 самцов' (всего 60 животных). Учитывая возможность негативного влияния гипергликемии на репродуктивную функцию, использовали животных без сахарного диабета. В результате теста количество покрытых самок во всех сериях составило 100%.

III. СОЗДАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ И СПОСОБА ЛЕЧЕНИЯ ЭНКОПРЕЗА

Распространенность энкопреза (недержания кала, анальной инконтиненции) составляет 2-4% среди взрослого населения (по некоторым данным до 8%); заболеваемость увеличивается с возрастом - энкопрез диагностируется у 45% пациентов домов престарелых, различные расстройства дефекации у детей встречаются с частотой от 1,2 до 8% (Nagle, 1999; MacArthur, Glazener et al., 2005; Chitkara, Talley, Locke et al., 2007; Palsson, Turner et al., 2009). Исходя из анализа литературных данных, мы предположили, что возможность применения аллотрансплантации различных тканей для коррекции данного состояния не использовали, так как ключевой проблемой является отсутствие информации об адекватной модели анальной инконтиненции. В связи с этим, прежде всего нами была разработана экспериментальная модель энкопреза, суть которой заключается в хирургическом иссечении участка прямой кишки с захватом мышц наружного анального сфинктера (см. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ). После оперативного повреждения анальной области нарушалась функция запирательного аппарата прямой кишки. Для ликвидации образовавшегося органического и функционального дефекта проводили аллогенную пересадку ткани костного мозга в зону вокруг хирургической раны.

Экспериментальные животные (крысы Вистар) были распределены на 3 группы: интактный контроль, животные с хирургически инициированным энкопрезом без лечения и животные, которым вслед за развитием анальной инконтиненции производилась аллогенная пересадка тканей костного мозга, богатого клетками-предшественниками.

После нанесения хирургической травмы наблюдалась выраженная воспалительная реакция с последующим процессом эпителизации раневой поверхности в течение 14-16 суток. При гистологическом исследовании определялось развитие грануляционной ткани (рис. 5), на более поздних сроках -организация соединительной ткани в рубцовую, в большинстве случаев этот процесс осложнялся парапроктитом.

Рис. 5. Ув. 4x10. Травма (без трансплантации), 10-е сутки. Сквозной дефект мышечной ткани. 1- грануляционная ткань; 2 - мышечная ткань. Окраска гематоксилин-эозин.

Когда после хирургической травмы трансплантировали фрагменты ткани костного мозга, полная эпителизация регистрировалась уже через 6 суток. При гистологическом исследовании в толще мышечной ткани определялись скопления клеток бластного типа, неспецифическое воспаление проходило без экспрессивного разрастания грануляционной ткани (рис. 6). 'к*..

V - I

Ш»* я •

«$ I . ;

.......г" ' 1.......:

ш

V « 1

тМ

Ш ж Й

' >' * " * \ »• • ~ ' Рис. 6. Ув. 10x10. 10 суток после трансплантации костного мозга. Общий вид гранулематозного воспаления. 1- скопления клеток бластного типа среди мышечной ткани. Новообразование сосудов не выражено. Окраска гематоксилин-эозин.

В результате заживление не сопровождалось образованием грубого рубца. На более поздних сроках при гистологическом исследовании отмечались лишь незначительные гипотрофия мышечной ткани и нейтрофильная инфильтрация (рис. 7). Явления энкопреза ликвидировались.

■

1 к

| ч. > ; ' С. : V > ч

'¿щЩш - -

I ЗЙВ

1

Рис.7. Ув. 4x10. 21 сутки после трансплантации костного мозга. 1-Мышечная ткань с незначительной гипотрофией. Рубцовая ткань не определяется. Окраска гематоксилин-эозин.

Следует отметить, что в части' работы, связанной с энкопрезом, принципиальным отличием было помещение трансплантата в область, не защищенную гисто-гематическим иммунным барьером.

Говоря о перспективе клинического применения пересадки тканей для лечения энкопреза, нужно подчеркнуть возможную целесообразность использования аутологичного материала, что снимает трудности этического,

юридического и, наконец, иммунологического характера, которые неизменно возникают в трансплантологической практике.

Основные принципы, отработанные в процессе наших экспериментальных исследований, могут быть использованы специалистами для изучения возможности ускоренной безрубцовой регенерации тканей при различных состояниях: химические и термические поражения, хирургические и косметологические операции и др.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе экспериментальной работы на животных нами применялись разные схемы трансплантации. . В качестве донорского материала использовали аплогенные ткани поджелудочной железы, тимуса, костного мозга. После трансплантации во всех случаях мы наблюдали восстановление не только функционального, но и структурного компонентов: увеличение количества тимоцитов, площади островков Лангерганса, регенерация запирательного аппарата прямой кишки. Известно, что для поддержания постоянства структуры и выполняемых функций во всех тканях существует определенная иерархия клеток-предшественников (плюрипотентные, разные категории мульти- и олигопотентных прогениторных клеток, монопотентные прогениторные клетки). Эти клетки обеспечивают как физиологическую, так и репаративную регенерацию в соответствующих условиях (Тимофеев, 2009). Генетическая неоднородность, условия функционирования трансплантата в наших экспериментах определяют крайне низкую вероятность того, что пересаженные прогениторные клетки могут быть источником новых структур в организме реципиента. Мы полагаем, что при воздействии продуцируемых пересаженной тканью биологически активных веществ происходит активация собственных регенерационных ресурсов организма реципиента; трансплантат, помещенный в иммунопривилегированную область, интегрируется в систему физиологической регуляции функций организма и способен к длительному выживанию без использования иммунодепрессантов. Механизмы взаимного влияния организма реципиента и трансплантата являются предметом наших будущих исследований.

Полученные в результате выполненной работы данные и предложенные методы, могут быть полезными при исследовании процессов физиологической и репаративной регенерации тканей на разных стадиях развития организма.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы стимуляции остаточных функций иммунной и эндокринной тканей при необратимой возрастной инволюции тимуса, экспериментальном сахарном диабете путем аплотрансплантации адекватных тканей в иммунопривилегированные области организма.

2. Трансплантация ткани тимуса в переднюю камеру глаза экспериментальных животных приводит к увеличению средней (на 19±5%) и максимальной (на 21%) продолжительности жизни.

3. Пересадка аллогенной ткани фетальной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза крысы приводит к увеличению площади эндокринной части поджелудочной железы реципиента (в 2,4±0,5 раза), частичному восстановлению продукции инсулина собственной поджелудочной железой.

4. Трансплантация аллогенной ткани (фетальной либо неонатальной) поджелудочной железы в иммунопривилегированные области (ПКГ, семенник) ведет к нормализации основных физиологических и биохимических показателей на сроках, соизмеримых с естественной продолжительностью жизни крысы.

5. Разработан метод, моделирующий развитие травматического энкопреза.

6. Пересадка ткани костного мозга в параанальную область при экспериментальном энкопрезе приводит к ускорению регенерации, восстановлению целостности запирательного аппарата прямой кишки без образования грубого рубца.

Список основных публикаций по теме диссертации

Публикации в ведущих периодических изданиях, включенных в перечень

ВАК РФ:

1. Куликов A.B., Корыстов Ю.Н., Чайлахян Л.М., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В., Шапошникова В.В., Куликов Д.А., Сухих Г.Т. Ускоренное старение иммунной системы и способы ее восстановления у разных возрастных категорий млекопитающих // Аллергология и иммунология. - 2005. - Т.6.- №4. - С. 486489.

2. Куликов A.B., Новоселова Е.Г., Корыстов Ю.Н., Глушкова О.В.^Смирнова Г.Н., Архипова Л.В., Куликов Д.А. Возрастная инволюция тимуса: способы замедления // Успехи геронтологии - 2005. - Вып. 17. - С. 82-86.

3. Куликов A.B., Архипова Л.В., Корыстов Ю.Н., Шапошникова В.В., Куликов Д.А., Чайлахян Л.М. Исследование возможности снижения темпа необратимой возрастной инволюции тимуса с помощью пересадки иммунокомпетентных или нейральных тканей // Доклады академии наук. - 2007. - Т. 414, №3. - С. 412-414.

4. Куликов A.B., Архипова J1.B., Смирнова Г.Н., Куликов Д.А., Сухих Г.Т. Использование особого иммунологического статуса ЦНС для создания способов компенсации экспериментальных патологических состояний // Неврологический вестник им. В. М. Бехтерева. - 2007. - Т. 39, №1. - С. 119-123. — ISSN 1027-4898.

5. Куликов A.B., Архипова Л.В., Новоселова Е.Г., Куликов Д.А., Смирнова Г.Н. Атопически трансплантированные ткани тимуса способны дистантно изменять метаболический статус организма // Биофизика. - 2008. - Т.53,- Вып.6. - С. 1141-1149.

6. Куликов Д.А., Машков А.Е., Шумский В.И., Куликов A.B. Компенсация мышечной дисфункции прямой кишки // Биофизика. - 2010. - Т.55, №5. - С. 850-854.

Статьи в сборниках:

7. Куликов A.B., Сухих Г.Т., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В., Полтавцева P.A., Рябчиков О.П., Третьяк Т.М., Куликов Д.А. Экспериментальная компенсация последствий диабета и возможность стимуляции пролиферации стволовых клеток трансплантацией эмбриональной или неонатальной поджелудочной железы // В книге "Горизонты биофизики от теории к практике". Под ред. член-корр. РАН Г.Р. Иваницкого, Пущино. - 2003. - С. 245-247.

8. Куликов Д.А., Корыстов Ю.Н., Куликов A.B., Новоселова Е.Г. Радиационный и социальный стресс как модели для исследования физиологических и биохимических изменений в организме // В сборнике "Боевой стресс: механизмы стресса в экстремальных условиях". Под ред. академика РАМН и чл.-корр. РАН И.Б.Ушакова, проф. Ю.А. Бубеева, Москва. - 2005. - С. 45-48.

9. Куликов A.B., Куликов Д.А. Стресс как модельная система для исследования физиологических и иммунологических изменений в организме // В сборнике "Война и здоровье: боевой стресс". Под ред. академика РАМН и чл.-корр. РАН И.Б.Ушакова, проф. Ю.А. Бубеева, Москва. - 2006. - С. 65-67.

10. Куликов Д.А., Гайворонский И.В., Тихонова Л.П. Новые способы модуляции возрастной инволюции тимуса и компенсации последствий естественного его старения И Инновационные технологии в морфологии: материалы научной конференции, Вып. 2., Санкт-Петербург. - 2007. - С. 56-59.

И. Куликов A.B., Архипова Л.В., Смирнова Г.Н., Куликов Д.А., Шишова Н.В. Задержка темпа необратимой возрастной атрофии тимуса с помощью аутотрансплантации длительно криоконсервированной вилочковой железы // Журнал проблемы криобиологии. - 2008. - Т.18, № 2. - С. 249-253.

12. Kulikov А.V., Arkhipova L.V., Novoselova E.G., Shishova N.V., Kulikov D.A., Smirnova G.N. Atopically transplanted tissues of йе pancreas and thymus are capable of distantly changing the metabolic status of the organism // Biological motility: achievements and perspectives. - 2008. - Pushchino, Russia. - V.2, - P. 228-231.

13. Куликов A.B., Машков A.E., Куликов Д.А. Разработка новых трансплантологических методов компенсации экспериментальных патологий // Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток, сборник статей по материалам Всероссийской конференции с международным участием, Самара. - 2008. - С. 57-59.

14. Куликов A.B., Машков А.Е., Архипова Л.В., Смирнова Г.Н., Сельвян A.M., Куликов Д.А., Катунян П.И. Биотехнологические подходы к компенсации патологических состояний // Материалы конференции 10 юбилейного международного форума «Высокие технологии XXI века», Москва. - 2009. - С. 235-238.

15. Куликов Д.А., Смирнова Г.Н., Архипова Л.В., Сельвян A.M., Шпурова H.A., Катунян П.И., Машков А.Е., Куликов A.B. Новый способ долговременной регистрации социального стресса во вновь образованных иерархических группах // Сборник трудов международной научно-практической конференции «Адаптация и функционирование живых систем», Сухум, Абхазия. - 2009. - С. 61-69.

16. Куликов A.B. Архипова Л.В., Смирнова Г.Н., Куликов Д.А., Шпурова H.A., Машков А.Е., Сухих Г.Т. Трансплантация иммунокомпетентных тканей в иммунопривилегированные области восстанавливает иммунологический статус организма после радиационного облучения // Сборник трудов международной научно-практической конференции «Адаптация и функционирование живых систем», Сухум, Абхазия. - 2009. - С. 69-78.

17. Куликов Д.А., Машков А.Е., Куликов A.B. Трансплантологическая модель компенсации энкопреза // Сборник статей международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы современных наук и образования», Курск. - 2010. - С. 180-182.

18. Куликов Д.А., Машков А.Е., Архипова Л.В., Гаврилюк В.Б., Слесарев В.В., Маевский Е.И. Нормализация физиологических и биохимических показателей с помощью трансплантации адекватных тканей при экспериментальных патологических состояниях // Сборник статей мемедународной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы современных наук и образования», Курск. - 2011. - Т.1. - С. 124-129.

19. Куликов Д.А., Машков А.Е, Слесарев В.В., Филюшкин Ю.Н., Ермилова Е.А., Куликов A.B., Маевский Е.И. Восстановление функции запирательного аппарата прямой кишки при экспериментальном энкопрезе // Сборник статей международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы современных наук и образования», Курск. - 2011. - Т.2. -С. 177-179.

Подписано в печать:

18.11.2011

Заказ № 6273 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Куликов, Дмитрий Александрович

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Влияние тимуса и его гормонов на различные системы организма.

Сахарный диабет: социальная значимость.

Обоснование использования тканевых и клеточных технологий в лечении сахарного диабета.

Трансплантологические методики в лечении сахарного диабета.

Аллоксановый сахарный диабет.

Энкопрез: способы лечения, проблемы и перспективы.

Трансплантация ткани в область центральной нервной системы.

Гистогематические барьеры.

Обоснование пересадки ткани в область центральной нервной системы.

Семенник как область для трансплантации островковых клеток.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные.

Трансплантация ткани тимуса в переднюю камеру глаза животных.

Определение количества тимоцитов.

Получение экспериментального сахарного диабета.

Пересадка аллогенной ткани поджелудочной железы в переднюю камеру глаза крысы.

Подготовка микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы крыс для трансплантации под белочную оболочку семенника.

Микрохирургический метод аллотрансплантации микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы под белочную оболочку семенника.

Тестирование уровня глюкозы в биологических жидкостях экспериментальных животных.

Определение потребления воды.

Тест на фертильность.

Ложные операции.

Методика хирургической инициации экспериментальногоэнкопреза.

Методика забора ткани костного мозга.

Пересадка ткани костного мозга при экспериментальном энкопрезе.

Гистологические исследования ткани.

Иммуногистохимические исследования.

Подсчет количества и определение размеров островков Лангерганса.

Статистика.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 1. Аллотрансплантация ткани тимуса.

Оценка влияния пересадки ткани тимуса в переднюю камеру глаза на динамику возрастной инволюции вил очковой железы реципиента.

Увеличение средней и максимальной продолжительности жизни крысы за счет трансплантации иммунокомпетентной ткани.

Глава 2. Аллотрансплантация ткани поджелудочной железы с целью компенсации физиологических и биохимических отклонений при экспериментальном сахарном диабете.

Отбор животных для трансплантации.

Трансплантация фетальной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза крысам с экспериментальным сахарным диабетом.

Содержание глюкозы в крови диабетических, интактных животных и крыс с компенсированным транпслантацией диабетом на разных сроках жизни.

Гистологические исследования поджелудочной железы животного-реципиента после инициации сахарного диабета и последующей трансплантации ткани фетальной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза.

Аллотрансплантация микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы под белочную оболочку семенника крысам с экспериментальным сахарным диабетом.

Динамическое исследование показателей компенсации углеводного обмена у животных с экспериментальным сахарным диабетом после аллотрансплантации микрофрагментов ткани неонатальной поджелудочной железы под белочную оболочку семенника.

Морфологическое состояние аллотрансплантата, помещенного под белочную оболочку семенника.

Тест на фертильность.

Глава 3. Создание экспериментальной модели и способа лечения энкопреза.

V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.