Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование полноразмерной ДНК-копии генома вируса клещевого энцефалита

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Конструирование полноразмерной ДНК-копии генома вируса клещевого энцефалита"

на правах рукописи

НА? 13Я7

ДОБРИКОВА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

КОНСТРУИРОВАНИЕ ПОЛНОРАЗМЕРНОЙ ДНК-КОПИИ ГЕНОМА ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА.

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск 1997

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН.

Научные руководители: доктор химических наук А.Г.Плетнев

кандидат биологических наук О.В.Морозова

Официальные оппонента»:

доктор биологических наук С.Н.Загребельнын кандидат биологических наук С.П.Коваленко

Ведущая организация: Государственный научный центр

вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Защита состоится " ИЯьбС^У&ЛсЯ^ 1997 г. в часов на

заседании диссертационного совета К 003.52.01 при Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект акад.Лаврентьева 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук О.С.Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Вирусы семейства Р1а\'Ып(1ае являются возбудителями опасных инфекционных заболеваний человека и животных, таких как желтая лихорадка, геморрагическая лихорадка Денге, японский энцефалит, клещевой энцефалит и др. Актуальность изучения вирусов этого семейства обусловлена их постоянной циркуляцией в природных очагах, приводящей к периодическим вспышкам вызываемых этими вирусами заболеваний.

Характерной особенностью флавивирусов, существенно затрудняющей их молекулярно-биологическое изучение, является опасность работы для исследователя с вирусным материалом, инфекционность РНК, низкие уровни продукции вирусспецифи-ческого материала при культивировании флавивирусов. Вызванная этими обстоятельствами ограниченная доступность очищенных препаратов вирусной РНК и белков отрицательно сказалась на изучении фундаментальных основ развития флавивирусных инфекций в клетках и организме, а также на решении практически важных проблем - создании эффективных средств диагностики и профилактики флавивирусных заболеваний.

Применение современных методов иммунологии и генной инженерии позволило значительно продвинуться в изучении флавивирусов на молекулярном уровне: получены данные о структуре геномов, антигенной структуре белка оболочки вирионов, определены нуклеотидные последовательности вирусных РНК, созданы библиотеки клонов, содержащие фрагменты кДНК вирусных геномов. Однако функции некоторых вирусных белков, а также роль клеточных компонентов на разных этапах репродукции вируса остаются

невыясненными. Одним из новых перспективных подходов к изучению биологии и патогенеза вирусов является направленное изменение вирусных геномов. Необходимым этапом для этого является создание стабильного кДНК-клона, с которого вирусная РНК может быть синтезирована in vitro.

Цель работы. Цель настоящей работы состояла в конструировании и клонировании в составе плазмидного вектора в E.coli стабильной полноразмерной ДНК-копии генома ВКЭ для синтеза in vitro индивидуальной вирусной РНК и изучения ее взаимодействия с вирусспецифическими и клеточными белками. Для этого было необходимо синтезировать и клонировать в плазмидном векторе недостающие фрагменты вирусной кДНК, которые соответствуют нетранслируемым областям геномной РНК, разработать стратегию и осуществить клонирование полноразмерной ДНК-копии генома ВКЭ, ввести в структуру рекомбинантной плазмиды участки, необходимые для транскрипции вирусной РНК in vitro, осуществить транскрипцию вирусной РНК in vitro с использованием в качестве матрицы клонированной кДНК ВКЭ, выявить при помощи синтетического транскрипта РНК-связывающие белки, присутствующие в контрольных и инфицированных ВКЭ клетках.

Научная новизна и практическая ценность работы. В процессе работы синтезированы и клонированы в плазмидном векторе фрагменты кДНК нетранслируемых областей генома ВКЭ (штамм Софьин), исследована их нуклеотидная последовательность. Впервые для флавивирусов показана гетерогенность З'-нетранслируемой области вирусной РНК по длине и первичной структуре внутри одного штамма вируса.

На основе имеющейся библиотеки кДНК ВКЭ с использованием

вновь клонированных фрагментов кДНК некодирующих областей впервые для вируса клещевого энцефалита сконструирована стабильная полноразмерная ДНК-копия генома. Вирусная кДНК клонирована под контроль промотора ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага SP6, что обеспечивает возможность получения индивидуальной вирусной РНК.

При использовании полноразмерной ДНК-копии генома ВКЭ в качестве матрицы и ДНК-зависимых РНК-полимераз бактериофагов SP6 и Т7 осуществлен синтез полноразмерной РНК ВКЭ в системе транскрипции in vitro. Радиоактивно меченый транскрипт использован для изучения взаимодействия вирусной РНК с вирусспеиифическими и клеточными белками. Выявлены два клеточных РНК-связывающих белка с молекулярными массами ЗОкДа и 22кДа, которые взаимодействуют с синтезированной in vitro РНК ВКЭ как в присутствии (зараженные ВКЭ клетки), так и в отсутствие вирусных белков (незараженные клетки).

Конструирование стабильной полноразмерной ДНК-копии генома ВКЭ, обеспечивающей синтез вирусной РНК in vitro, открывает широкие возможности для исследования генетической экспрессии и репликации вируса, изучения функций отдельных вирусспецифических белков и роли клеточных компонентов в вирусном патогенезе. Модификация генома ВКЭ на уровне кДНК при помоши сайт-направленного мутагенеза, делеций, вставок позволит продвинуться в изучении молекулярных основ патогенности вируса, что в перспективе может привести к созданию ослабленных (аттенуированных) вариантов вируса, пригодных в качестве живых вакцин.

з

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, получено авторское свидетельство на изобретение. Результаты работы были представлены на 3-ем международном симпозиуме "Positive strand RNA viruses" (Флорида, 1992 г.), 1-ом европейском совещании по вирусологии (Вюрцбург,

1995 г.), Х-ом международном конгрессе по вирусологии (Иерусалим,

1996 г.), международной научной конференции "Вирусные, риккет-сиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами" (Иркутск, 1996 г.).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 111 страницах, включающих 24 рисунка, 5 таблиц и список литературы (170 ссылок). Диссертационная работа состоит из введения, трех глав и выводов. Глава 1 - "Инфекционные транскрипты и кДНК-клоны РНК-содержаших вирусов" (Литературный обзор). Глава 2 содержит изложение и обсуждение результатов, полученных в работе. Глава 3 -экспериментальная часть.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Синтез, клонирование и анализ нуклеотидной последовательности фрагментов кДНК некодирующих участков РНК ВКЭ.

Для конструирования полноразмерной ДНК-копии генома ВКЭ прежде всего было необходимо синтезировать и клонировать фрагменты кДНК, соответствующие нетранслируемым областям РНК ВКЭ. Эти участки генома ВКЭ не были представлены в библиотеке кДНК ВКЭ и, кроме того, опубликованные нуклеотидные последовательности З'-конневой области РНК разных штаммов вируса существенно различались между собой (Pletnev et ai, 1990; Mandl et

al„ 1989; Mandl et ai, 1991). Фрагменты кДНК, соответствующие концевым участкам генома ВКЭ, получали по .методу, предложенному Mandl et al. (1991). Метод основан на способности РНК-лигазы фага Т4 циклизовать линейную молекулу РНК, что позволяет использовать в обратной транскрипции праймеры, комплементарные ¿'-концевой области генома и синтезировать фрагменты кДНК, соответствующие полной З'-кониевой последовательности вирусной РНК (рис. I). В качестве праймеров для получения кДНК нетранслируемых областей РНК ВКЭ использовали олпгонуклеотиды (табл.1), выбранные на основании первичной структуры РНК штамма Софьин.

Таблица I. Дезоксирибоолигонуклеотидные праймеры, использованные для синтеза фрагментов кДНК концевых участков генома ВКЭ.

Праймер Структура (5'- 3') Соответствие области вирусной РНК

PI CCCCTTCCTGTGAGATCTCCC Bglll комплементарен участку 768-788

Р2 GGCGGGTCGGTACCAGCGGGTGTTTTTCCGAG Kpnt комплементарен 10741-10758

РЗ AGATTTTCTTGCACGTGC гомологичен 1-18

Р5 GGATCCGGTACCTTCCCGGCCATCCCC Kpnl комплементарен 123-139

Р6 CCTTTCAAAAGCTTATGGGCAC Hindlll гомологичен 9915-9936

Для синтеза первой цепи кДНК использовали праймер Р5, который содержал последовательность, комплементарную вирусной РНК в положениях 123-139 и сайт рестрикции Крп1. Двухцепочечные фрагменты кДНК амплифицировали с помощью пары праймеров

сар-

РНКВКЭ

пирофосфатаза ТАР 3,

Т-4 РНК-лигаза

праймер Р5 ОТ

5', 3'

Р5

Р5/Р6 ПНР

5' I 3'

Р5-

Рб

гидролиз I НтШП-Крп!

Нш<Ш1'

ныш

Крп1 Нт<Ш1, ,Крп!

Т4 ДНК-лигаза [рОЕМЗ] Крп1

Рис.1. Схема получения рекомбинантных плазмид, содержащих нетранслируемые области генома ВКЭ.

Р5/Р6. Праймер Р6 содержал последовательность, гомологичную вирусной РНК в положениях 9915-9936 и сайт рестрикции HindIII.

Продукты ПЦР, которые представляли собой гетерогенный набор фрагментов длиной 700-900 п.о., клонировали в векторе pGEM3 по сайтам HindIII-Kpnl и определяли первичную структуру вставок, содержащихся в рекомбинантных плазмидах pGEM3(3'-5'). Нуклеотидная последовательность кДНК, соответствующая 5'-конце-вой области РНК ВКЭ, была идентична во всех проанализированных плазмидах, в то время как З'-концевая последовательность различалась у кДНК разных клонов (рис.2). Часть рекомбинантных плазмид содержали одинаковую последовательность З'-нетранслируемой области размером 394 н.о. (S*), остальные имели нуклеотидные замены или содержат разные по длине и локализации делеции по сравнению с S*.

*** ->i —» 4

S UGCACUGGGAGL'CC^ACUGG.VGAGCt'CAAUAAL'CL'AAAACCAGACUGUGA 10378

S*...................................................10378

N...........CU . .G.......................С...........10390

H...........CU . .G.......................С........... 10390

-> 2 -> 3 +-4

S cugagc.a.v\accuggagugcucguu.\.\.acauugi;ccag.\.\cc.\.\.vv\ccac i0429

S*................................................A. A 10429

N. A..........C. . . AG......A ... G.......G.........OAA. - 10440

H . A..........C. . . AG......A ... G.......G.........GAA. - 10440

S AGCAAGCAAUUCACAGAAACAGAGCUCGAACUGAAGAGCUCUUUAAAC 10477

S*. CAC--------------------------------------------- 10434

N.........С.......G. U........G____G..............(Ain 10483

H.........С.......GUGUGAGACCCCCCUGACCAGCAAAGGGGCAGAU 10491

<- 1.2.3

s*-------------------CCCCCGGAGUGCCCUACGGCAACACGUCAAU 10464

H CGGUCAGGGGUGAGGGAUG.....A......AU.......G. . . . С. . G . 10540

5*САСАОиаССОАСС,ССААСАиСОСССАССССаАСОиАССОСАЬ'иСиаии^ 10515 Н.................А........и..............С. . . . АА. . 10591

5*АСиЬ"иСЦСАСАССССССОСАССАиСАСААСССССААСАиОСиССААС - АА 10564 Н................и... и........................и. А.. 10741

5*СОООАСОССССССОААССА1'ОС1ТГССССАООАССОААСЛОАСА.АА1'иСС 10614

На................с. с.............................. 10691

3*СААСиСиС1!иСОССАиииииССиССиССиАиАСС.А.ААииССССииСАЛиАО 10665 Н . . в........А.....................А.........С . .СО. . . 10742

3*ЛСОООООСССаСиССЬ'0^1гСиСССЬ'ОАОССАССА1,САСССАСАСАСЛОЛи 10715 Н.................................................. 10792

10758 1

5 ------------------------------------------ ...---. 7

Б*АСиС1'ОАСААОСАССССАиОТСиСАСиСССААААЛСАСССССи АОАЬ'иии 7

Н....................................................................................................7

10335 1

Б СииССАССС'ОСА[.гОСОиииССиССССАиАССААСАССАСССАСАССиииС 57

Б*....................................................................................................57

Н.....в.....С..........С. ... С .... 147.......Сии............57

Рис.2. Сравнение нуклеотидных последовательностей («кодирующих

областей РНК разных штаммов ВКЭ.

Б - Софьин, Н - Нург, N - №ис!оегА, 8* - продукты ПЦР. ЦАА -терминирующий трансляцию вирусного полипротеина кодон, стрелками обозначена локализация делений, обнаруженных в клонированных продуктах ПЦР.

Следует отметить, что для З'-нетранс.тируемой области РНК других штаммов ВКЭ (\Yallner ег а/., 1995) была определена единственная нуклеотидная последовательность, в то время как для штамма Софьин мы обнаружили вариабельность участка, расположенного непосредственно за терминирующим трансляцию

вирусного полипротеина кодоном. Это может быть обусловлено тем, что для синтеза кДНК мы использовали вирусную РНК, выделенную из мозга зараженных ВКЭ мышей. В случае использования РНК, выделенной из отдельной бляшки вируса, такой гетерогенности обнаружено не было. По-видимому, гетерогенность этого участка вирусной РНК отражает существующую в природе гетерогенность вирусной популяции. В то же время концевой участок 3'-нетранслируемой области РНК штамма Софыш был идентичен во всех клонах и содержал все структурные элементы, необходимые для формирования вторичной структуры вирусной РНК и обнаруженные в РНК других штаммов ВКЭ.

2. Клонирование полноразмериой кДНК ВКЭ.

Для сборки полноразмерной ДНК-копии генома ВКЭ (рис.3) использовали библиотеку клонированных фрагментов кДНК кодирующей области РНК штамма Софьин, рекомбинантные плазмиды, содержащие блок генов E-NS1, а также кДНК-фрагменты нетранслируемых участков, полученные с помощью ОТ и ПНР вирусной РНК с использованием пары праймеров Р1/РЗ для синтеза индивидуального 5'-концевого фрагмента и Р2/Р6 для получения 3'-конпевого фрагмента. Серией последовательных субклонирований указанные фрагменты объединяли в крупные блоки, используя сайты рестрикции, присутствующие в структуре вирусной кДНК. На промежуточных этапах сборки генома ВКЭ были сконструированы рекомбинантные плазмиды, содержащие блок структурных генов (рТ-51.!), блок генов С, M, Е и NSI (pG-CMENSI), блок неструктурных генов NS2a. NS2b и NS3 (pG-2a2b3), блок генов NS3 и NS4a (pBR322-34а) и т.д. Заключительные этапы клонирования полноразмерной

А.

о

2000

4000

6000

8000

10000

структурные ' неструктурные белки >

ilCIMl'e INSI |2а|2М Nss' ИаЦЬ| NS5 (I-

р 10

К

Р4

N В

р8 рб pi » t » ♦ •

H N Sc S С

pis p223 _

! t t t ! : К Sc X Bal PB

__PU

» t *

P Bp H P7

ПНР pGEM109

! ! ! t Sp Bg R H

pl p210 !. t t ! S X Bgl с

p!3 ПЦР

! ! ! î В Bp H к

в.

pT-51.1

Bg R pBR322-5'

Be

pG-CMENSl

Bg

pTBEV-5'

pG-2a2b3 pBR322-34a î * 4 * H SX с

H

pGEM3-S*

j t

h k

pGEM3-3'

pTBEV-3'

P

Рис.3. Конструирование полноразмерной ДНК-копии генома ВКЭ.

A. Расположение клонированных фрагментов кДНК вдоль генома. plO, р4, pGEMI09 и т.п. - рекомбинантные плазм иды, содержащие клонированные фрагменты кДНК ВКЭ; ПЦР - фрагменты кДНК 5'- и 3'- концевых участков генома ВКЭ, полученные при помоши ПЦР.

B. Основные промежуточные этапы клонирования. Сокращенные обозначения сайтов рестрикции: В - BamHI, Bs - Belli, Bel - Ball, Bp -BpuUI, С - Clal, H - HindIII, К - Kpnl, N - Ncol, P -~PstI, R - EcoRI, S -Sali, Sc - SacI, Sp - SphI, X - Xhol.

ДНК-копии генома ВКЭ осуществляли в модифицированном векторе рВЯ322, по Рзи-саиту которого были введены два синтетических дезоксирибоолигонуклеотида (рис.4), содержащих последовательность промотора ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага БР6, первых 22 н.о. вирусного генома, включая сайт для эндонуклеазы рестрикции БрМ, и по.тилинкера с уникальными сайтами рестрикции ВиШ, ХЬо1, С1а1 и Крп1.

-> старт транскрипции

5' pAGCGGCCGCATTTAGGTGACACTATAGAGATTTTCTTGCACGTGCATGC

ACGTTCGCCGGCGTAAATCCACTGTGATATCTCTAAAAGAACGTGCACGTACG NotI SP6 промотор SphI

Xhof Kpnl

AGATCTCTCGAGATCGATGGTACCTGCA TCTAQAGAGCTCTAGCTACCATGGp 5' BgÜI dal

Рис.4. Структура олигонуклеогидов, использованных для

модификации pBR322.

Стрелка указывает точку инициации транскрипции, штриховыми линиями отмечены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, непрерывной линией - последовательность промотора ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага SP6, жирным шрифтом выделена последовательность, соответствующая 5'-концу РНК ВКЭ.

В результате была сконструирована стабильная рекомбинантная плазмида pS-TBEVS*, содержащая полноразмерную кДНК ВКЭ и участки, необходимые для синтеза вирусной РНК in vitro (рис. 5).

ВзтН! (8937) , Belli (9600) EcoRl (""-"' EcoRI (8 Pstl (825'

KpnH 10758V Pstl 3609

EcoRl 4361 _BarattL37i_

Pstl (6S76)

Pstl (6808) 4

Bgllt (6330) . Xhol (5700) . Pstl (5345) . -

Noil!-PiXl 3609

f старт транскрипции

. Mlul (206)

Pstl (1977)

, Bglll (771)

'' EcoRI (1913)

BamHl (1982) /

Рис.5. Рекомбинантная плазмияа pTBEV-S* , содержащая

полноразмерную ДНК-копию генома ВКЭ.

Сбоку отмечены некоторые сайты рестрикции, присутствующие в структуре плазмиды. Цифры в скобках указывают положение соответствующего сайта в геноме ВКЭ, цифры без скобок - положение сайта в векторе. Курсивом выделены сайты рестрикции, фланкирующие последовательность вирусной кДНК.

3. Синтез полноразмерной РНК ВКЭ in vitro.

Плазмида pS-TBEVS* была использована как матрица для синтеза вирусной РНК в системе транскрипции in vitro. Следует отметить, что выбранная нами последовательность SP6 промотора не была оптимальной для эффективной транскрипции РНК. Известно, что сильные промоторы фаговых ДНК-зависимых РНК-полимераз, с

которых осуществляется высокоэффективный синтез РНК. располагаются в области от -17 до И и.о. относительно сайта инициации транскрипции. РНК, синтезированная с такого промотора, имеет на своем 5'-конце дополнительные нуклеотидные остатки, которые могут нежелательным образом отразиться на формировании 5'-концевой вторичной структуры вирусной РНК. Поэтому при конструировании матрицы зля транскрипции РНК ВКЭ ш viiro мы использовали укороченный промотор SP6 полимеразы, содержащий только один дополнительный нуклеотидный остаток (инициирующий остаток GTP) после сайта инициации транскрипции.

При синтезе РНК с использованием немеченых риботрифос-фатов с последующим электрофоретическим разделением и окрашиванием продуктов транскрипции в растворе бримистого этидпя нам не удалось обнаружить заметных количеств РНК. Это можно объяснить либо низким уровнем транскрипции, что вполне вероятно из-за использования укороченного промотора РНК-полимеразы, либо терминацией транскрипции на ранней стадии (абортивный синтез), которая может быть обусловлена наличием на 5'-конпе РНК ВКЭ AU-богатого участка. Для проверки предположения о преждевременной терминации транскрипции мы проводили синтез РНК с использованием радиоактивно меченого субстрата - [a3:P]-GTP. Продукты транскрипции после электрофоретического разделения выявляли радиоавтографией (рис.6). На радиоавтографах обнаруживалась одна радиоактивно меченая полоса, которая по подвижности в геле соответствовала полноразмерной РНК ВКЭ; коротких транскриптов, которые могли бы соответствовать продуктам абортивного синтеза, выявлено не было. Интересно отметить, что синтез высокомолекулярной РНК с полноразмерной ДНК-копии

генома ВКЭ наблюдался как при использовании гомологичной введенному промотору РНК-полимеразы фага БР6, так и гетерологичной РНК-полимеразы фага Т7 (рис.6, дорожки 2, 3).

1 2 3

"""" <- старт

Рис.6. Радиоавтограмма продуктов транскрипции in vitro.

Дорожка 1 - транскрипция при помощи РНК-полимеразы фага Т7 с контрольной матрицы pGEMl, линеаризованной по Pvul-cafrry. Дорожки 2 и 3 - синтез РНК с матрицы pS-TBEVS* РНК-полимеразой фага Т7 и фага SP6 соответственно. Слева указана длина транскрипта.

По включению [a32P]-GTP в ТХУ-нерастворимую фракцию была определена эффективность транскрипции РНК с плазмиды pS-TBEVS* при использовании РНК-полимераз бактериофагов SP6 и Т7. Уровень транскрипции для обоих ферментов был приблизительно одинаков и

составил (1-5)х[0": пкмоль РНК-транскрипта на 1 пкмоль ДНК-матрицы,

Считается, что РНК-полимераза бактериофага Т7 обладает высокой избирательностью в отношении матриц и для синтеза РНК использует только те ДНК, в структуре которых присутствуют специфические промоторные последовательности. Однако, если сильные промоторы III класса РНК-полимеразы фага Т7 консервативны в области от -23 до +6 н.о. относительно точки инициации транскрипции, то гомология промоторов II класса на том же участке составляет от 91 до 69%. ДНК-зависимые РНК-полимеразы бактериофагов Т7 и SP6 являются близкородственными ферментами с одинаковыми функциями и близким строением, их промоторы имеют оошие структурные элементы - АТ-богатые участки, облегчающие плавление ДНК в комплексе с ферментом и консенсус, расположенный между -7 и -3 н.о. относительно точки инициации транскрипции. Последовательность промотора РНК-полимеразы фага SP6, использованная при конструировании pS-TBEVS*, имеет прямую гомологию с промоторами II класса Т7 полимеразы до 68%, которая, по-видимому, является достаточной для связывания РНК-полимеразы фага Т7 с гетерологич-ным SP6 промотором.

4. Взаимодействие синтетического транскрипта с клеточными белками.

Синтезированные in vitro радиоактивно меченые РНК-транскрипты были использованы для изучения взаимодействия вирусной РНК с вирусспецифическими и клеточными белками.

Способность вирусной РНК связываться с клеточными факторами была продемонстрирована методом сдвига подвижности РНК в

геле. После инкубации синтетических РНК-транскриптов с лизатами контрольных и инфицированных ВКЭ клеток СПЭВ наблюдалось изменение их подвижности в нативном ПААГ (рис.7). Сдвиг подвижности РНК был одинаков после инкубации с обоими типами клеток, что позволяет сделать предположение о взаимодействии с факторами, присутствующими как в зараженных, так и в контрольных клетках.

12 3 4

Рис.7. Электрофоретическая подвижность РНК ВКЭ в 5% ПААГ.

1 - полноразмерный РНК-транскрипт; 2, 3 и 4 - та же РНК после инкубации с лизатами неинфицированных клеток СПЭВ (2) и клеток, взятых в разные сроки после заражения ВКЭ.

Для идентификации клеточных факторов, взаимодействующих с РНК ВКЭ, установления их природы использовали два метода - метод перекрестного сшивания РНК и белков под действием ультрафиолетового света и РНК-белковый блотшкг. При помощи первого метода

были выявлены два клеточных фактора, присутствующих как в контрольных, так и инфицированных ВКЭ клетках и чувствительных к обработке проназой. Следовательно, клеточные факторы, связывающиеся с РНК ВКЭ, являются белками. Их молекулярные массы составляют 22 и 30 кДа. Однако взаимодействуют ли эти белки с вирусной РНК напрямую или нуждаются для связывания в дополнительных компонентах? Результаты РНК-белкового блоггинга (рис.8) свидетельствуют о способности этих двух клеточных белков взаимодействовать с РНК ВКЭ в изолированном состоянии, так как в условиях данного эксперимента белки сначала были разделены электрофорезом, а уже затем проинкубированы с радиоактивно меченой вирусной РНК.

А В С

и.| 0.« и.!

кДа

46

е>®

— 30

— 21,5

Рис.8. РНК-белковый блотпгаг.

А - связывание клеточных белков с контрольным РНК-транскриптом (рСЕМ1-Р\и1), В - с 5'-концевым участком РНК ВКЭ (206 н.о.), С - с полноразмерной РНК ВКЭ.

и - неинфицированные клетки; [ - инфицированные ВКЭ клетки.

В последние годы продемонстрировано участие клеточных белков в реплнкативном цикле ряда РНК- и ДНК-содержащих вирусов. В некоторых случаях клеточные белки взаимодействуют с определенными участками вирусной РНК, в других - формируют комплекс с вирусспеиифическими белками, необходимый для связывания с вирусной РНК. Для ВКЭ мы выявили клеточные белки, взаимодействующие непосредственно с вирусной РНК. Однако для полной идентифицнкацни этих РНК-связывающих белков, а также для установления их роли в репродукции вируса необходимы дополнительные исследования.

ВЫВОДЫ.

1. Осуществлен синтез и клонирование фрагментов кДНК нскодирующих областей РНК вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) (штамм Софьин) и исслелована их нуклеотидная последовательность. Впервые для вирусов сем. Flaviviridae выявлена гетерогенность по длине и первичной структуре центрального участка З'-нетрансли-руемой области РНК внутри одного штамма вируса. В то же время показано, что концевой участок З'-нетранслируемой области РНК данного штамма консервативен и имеет высокую гомологию (до 91,6%) с соответствующими участками РНК других штаммов ВКЭ.

2. Серией последовательных клонирований фрагментов кДНК ВКЭ впервые сконструирована стабильная рекомбинантная плазмида (pS- TBEVS*), несущая полноразмерную ДНК-копию генома ВКЭ (10758 п.о.). При помощи синтетических дезоксирибоолиго-нуклеотидов в ее структуру введены участки, необходимые для синтеза РНК in vitro: непосредственно перед 5'-концом вирусной кДНК -

промотор ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага SP6 и уникальный сайт рестрикции Kpnl - после З'-конца.

3. Показано, что рекомбинантная плазмида pS-TBEVS* является матрицей для транскрипции полноразмерной РНК ВКЭ in vitro, причем синтез с одинаковой эффективностью может осуществляться не только гомологичной клонированному промотору ДНК-зависимой РНК-полимеразой бактериофага SP6, но и гетерологичной РНК-полимеразой фага Т7, что, по-видимому, обусловлено наличием общих элементов в структуре промоторов этих РНК-пошшераз. Уровень транскрипции для обоих ферментов составляет (1-5)х10-2 гкмоль РНК на 1 пкмоль ДНК- матрицы.

4. С использованием трех различных методов: метода сдвига подвижности РНК в геле, метода перекрестного сшивания РНК с белками и РНК-белкового блоттинга показано, что синтезированная in vitro вирусная РНК непосредственно взаимодействует с двумя клеточными белками. Молекулярные массы клеточных РНК-связывающих белков, определенные по их подвижности в денатурирующем ПААГ, составляют 30 и 22 кДа.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Беляев А.С., Хромых А.А., Малыгин Э.Г., Плетнев А.Г., Матвеев Л.Э., Шевлягина J1.P., Путинцева Н.И., Данилюк Н.К., Вторушина И.А., Синяков А.Н., Приходько Г.Г., Мамаев Л.В., Куличков В.А., Ямщиков В.Ф., Добрикова Е.Ю., Прессман Е.К. Рекомбинантная плазмидная ДНК р28СМЕ, кодирующая синтез полипептидов для получения живой рекомбинантной вакцины против клещевого энцефалита, и способ ее конструирования. Авторское свидетельство № 1490963, 1989 г.

2. Pugachev K.V., Nomokonova N.Yu., Dobrikova E.Yu., Wolf Yu.I. Site-directed mutagenesis of tick-borne encephalitis virus NS3 gene reveals the putative serine protease domain of the NS3 protein. FEBS Lett., 1993, v.328, № 1-2, p. 115-118.

3. Годовикова T.C., Орлова Т.Н., Добрикова Е.Ю., Шаманин В.А., Зарытова В.Ф., Воробьева Н.В., Сердюкова Н.А., Шаманина М.Ю., Петрусева И.О., Пиценко Н.Д. Высокочувствительная нерадиоактивная детекция вируса клещевого энцефалита. Биоорг. химия, 1994, т.20, №11, с. 1196-1205.

4. Добрикова Е.Ю., Плетнев А.Г. Полноразмерная ДНК-копия генома вируса клещевого энцефалита. I. Анализ 5'- и З'-концевых некодируюишх областей генома. Биоорг. химия, 1995, т.21, № 7, с.528-534.

5. Dobrikova E.Yu., Pletnev A.G., Karamvshev V.N., Morozova O.V. T7 DNA-dependent RNA polymerase can transcribe RNA from tick-borne encephalitis virus (TBEV) cDNA with SP6 promoter. FEBS Lett., 1996, v.382, № 3, p.327-329.

6. Морозова О.В., Бахв&това В.Н., Добрикова Е.Ю., Максимова Т.Г. Структура и функции белков репликативного комплекса вируса клещевого энцефалита. Журнал инфекционной патологии, 1996, т.З, № 4, с.44-46.