Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мониторинг структуры популяций вируса клещевого энцефалита в Уральском, Западносибирском и Северо-западном регионах России (вирусологические и молекулярно-биологические исследования)

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Мониторинг структуры популяций вируса клещевого энцефалита в Уральском, Западносибирском и Северо-западном регионах России (вирусологические и молекулярно-биологические исследования)"

Колясннкова Надежда Михайловна

Мониторинг структуры популяций вируса клещевого энцефалита в Уральском, Западносибирском и Северо-западном регионах России

(вирусологические и молекулярно-биологические исследования)

03 00 06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003448871

Колясникова Надежда Михайловна

Мониторинг структуры популяций вируса клещевого энцефалита в Уральском, Западносибирском и Северо-западном регионах России

(вирусологические и молекулярно-биологические исследования)

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им МП Чумакова РАМН.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Погодина Ванда Вацлавовна Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Урываев Леонид Викторович

доктор медицинских наук, профессор Воробьева Майя Сергеевна

Ведущая организация:

Государственное учреждение эпидемиологии и микробиологии РАМН

научно-исследовательский Институт им почетного академика НФ. Гамалеи

Защита состоится «Ж» 2008 г в /Р часов на заседании

диссертационного совета Д 001.026 01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им МП Чумакова РАМН по адресу 142782, Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им М П Чумакова РАМН

Автореферат разослан^ ЛУ СЛМГ^^^?_2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Медведкина О А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Проблема заболеваемости клещевым энцефалитом (КЭ), как и прежде, продолжает оставаться актуальной для здравоохранения Российской Федерации (РФ) и имеет медицинское и социальное значение В структуре общероссийской заболеваемости КЭ наибольший удельный вес приходится на территории Урала, Сибири и Дальнего Востока, где показатели заболеваемости в 2-3 раза превышают общероссийские показатели (2005-2007 гг) (Онищенко Г Г., 2007).

Со времени открытия КЭ наблюдается эволюция инфекции существенное расширение нозоареала, рост заболеваемости, изменение экологической ситуации, антропогенная трансформация природных очагов Изменилась эпидемиология КЭ. из болезни лиц, профессионально связанных с лесом, КЭ стал болезнью преимущественно невакцинированных городских жителей (Злобин В И, 2006, Волкова ЛИ и др, 2004) Как в 40-50-с годы XX века, так и в настоящее время, наряду с трансмиссивным заражением регистрируется и алиментарное - через сырое молоко коз и коров (Дружинина Т А, Погодина В В и др, 2002) За минувшие 20 лет накоплена новая большая информация о широком распространении сочетанных очагов КЭ и других клещевых инфекций, особенно с иксодовыми клещевыми боррелиозами (Коренберг Э И , 2004, Данчинова Г А , 2006, Карань Л С и др, 2006, Козлова ИВ и др, 2006) Связь эволюции КЭ с эволюцией возбудителя крайне мало изучена Молекулярно-эпидем и о логические исследования последних лет показали циркуляцию на территории России трех подтипов ВКЭ дальневосточного, сибирского (урало-сибирского) и европейского (Вотяков В И и др, 2002, Злобин В И и др , 2003, Погодина В В и др, 2004) Дальневосточный подтип доминирует в Приморском (Леонова Г Н, Беликов С .И и др, 2007), Хабаровском краях, на острове Сахалин (Злобин В И и др, 2003), составляет до 50-70% вирусной популяции в республике Бурятия и Читинскои области (Погодина В В и др, 2004, Погодина В В , 2005) Ареал сибирского подтипа чрезвычайно широк', он доминирует на большей части территории страны, включая Центральный, Уральский, Северо-западный регионы, Западную Сибирь, многие районы Иркутской области, Красноярского края (Адельшин Р В и др, 2006, Верхозина М М. и др, 2006, Погодина В.В , 2005) Остается неясным, когда и почему сибирский подтип стал доминантным компонентом природных вирусных популяций

Одним из методов изучения эволюции вирусов является генетический анализ хронологических рядов штаммов (Цилинский Я Я, 1988) Построить хронологические ряды ВКЭ возможно для немногих территорий из-за утраты изолятов, выделенных в начале документированного исторического периода Коллекция штаммов ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им МП Чумакова РАМН позволяет изучать эволюцию популяций ВКЭ в хронологическом и территориальном аспектах

Цель и задачи исследования. Целью работы явилась характеристика современной структуры популяций ВКЭ в Уральском, Западносибирском и Северо-западном регионах России, вирусологическая и генетическая характеристика изолятов РНК и штаммов ВКЭ в хронологическом аспекте

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.

1 Сформировав хронологические ряды штаммов и изолятов РНК ВКЭ как основу для проведения мониторинга вирусных популяций в Уральском, Западносибирском и Северо-западном регионах России на протяжении 30-60-летнего периода

2 Проанализировать изменение эпидемиологической и экологической ситуации в обследуемых регионах в течение документированного исторического периода

3 Провести ретроспективное генотипирование штаммов, изолированных в 40-70-е годы XX века в Свердловской, Кемеровской, Вологодской областях

4 Изучить генетическую структуру современных популяций ВКЭ, распространенных в Свердловской, Курганской, Кемеровской и Вологодской областях

5 Использовать для генотипирования ВКЭ современные методы лабораторной диагностики полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с геногипспецифическими зондами, метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и метод секвенирования

6 Провести секвенирование участков генома ряда штаммов ВКЭ для изучения генетической гетерогенности сибирского подтипа ВКЭ

7 Изучить на лабораторных моделях вирулентность и инвазивные свойства современных штаммов ВКЭ, циркулирующих на изучаемых территориях

8 Для уточнения западной границы ареала сибирского подтипа ВКЭ провести генотипирование дополнительного набора штаммов

Научная новизна Впервые дана характеристика структуры современных популяций ВКЭ, распространенных в различных ландшафтных зонах Свердловской, Курганской, Кемеровской и Вологодской областей

Впервые изучено изменение структуры вирусных популяций КЭ на территории изучаемых областей за 30-60-летний период

Выявлены генетические особенности штаммов ВКЭ сибирского подтипа, распространенных на данных территориях

Впервые описаны «микст-штаммы» ВКЭ, изолированные из клещей, представляющие собой смесь различных подтипов

Изучена вирулентность штаммов ВКЭ, циркулирующих на современном этапе в Уральском и Северо-западном регионах России

Практическая значимость работы. В результате 4-летнего изучения современной структуры популяций ВКЭ в Свердловской области (2003, 2004, 2006, 2007 гг) установлено доминирование сибирского подтипа ВКЭ (94,4 - 100%) Значение этих данных определяется тем, что в Свердловской области проводится кампания массовой вакцинации населения четырьмя вакцинами, приготовленными из штаммов дальневосточного и европейского подтипов, генетически отличных от циркулирующих в природных популяциях ВКЭ Несмотря на генетическое несоответствие между природными популяциями ВКЭ и вакцинными штаммами, массовая вакцинация населения дала высокий эпидемиологический эффект Достигнутый успех вакцинации в

сопоставлении с нашими данными о структуре природных популяций ВКЭ позволяет заключить, что существующие вакцины против КЭ могут быть рекомендованы для использования и в других регионах, где доминирует сибирский подтип ВКЭ (Кемеровская, Курганская, Вологодская и другие области)

Нукле01идные последовательности полноразмерного гена белка Е 10 изолятов РНК и 25 штаммов ВКЭ депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank (http //www nebí nlm mh gov/Gcnßank. № FJ214112, FJ214113, FJ214115, FJ214116, FJ214117, FJ214118, FJ214119, FJ214120, FJ214121, FJ214122, FJ214123, FJ214124, FJ214125, FJ214126, FJ214127, FJ214128, FJ214129, FJ214130, FJ214131, FJ214132, FJ214133, FJ214135, FJ214136, FJ214137, FJ214138, FJ214139, FJ214140, FJ214141, FJ214142, FJ214143, FJ214149, FJ214150, FJ2I4I51, FJ214152, FJ214153) Основные положения, выносимые на защиту.

1 Впервые проведен мониторинг структуры популяций ВКЭ на основе генотипирования хронологических рядов штаммов и изолятов РНК ВКЭ

2 На территориях Свердловской, Курганской, Кемеровской и Вологодской областей на современном этапе циркулирует преимущественно сибирский подтип ВКЭ (94,4 - 100% вирусной популяции)

3 В Свердловской и Кемеровской областях отмечено преобразование вирусных популяций с общей тенденцией - заменой дальневосточного подтипа сибирским подтипом ВКЭ за 50-60-летний период

4 Выявлены генетические особенности сибирского подтипа ВКЭ, распространенного в Вологодской области

5 Современные штаммы ВКЭ, изолированные в Уральском и Северозападном регионах России из клещей / persulcatus, характеризуются высокой вирулентностью и нейроинвазивностью в экспериментах на белых мышах В опытах на сирийских хомяках штаммы сибирского подтипа вызывают замедленное развитие патологического процесса Штаммы дальневосточного подтипа индуцируют быстрое развитие заболевания и гибель 100% зараженных животных.

6 Политиповые или «микст-штаммы» ВКЭ, изолированные из клещей I persulcatus, имеют генетические структуры сибирского и дальневосточного подтипов ВКЭ, что подтверждено методами ПЦР и ПДРФ

Апробация работы Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научной конференции «Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита (к 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита) (Москва, 2007), расширенном заседании ученого совета ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им М П Чумакова РАМН, проблемной комиссии «Клещевой и другие вирусные энцефалиты» совместно с Федеральным государственным унитарным предприятием «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им М П Чумакова» РАМН (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006 Совершенствование иммунологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006)

Апробация диссертационной работы состоялась 10 Об 2008 г. на заседании межлабораторного ученого совета ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 9 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и указателя литературы, состоящего из 166 работ отечественных и 82 работ зарубежных авторов Диссертация изложена на 216 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 таблицами и 21 рисунком

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. Для решения поставленных задач в диссертационной работе использован комплекс эпидемиологических, вирусологических, молекулярно-биологических и статистических методов исследования

Анализ эпидемиологической ситуации на территории Уральского (Свердловская, Курганская области), Западносибирского (Кемеровская область) и Северо-западного (Вологодская область) регионов России проведен на основании данных официальной регистрации заболеваемости КЭ и по данным ФГУЗ Центров гигиены и эпидемиологии изучаемых областей

Основой характеристики современных популяций ВКЭ послужил полевой материал - клещи вида I persiilcatus, собранный на территориях различных ландшафтных зон исследуемых областей в эпидемические сезоны в 2003-2007 гг в Свердловской области, в 2005 г в Кемеровской области, в 2006-2007 гг в Вологодской области и в 2007 г в Курганской области, с изоляцией РНК и штаммов ВКЭ из этих клещей Для изучения хронологического аспекта в работе использована обширная коллекция штаммов ВКЭ, изолированных в различных ландшафтных зонах исследуемых областей в течение 30-60 лет, созданная в ГУ ИПВЭ им МП Чумакова РАМН Изоляция современных штаммов ВКЭ, изучение их вирулентности и культуральных характеристик проводились в лаборатории клещевого энцефалита и других вирусных энцефалитов ГУ ИПВЭ им М П. Чумакова РАМН

Суспензии клешей готовили преимущественно из индивидуальных экземпляров клещей, а также из пулов по 10 особей и суспендировали в 1 мл среды 199 на растворе Эрла

В исследованиях использовали 2 вида животных рандомбрендных белых мышей массой 5-7 г и сирийских хомяков. Мышей заражали в мозг по 0,03 мл, под кожу по 0,25 мл инокулята Животных, зараженных интрацеребрально, наблюдали в течение 14 дней, зараженных экстраневрально - 21 день. Нейровирулентность штаммов оценивали путем интрацеребрального титрования вируссодержащей суспензии. В опытах титрования на мышах и культуре ткани СПЭВ по цитопатическому действию титры вируса определяли по методу полных кумулятивов Рида и Менча и выражали в lg ЛД50/мл и lg ТЦД50/мл

Инвозивныс свойства вируса оценивали по относительному показателю, так называемому индексу иивазивности (ИИ), представляющему разницу титров вируса при церебральном и подкожном заражении мышей, выраженную в ^ ЛД50/мл Значение ИИ в пределах 1-2,5 свидетельствовало о высоких инвазивных свойствах штамма, способности преодолевать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), достигать центральной нервной системы (ЦНС) и размножаться в пей Значение ИИ более 3 указывало на сниженную инвазивную активность штамма

Изучение нейровирулентности на 2-3-недельных сирийских хомяках проводили путем введения животным в мозг по 0,05 мл инокулята Заражение сирийских хомяков массивной дозой вируса (105 ЛД50/мл) позволяло дифференцировать штаммы на высоко-, умеренно- и слабовирулентные для данного вида животных Критериями служили процент гибели животных и средняя продолжительность жизни (СПЖ)

Молекулярно-генетические исследования проводились на базе Научно-производственной лаборатории по разработке и производству препаратов для диагностики инфекционных заболеваний человека и животных ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора РФ (под руководством Л С Карань) Для детекции ВКЭ и генотипирования штаммов и изолятов из клещей использовали разработанные Л С Карань 3 метода генотипирования ВКЭ секвенирование всего гена белка Е или его фрагмента длиной 211 нуклеотидных оснований, содержащего маркерную аминокислоту в 206-й позиции, уникальную для каждого генотипа, анализ ПДРФ и ОТ-ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с генотипспецифическими зондами Всего на наличие РНК ВКЭ были исследованы 2942 клеща I регьикаШь, собранные в природе (табл 1) Генотипировано 137 штаммов ВКЭ, выделенных за период 1940-2007 гг и 124 изотята РНК ВКЭ (полевой материал 2003-2007 гг)

Таблица 1 Количество обследованных клещей, собранных на территории изучаемых областей за период 2003-2007 гг.

Область Год сбора Количество обследованных клешей / регяикайм

Свердловская 2003 г. 232

область 2004 г. 413

2006 г. 409

2007 г. 139

Курганская область 2007 г. 162

Кемеровская 2005 г. 960

область

Вологодская 2006 г. 160

область 2007 г 467

Всего 2942

Для подготовки пробы к ПЦР использовали различные методики в зависимости от типа исследуемого материала Выдетение РНК вируса из суспензии гомогенизированного клеща осуществляли набором реагентов

«РИБО-преп»; выделение РНК из 10% мозговой суспензии проводили набором реагентов «РИБОЗОЛЬ-В», обратную транскрипцию - набором реагентов «PEBEPTA-L-ЮО» производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ (г Москва) В работе для детекции кДНК ВКЭ и определения генотипа применяли вариант ПЦР в режиме реального времени (Real-Time PCR), где мишенью для праймеров и зондов является участок NS1 гена Начиная с 2007 г РНК ВКЭ детектировали в одноступенчатой (реверсия и ПЦР в одной пробирке) ОТ-ПЦР в режиме реального времени с праймерами и зондами, комплементарными С гену

Расшифровку нуклеотидных последовательностей полученных ПЦР-продуктов проводили на автоматическом секвенаторе «АВ1 Prism DNA Sequncer 3100» (Applied Biosystems, США) с набором реактивов ABI Prism Big Dye Terminator Kit v 1 1 » Полученные нуклеотидные и аминокислотные последовательности анализировали с помощью программы Mega 3 1 Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей анализируемых нами штаммов и изолятов РНК с другими нуклеотидными последовательностями РНК разных изолятов ВКЭ, имеющимися в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank, NCBI, осуществляли с помощью программы ClustalX 1.8 Анализ уровня генетического родства и построение филогенетических деревьев проводили в программе Mega 3 1 методом neighbor-joining (объединения ближайших соседей), попарные расстояния между нуклеотидными последовательностями вычислялись по двупараметрической модели Kimura-2-parameter с числом бутстрепинга 1000, или методом UPGMA с применением алгоритма пропорциональных расстояний, модель p-distance

Для проведения анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ) в ПЦР использовали праймеры, комплементарные области Е гена ВКЭ. Полученный ампликон 205 нуклеотидных пар (нп) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Asu2CI, Bst4CI, Hmfl, в результате получали набор последовательностей ДНК различной длины для каждого генотипа Таким образом, генотипирующими рестриктазами явились для дальневосточного генотипа - Asu2CI, для сибирского - Hinil, для европейского - Bst4CI (Карань Л С и др , 2006, Карань Л С и др, 2007)

Полученные результаты обрабатывались общепринятыми методами вариационной статистики Для оценки достоверности различий между сравниваемыми величинами использовали Т-распределение Стьюдента (Анджапаридзе О Г. и др ,1962, Ашмарин И П и др, 1962; Ворошилова М К и др, 1964)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Мониторинг структуры популяций вируса клещевого энцефалита в Свердловской области. Свердловская область является напряженным природным очагом КЭ с постоянно регистрируемой заболеваемостью и относится к числу высокоэндемичных территорий по КЭ Область располагается на территории 2 географических зон лесной и лесостепной, которые включают подзоны (согласно схеме ландшафтно-растительного

районирования области, предложенной Б.К. Колесниковым, 1969г.). В пределах этих подзон располагаются районы Свердловской области (рис. 1).

Лесная зона А - подзона Северной тайги Б - подзона Средней равнинной тайги

В - подзона Южной равнинной тайги

Г - подзона Южной предгорной таиги

Д - подзона Южной горной тангн Е - подзона Сосново-березовых лесов

Ж - подзона смешанных лесов

Лесостепная зона 3 - подзона лесостепи Зауралья И - подзона лесостепи Предуралья

Рис. ]. Ландшафтно-растительное районирование Свердловской области (по Б.К. Колесникову)

Структура современных популяций ВКЭ, распространенных в различных ландшафтных зонах Свердловской области была изучена нами в течение 2003, 2004. 2006 и 2007 гг. (табл. 2). Исследованы 1193 клеща вида /. репикат, собранные на территории подзон южной предгорной и равнинной тайги, южной горной тайги, сосново-березовых лесов и лесостепи Зауралья. По результатам исследования уровень зараженности клещей вирусом составил по области в сезон 2003 г. - 4,3+1,3%, в 2004 г. - 5,08+1,08%, в сезон 2006 г. -3,6+0,9% и в 2007 г. - 9,35+2,5%. Большая часть инфицированных клещей была локализована в подзоне южной предгорной и равнинной тайги (9.0+3,5% -

2003 г.; 8,3+2,3% - 2006 г.) и в подзоне сосново-березовых лесов (12,6+3,7% -

2004 г.; 27,2+7,7% - 2007 г.).

Таблица 2. Структура популяций ВКЭ по результатам обследования

Год Исследовано клещей Число биопроб, положительных в ПЦР Генотипировано изолятов РНК Выделено штаммов

Абс. %+ш число подтип ВКЭ число подтип ВКЭ

2003 232 10 4,3+1,3 10 сибирский 3* дальневосточный

2004 413 21 5,08+1,08 18 сибирский 0 -

2006 409 15 3,6^0,9 15 сибирский 3 сибирский

2007 139 13 9,35+2,5 5 сибирский 0 -

Всего 1193 59 4,9+0,6 48 сибирский 6 сибирский-З дальневосточный-3

* - штаммы были выделены из суспензий клещей, в которых по результатам генотипирования детектирована РНК ВКЭ сибирског о генотипа

При генотипировании образцов ВКЭ (изоляты РНК, выделенные из суспензий клещей и штаммы ВКЭ, полученные из этих же суспензий клещей) на территории Свердловской области установлено доминирование сибирского генотипа ВКЭ, что в структуре региональных популяций ВКЭ составляет 94,4+3,1%. В вирусной популяции присутствуют также штаммы дальневосточного подтипа (5,5+3,1%) (три штамма, выделенные из суспензий клещей в 2003 г.) (табл. 2). В целом проведенное генотипирование свидетельствует о распространении, стабильной циркуляции и доминировании на современном этапе сибирского подтипа ВКЭ в Свердловской области.

Выявить изменение структуры популяций ВКЭ можно лишь при генотипировании хронологических рядов штаммов. При оценке доли каждого генотипа в структуре популяции ВКЭ без учета конкретного времени изоляции получается искаженная картина. Нами на основе ретроспективного генотипирования коллекционных штаммов, выделенных в 3 периода, отличающихся по эпидемиологической ситуации, была изучена структура вирусной популяции в хронологическом аспекте. Это позволило выявить изменение структуры популяций ВКЭ на территории Свердловской области.

На Урале в 40-е годы XX в. группа ученых во главе с М.П. Чумаковым, впервые изолировала штаммы ВКЭ из клещей, от больных и погибших людей (территория подзон средней предгорной тайги, южной предгорной тайги и южной горной тайги Свердловской области). Генотипирование этих штаммов показало доминирование (21 из 22 штаммов (95,5+4,4%)) дальневосточного генотипа. На циркуляцию сибирского подтипа указывает обнаружение единственного штамма, выделенного из /. рег$и1саш в 1945 году (штамм /х реп — 45), в составе которого выявлены генетические структуры сибирского и дальневосточного подтипов. Следует отметить, что в первые годы изучения инфекции регистрировались в основном тяжелые формы болезни. В 60-е годы учитываются уже и стертые формы болезни и из 5 изолированных штаммов 3 отнесены к дальневосточному, 2 - к сибирскому подтипу. Штаммы были выделены В.В. Погодиной (1967) в районе Бисерти (подзона южной горной тайги), где уровень зараженности клещей в 60-70-е годы XX века был особенно высок - 30% (Пономарев Д.Н., 1974). Период с 1990 по 1999 г. характеризуется резким ростом заболеваемости с пиками в 1993 и 1996 гг. - 1067 и 1824 больных соответственно (Волкова Л.И. и др., 2004; Федотова Т.Т., 1999). Штаммы этого периода не типировались. На современном этапе (2003-2007 гг.) при исследовании клещей нами показано доминирование сибирского генотипа (94,4 - 100% вирусной популяции) на территории Свердловской области (рис. 2, табл. 3).

54

81 изолят и штамм

90% - —ЁШ 80% • —Ш 70% - — 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

■С

□

-дв

-СНБ - СИБ+ДВ

Рис. 2. Изменение структуры популяций ВКЭ в Свердловской области за 60-летний период

Таблица 3. Изменение структуры популяций ВКЭ в Свердловской __области за 60-летний период_

Год 1ПОЛИШШ ВКЭ (штаммы и РНК) Число гсиотипированпмх образцов Подтип образцов

штаммы РНК из клещей всего дальиевосточнын Лбе (%) сибирский Лбе. (%) микст* Лбе. (%)

1939-1945 22 0 22 21 (95,5%) 0 1 (4,5%)

1959-1960 5 0 5 3 (60%) 2 (40%) 0

2003 3 10 13 3(23,1%) 10 (76,9%) 0

2004 0 18 18 0 18 (100%) 0

2006 3 15 18 0 18 (100%) 0

2007 0 5 5 0 5 (100%) 0

Всего 33 48 81 27 (33,3%) 53 (65,4%) 1(1,2%)

* - микст-штаччы ВКЭ содержат генетические сгруктурц белка Е, специфичные для сибирского и дальневосточного подпшов

Таким образом, за 60 лет произошли кардинальные изменения в структуре популяций ВКЭ дальневосточный подтип, который активно циркулировал в 40-е годы XX века, был замещен сибирским подтипом, занявшим его экологическую нишу В разных ландшафтных подзонах Свердловской области (южная горная тайга, южная предгорная и равнинная гайга, сосново-березовые леса и лесостепь Зауралья) процесс имел общую направленность - расселение сибирского подтипа Полученные данные позвотяют предположить, что переломным этапом в смене подтипа ВКЭ на Среднем Урале явились 60-е годы XX века

Причины смены подтипов ВКЭ могут быть связаны с комплексом экологических факторов, прежде всего с изменением экосистем вследствие антропогенной трансформации естественных ландшафюв Ишенсивная промышленная эксплуатация лесов, разнообразных природных ресурсов и другие виды хозяйственной деятельности и социальной активности привели к формированию производных лесов с новыми растительными группировками (Пономарев ДН, 1974, Хохуткин ИМ и ар, 1998) На урбанизированных территориях появились принципиально новые очаги КЭ, приуроченные к зеленому поясу парково-дачных территорий крупных городов, мало связанные с таежными сообществами

Изучение структуры популяций вируса клещевого энцефалита в Курганской области на современном этапе. Курганская область расположена в лесостепной зоне Южною Зауралья и относится к числу эндемичных территорий по КЭ По данным ФГУЗ РФ в 2006 г из 26 административных территорий Курганской области эндемичными признаны 19, в 2007 г - 20 территорий Основная заболеваемость наблюдается в северо-западных районах - Далматовском, Катайском, Мишкинском, Шадринском, Шатровском, г Шадринск В группу эндемичных территорий вошли восточные районы области, где ранее КЭ официально не регистрировался (Лебяжьевский, Частоозерский, Белозерский) или регистрировались только спорадические случаи КЭ (Каргапольскии район) Эндемичными по КЭ на современном этапе

являются также Кетовский, Куртамышский, Мокроусовский, Сафакулевский, Целинный, Шумихинский, Шучанский, Юргамышский районы и г. Курган.

' HKJ-14/60/23,0%

Рис. 3. Уровень зараженности клешей вида I. репикаШ вирусом КЭ в обследуемых районах

С целью характеристики структуры вирусных популяций КЭ на современном этапе в сезон 2007 г. на территории Курганской области, методом ПЦР нами исследовано 162 экземпляра клещей вида I. регэикаШ, собранных в Щадринском, Каргапояьском и Далматовском районах (рис. 3). По результатам исследования уровень зараженности ВКЭ клещей в обследуемых нами районах в сезон 2007 г. составил 54,9+3,9%. Большая часть инфицированных клещей была локализована на территории Каргапольского района (87,0+4,3%). При гснотипировании образцов (штаммы и изоляты РНК ВКЭ) установлено доминирование сибирского генотипа ВКЭ, что в структуре региональных популяций ВКЭ составляет 100%. Дальневосточный и европейский подтипы, как и «микст-штаммы» обнаружены нами не были. Результаты изоляции РНК ВКЭ методом ПЦР по трем исследованным районам Курганской области суммированы в таблице 4.

Таблица 4. Результаты детекции ВКЭ в клещах I. persulcatus, собранных в Курганской области в 2007 г.

Район ПЦР Изолировано штаммов ВКЭ

Исследовано клещей Выявлена РНК ВКЭ %+ш

Далматовекий 60 14 (23,0+5,4%) 9

Шадринский 41 22 (53,6+7,7%)

К'аргапольский 61 53 (87,0+4,3%)

Всего 162 89 (54,9+3,9%)

В 80-е годы XX века изучение эпидемиологической ситуации, определение уровня зараженности клещей и серотипа выделенных штаммов было проведено тремя экспедициями ИПВЭ АМН СССР (Н.Г. Бочкова, Л.С. Левина). Структура

популяций ВКЭ на территории Курганской области (Шадринский, Далматовский, Катайский и др. районы) в 1983-1990 гг. характеризовалась на основе иммунотипирования в РДПА 11 штаммов ВКЭ. В популяции, изолированной в эти годы из клещей I. репикаШ, доминировал сибирский подтип: 8 из 11 штаммов (72,7%) (Погодина В.В. и др., 2004; Погодина В.В., 2005). Также проводилось изучение структуры популяционного иммунитета среди населения Курганской области (Шадринский, Каргапольский, Притобольский районы) в отношении различных серотипов ВКЭ в РТГА и РН. Среди положительных проб, выявленных в РН, 63% содержали антитела одновременно к штаммам Айна/1448 и Софьин, 8% избирательно нейтрализовали штамм Айна/1448 и 6,5% - штамм Софьин.

Таким образом, установлено изменение структуры популяций ВКЭ в течение 1983-2007 гг. Иммунотипирование штаммов, выделенных в 1983-1990 гг., и изучение в РН иммуноструктуры населения свидетельствовали о циркуляции в области двух подтипов ВКЭ: сибирского и дальневосточного. Генотипирование изолятов РНК и штаммов ВКЭ, выделенных в 2007 г., выявило циркуляцию только сибирского подтипа ВКЭ (табл. 5, рис. 4).

Таблица 5. Изменение структуры популяций ВКЭ в Курганской

области

Метод Год Число Подтип изолятов и штаммов

детекции изоляции иммунотипированных* и

ВКЭ генотипированных изолятов и штаммов

штаммы РНК из клещей всего дальневосточный Абс. (%) сибирский Абе. (%) микст

РДПА 1983 8* 0 8* 1 (12,5%) 7 (87,5%) 0

1990 3* 0 3* 2 (66,7%) 1 (33,3%) 0

ПЦР 2007 9** (4) 46 50** 0 50 (100%) 0

всего 20 46 66 3 (4,5%) 63 (95,5%) 0

** - для 4 из них не генотипирована РНК ВКЭ из клешей

61 изолятов и штаммов

Рис. 4. Изменение структуры

|_-Дв популяций ВКЭ в

- сив Курганской области

I Щ - С'ИБ+ДВ

Мониторинг структуры популяций вируса клещевого энцефалита в Кемеровской области. Кемеровская область является напряженным очагом КЭ и относится к числу высокоэндемичных территорий по КЭ. По данным ФГУЗ Центра гигиены и эпидемиологии РФ за 2005-2007 гг. вся территория

Кемеровской области признана эндемичной по КЭ (все 38 административных территорий).

Ч, 5 - '/50/2,13% 1/50/2,0%

Рис. 5. Уровень зараженности клещей вида I. рег$и1саШ вирусом КЭ в разных районах Кемеровской области (2005 г.)

вкэг-2/6: с ,г

Генетическая характеристика современных популяций ВКЭ (2005 г.), циркулирующих на территории Кемеровской области, оценивалась с помощью метода ПЦР. Исследованы 960 экземпляров клещей вида I. регзикаШя: 300 индивидуально и 660 особей в виде пулов по 10 экземпляров (табл. 6). Клещи собирались на территории Анжеро-Судженского, Яйского, Юргинского, Мариинского, Кемеровского и Беловского районов. По результатам исследования уровень зараженности клещей вирусом в 2005 г. по области составил 2.08+0,8%. Степень зараженности клещей колебалась от 2% (Анжеро-Судженский, Яйский, Юргинский районы) до 4% (Кемеровский, Мариинский, Беловский районы) (рис. 5). При генотипировании изолятов РНК ВКЭ, выделенных из суспензий клещей, на территории Кемеровской области установлено доминирование сибирского генотипа ВКЭ, что в структуре региональных популяций ВКЭ составляет 100%. Дальневосточный подтип, европейский подтип, как и «микст-штаммы», нами не были обнаружены.

Таблица 6. Результаты обследования имаго клещей, собранных в сезон 2005 года в Кемеровской области

Количество клещей в партии Всего особей /пулов Число изолятов (ПЦР) Генотипирование (подтипы)

сибирский дальневосточный микст

1 особь 300 9 9 0 0

Пулы по ¡0 особей 660 / 66 11 11 0 0

Всего 960 клещей 20 20 0 0

Ретроспективное генотипирование штаммов BIO, изолированных в 1953-1970 гг. из различных районов Кемеровской области показывает общую направленность процесса расселения сибирского подтипа и возможно вытеснения дальневосточного. Структура популяций ВКЭ этого периода характеризуется на основе генотипирования 87 образцов. Показано, что первые вспышки КЭ в 1953-1963 гг. были вызваны дальневосточным и сибирским подтипами. В популяции 1967-1970 гг., изолированной из I. persidcatus, доминировал сибирский подтип: 58 из 62 штаммов (93,6+3,1%). Доминирует сибирский подтип и на современном этапе (табл. 7, рис. 6).

Таблица 7. Изменение структуры популяций ВКЭ в Кемеровской области в течение 1953-2005 гг.

Метод Год Число reno i ¡тированных Подтип изолятов и штаммов

детекции изоляции изолятов и штаммов

ВКЭ штаммы РНК ВКЭ всего дальне восточный сибирский микст

ГЩР 1953-1963 5 0 5 2 (40%) 3 (60%) 0

1967-1970 62 0 62 0 58 (93,6%) 4 (6,4%)

2005 0 20 20 0 20 (100%) 0

Всего 67 20 87 2 (2,3%) 81 (93,1%) 4 (4,6%)

100% 90% 80% 70% 60% 50% ■10% 30% 20% 10% 0%

62

20

87 изолятов и штаммов

-ДВ

- СИ Б

- 01Б+ДВ

Рис. 6. Изменение структуры популяций ВКЭ в Кемеровской области за 50-летний период

Характер эволюционного процесса в популяциях ВКЭ в Кемеровской области сходен с таковым в Свердловской области, однако, с ускоренной динамикой вытеснения дальневосточного подтипа. Уже к концу 60-х - в 70-е годы XX века сибирский подтип стал доминирующим. Причинами эволюционных преобразования популяций ВКЭ могут быть изменения экосистем в результате антропогенного нарушения природных ландшафтов и массивных акарицидных обработок, проводившихся до 1989 г. Разрушающее действие на природный очаг КЭ стойкого акарицида ДДТ показано в работах H.H. Горчаковской. М.П. Чумакова и др. (Горчаковская H.H. и др., 1962; Чумаков М.П. и др., 1968).

Изучение структуры популяций вируса клещевого энцефалита в Вологодской области. Вологодская область является напряженным очагом КЭ и относится к числу высокоэндемичных территорий по КЭ. Изучение современной структуры природных популяций ВКЭ в Вологодской области проводилось нами в сезоны 2006-2007 гг. В целом было исследовано 627

клещей вида /. реми/са/к.?, собранных на территории 8 районов: Грязовецком, Череповецком, Кириловском, Сокольском, Великоустюгском, Устюженском, Вологодском и Вытегорском (рис. 7). По результатам исследования уровень зараженности клещей вирусом по области составил в сезон 2006 г. - 1,9+1,07%, в 2007 г. - 1,5+0,5%. Все инфицированные клещи в 2006 г. были локализованы в Вытегорском районе (6,4+3,5%), в 2007 г. - в Вологодском районе (1,5+0,5%). При генотипировании образцов ВКЭ (изоляты РНК, выделенные из суспензий клещей и штаммы ВКЭ, полученные из этих же суспензий клещей) на территории Вологодской области установлено доминирование сибирского генотипа ВКЭ, что в структуре региональных популяций ВКЭ составляет 100%. Дальневосточный и европейский подтипы, как и «микст-штаммы» нами обнаружены не были.

Рис. 7. Обследованные районы Вологодской области в 2006-2007 гг.

*L

¿Ш? к т

ЧУяже

\

Нами изучены ретроспективно 6 штаммов ВКЭ, выделенных в 1974-1975 гг. из клещей вида /. persiilcatus и /. ricinus на территории Вологодской области (Харовский и Вытегорский стационары), которые были генотипированы тремя методами: ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с генотипспецифическими зондами, ПДРФ и секвенированием. Результаты исследований показали, что все штаммы относятся к сибирскому подтипу ВКЭ.

Таким образом, результаты наших исследований показали, что на территориях изучаемых областей (Свердловская, Курганская, Кемеровская, Вологодская) на современном этапе активно циркулирует сибирский подтип ВКЭ. Почему именно сибирский подтип стал доминантным, какими селективными преимуществами он обладает, какие события на популяционном уровне обусловили смену подтипов - все эти вопросы требуют дальнейшего целенаправленного изучения.

Генетическая гетерогенность ВКЭ топоварнлнты и природные мутанты сибирского подтипа ВКЭ. С помощью метода секвенирования нами были получены новые данные о генетической гетерогенности сибирского подтипа ВКЭ выявлены его топоварианты и природные мутанты

Известно, что сибирский подтип неоднороден и образует 2 топоварианта (азиатский и европейский) в зависимости от маркерных аминокислот в позициях 175 и 234 белка Е и нуклеотидных замен (Карань Л С. и др, 2007) Азиатский топовариаш ткже в своем составе имеет 2 группы с прототипными штаммами Васильченко и Заусаев

Пять генотипированных нами изолятов сибирского подтипа, выделенных в 2006 г из ктещей в Свердловской области, были ссквенированы по полной последовательности Е гена Все изоляты содержали в позиции 234 аминокислоту гистидин (Н), однако на дендрофамме, построенной на основе полученных последовательностей, они вошли в два различных кластера -азиатский (4 изолята) и европейский кластер - 1 изолят (рис 8) Гаким образом, штаммы сибирского подтипа, циркулирующие на современном этапе на Среднем Урале, представляют собой переходную ipynny между азиатской и европейской популяциями доминирующего сибирского подтипа

В ходе исследования были определены нуклеотидные последовательности полноразмерного гена белка обо точки Е 8 курганских штаммов ВКЭ сибирского генотипа, изолированных в 2007 г из суспензий клещей Анализ филогенетического дерева, построенного на основе определенных нами последовательностей показал, что штаммы К-264, К-269, К-272, К-273 относятся к европейскому топоварианту, а штаммы К-279, К-371, К-316, К-280

- к азиатскому (рис 8), что также подтверждает теорию о промежуточном положении Урала для двух топовариантов сибирского генотипа.

Ранее Л С Караьь и В В Погодиной были секвенированы кемеровские штаммы (К-34, К-25), выделенные в 1967 г из крови больных, которые по результатам генотипирования были отнесены к сибирскому генотипу ВКЭ Оба штамма вошли в азиатский кластер ВКЭ сибирского подтипа В этот кластер по результатам секвенирования вошел изолят РНК ВКЭ (8-11), выделенный в 2005 г а Кемеровской области из клещевой суспензии (рис 8)

Определение нуклеотидной последовательности полноразмерного гена и фрагмента гена белка оболочки Е 10 вологодских штаммов и изолятов РНК ВКЭ выявило их особенности

1) По данным секвенирования полной последовательности Е гена и участка Е гена длиной 211 но, шесть штаммов и три изолята РНК ВКЭ отнесены к европейскому топоварианту, один штамм - к азиатскому (рис 8) Европейский топовариант имеет устойчивый аминокислотный маркер в позиции 175 белка Е

- аспарагин Он присутствует у 8 вологодских штаммов и изолятов РНК ВКЭ, а также у прибалтийских и всех финских штаммов, выделенных на архипелаге Коккола, ярославских штаммов, у штамма Волхов-2, наиболее раннего штамма сибирского генотипа, изолированного в 1943 г из клеща / nanus в Ленинградской области

2) Особенностью вологодских штаммов является наличие устойчивых уникальных мутаций в геноме, сохраняющихся в течение 30 лет Один штамм и

три изолята РНК ВКЭ имели в позиции 234 белка Е тирозин (Y) вместо гистидина (Н) или глутамина (Q), что отличает эти штаммы от всех известных представителей сибирского подтипа (рис. 9). Мутации выявлены у штаммов, выделенных в 1974-1975 гг. из суспензий клещей /. persulcatus, I. ricinus, и непосредственно при исследовании суспензий клещей I. persulcatus (изоляты РНК), из которых в 2006 г. были выделены 3 штамма.

Таким образом, часть вологодской популяции ВКЭ на протяжении 30-летнего периода ее изучения имеет в своем составе особей со своеобразным геномом.

FJ214128-Kurgan-272-07 - «§• F.1214153-Vo logda-227-06 ❖ FJ21413 l-Kurgan-273-07 FJ214129-Kurgan-269-07 F.)2I4130-Kurgan-264-07 О FJ214144-Ya«-r>slavl-80 AJ415565-Latvin-1-96 # FJ214138-Vologda-911-74 Г DQ4S1295-Kokkola-102 ' DQ4S1296-Kokkol»-118

Ф FJ214142-Volngda-509-75 FJ2l4136-Vologda-365-7S FJ214143-Vologda-3-75

ЕВРОПЕЙСКИМ

'тшоалгилнт1

100! О F.J21414S-Yaroslavl-l 15-01 <> FJ214146-Yaro.s lavi-140-98 F.J214123-Ekatcrinburg-27-l 1-06 DQ393773-Est54 FJ214140-Vologda-14-06 , > FJ214139-Vologda-4-06 99^ Ф FJ21414l-Vologda-15-06 О FJ214 l48-Volkhov-2-43

_, DQ4.46861-EK-328

oöL DQ393774-Est3535 AB049348-IR99-lml AB0493SG-lR99-2m3 О Irkuts k-20-05 О 1392-04-Irkuts k AF09 i 006-Alna L4036 l-Vasilchenko ♦ FJ214134-Kc nie rovo-K34-67

♦ FJ214135- Kerne rovo-8-ll-05 F.I214150-Kurgan-37l-07 .l214137-Vologda-658-7S FJ214151 -Kurgan-316-07 I M 21412 2 - E kii tc rinburg - 3 5-8 - 0 6 ■ф FJ214125-Ekaterinburg-14-5-06 FJ214126-Ekate rinbtirg-37-3-06 AF527415-Za us ae v > F.1214127-Ekareriubi.rg-56-03 FJ2I4124-Ekaterinburg-44-2-06 FJ214149-Kurgaib279-07 FJ214152 -Kuigaib280-07 L'27495-Neudoc rtl - AJB062064-Soijin-H0

Рис. 8. Дендрограмма, построенная по полной последовательности Е-гена различных штаммов ВКЭ сибирского генотипа. Алгоритм Neighbor-Joiп.ing (N1), К1тига-2-рагате1г (ромбами отмечены изоляты РНК и штаммы ВКЭ, изученные в данной работе).

002

175 206 234

#X07755-Sof j in TILTMGDYGD VSLLCRVASG VDLAQTVILE LDKTSEHLPT AHQVHRDWFH DLALFKKHEG AQHHHN

#Ekaterinburg-27-ll-2006 . . .N..............................L...........................H. . .

#v365-Vologda-1975 . . .N..............................L...........................Q...

#V911-Vologda-1974 ...N..............................L...........................H...

#V658-Vologda-1975 ..................................L...........................Y . . .

#V4-Vologda-2006 . . -N..............................L...........................Y. . .

#V15-Volocda-2006 . . .N..............................L...........................Y. . .

#V14-Vologda-2006 . . .N..............................L...........................Y. . .

8AJ41556S-Latvia-l-96 . . -N..............................Ь...........................H. ..

&DQ4S6S61-EK-32S ...N..............................L.....................R.....H...

#DQ393774-Est353b . . .¥..............................L.....................R.....H. . .

#DQ393773-Est54 ...N..............................L...........................l-i...

#DQ451295-Kokkola-102 . - .N..............................L...........................K. ..

#DQ451?96-Kokkola-118 ...H..............................L...........................H...

#DQ45a294-I<okkola-36 . . .N..............................L...........................H. . .

#DQ451293-Kokkola-84 .V.N..............................L...........................H. . .

#DQ4bl292-Kokkola-81 ...Ы..............................L...........................H...

#00451291-Kokkola-79 . . .N..............................L...........................K. . .

#DQ4S1290-Kokkola-39 . . .S..............................L...........................H...

Рис. 9. Анализируемые аминокислоты E белка вологодских образцов ВКЭ

Генетическое типироваине штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных на западной границе ареала сибирского подтипа. Изучение молекулярной эпидемиологии КЭ показало широкое распространение сибирского подтипа на европейской и азиатской территории России (Верхозина ММ и др , 2007, Вотяков В И и др , 2002, Злобин В И и др , 2003, Погодина В В и др, 2004) Результаты наших исследовании выявили тенденцию преобразования популяций ВКЭ в сторону доминирования сибирского подтипа Данный процесс наблюдается в различных ландшафтных зонах, в гом числе на территориях, подвергнутых значительной антропогенной трансформации С целыо уточнения вопроса о западной граиице ареала сибирского подтипа нами было проведено генотипирование дополнительного набора штаммов ВКЭ, выделенных как на заповедных малонарушенных территориях (Польша, Белоруссия - Беловежская Пуща), на островах Адриатического моря, а также в окультуренных лесах (Австрия, ЧССР и др) По результатам наших исследовании сибирский генотип был обнаружен на территории Австрии (клещ I ricinus, 1955 г) и Белоруссии (клещ I ricinus, 1945 г) Рацее Р В Аделылин (2006 г) при исследовании обширной коллекции штаммов ВКЭ показал, что самой западной территорией сибирского подтипа ВКЭ является Босния и Герцеговина Таким образом, установлено, что рядом расположенные территории, Австрия и Босния и Герцеговина (по данным Р В Адельшина), являются самой западной границей, i де обнаружен сибирскии подтип ВКЭ

Оценка степени вируленшосш современных штаммов ВКЭ, выделенных за пределами Дальнего Востока Несмотря на то, что сибирский подтип составляет основную часть популяций ВКЭ на территории России, его вирулентность на современном этапе исследована недостаточно Нами в работе проведено изучение каргины экспериментального КЭ, вызванного генетическими вариантами вируса, изочированными из клещей / persulcatus в течение 2003-2007 гг в Уральском и Северо-западном регионах России На лабораторных моделях (белые мыши и сирийские хомяки) нами изучены 19 штаммов ВКЭ (табл 8)

Так, 3 штамма (Ек-42, Ек-74, Ек-79), выделенные из ктешей, собранных в 2003 г в Свердловской области (подзона южной горной тайги), были типированы как дальневосточный подтип ВКЭ Еще 3 штамма (Ек-27/11, Ек-35/8. Ек-37/3) были выдетены из клещей I persulcatus в 2006 г , собранных в местах, активно посещаемых горожанами (подзона сосново-березовых лесов), типированные как сибирский подтип ВКЭ В Вологодской области (Вытегорский район) в 2006 г из клещевых суспензий было выделено 3 штамма (В-32, В-42, В-43), еще 1 штамм (В-227) изолирован в 2007 г (Вологодский район) По результатам генотипирования штаммы принадлежали к сибирскому генотипу ВКЭ В Курганской области в 2007 г из суспензий клещей было выделено 9 штаммов (Шадринский район - 7 штаммов (К-264, К-265, К-269, К-272, К-273, К-279, К-280)), Каргапольский район - 1 штамм (К-316), Далматовский район - 1 штамм (К-371)) Все штаммы по результатам генотипирования отнесены к сибирскому подтипу ВКЭ

Существенной разницы между титрами при заражении белых мышей в мозг между изученными штаммами не наблюдалось Средний титр составил 9,9+0,1ЛД50/мл

При заражении белых мышей под кожу штаммы дальневосточного подтипа имели титр (1ц ЛД50/мл) 7,1, средний титр штаммов сибирского подтипа составил 8,2+0,1 ^ ЛД50/мл

Показатель ИИ у штаммов дальневосточного подтипа (3,1+0,2) был статистически достоверно выше (Р < 0,001), чем у штаммов сибирского подтипа (1,5+0,3)

Значительная разница отмечена между штаммами изученных подтипов в экспериментах на сирийских хомяках Три штамма дальневосточного подтипа вызывали быструю гибель 100% животных при среднем значении СПЖ 6,2+0,5 дней Все 16 изученных штаммов сибирского подтипа были менее вирулентны для сирийских хомяков гибель - 42,1+2,8% животных при среднем значении СПЖ 21,2+0,7 дней, что статистически достоверно ниже чем у штаммов дальневосточного подтипа

Таблица 8. Особенности вирулентности современных штаммов ВКЭ в опытах на белых мышах и сирийских хомяках

Регион РФ, Штамм Генотип Белые мыши Сирийские хомяки

годы Ig ЛД50/мл, IIII

изоляции ВКЭ заражение

в мозг под % СПЖ в

кожу гибели днях

Свердловская Екатеринбург-42 да 10,5 7,1 3,4 100 5,8

область Екатерпнбу рг-74 дв 9,9 7,1 2,8 100 6,6

2003 Екатсринб) рг-79 да ПИ* НИ * НИ" 100 6,3

Свердловская Екатерпнбу pr-27/l 1 СИБ 9,7 8,1 1,6 33,3 21,8

область Екатеринбург-35/8 СИБ 9,5 8,6 0,9 31,3 24,2

2006 FKaiepnn6ypr-37/3 СПБ 9,0 7,6 1,4 40 27,0

Вологодская Вологда-32 СИБ 10,0 8,1 1,9 33-40 22,4-23,4

область Вологда-42 СИБ >11,0 8,6 >2,4 20-40 22,0

2006,2007 Вологда-43 СИБ 9,7 7,6 2,1 50 19,4

Вологда-227 СИБ 9,5 8,6 0,9 30 21,8

Курганская Курган-264 СПБ 10,0 8,6 1,4 44,4 22,1

обгасть Курган-265 СИБ 10,0 9,1 0,9 55,5 18,1

2007 Kjpian-269 СИБ 10,7 8,6 2,1 62,5 15,6

Курган-272 СИБ НИ * ни- ни- 55,5 18 6

Кургаи-273 СИБ ни* ни* ни* 60,0 17,3

Курган-279 СИБ 9,5 8,4 1,1 33,3 23,7

Курган-280 СИБ 10,0 8,1 1,9 30,0 25,0

Курган-316 СПБ 9,5 7,8 1,7 40,0 21,1

Курган-371 СИБ 9,5 8,6 0,9 60,0 16,9

* - не исследованы

Полученные данные свидетельствуют о неодинаковой степени вирулентности штаммов сибирского подтипа для грызунов разного вида -высокой нейровирулентности и нейроинвазивности для белых мышей и

сниженной вирулентности и замедленном развитии инфекции у сирийских хомяков

Выявление «микст-штаммов» ВКЭ, изолированных из клещей I. persulcatus При изучении многочисленных штаммов ВКЭ, изолированных из клещей I persulcatus, методами ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с генотипспецифическими зондами и ПДРФ нами были выявлены своеобразные «микст-штаммы», имеющие участки генома белков Е и NS1, характерные для сибирского и дальневосточного подтипов ВКЭ Штаммы были изолированы на тех территориях и в тот период, когда одновременно циркулировали два указанных подтипа ВКЭ - в Кемеровской области в 1969 г и в Ярославской области в 1990-1993 гг (Бочкова H Г и др, 1999, Погодина В В , 2005) (табл 9)

Таблица 9 «Микст-штаммы» ВКЭ

Наименование штамма Год и район изоляции Источник изоляции

lx.pers-45 1945 г., Свердловская область Пул имаго клещей / репиквиа

СК-13/12 1969 г, Кемеровская область, Яшкинский район Пул имаго клещей I репикаш

Яр-83 1993 г, Ярославская область, Рыбинский район 1 самка I репи1саШ

Яр-240 1990 г, Ярославская область, Некрасовский район Пул имаго клетей I репикаШя

Штамм Яр-83 был изолирован из одного экземпляра имаго 1 persulcatus, он moi возникнуть как при кровососании клеща или его преимагинальных стадий на позвоночном хозяине, зараженном двумя подтипами ВКЭ, так и при питании различных фаз развития клеща на разных позвоночных хозяевах или путем трансфазовой и трансовариальной передач

Другие «микст-штаммы» были изолированы из пулов переносчиков, которые могли содержать дискретные особи клещей, инфицированных сибирским и дальневосточным подтипами ВКЭ До генотипирования, выявившего наличие геномов двух подтипов, каждый штамм прошел 3-4 пассажа в культуре клеток СПЭВ и на белых мышах, что указывало на относительную стабильность двойной инфекции

На рис 10 и 11 показано типирование на примере «микст-штамма» Яр-83, методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией и методом ПДРФ (выявление генетических структур дальневосточного и сибирского подтипов)

пко-дв

s l0. <5 20 'Л ЗЭ 35 40 <5 : Cyde ¡0

No. Name Туре et

15 Яр-83 проба 35,97

32 k- 'Отрицательный контроль

33 пко-дв Положительный контроль 28,05

34 ПКО-СИБ Положительный контроль

ошз: s ta is 20 И 30 35 <0 45 5 Cyde 3 0

No. Name Type et

15 Яр-83 проба 34,08

32 k- Отрицательный контроль

33 ПКО-ДВ Положительный контроль

34 ПКО-СИБ Положительный контроль 30,71

Рис. 10. Результаты детекции штамма ВКЭ Яр-83 в ПЦР в режиме реального времени с генотнпсиецифическими зондами.

а - считывание сигнала по каналу FAM; б - считывание сигнала по каналу JOE. К- отрицательный контрольный образец; ПКО-ДВ - положительный контрольный образец, кДНК ВКЭ дальневосточного генотипа; ПКО-СИБ - положительный контрольный образец, кДНК ВКЭ сибирского генотипа.

Рис. 11. Результаты дегекции штамма ВКЭ Яр-83 методом анализа ПДРФ.

1 - ампликон после рестрикции НтП (для сибирского генотипа рестрикционные фрагменты 163 и 42 н.п.); 2 - ампликон после рестрикции Ази2С1 (для дальневосточного генотипа рестрикционные фрагменты 126 и 79 н.п.); 3 -ампликон после рестрикции Вз14С1 (для европейского генотипа рестрикционные фрагменты 160 и 45 н.п.); А - необработанный рестриктазами ампликон

С целью характеристики «микст-штаммов» были изучены их свойства на модели штамма 1х. репч-45. На культуре клеток СПЭВ при 4-ом пассаже штамм /х реп-45 вызывал полную деструкцию клеточного монослоя на 7-е сутки. Изучение нейровирулентности и нейроипвазивности на белых мышах и сирийских хомяках показало, что высокий процент гибели животных характерен для дальневосточного подтипа (данный «микст-штамм» вызывал гибель 70% хомяков при СПЖ 20,1 дня), замедленное развитие инфекционного процесса свойственно преимущественно штаммам сибирского подтипа. Данные характеристики указывают на присутствие в составе изученного штамма сибирского и дальневосточного подтипов ВКЭ.

Политиповые или, так называемые, «микст-штаммы» ВКЭ выявлены нами впервые. Следует отметить, что первоначально политиповые штаммы были выявлены в РДПА с моноспецифичными перекрестно истощенными

Нерестрицироваваннзя Нерестрицировавамная часть ампликона часть амлликона

=

сыворотками (Трухина А I , 1989). Дальнейшее их изучен ис позволит уточнить характер взаимодействия и терминологию

Как было показано в диссертационной работе, в Свердловской, Кемеровской, Курганской областях с течением времени из популяции ВКЭ элиминировался дальневосточный подтип, а сибирский подтип ВКЭ становился доминантным

Для понимания механизмов вытеснения дальневосточного подтипа из природных популяций ВКЭ нужно знать конкретные изменения в биоценозах в очагах КЭ тех территорий, где нами отмечена смена подтипов ВКЭ Приблизиться к пониманию этих процессов можно путем изучения смешанных инфекций двух подтипов в различных модельных системах с использованием разных пар штаммов, разных путей и сроков инфицирования, разной множественности инфекции и тд

Выводы

1 Впервые проведен мониторинг популяций ВКЭ на основе изучения хроночогических рядов штаммов, выделенных в европейских и азиатских peí ионах России Генотипировано 137 штаммов и 124 изолята РНК с использованием современных методов лабораторной диагностики ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с генотипспецифическими зондами, рестрикционного анализа и секвенирования

2 Установлено ранее не описанное явление - смена подтипов ВКЭ в региональных популяциях за 50-60-летний период В Свердловской и Кемеровской областях преобразование вирусных популяций характеризовалось общей тенденцией - заменой дальневосточного подтипа сибирским подтипом ВКЭ В Северо-западном регионе РФ (Вологодская область) на протяжении 30-летнего периода в различных ландшафтных зонах выявляются штаммы одного - сибирского подтипа

3 Впервые изучена структура современных популяций ВКЭ, циркулирующих на Среднем Урале, в Южном Зауралье, Западной Сибири и Северо-западном регионе РФ Показано, чго 94,4 - 100% вирусной популяции, переносимой клещами I petsulcalus, составляет сибирский подтип ВКЭ

4 Исследование клещей (по одному в биопробе) методом ПЦР выявило разный уровень зараженности ВКЭ на обследованных территориях В Свердловской области в 2003 - 2007 гг - от 4,3 до 9,35%, в Кемеровской обласги в 2005 г. - 2,08 %, в Вологодской области в сезоны 2006 - 2007 гг. уровень зараженности клещей составил 2,1% Необычайно высокая степень зараженности, достигающая 54,9%, установлена при обследовании в 2007 г клещей в северо-западных районах Курганской области

5 Получены новые данные о генетической гетерогенности сибирского подтипа ВКЭ Проведено секвенирование гена белка Е 35 образцов (штаммы и изоляты РНК ВКЭ) При исследовании вологодских штаммов выявлены ранее не описанные мутации - наличие аминокислоты тирозин в

позиции 234 белка Ь вместо глутамина или гистидина, как у других штаммов сибирского подтипа Данная мутация является устойчивой, сохраняется в популяции на протяжении 30 лет, не связана с источником изоляции штамма - клещи I ricinus и I persulcatus

6 Современные штаммы ВКЭ, изолированные в Уральском и Северозападном регионах России из клещей I persulcatus, характеризуются высокой вирулентностью и кейроинвазивностью в экспериментах на белых мышах Особенностью штаммов дальневосточного подтипа является высокая вирулентность и быстрая гибель 100% животных. Сибирский подтип менее вирулентен для сирийских хомяков, вызывает замедленное развитие патологического процесса

7 Впервые выявлены «микст-штаммы» ВКЭ, сочетающие генетические структуры дальневосточного и сибирского подтипов (участки генов Е и NS1) «Микст-штаммы» выделены из единичных экземпляров и пулов клещей I persulcatus на тех территориях и в тот период, когда одновременно циркулировали сибирский и дальневосточный подтипы ВКЭ (Свердловская область 1945 г, Кемеровская область 1960-1970 гг, Ярославская область 1990-1993 гг )

Список работ, опубликованных, по теме диссертации

1 Маленко Г В , Погодина В.В , Карань Л С, Колясникова Н.М., Булгакова Т А , Гамова Е Г, Левина Л С, Соколов В M , Шейдерова И Д , Минаков Е С , Платонов А Е Мониторинг популяций ВКЭ в Кемеровской области и особенности современной эпидситуации // Медицинская вирусология Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им МП Чумакова РАМН - M, 2006 - Т XXIII - С. 103-109

2 Погодина В В , Романенко В В , Карань Л С., Есюнина M С , Килячина А С , Колясникова Н.М , Булгакова Т А , Гамова Е Г, Левина Л С , Маленко Г В , Бочкова H Г, Пименова Т А Структура популяции ВКЭ в Свердловской области на современном этапе и вопросы вакцинопрофилактики // Медицинская вирусоло1 ия Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им M П. Чумакова РАМН - M, 2006 - Т XXIII - С 110-115

3. Лесникова M В , Лесников И Р , Филоненко И В , Колясникова Н.М., Карань Л С , Маленко Г В , Погодина В В. Особенности клещевого энцефалита на территории Вологодской области // Медицинская вирусология Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им M П Чумакова РАМН - M, 2007 - Т XXIV - С 53-58

4 Погодина В В., Карань Л С, Колясникова Н.М., Левина Л С , Маленко Г В, Гамова Е Г., Лесникова M В , Килячина А С, Есюнина M С., Бочкова H Г, Шопенская Т А, Фролова Т В , Андаев Е И , Трухина А Г Эволюция клещевого энцефалита и проблема эволюции возбудителя Н Вопросы вирусологии - M, 2007 - №5 - С 16-21

5 Карань Л С, Маленко Г В , Бочкова H Г, Левина Л.С, Пиванова Г П , Колясникова Н.М. и др Применение молекулярно-генетических методов

для изучения структуры штаммов вируса клещевого энцефалита // Бюлл СО РАМН -Новосибирск, 2007.-№4 - С 34-40

6 Погодина В В , Левина Л С , Бочкова II Г, Маленко Г В , Колясннкова Н.М., Гамова Е Г Решенные и нерешенные проблемы профилактики клещевого энцефалита//Дезинфекц дело -М,2007 - №1 - С 42-45

7 Карань Л С , Шопенская Т А , Платонов А Е , Погодина В В , Бочкова Н Г , Маленко Г В , Левина Л С, Колясннкова Н.М. и др Молекулярные методы в алгоритме мониторинга очагов клещевых трансмиссивных инфекций // Молекулярная диагностика - 2007 Сборник трудов б-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием -М,2007 - Т II - С 316-317

Результаты работы изложены в тезисах следующих конференций:

1 Колясннкова Н.М., Карань Л С Лесникова М В , Левина Л С , Погодина В В Своеобразие штаммов вирусов клещевого энцефалита, изолированных в Вологодской области па протяжении 30-летнею периода // тезисы докладов // Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита - М , 2007 - С 64-65

2 Колясннкова Н.М., Карань Л С , Левина Л С , Гамова Е Г , Погодина В В Генетическая и вирусологическая характеристика современных штаммов вируса клещевого энцефалита в Свердловской области и вопросы вакцинопрофилакгики // тезисы докладов // Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита - М, 2007 - С 66-67

3 Карань Л С , Шопенская Т А , Колясннкова Н М., Гамова Е Г, Маленко Г В , Левина Л С , Бочкова Н Г , Погодина В В Изучение возбудителей клещевых инфекций в сочетанных очагах в Северо-западном, Приволжском, Уральском и Сибирском регионах РФ // тезисы докладов // Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита - М , 2007 - С 54-55

4 Погодина В В , Карань Л С , Колясннкова Н М., Романенко В В , Гамова Е Г, Левина Л С, Маленко Г В , Лесникова М В , Есютина М С , Килячина А С , Бочкова Н Г , Фролова Т В , Платонов А Е Изменение клещевого энцефалита и эволюция популяций возбудителя за 70-летний период // Тезисы юбилейной конференции, посвященной 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита - Владивосток, 2007 -№11 -С 103

5 Погодина В В , Карань Л С , Колясннкова Н М., Булгакова Т А , Гамова Е I , Левина Л С, Маленко Г В , Пименова Т А , Бочкова Н Г , Платонов А Е Структура популяции ВКЭ в Свердловской области в период проведения массовой вакцинопрофилактики заболевания // тезисы докладов // Вакцинология - М , 2006 - С 77

Выражаю огромную благодарность моему научному руководителю доктору медицинских наук, профессору В В Погодиной за постоянное внимание, всестороннюю помощь и полученные знания

Особую признательность выражаю сотрудникам лаборатории клещевого энцефалита и других вирусных энцефалитов ГУ ИПВЭ им М.П Чумакова РАМН ведущим научным сотрудникам - к б н Л.С. Левиной, к б.н Г.В. Маленко, к м н Н Г Бочковой за помощь в сборе и обработке полевого материала, изоляции штаммов ВКЭ и проведении вирусологических исследований

Автор благодарна старшим лаборантам - 3 Н Румянцевой, А И Филатовой, Н Н Трофимовой и М П Романовой за высококвалифицированную научно-техническую помощь в работе

Благодарю руководство ЦНИИЭ за предоставление возможности проведения молекулярно-биологических исследований на базе Научно-производственной лаборатории по разработке и производству препаратов для диагностики инфекционных заболеваний человека и животных ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ За помощь в проведении работы по генотипированию ВКЭ выражаю особую благодарность научному сотруднику Л С Карань и младшему научному сотруднику ТА Шопенской

Данная работа не могла состояться без помощи со стороны сотрудников практических учреждений санитарно-эпидемиологической службы различных регионов страны по Свердловской области - к м н В В Романенко, Т А Пименова, по Кемеровской области - В М Соколов, Е С. Минаков, И Д Шейдерова, но Вологодской области - М В Лесникова, по Курганской области -СМ Скрынник

Глубокую признательность выражаю ученому секретарю Государственного учреждения Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им МП Чумакова РАМН, кандидату биологических наук Медведкиной О А

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Колясникова, Надежда Михайловна

Список условных сокращений.

Введение.

Часть I. Обзор литературы

Глава 1. Генотипы и серотипы вируса клещевого энцефалита и их географическое распространение.

1.1. Современная генетическая классификация флавивирусов и ВКЭ.

1.2. Молекулярная структура и организация генома ВКЭ.

1.3. Серотипы ВКЭ и их дифференциация.

1.4. Генотипы ВКЭ и методы их дифференциации.

1.5. Результаты молекулярно-эпидемиологических исследований КЭ.

Глава 2. Изучение особенностей популяций вируса клещевого энцефалита в условиях антропогенной трансформации природных очагов.

2.1. Основные термины.

2.2. Природные очаги КЭ и их антропогенная трансформация.

2.3. Популяции ВКЭ в условиях преобразования естественных ландшафтов.

Часть II. Собственные исследования

Глава 3. Материалы и методы исследования.

3.1. Штаммы ВКЭ.

3.2. Клещи.

3.3. Тканевые культуры и их заражение.

3.4. Титрование вируса.

3.5. Учет цитопатогенного действия.

3.6. Критерии оценки нейровирулентности штаммов ВКЭ на лабораторных животных.

3.7. Использование молекулярно-биологических методов генотипирования ВКЭ.

3.8. Оценка эпидемиологической ситуации в обследованных регионах.

3.9. Статистическая обработка результатов исследований.

Глава 4. Мониторинг структуры популяций вируса клещевого энцефалита в Свердловской области.

4.1. Эпидемиологическая ситуация по КЭ.

4.2. Ретроспективное генотипирование штаммов ВКЭ, изолированных в 1939-1960 гг.

4.3. Структура современных популяций ВКЭ, распространенных в различных ландшафтных зонах Свердловской области.

4.4. Смена подтипов ВКЭ на Среднем Урале за 60-летний период.

Глава 5. Изучение структуры популяций вируса клещевого энцефалита в Курганской области на современном этапе.

Глава 6. Мониторинг структуры популяций вируса клещевого энцефалита в Кемеровской области.

6.1. Эпидемиологическая ситуация по КЭ.

6.2. Ретроспективное генотипирование штаммов ВКЭ, изолированных в 1953-1970 гг.

6.3. Генетическая характеристика современных популяций ВКЭ, циркулирующих в различных ландшафтных зонах.

6.4. Изменение структуры популяций ВКЭ в Кемеровской области за 50-летний период.•.

Глава 7. Изучение структуры популяций вируса клещевого энцефалита в Вологодской области.

7.1. Эпидемиологическая ситуация по КЭ.137 •

7.2. Ретроспективное генотипирование штаммов ВКЭ, изолированных в 1974-1975 гг.

7.3. Изучение структуры популяций ВКЭ, циркулирующих в у Вологодской области на современном этапе.

7.4. Изучение генетических особенностей вологодской популяции ВКЭ.

Глава 8. Генотипирование штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных на западной границе ареала сибирского подтипа.

Глава 9. Вирусологическая и генетическая характеристика штаммов вируса клещевого энцефалита.

9.1. Оценка степени вирулентности современных штаммов ВКЭ, выделенных за пределами Дальнего Востока.

9.2. Выявление «микст — штаммов» ВКЭ, изолированных из клещей

I. persiilcatus.

Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мониторинг структуры популяций вируса клещевого энцефалита в Уральском, Западносибирском и Северо-западном регионах России (вирусологические и молекулярно-биологические исследования)"

Проблема заболеваемости клещевым энцефалитом (КЭ), как и прежде, продолжает оставаться актуальной для здравоохранения Российской Федерации (РФ) и имеет медицинское и социальное значение. Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) широко распространен в северной части Евроазиатского континента, где ежегодно регистрируется до 14000 случаев заболевания. Заболеваемость КЭ отмечается более чем в 25 европейских и 7 азиатских странах [30, 176]. Ежегодно случаи КЭ регистрируются в 46-64 субъектах РФ [84, 101, 117]. Согласно данным Федерального государственного учреждения здравоохранения (ФГУЗ) РФ в 2006 году КЭ был зарегистрирован на 49 административных территориях, причем полностью эндемичными по КЭ стали территории 18 субъектов РФ (к числу которых относятся Вологодская, Свердловская, Кемеровская области). На 39 административных территориях субъектов РФ КЭ зарегистрирован не был' [118]. В 2007 г. КЭ был зарегистрирован на 48 административных территориях РФ, средний уровень заболеваемости составил 1,77 на 100 тыс. населения [116].

В структуре общероссийской заболеваемости КЭ наибольший удельный вес приходится на территории Урала, Сибири и Дальнего Востока. В 1990-х годах заболеваемость КЭ в РФ достигла самых высоких показателей (6,97 на 100 тыс. населения). Наиболее неблагополучными регионами стали: Урал -42,2 % от всей заболеваемости КЭ в России, Западная и Восточная Сибирь -32,2% и 17,4% соответственно с показателями заболеваемости от 21,0 до 73,7 на 100 тыс. населения [24, 51].

По материалам многих исследователей, эпидемиология современного КЭ отличается рядом новых особенностей по сравнению с классическими представлениями о проявлении инфекции [28, 48]. В последние годы большинство заболевших (до 80%) составляют жители городов, а не лесных» профессий, как это было ранее (по сравнению с пятидесятыми -шестидесятыми годами прошедшего столетия). Заражение людей происходит преимущественно в антропургических очагах, появившихся в большом количестве вблизи городов [36]. Широко развернутое жилищное и дачное строительство в пригородных лесах, массовые выезды горожан за город способствуют увеличению контактов людей с иксодовыми клещами. Высказывается мнение о том, что численность последних растет благодаря природным факторам, таким как потепление климата, а также антропогенным - сведение и захламление лесов, образование многочисленных линейных коммуникаций, где концентрация клещей наивысшая. Во многих эндемичных регионах отмечается тенденция к расширению нозоареала КЭ [80, 101, 107]. За минувшие 20 лет накоплена новая большая информация о широком распространении сочетанных очагов -КЭ и других клещевых инфекций, особенно с иксодовыми клещевыми боррелиозами [38, 67, 79, 80, 84, 110]. (

Особенности современного КЭ меняют существующие представления о рациональных подходах к профилактике этого заболевания. Основным инструментом борьбы с КЭ на современном этапе рекомендована массовая-вакцинопрофилактика населения высокоэндемичных районов [117, 137]. Обязательна разработка программ, адаптированных к условиям различных регионов, экстренную специфическую профилактику следует проводить дифференцированно в отношении различных инфекций на основе результатов лабораторных диагностических экспресс-исследований. Неспецифическая профилактика также не утратила актуальности.

В сложившейся эпидемиологической ситуации чрезвычайно важными являются вопросы, связанные с более ясным пониманием пространственно-генетической структуры вируса в формировании заболеваемости в разных географических районах. Развитие молекулярно-эпидемиологических исследований дает информацию, необходимую для рассмотрения вопросов происхождения, генетического родства и эволюции на уровне геномных структур ВКЭ, таксономии и классификации, а также имеет существенное значение для повышения эффективности диагностики и специфической профилактики заболевания.

Как известно, существуют различия в тяжести заболевания в разных частях ареала ВКЭ. На Дальнем Востоке России число тяжелых очаговых форм достигает 60-70%, летальность - 30-35%, тогда как в западной части ареала преобладают лихорадочные и менингеальные формы с редкими случаями летальных исходов [28, 99]. На Урале и в Сибири КЭ протекает доброкачественнее, чем на Дальнем Востоке и по тяжести занимает промежуточное положение между западным и дальневосточным КЭ [57, 59].

Результаты молекулярно-эпидемиологических исследований последних лет показывают, что на огромном пространстве ареала ВКЭ в России* циркулируют три основных генотипа: дальневосточный (генотип 1), европейский (генотип 2) и сибирский (генотип 3) [129]. Различия (на уровне нуклеотидных и аминокислотных последовательностей) между генотипами весьма существенны и сопоставимы с межвидовыми различиями ряда t вирусов семействаFlaviviridae [1].

Сибирский подтип (обозначаемый также как урало-сибирский) описан лишь в 1980-1981 гг. [124, 232]. Полная генетическая структура сибирского , подтипа расшифрована в 1997 и 2003 гг. [190, 192]. Молекулярно-эпидемиологическими исследованиями установлено доминирование сибирского подтипа на большей части территории России, кроме Дальнего Востока и крайних западных регионов страны [28, 56, 129]. Однако остается неясным, когда сибирский подтип стал доминирующим компонентом вирусных популяций, и какие факторы определили этот процесс?

Исследования по молекулярной эпидемиологии КЭ, показавшие зоны циркуляции различных подтипов ВКЭ, имели географическую направленность и базировались на изучении штаммов, выделенных в определенный отрезок времени. В основополагающих работах В.И. Злобина и соавторов были изучены штаммы периода 1985-1990 гг., показано географическое распространение подтипов ВКЭ [57]. Однако остаются малоизученными популяции ВКЭ, заселяющие Урал, ряд областей Сибири, европейской части РФ. В работах В.В. Погодиной и соавторов представлены результаты генотипирования штаммов, изолированных в Иркутской области в 1960-1982 гг., в Кемеровской области в 1953-1970 гг., в Ярославской области в 1988-2003 гг. [122, 129].

Одним из методов изучения эволюции вирусов является генетический анализ хронологических рядов штаммов [164]. Построить хронологические ряды ВКЭ возможно для немногих территорий из-за утраты изолятов, выделенных в начале документированного исторического периода. Из 30 штаммов, выделенных экспедицией JI.A. Зильбера в 1937 г., до нашего времени дошли 2 - Софьин и Обор-4.

Коллекция штаммов Государственного учреждения Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (ГУ ИПВЭ РАМН) позволяет изучать эволюцию популяций ВКЭ в хронологическом и территориальном аспектах. Настоящая работа представляет новый — хронологический этап в изучении молекулярной I эпидемиологии КЭ, сущность которого состоит в мониторинге региональных популяций ВКЭ на протяжении десятилетий, в течение которых произошла трансформация природных ландшафтов и эволюция инфекции.

Подобные хронологические исследования проведены нами на таких малоизученных территориях как Свердловская, Кемеровская, Вологодская и другие области.

Несмотря на широкое распространение сибирского подтипа, до сих пор остается недостаточно изученной вирулентность современных штаммов этого подтипа. В работе представлены новые результаты исследований по изучению вирулентности штаммов сибирского и дальневосточного подтипов, циркулирующих на современном этапе за пределами Дальнего Востока.

В работе впервые представлены результаты исследований по природным политиповым штаммам ВКЭ («микст-штаммам»).

В данной работе сделана попытка рассмотреть такие вопросы, как:

Является ли новым сибирский подтип ВКЭ, открытый только в 80-е годы XX века?

Изменилась ли структура популяций ВКЭ на эндемичных территориях на протяжении документированного исторического периода, исчисляемого со времени открытия ВКЭ - 1937 г.

Какова вирулентность современных штаммов сибирского и дальневосточного подтипов?

Цель исследования

Характеристика современной структуры популяций ВКЭ в Уральском, Западносибирском и Северо-западном регионах России, вирусологическая и генетическая характеристика изолятов РНК и штаммов ВКЭ в хронологическом аспекте.

Основные задачи

1. Сформировать хронологические ряды штаммов и изолятов РНК ВКЭ как основу для проведения мониторинга вирусных популяций в Уральском, Западносибирском и Северо-западном регионах России на протяжении 30-60-летнего периода.

2. Проанализировать изменение эпидемиологической и экологической ситуации в обследуемых регионах в течение документированного исторического периода.

3. Провести ретроспективное генотипирование штаммов, изолированных в 40-70-е годы XX века в Свердловской, Кемеровской, Вологодской областях.

4. Изучить генетическую структуру современных популяций ВКЭ, распространенных в Свердловской, Курганской, Кемеровской и Вологодской областях.

5. Использовать для генотипирования ВКЭ современные методы лабораторной диагностики: полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с генотипспецифическими зондами, метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и метод секвенирования.

6. Провести секвенирование участков генома ряда штаммов ВКЭ для изучения генетической гетерогенности сибирского подтипа ВКЭ.

7. Изучить на лабораторных моделях вирулентность и инвазивные свойства современных штаммов ВКЭ, циркулирующих на изучаемых территориях.

8. Для уточнения западной границы ареала сибирского подтипа ВКЭ провести генотипирование дополнительного набора штаммов.

Работа по мониторингу популяций ВКЭ основана на текущем и ретроспективном изучении обширной коллекции штаммов, изолированных в указанных выше регионах. Основой характеристики современных популяций

ВКЭ послужил полевой материал (клещи вида I. persulcatus), собранный на территориях различных ландшафтных зон исследуемых областей в эпидемические сезоны 2003-2007 годов, с изоляцией РНК и штаммов ВКЭ из этих клещей. Для проведения исследований в хронологическом аспекте использована обширная коллекция штаммов ВКЭ, изолированных в различных ландшафтных зонах изучаемых территорий в течение 30-60 лет, созданная в ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН (г. Москва). Изоляция современных штаммов ВКЭ; изучение их вирулентности и культуральных характеристик проводились в лаборатории клещевого энцефалита и других вирусных энцефалитов (руководитель лаборатории профессор В.В. Погодина). Сбор клещей осуществлялся диссертантом совместно с сотрудниками лаборатории и специалистами ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» Свердловской, Курганской, Кемеровской и Вологодской областей. Работа по генотипированию изолятов РНК выполнялась на базе Научно-производственной лаборатории по разработке и производству препаратов для диагностики инфекционных заболеваний человека и животных ФГУН Центрального научно-исследовательского института Эпидемиологии (ЦНИИЭ) Роспотребнадзора РФ (под руководством JI.C. Карань). Генотипирование ВКЭ проводили тремя методами: секвенирование фрагмента или всего гена белка Е, ПДРФ и ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с генотипспецифическими зондами. 1

Научная новизна

• Впервые дана характеристика структуры современных популяций ВКЭ, распространенных в различных ландшафтных зонах Свердловской, Курганской, Кемеровской и Вологодской областей.

• Впервые изучено изменение структуры вирусных популяций КЭ на территории изучаемых областей за 30-60-летний период.

• Выявлены генетические особенности штаммов ВКЭ сибирского подтипа, распространенных на данных территориях.

• Впервые описаны «микст-штаммы» ВКЭ, изолированные из клещей, представляющие собой смесь различных подтипов.

• Изучена вирулентность штаммов ВКЭ, циркулирующих на современном этапе в Уральском и Северо-западном регионах России.

Практическая значимость работы

В результате 4-летнего изучения современной структуры популяций ВКЭ в Свердловской области (2003, 2004, 2006, 2007 гг.) установлено доминирование сибирского подтипа ВКЭ (94,4 - 100%). Значение этих данных определяется тем, что в Свердловской области проводится кампания массовой вакцинации населения четырьмя вакцинами, приготовленными из штаммов дальневосточного и европейского подтипов, генетически отличных от циркулирующих природных популяций ВКЭ. Несмотря на генетическое несоответствие между природными популяциями ВКЭ и вакцинными штаммами, массовая вакцинация населения дала высокий эпидемиологический эффект. Достигнутый успех вакцинации в сопоставлении с нашими данными о структуре природных популяций ВКЭ позволяет заключить, что существующие вакцины против КЭ могут быть рекомендованы для использования и в других регионах, где доминирует сибирский подтип ВКЭ (Кемеровская, Курганская, Вологодская и другие области).

Нуклеотидные последовательности полноразмерного гена белка Е 10 изолятов РНК и 25 штаммов ВКЭ депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank, № FJ214112, FJ214113, FJ214115, FJ214116, FJ214117, FJ214118, FJ214119, FJ214120, FJ214121, FJ214122, FJ214123, FJ214124, FJ214125, FJ214126, FJ214127, FJ214128, FJ214129, FJ214130, FJ214131, FJ214132, FJ214133, FJ214135, FJ214136, FJ214137, FJ214138, FJ214139, FJ214140, FJ214141, FJ214142, FJ214143, FJ214149, FJ214150, FJ214151, FJ214152, FJ214153).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Впервые проведен мониторинг структуры популяций ВКЭ на основе генотипирования хронологических рядов штаммов и изолятов РНК ВКЭ.

2. На территориях Свердловской, Курганской, Кемеровской и Вологодской областей на современном этапе циркулирует преимущественно сибирский подтип ВКЭ (94,4 - 100% вирусной популяции).

3. В Свердловской и Кемеровской областях отмечено преобразование вирусных популяций с общей тенденцией - заменой дальневосточного подтипа сибирским подтипом ВКЭ за 50-60-летний период.

4. Выявлены генетические особенности сибирского подтипа ВКЭ, распространенного в Вологодской области.

5. Современные штаммы ВКЭ, изолированные в Уральском и Северозападном регионах России из клещей I. persulcatus, характеризуются высокой вирулентностью и нейроинвазивностью в экспериментах на белых мышах. В опытах на сирийских хомяках штаммы сибирского подтипа вызывают замедленное развитие патологического процесса. Штаммы дальневосточного подтипа индуцируют быстрое развитие заболевания и гибель 100% зараженных животных.

6. Политиповые или «микст-штаммы» ВКЭ, изолированные из клещей I. persulcatus, имеют генетические структуры сибирского и дальневосточного подтипов ВКЭ, что подтверждено методами ПЦР и ПДРФ.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научной конференции «Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита (к 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита) (Москва, 2007), расширенном заседании ученого совета ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, проблемной комиссии «Клещевой и другие вирусные энцефалиты» совместно с Федеральным государственным унитарным предприятием «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН» (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006).

Апробация диссертационной работы состоялась 10.06.2008 г. на заседании межлабораторного ученого совета ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 9 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и указателя литературы, состоящего из 166 работ отечественных и 82 работ зарубежных авторов. Диссертация изложена на 216 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 таблицами и 21 рисунком.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Колясникова, Надежда Михайловна

1. Впервые проведен мониторинг популяций ВКЭ на основе изучения хронологических рядов штаммов, выделенных в европейских и азиатских регионах России. Генотипировано 137 штаммов и 124 изолята РНК с использованием современных методов лабораторной диагностики: ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с генотипспецифическими зондами, рестрикционного анализа и секвенирования.2. Установлено ранее не описанное явление - смена подтипов ВКЭ в региональных популяциях за 50-60-летний период. В Свердловской и Кемеровской областях преобразование вирусных популяций характеризовалось общей тенденцией - заменой дальневосточного подтипа сибирским подтипом ВКЭ. В Северо-западном регионе РФ (Вологодская

область) на протяжении 30-летнего периода в различных ландшафтных зонах выявляются штаммы одного - сибирского подтипа.3. Впервые изучена структура современных популяций ВКЭ, циркулирующих на Среднем Урале, в Южном Зауралье, Западной Сибири и Северо-западном регионе РФ. Показано, что 94,4 - 100% вирусной популяции, переносимой клещами I. persidcatus, составляет сибирский подтип ВКЭ.

4. Исследование клещей (по одному в биопробе) методом ПЦР выявило разный уровень вирусофорности на обследованных территориях. В Свердловской области в 2003 - 2007 гг. - от 4,3 до 9,35%, в Кемеровской области в 2005 г. - 2,08%, в Вологодской области в сезоны 2006 - 2007 гг.уровень зараженности клещей составил 2,1%. Необычайно высокая степень зараженности, достигающая 54,9%, установлена при обследовании в 2007 г.клещей в северо-западных районах Курганской области.5. Получены новые данные о генетической гетерогенности сибирского подтипа ВКЭ. Проведено секвенирование гена белка Е 35 образцов (штаммы и изоляты РНК ВКЭ). При исследовании вологодских штаммов выявлены ранее не описанные мутации — наличие аминокислоты тирозин в позиции 234 белка Е вместо глутамина или гистидина, как у других штаммов сибирского подтипа. Данная мутация является устойчивой, сохраняется в популяции на протяжении 30 лет, не связана с источником изоляции штамма — клещи /. ricinus и /. persulcatus.6. Современные штаммы ВКЭ, изолированные в Уральском и Северо-западном регионах России из клещей /. persulcatus, характеризуются высокой вирулентностью и нейроинвазивностью в экспериментах на белых мышах. Особенностью штаммов дальневосточного подтипа является высокая вирулентность и быстрая гибель 100% животных. Сибирский подтип менее вирулентен для сирийских хомяков, вызывает замедленное развитие патологического процесса.7. Впервые выявлены «микст-штаммы» ВКЭ, сочетающие генетические структуры дальневосточного и сибирского подтипов (участки генов Е и NS1).«Микст-штаммы» выделены из единичных экземпляров и пулов клещей I. persulcatus на тех территориях и в тот период, когда одновременно циркулировали сибирский и дальневосточный подтипы ВКЭ (Свердловская область 1945 г., Кемеровская область 1960-1970 гг., Ярославская область 1990-1993 гг).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Колясникова, Надежда Михайловна, п/о Институт полиомиелита

1. Аделыиин Р.В. Генетическая вариабельность вируса клещевого энцефалита на территории Европейской части Российской Федерации и некоторых стран Восточной и Юго-восточной Европы // Автореф. дис.канд.биол. наук. — М., 2006. -С. 3-17.

2. Аделыиин Р.В., Злобин В.И., Беликов С.И. и др. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита в европейской части России и некоторых стран Балтии, Восточной и Юго-восточной Европы // Эпидемиол. и вакцинопрофилактика. — 2006. № 2. — С. 27-34.

3. Алексеев А.Н. Современное состояние знаний о переносчиках клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. 2007. - № 5. - С. 21-26.

4. Алыптейн А.Д. Изучение взаимоотношения вируса клещевого энцефалита с клетками в системах с хронической и острой формой инфекции // Клещевой энцефалит и другие арбовирусные инфекции. -Москва-Минск. 1962. - С. 63-64.

5. Андаев Е.И., Трухина А.Г., Карань JI.C. и др. Этиология очаговых форм клещевого энцефалита с летальными исходами в Читинской области // Мед. вирусология. М., 2006. - Т. 23. - С. 75-77.

6. Анджапаридзе О.Г., Гаврилов В.И., Семенов Б.Ф., Степанова Л.Г. Культура ткани в вирусологических исследованиях. М., 1962, 184 с.

7. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях // Медгиз. Л., 1962.

8. Бахвалова В.Н. Эпизоотическое состояние природного очага клещевого энцефалита и особенности вирусной популяции в лесостепном Приобье (Западная Сибирь): Автореф.дис. .канд.биол.наук. Кольцово. - 1994.

9. Бахвалова В.Н., Pap В.А., Ткачев С.Е. и др. Характеристика штаммов вируса клещевого энцефалита Западной Сибири. Сообщ. 1. Генетический анализ штаммов вируса клещевого энцефалита Западной Сибири // Вопр.вирусол. 2000. - № 5. - С. 11-13.

10. Богачек М.В., Протопопова Е.В., Терновой В.А. и др. Иммунохимические свойства рекомбинантных полипептидов, моделирующих домены I и II белка Е вируса Западного Нила // Молекул, биол. 2005. - Т. 39. - С. 813-822.

11. Богачек М.В., Протопопова Е.В., Терновой В.А. и др. Иммунохимические свойства белка РгМ и С-концевого фрагмента белка М вируса Западного Нила // Молекул, биол. 2007. - Т. 41. -С. 8-17.

12. Большая Советская энциклопедия. М., 1973. - Т.14. - С. 26-27.

13. Бочкова Н.Г., Жезмер В.Ю., Трухина А.Г. и др. Изучение серотипа Айна/1448 вируса клещевого энцефалита.// Вопр.вирусол. 1985. -№ 5. - С. 572-575.л

14. Бычкова М.В. Изучение некоторых вопросов этиологии, диагностики клещевого энцефалита (по материалам многолетних наблюдений в Кемеровской области)// Автореф.дис.канд.мед.наук. М., 1970.

15. Васильев В.В., Злобин В.И., Дживанян Т.И. и др. Изучение электрофоретической подвижности вирусспецифических белков штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в разных географических зонах СНГ // Вопр.вирусол. 1993. - №1. - С. 11-16.

16. Верета Л.А., Воробьёва М.С. Природная гетерогенность и целенаправленный отбор штаммов вируса клещевого энцефалита. М., 1990. - 124 с.

17. Верхозина М.М., Козлова И.В., Демина Т.В. и др. Географические и экологические аспекты генетической вариабельности вируса клещевого энцефалита // Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке. Томск. - 2006. - С. 30-31.

18. Верхозина М.М., Злобин В.И., Демина Т.В. и др. Генетическая вариабельность ВКЭ в Азиатской части ареала // Тезисы докладов: Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита. -М., 15-16 ноября, 2007. С. 23-24.

19. Верхозина М.М., Злобин В.И., Демина Т.В. и др. Экологические аспекты генетической вариабельности ВКЭ в Восточной Сибири // Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита. -М., 15-16 ноября, 2007. С. 25-26.

20. Волкова Л.И., Романенко В.В., Струин Н.Л. и др. Эпидемиология, этиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика клещевого энцефалита . — Екатеринбург. — 2004. 72 с.

21. Волкова Л.И., Романенко В.В., Есюнина М.С. Клещевой энцефалит: Современное состояние проблемы // Аннотированные доклады.— I Национальная конференция с международным участием «Нейроинфекции». 2007. - С. 20-24.

22. Воронцова Т.А., Дубровский Ю.А. Историко-экологическая основа функционирования природных очагов клещевых облигатно-трансмиссивных инфекций // Бюлл.моск. общ-ва испыт. природы, отд. биол. 1988. - Т. 93. - В. 5. - С. 3-14.

23. Ворошилова М.К., Жевандрова В.И., Балаян М.С. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций.-М., 1964.-152 с.

24. Вотяков В.И., Злобин В.И. Мишаева Н.П. Клещевые энцефалиты Евразии. Новосибирск. - 2002. - 437 с.

25. Гильманова Г.Х. Эпидемиологические и вирусологические материалы по характеристике очагов клещевого энцефалита в лесостепной зоне с переносчиком Ixodes persulcatus: Автореф.дис. .докт.биол.наук. -Казань. — 1965. 30 с.

26. Гниель Д., Брокер М. Ситуация по клещевому энцефалиту в мире. Вирус-возбудитель заболевание и профилактика // Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия). — Владивосток. - 2002. — С. 180-186.

27. Гольдфарб Л.Г. Изучение эпидемиологического процесса при клещевом энцефалите в связи с задачами профилактики // Дис. .докт.мед.наук. Москва, 1973. - С.41-42.

28. Горчаковская Н.Н., Найдич Г.Н., Бондарева М.П. и др. Эффективность обработок акарицидами крупных территорий очагов клещевого энцефалита // Клещевой энцефалит, кемеровская клещевая лихорадка и другие арбовирусные инфекции. -М., 1964. 166 с.

29. Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2006 г.». С. 252-255.

30. Грацианский А.Н. Природа Югославии. М, 1955.

31. Данчинова Г.А. Экология иксодовых клещей и передаваемых ими возбудителей трансмиссивных инфекций в Прибайкалье и на сопредельных территориях // Автореф.дис. . канд. биол. наук. -Иркутск. 2006. - 45 с.

32. Демина Т.В. Характеристика генетической вариабельности штаммов вируса клещевого энцефалита на основе гомологии участков вирусного генома// Автореф.дис. .канд.мед.наук. Владивосток. - 1999.

33. Дживанян Т.И., Карганова Г.Г., Соболев С.Г. и др. Свойства частиц, формирующихся при воспроизведении острой инфекции in vitro вирусом клещевого энцефалита, адаптированным к клещам H.plumbeum // Вопр.вирусол. 1991. - №4. - С. 297-300.

34. Добрикова Е.Ю., Плетнев А.Г., Шаманин В.А. Обнаружение вируса клещевого энцефалита в крови людей и в индивидуальных клещах методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот // Вопр. вирусол. 1986. - №6. - С. 739-742.

35. Дружинина Т.А., Погодина В.В., Бочкова Н.Г. и др. Клещевой энцефалит в Ярославской области // Эпидемиол. и вакцинопрофилактика. М., 2002. - №1. - С. 39-41.

36. Жанков А.И., Жданов В.М., Ляпустин В.Н. и др. Сравнительное изучение олигопептидных карт вирусспецифических белков вирусов комплекса клещевого энцефалита // Вопр.вирусол. 1985. - №1. -С. 86-89.

37. Жанков А.И., Дживанян Т.И., Лашкевич В.А. Различия электрофоретической подвижности низкомолеклярных вирусспецифических белков вирусов комплекса клещевого энцефалита // Вопр.вирусол. 1985. - №5. - С. 610-614.

38. Жданов В.М., Лашкевич В.А., Дживанян Т.И. Олигопептидное картирование вирусов комплекса клещевого энцефалита // Вопр.вирусол. 1981. - №1. - С. 20-33

39. Живоляпина P.P. Материалы к изучению штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в Иркутской области // Доклады Иркутского противочумного института. — Иркутск. —1971. В. 9. - С. 163-166.

40. Злобин В.И. Современная эпидемиологическая обстановка и вопросы профилактики клещевого энцефалита в Российской Федерации // Тезисы докладов: Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке. — Томск. 2006. — С. 50-51.

41. Злобин В.И., Дрокин Д.А., Мансуров П.Г. и др. Типирование штаммов вируса клещевого энцефалита по растворимому антигену // Вопр.вирусол. 1991. - № 1. - С. 24-27.

42. Злобин В.И., Горин О.З. Клещевой энцефалит // Этиология, эпидемиология и профилактика в Сибири. Новосибирск.-1996.- 177 с.

43. Злобин В.И., Мамаев JI.B., Джиоев Ю.П., Козлов И.В. Генетические типы вируса клещевого энцефалита // Журн.инфекц.патол. — Иркутск. -1996. — Т. 3. № 4. - С. 13-17.

44. Злобин В.И., Демина Т.В., Мамаев JI.B. и др. Анализ генетической вариабельности штаммов вируса клещевого энцефалита по первичной структуре фрагмента гена белка оболочки Е // Вопр.вирусол. — 2001. -№ 1.-С. 13-16.

45. Злобин В.И., Демина Т.В., Беликов С.И. и др. Генетическое типирование штаммов вируса клещевого энцефалита на основе анализа гомологии фрагмента белка оболочки // Вопр.вирусол. 2001. - № 1. — С. 16-21.

46. Злобин В.И., Газо М.Х., Беликов С.И. и др. Молекулярные зонды для генетического типирования вируса клещевого энцефалита // Вопр.вирусол. 2001. -№ 4. - С. 43-47.

47. Злобин В.И., Борисов В.А. Верхозина М.М. и др. Клещевой энцефалит в Восточной Сибири. Иркутск. - 2002. - 183 с.

48. Злобин В.И., Беликов С.И., Джиоев Ю.П. и др. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита. — Иркутск. 2003. — 271 с.

49. Злобин В.И., Верхозина М.М., Демина Т.В. и др. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита // Вопр.вирусол. Т.52 - №6. -2007.-С. 4-13.

50. Иерусалимский А.П. Клещевой энцефалит. — Новосибирск. 2001. -359 с.

51. Изотов В.К., Журавлева М.Г., Подольский В.М. и др. Роль арбовирусов в патологии человека на территории Вологодской области // Вопр.эпидемиол. и приклад. иммунол., труды казанского мед.института. Казань. — 1975. - Часть 2. - С. 69-72.

52. Инфекционные заболевания в России. Статистический справочник. -М., 1992.-С. 45-47.

53. Калишер Ч.Х. Антигенная классификация и таксономия флавивирусов (семейство Flaviviridae). Создание универсальной системы для таксономии вирусов, вызывающих клещевой энцефалит // Acta virol. -1988.-Т. 32.-С. 464-473.

54. Караванов А.С., Матвеев Л.Э., Рубин С.Г. и др. Идентификация отдельных антигенных эпитопов белка оболочки вируса клещевого энцефалита с применением моноклональных антител // Вопр.вирусол. -1990.-№2.-С. 140-143.

55. Карань JI.C., Погодина В.В., Фролова Т.В., Платонов А.Е. Генетические различия восточноевропейской и азиатской популяций вируса клещевого энцефалита сибирского подтипа // Бюлл.сиб.мед. -2006. Т.5, прил. 1. - С. 24-27.

56. Карань Л.С., Браславская С.И., Мязин А.Е. Развитие методов детекции и генотипирования вируса клещевого энцефалита на основе амплификационных технологий // Вопр.вирусол. № 6.- 2007.С.- 17-21.

57. Карань Л.С., Маленко Г.В., Бочкова Н.Г., Левина Л.С., Ливанова Г.П., Колясникова Н.М. и др. Применение молекулярно-генетических методик для изучения структуры штаммов вируса клещевого энцефалита. // Бюлл. СО РАМН. Т.4. - 2007. - С. 34-40.

58. Карганова Г.Г., Дживанян Т.И., Гмыль А.П. и др. Микроэволюция вируса клещевого энцефалита, связанная со сменой хозяина // Актуал.проблемы мед.вирусологии. М., 1999. - Т.2. - С. 30.

59. Карганова Г.Г., Дживанян Т.И., Бахмутов Д.В. и др. Сравнительная характеристика вируса клещевого энцефалита, адаптированного к клещам и млекопитающим // Материалы VIII всерос.съезда эпидемиол., микробиол., паразитологов. М., 2002. - Т.1. - С. 333-334.

60. Карпов С.П. Томский очаг клещевого энцефалита и вопросы его оздоровления // Клещевой энцефалит. — Минск. — 1965. — С. 212-221.

61. Карцев Г.П. Беловежская пуща // СПБ, 2003.

62. Катин А.А., Якина Н.Х. Возрастная гетерогенность популяций таёжного клеща как один из важных факторов, влияющих на заражённость этого переносчика вирусом клещевого энцефалита // XII Всес.конф. по природно-очаговым болезням. М., 1989. - С. 76-77.

63. Кестнер Б.В., Шостак С.В. Прошлое и настоящее Беловежской Пущи. -М., 1968.

64. Козлова И.В., Злобин В.И., Верхозина М.М. и др. Молекулярная эпидемиология и генетическая характеристика урало-сибирского генотипа вируса клещевого энцефалита // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. — 2002. Т. 2. - № 4. - С. 70-73.

65. Коренберг Э.И. Клещевой энцефалит // Природная очаговость болезней. Исследования Института им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. М.,2003.- С. 35-63.

66. Коренберг Э.И., Лихачева Т.В. Клещевой энцефалит: ретроспективная оценка показателей заболеваемости в России // Биопрепараты. — июнь2004. С. 13-16.

67. Коротков Ю.С. Постепенная изменчивость паразитарной системы клещевого энцефалита // Вопр.вирусол. 2005. - № 3. - С. 52-56.

68. Коротков Ю.С., Чунихин С.П. Источники и закономерности восстановления численности таёжного клеща (Ixodes persulcatus, Shulze, 1930) в очагах клещевого энцефалита, обработанных дустом ДДТ // Мед. Паразитология. 1989. - № 3. - С. 9-16.

69. Коротков Ю.С., Никитин А.Я., Антонова A.M. и др. Временная структура численности таёжного клеща в пригородной зоне Иркутска //Бюлл. Восточно-Сибирского научного центра. Иркутск . — 2007. -№ 3. - 55 (приложение). - С. 126-130.

70. Кошкина Т.В., Земская А.А., Баннова Г.Г. и др. Некоторые особенности очага клещевого энцефалита в Хабаровском районе Вологодской области // Вопр.мед.вирусол. М., 1975. — С. 304-305.

71. Кошкина Т.В., Чумаков М.П., Сарманова Е.С., Баннова Г.Г. и др. Сравнительная характеристика очагов клещевого энцефалита в Центральной и Северо-западной частях Вологодской области // Вопр.мед.вирусол. М., 1975. - С. 306-307.

72. Краминская Н.Н., Живоляпина P.P., Мейерова Р.А. Опыт вирусологического изучения гиперкинетических форм клещевого энцефалита с прогредиентным течением // Актуальные проблемы вирусологии и профилактики вирусных заболеваний. М., 1972. - С. 224-225.

73. Кузнецов Г.Г. Ландшафтное районирование территорий и очагов туляремии в Вологодской области // Материалы конференции института им. Пастера. Ленинград. - 1964. - С.87-89.

74. Курганская область: административно-территориальное деление. -Курган. 1982. - 198 с.

75. Кучерук В.В., Иванова JI.M и др. Клещевой энцефалит: география природно-очаговыхболезней человека. — М., 1969.-С. 171-217.

76. Левкович Е.Н., Погодина В.В., Засухина Г.Д., Карпович Л.Г. Вирусы комплекса клещевого энцефалита. Л., 1967. - 245 с.

77. Левкович Е.Н., Карпович Л.Г., Засухина Г.Д. Генетика и эволюция арбовирусов. М., 1971. - 263 с.

78. Леонова Г.Н. Клещевой энцефалит в Приморском крае // Вирусологические и эколого-эпидемиологические аспекты. -Владивосток. 1997. - 191 с.

79. Леонова Г.Н., Кожемяко В.Б., Исаева М.И., Майстровская О.С. Молекулярная характеристика популяции вируса клещевого энцефалита Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона // Вопр.вирусол. 1996. - № 4. - С. 154-158.

80. Леонова Г.Н., Павленко Е.В., Крылова Н.В. Вакцинопрофилактика клещевого энцефалита. — Владивосток. 2006. - С. 5-8.

81. Лесникова М.В., Лесников И.Р., Филоненко И.В. и др. Особенности клещевого энцефалита на территории Вологодской области // Мед.вирусология. М., 2007. - Т. 24. - С. 53-58.

82. Липин С.И., Жезмер В.Ю. К вопросу об эволюции природных очагов клещевого энцефалита в Восточной Сибири // Природно-очаговые инфекции в районах народно-хозяйственного освоения Сибири и Дальнего Востока. Омск. - 1983. - С. 36-40.

83. Литвин В.Ю., Коренберг Э.И. Природная очаговость болезней, развитие концепции к исходу века // Природная очаговость болезней. Исследования Института им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. М., 2003.- С. 12-34.

84. Локтев В.Б., Терновой В.А., Нетесов С.В. Молекулярно-генетическая характеристика вируса клещевого энцефалита // Вопр.вирусол. — 2007. -№5.- С. 10-16.

85. Львов Д.К. Иммунопрофилактика клещевого энцефалита: Дис. . докт. мед.наук. -М., 1965.

86. Львов Д.К., Злобин В.И. Стратегия и тактика профилактики клещевого энцефалита на современном этапе // Вопр.вирусол. — 2007. -№ 5. С. 26-30.

87. Ляпустин В.Н., Жанков А.И., Дживанян Т.И., Лашкевич В.А. Сравнительный анализ электрофоретической подвижности высокомолекулярных вирусспецифических белков флавивирусов // Вопр.вирусол. 1984. - №6. - С. 740-746.

88. Маленко Г.В., Погодина В.В., Карань Л.С. и др. Мониторинг популяций вируса клещевого энцефалита в Кемеровской области и особенности современной эпидситуации // Мед.вирусология. — М.,' 2006.-Т. 23.-С. 103-109.

89. Матущенко Е.В. Совершенствование лабораторной верификации клещевых инфекций в условиях сочетанности природных очагов // Автореф.дис. . .канд.мед.наук. — Омск. 2006. - 22 с.

90. Майр Э. Популяции, виды и эволюция. М., 1974. - 460 с.

91. Методические указания по клинике, лечению, лабораторной диагностике, эпидемиологии и профилактике (специфической и неспецифической) клещевого энцефалита. М., 1981. — С. 25-29.

92. Монастырская Г.С., Костина М.Б., Филюкова О.Б. и др. Активация гена RIG-I, кодирующего DexH/D-белок, при инфекции клеток RHвирусом клещевого энцефалита // Биоорган, химия. 2004. - Т. 30. -С. 146-150.

93. Найдич Г.Н., Чигирик Е.Д., Чумак Н.Ф. и др. Методы профилактики и оздоровления местности от клещевого энцефалита в районах Кемеровской области // IX совещание по паразитарным проблемам. — Л., 1959.-I.-С. 69-70.

94. Окулова Н.М. Биологические взаимосвязи в лесных экосистемах на примере природных очагов клещевого энцефалита. М., 1986. - 248 с.

95. Онищенко Г.Г. Современное состояние клещевого энцефалита в Российской Федерации // К 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита: Расширенное заседание ученого совета ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. М., 11-12 октября, 2007.

96. Онищенко Г.Г., Федеров Ю.М., Пакскина Н.Д. Организация надзора за клещевым энцефалитом и меры по его профилактике в Российской Федерации // Вопр.вирусол. М., 2007. - № 5. - С. 8-10.

97. Перечень административных территорий субъектов Российской Федерации, эндемичных по клещевому вирусному энцефалиту в 2006 г. // ФГУЗ «Федеальный Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора РФ.

98. Петрищева П.А. Влияние хозяйственной деятельности на природные очаги некоторых трансмиссивных болезней // Зоолог.журнал. 1964. -№43-3.-С. 334-345.

99. Плетнев А.Г., Ямщиков В.Ф., Блинов В.М. Нуклеотидная последовательность генома и полная аминокислотная последовательность полипротеина вируса клещевого энцефалита // Биоорганич.химия. 1989. - Т. 15. - № 11. - С. 1504-1521.

100. Погодина В.В. Вирусы антигенного комплекса клещевого энцефалита // Дис. .докт.мед.наук. М., 1967.

101. Погодина В.В. Мониторинг популяций вируса клещевого энцефалита и этиологической структуры заболеваемости за 60-летний период // Вопр.вирусол. 2005. - С. 7-13.

102. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Левина Л.С. и др. Иммунологические и некоторые этиологические аспекты изучения серотипа Айна/1448 вируса клещевого энцефалита // Вопр.вирусол. — 1981.-№ 6.- С.735-741.

103. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Корешкова Г.В. Свойства штаммов серотипа Айна/1448 вируса клещевого энцефалита // Вопр.вирусол. — 1981.-№6.-С. 741-745.

104. Погодина В.В., Фролова М.П., Ерман Б.А. Хронический клещевой энцефалит. — Новосибирск. — 1986. 233 с.

105. Погодина В.В., Трухина А.Г., Шаманин В.А. и др. Дезоксиолигонуклеотидные зонды, дифференцирующие антигенные и патогенетические варианты вируса клещевого энцефалита // Вопр.вирусол. 1992. - № 1. - С. 53-56.

106. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Злобин В.И. и др. Генетическая характеристика серотипа Вергина вируса клещевого энцефалита и 1 особенности его патогенности // Вопр.вирусол. 1993.-№ 4.-С. 158-163.

107. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Левина Л.С. и др. Комплексная характеристика сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита: Клещевой энцефалит. — Владивосток. 2002. - С. 72-87.

108. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань Л.С. и др. Сибирский и дальневосточный подтипы вируса клещевого энцефалита в европейских и азиатских регионах России: генетическая и антигенная характеристика штаммов // Вопр.вирусол. 2004. - №4. - С. 20-25.

109. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань Л.С. и др. Сравнительный анализ вирулентности сибирского и дальневосточного подтипов вируса клещевого энцефалита на основе экспериментальных и клинических данных // Вопр.вирусол. 2004. - №6. - С. 24-30.

110. Погодина В.В., Романенко В.В., Карань JI.C. и др. Структура популяций вируса клещевого энцефалита в Свердловской области на современном этапе и вопросы вакцинопрофилактики // Мед.вирусология. -М., 2006. -Т. 23. -С. 110-115.

111. Погодина В.В., Карань JI.C., Колясникова Н.М. и др. Эволюция клещевого энцефалита и проблема эволюции возбудителя // Вопр.вирусол. 2007. - Т5. - С. 16-21.

112. Пономарев Д.Н. Нозогеография краевой инфекционной и паразитарной патологии Среднего Урала. — Свердловск. 1974.

113. Пуховская Н.М. Изучение природных популяций вируса клещевого энцефалита методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот: Автореф.дис. . канд. биол. наук. — М., 1994.

114. Романенко В.В., Прохорова О.Г., Злобин В.И. Новая стратегия специфической профилактики клещевого энцефалита: опыт организации массовой вакцинации населения Свердловской области // Эпидемиол. и вакцинопрофилактика. — 2005. №3. — С. 24-27.

115. Романенко В.В., Есюнина М.С, Килячина А. С. Опыт реализации массовой иммунизации населения против клещевого энцефалита в Свердловской области // Вопр.вирусол. М., 2007. - № 6. - С. 22-25.

116. Романова Л.Ю. Изменение свойств популяции вируса клещевого энцефалита при смене хозяев // Дис. . канд.биол.наук. М., 2006.

117. Рубин С.Г., Чумаков М.П., Парадопулос О. Антигенный тип штамма Вергина вируса клещевого энцефалита, выделенного в Греции в 1969 г. от больного козленка // Вопр.мед.вирусол. М., 1975. - С. 353-354.

118. Сарманова Е.С. Клещевой энцефалит (этиология, иммунология, лабораторная диагностика, клинико-эпидемиологические особенности и профилактика по материалам Кемеровской области) // Дис. . .докт.мед.наук. М., 1968.-441 с.

119. Сафронов П.В., Нетесов С.В., Микрюкова Т.П. и др. Нуклеотидная последовательность генов и полная аминокислотная последовательность белков вируса клещевого энцефалита штамма 205 // Молекул.генетика. 1991. - №4. - С. 23-29.

120. Селютина И.А. Материалы по клинической и эпидемиологической иммунологии клещевого энцефалита // Дис. .канд.мед.наук. — М., 1971.

121. Смородинцев А.А., Дубов А.В. Клещевой энцефалит и его вакцтнопрофилактика. Л., 1986. - С. 155-169.

122. Субботин А.В., Деконенко Е.П., Чебаненко Н.В.и др. О роли различных факторов в прогнозировании развития и формирования очаговой формы клещевого энцефалита // Неврол.журнал. 2004. - Т.9. - № 4 - С. 19-25.

123. Терновой В.А., Кононова Ю.В., Москвитина Н.С. и др. Вирус клещевого энцефалита в городских и пригородных биотопах г. ТомскаТезисы докладов: Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита. М., 15-16 ноября, 2007. — С. 110-120.

124. Трухина А.Г. Особенности популяции возбудителя клещевого энцефалита в зоне распространения двух серотипов вируса на территории Прибайкалья: Дис. . канд.мед.наук. — Иркутск. 1989. -176 с.

125. Урбах В.Ю. Математическая статистика для биологов и медиков. -М., 1963. (АН СССР, Ин-т Биофизики).

126. Федотова Т.Т. Эпидемиология клещевого энцефалита в Свердловской области // Вестник 1-й областной клинической больницы. -Екатеринбург. 1999. - № 2. В. 1. - С. 44-46.

127. Хазова Т.Г., Ястребов В.К. Некоторые особенности очагов клещевого энцефалита и клещевого боррелиоза в Красноярском крае // Природно-очаг. инфекции России, современ. эпидемиол., диагн., тактика защиты населения. Омск. — 1998. - С. 36-38.

128. Холдман X., Воробьева М.С., Ладыженская И.П. и др. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита: перекрестная защита междуевропейскими и дальневосточными субтипами // Эпидемиол. и вакцинопрофилактика. — 2003. № 2. - С. 37-41.

129. Черкасский Б.Л. Эпидемиологический словарь. М., 2001. - 84 с.

130. Чумаков М.П. Клещевой энцефалит человека // Дис. .докт. мед. Наук. М., 1994.

131. Чумаков М.П., Львов Д.К. Найдич Г.Н. Данные по эффективности специфической вакцинопрофилактики клещевого энцефалита // Клещевой энцефалит и вирусные геморрагические лихорадки. Омск. -1963.- 275 с.

132. Чумаков М.П., Горчаковская Н.Н., Найдич Г.Н. и др. Возможность ликвидации заболеваемости клещевым энцефалитом путем истребленияпереносчика стойким акарицидом. // Эндемичные вирусные инфекции. — М., 1968. №12. — 229 с.

133. Чумаков М.П., Рубин, С.Г., Линев М.Б. Три антигенных типа вируса клещевого энцефалита, их зависимость от основного вида клещей переносчиков и географическое распространение // Вопр.мед.вирусол. -М., 1975.-С. 371-372.

134. Чумаков М.П., Кусов Ю.Ю., Рубин С.Г. и др. Клонирование и изучение первичной структуры ДНК-копий участков генома вируса клещевого энцефалита // Биоорганич.химия. 1983. - Т. 9. - №2. -С. 276-279.

135. Чунихин С.П., Куренков В.Б., Леонова Г.Н. и др. Дифференциация штаммов вируса клещевого энцефалита по уровню вирусемии,вызываемой ими у рыжей полёвки // Мед. паразитология и паразитарные болезни. 1981. - Т.50. - № 5. - С. 76-81.

136. Чунихин С.П., Леонова Г.Н. Экология и географическое распространение арбовирусов. М., 1985. — 126 с.

137. Цилинский Я.Я. Популяционная структура и эволюция вирусов. М., 1988.-240 с.

138. Цилинский Я.Я., Львов Д.К. Популяционная генетика вирусов позвоночных. М., - 1977. - 192 с.

139. Эрлих П., Холм Р. Процесс эволюции. М., 1966. - 330 с.

140. Alekseev A.N., Dubinina N.N. Abnormalities in Ixodes ticks (Ixodidae, Ixodinae) //Acarina. 1993. - Vol.1. -No.l. - P. 73-85.

141. Allison S.L., Schalich J., Stiasny K. et al. Mutational evidence for an internal fusion peptide in flavivirus envelope protein E // J. Virol. 2001. -Vol. 75.-P. 4268-4275.

142. Arias C.F., Preugschat F., Strauss J.H. Denge 2 virus NS2B and NS3 form a stable complex that can cleave NS3 within the helicase domain // Virology. 1993. - Vol. 193. - P. 888-899.

143. Biebricher C.K., Eigen M. What is a Quasispecies? In: Quasispecies: concepts and amplications for virology // Springer-Verlag, ed by E. Domingo. 2006. - P. 1-32.

144. Calisher C.H., Karabatsos N., Dalrymple J.M. et al. Antigenetic relationships between flaviviruses as determined by cross-neutralization tests with polyclonal antisera // J.Gen.Virol. 1989. - Vol. 70. - P.37-43.

145. Casals J, Brown L., Hemmagglutination on with anthropoid borne viruses // J. Exper. Medicine. 1954. - Vol. 99. - P. 429.

146. Casati S., Gern L., Pifaretti J.C. Diversity of the population of Tick-borne encephalitis virus infecting Ixodes ricinus ticks in an endemic area of central Switzerland (Canton Bern) // J.Gen.Virol. 2006. - Vol. 87.- P. 2235-2241.

147. Castle E., Nowak Th., Leidner U. et al. Sequence analysis of the viral core protein and membrane associated proteins VI and NV2of the flavivirus West Nile virus and the genome sequence for these proteins // Virology. — 1985. Vol. 145. - P. 227-236.

148. Chambers T.J., Hahn C.S., Galler R., Rice C.M. Flavivirus genome organization, expression, and replication // Annu. Rev. Microbiol. 1990. -Vol. 44.-P. 649-668.

149. Charrel R.N., Attoui H., Butenko A.M. et al. Tick-borne virus diseases of human interest of Europe // Clin. Microbiol. Infect. 2004. - Vol. 10. - P. 1040-1055.

150. Chen W.R., Tesh R.B., Rico-Hesse R. Genetic variation of Japanese encephalitis virus in nature // J. Gen. Virol. 1990. - Vol.71.- P. 2915-2922.

151. Clark D.H. Further studies on antigenic relationship among the viruses of the group В tick-borne complex // Bull. WHO. 196. - Vol. 31. - P. 45-56.

152. Domingo E., Martin V., Perales C. et al. Viruses as Quasispecies: biological implications. In: Quasispecies: concepts and amplications for virology // Springer-Verlag, ed by E. Domingo. 2006. - P. 51-82.

153. Dubinina N.N., Alekseev A.N., Svetashova E.S. New Ixodes tick population appearing as a result of, and tolerant to cadmium contamination //Acarina. - 2004. - Vol. 12. - No.2. - P. 141-149.

154. Ecker M., Allison S.L., Meixner Т., Heinz F.X. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia // J.Gen.Virol. 1999. - Vol. 80. - P. 179-185.

155. Flamand M., Megret F., Mathieu M. et al. Denge virus type 1 nonstructural glycoprotein NS1 is secreted from mammalian cells as a soluble hexamer in a glycosylation-dependent fashion // J. Virol. 1999. -Vol.73.-P.6104-6110.

156. Floris R., Altoibrlli A., Boemo B. et al. First detection of TBE virus sequences in Ixodes ricinus from Friuli Venezia Giulia (Italy) // New Microbiol.-2006.-Vol. 29.-P. 147-150.

157. Gaidamovich S.Y., Melnikova Y.E., Gresikova M. et al. Two kind of monoclonal antibodies to tick-borne encephalitis virus // Acta Virol. — 1986. -Vol. 30.-P. 206-212.

158. Golovljova I., Vene S., Sjolander K.B. et al. Characterization of tick-borne encephalitis virus from Estonia // J. Med. Virol. 2004. -Vol.74.-P.580-588.

159. Gorbalenya A.E., Donchenko A.P., Koonin E.V., Blinov V.M. N-terminal domains of putative helicases of flavi- and pestiviruses may be serine proteases //Nucl. Asids Res. 1989. - Vol. 17. - P. 3889-3897.

160. Gorbalenya A.E., Koonin E.V., Donchenko A.P., Blinov V.M. Two related superfamilies of putative helicases involved in replication, recombination, repair and expression of DNA and RNA genomes // Nucl. Asids Res. -1989. Vol. 17. - P. 4713-4729.

161. Grard G., Moureau G., Charrel R.N. et al. Genetic characterization of tick-borne flavi viruses: New insights into evolution, pathogenetic determinants and taxonomy // Virology. 2006. - doi: 10.1016/j. virol. 2006.09.015. -P. 1-13.

162. Gritsun T.S., Frolova T.V., Pogodina V.V. et al. Nucleotide and deduced amino-acid sequence of the envelope glycoprotein of the Vasilchenko strain of the virus; comparison with other flaviviruses // Virus Res. 1992. - Vol. 29.-P. 201-209.

163. Gritsun T.S., Venugopal K., Zanotto P.M. et al. Complete sequence of two tick-borne flavivirus isolated from Siberia and the UK: analysis and significance of the 5/ and 3/ UTRs // Virus Res. - 1997. -Vol. 49.-P.27-39.

164. Gritsun T.S., Desai A., Gould E.A. The degree of attenuation of tick-borne encephalitis virus depends on the cumulative effects of point mutations//J. Gen. Virol.-2001.-Vol. 82.-P. 1667-1675.

165. Gritsun T.S., Frolova T.V., Zhankov A.I. et al. Characterization of a Siberian virus isolated from a patient with progressive chronic tick-borne encephalitis // J. Virol. 2003. - Vol. 77. - P. 25-36.

166. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. Tick-borne encephalitis // Antiviral Res. 2003. - Vol. 57. - P. 129-146.

167. Hall R.A., Khromykh A.A., Mackenzie J.M. et al. Loss of dimerisation of the nonstructural protein NS1 of Kunjin virus delays viral replication and reduces virulence in mice, but still allows secretion of NS1 // Virology. -1999.-Vol. 264.-P. 66-75.

168. Hayasaka D., Suzuki Y., Kariva H. et al. Phylogenetic and virulence analysis of tick-borne encephalitis viruses from Japan and far-eastern Russia // J. Gen. Virol. 1999. - Vol. 80. - P. 3127-3135. :

169. Hayasaka D., Ivanov L., Leonova G.N. et al. Distribution and characterization of tick-borne encephalitis viruses from Siberia and far-eastern Asia//J. Gen. Virol. 2001.-Vol. 82.-P. 1319-1328.

170. Heinz F.X., Kunz Ch. Homogeneity of the structural glycoprotein from European isolates of tick-borne encephalitis virus: comparison with the flaviviruses // J. Gen. Virol. 1981. - Vol. 57. - P. 263-274.

171. Heinz F.X., Kunz C. Molecular epidemiology of tick-borne encephalitis virus: peptide mapping of large nonstructural protein of European isolates and comparison with other flaviviruses // J. Gen. Virol. — 1982. Vol. 62. -P. 271-283.

172. Heinz F.X., Berger M., Tuma W., Kunz Ch. A topological and functional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick-borne encephalitis virus defined by monoclonal antibodies // Virology. — 1983. Vol. 126. - P. 525-537.

173. Heinz F.X., Mandl C.W. The molecular biology of tick-borne encephalitis virus // APMIC. 1993. - Vol. 101. - P. 735-745.

174. Heinz F.X., Ecker M., Mandl C.W., Holzman H. The molecular epidemiology of tick-borne encephalitis vims in Europe and Asia // 4-th Intern. Postdam Symp. «Tick-borne encephalitis and Lime Borreliosis». -Postdam, 1997.-P. 27-33.

175. Heinz F.X., Collet M.S., Purcell R.H. et al. Family Flaviviridae // Virus taxonomy: classification and nomenclature of viruses. Seventh repot of the International Committee on Taxonomy of Viruses. — San Diego, 2000. P. 859-878.

176. Heinz F.X., Kunz C. Tick-borne encephalitis and the impact of vaccination // Arch. Virol. Suppl. 2004. - Vol. 18. - P. 201-205.

177. Henderson, Taylor, 1959; Porterfield J.S. A simple plaque inhibition test for the study of anthropod borne viruses // Bull. WHO. 1960. - Vol. 22. -P. 373.

178. Hoglund M., Vene S., Forsgren M. et al. Characterization of human tick-borne encephalitis virus from Sweden // J. Med. Virol. 2003. - Vol. 71. — P. 610-621.

179. Holland J.J. Transitions in understanding of RNA viruses: a historical perspective? In: Quasispecies: concepts and amplications for virology // Springer-Verlag, ed by E. Domingo. 2006. - P. 371-401.

180. Holland J.J., Notkins A.A., Oldstone M.B. Continuum of change in RNA virus genomes // Concepts in viral pathogenesis. New Jork. - 1984. - P. 137-143.

181. Holzmann H., Mandl C.W., Guirachoo F. et al. Characterization of antigenic variants of tick-borne encephalitis virus selected with neutralizing monoclonal antibodies // J. Gen. Virol. 1989. - Vol. 70. - P. 219-222.

182. Holzmann H., Mandl C.W., Guirakhoo F. et al. Molecular epidemiology of tick-borne encephalitis (TBE) virus // 2-nd Intern. Symp. on tick-borne encephalitis. Baden near Vienna, Austria, 6-7 June, 1991. - P. 66.

183. Jaaskelainen A.E., Tikkakoski Т., Uzcategui N.Y. et al. Siberian subtype tick-borne encephalitis virus, Finland // Emerg. Infect. Dis. 2006. - Vol. 12. -P. 1568-1571.

184. Khromikh A.A., Westaway E.G. Subgenomic replicons of the flavivirus Kunjin: Construction and applications // J.Virol. 1997. - Vol. 71. - P. 1497-1505.

185. Koonin E.V. Computer-assisted identification of a putative methyltransferase domain in NS5 protein of flaviviruses and lambda 2 protein of reovirus // J. Gen. Virol. 1993. - Vol. 74. - P. 733-740.

186. Korenberg E.I., Kovalevskii Y.V. Main features of tick-borne encephalitis eco-epidemiology in Russia // Z.Bakteriol. 1999. - Bd. 289. - P. 525-539.

187. Kuno G., Chang G.-J., Tsuchiya K.R. et al. Phylogeny of the genus flavivirus // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - P.73-83.

188. Lanciotti R.S., Ebel G.D., Deubel V. et al. Complete genome sequences and phylogenetic analysis of West Nile virus strains isolated from the United States, Europe, and the Middle East // Virology. 2002.-Vol.298.-P.96-105.

189. Lin Y.L., Chen L.K., Liao C.L. et al. DNA immunization with Japanese encephalitis virus nonstructural protein NS1 elicits protective immunity in mice // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 191-200.

190. Lundkvist A., Vene S., Golovljova I. et al. Characterization of tick-borne encephalitis virus from Latvia: evidences for co-circulation of three distinct subtypes//J. Med. Virol. 2001. - Vol. 65.-P. 730-735.

191. Mackenzie J.M., Khromykh A.A., Jones M.K., Westaway E.G. Subcellular localization and some biochemical properties of the flavivirus Kunjin nonostructural proteins NS2A and NS4A // Virology. 1998. - Vol. 245. -P. 203-215.

192. Malet H., Egloff M.P., Selisko B. et al. Crystal structure of the RNA polymerase domain of the West Nile virus non-structural protein 5 // J. Biol.Chem. 2007. - Manuscript M607273200 http://www.ibc.0rg/cgi/d0i/l 0.1074/ibc.M607273200

193. Mandl C.W., Heinz .X., Kunz Ch. Sequence of the structural proteins of tick-borne encephalitis vims (western subtype) and comparative analysis with other flaviviruses // Virology. 1988. - Vol. 166. - P. 197-205.

194. Mandl C., Guirakhoo F., Holzman H. et al. Antigenic structure of the flavivirus envelope protein at the molecular level using tick-borne encephalitis virus as a model // J. Virol. 1989. - Vol. 63. - P. 564-571.

195. Nowak Т., Wenger G. Analysis of disulfides present in the membrane proteins of West Nile flavivirus // Virology. 1987. - Vol. 156.- P. 127-137.

196. Okuno Т., Okada Т., Kondo A. et al. Immunotyping of different strains of Japanese encephalitis virus by antibody adsorption and complement fixation tests // Bull. WHO. 1968. - No. 38. - P. 547-563.

197. Pletnev A.G., Yamshchikov V.F., Blinov V.M. Nucleotide sequence of the genome and complete amino acid sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis virus // Virology. 1990. - Vol. 174. - P. 250-263.

198. Reed L.J., Muench H.A. A simple method of estimating fifty percent endpoints // Amer. J. Hyg. 1938. - No. 27. - P. 493-497.

199. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C. et al. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution // Nature. — 1995. —Vol. 375. -P. 291-298.

200. Rice C.M., benches E.M., Eddy S.R. et al. Nucleotide sequence of Yellow fever virus: implications for flavivirus gene expression and evolution // Science. 1985. - Vol. 229. - P. 726-733.

201. Roehrig J.T. Antigenic structure of flavivirus protein // Adv.Virus Res. — 2003.-Vol. 59.-P. 141-175.

202. Rubin S.G., Chumakov M.P. New data on the antigenic types of tick-borne encephalitis (TBE) virus // Arboviruses in the Mediterranean Countries. — Stutgart, N.Y., 1980. P. 231-236.

203. Scherer W.F., Buescher E.L., Mc Clure H.E. Ecologic studies of Japanese encephalitis virus in Japan. V. Avian factors // Amer. J. Trop. Med. Hyg. — 1959. No. 8. - P. 689-697.

204. Scherer W.F., Moger J., Isumi T. et al. Ecologic studies of Japanese encephalitis vims in Japan. VI. Swine infection // Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1959. - No. 8. - P. 698-706.

205. Shamanin V.A., Pletnev A.G., Rubin S.G., Zlobin V.I. Differentiation of strains of tick-borne encephalitis virus by means of RNA-DNA hybridization // J. Gen. Virol. 1990. - Vol. 71. - P. 1505-1515.

206. Shiu S.Y.W., Aires M.D., Gould F.A. Genomic sequence of the structural proteins of Louping ill virus: comparative analysis with tick-borne encephalitis virus // Virology. 1991. - Vol. 180. - P. 411-415.

207. Skarpaas Т., Golovljova I., Vene S. et al. Tick-bome encephalitis virus, Norway and Denmark // Emerg. Infect. Dis. 2006. - Vol. 12. - P. 411-415.

208. Suss J., Schrader C., Abel U. et al. Characterization of tick-borne encephalitis (TBE) foci in Germany and Latvia (1997-2000) // Int. J. Med. Microbiol. 2002. - Suppl. 33. - P. 22-29.

209. Temovoy V.A., Kurzhukov G.P., Sokolov Y.V. et al. Tick-borne encephalitis with hemorrhagic syndrome, Novosibirsk Region, Russia, 1999 // Emerg. Infect. Dis. 2003. - Vol. 9. - P. 743-746.

210. Trent D.W., Grant J.A., Vorndam A.V., Monath T.P. Genetic heterogeneity among Saint Louis Encephalitis Virus isolates of different geographic origin // Virology. 1981. - Vol. 114. - No 2. - P. 319-332.

211. Weidmann M., Schmidt P., Hufert F.T. et al. Tick-borne encephalitis virus in Clethrionomys glareolus in the Czech Republic // Vector Bome Zoonotic Dis. 2006. - Vol. 6. - P. 379-381.

212. Westawey E.G., Khromykh A.A., Kenney M.T. et al. Proteins С and NS4B of the flavivirus Kunjin translocate independently into the nucleus // Virology. 1997. - Vol. 234. - P. 31-41.

213. Whitby J.E., Whitby S.N., Jennings A.D. et al. Nucleotide sequence of the envelope protein of a Turkish isolate of tick-borne encephalitis (TBE) vims is distinct from other viruses of the TBE virus complex // J. Gen. Virol. -1993.-Vol. 74.-P. 921-924.

214. Whittaker R.H. Communities ecosystems // 2nd ed., New York, Macmillan. 1975.

215. Wu J., Bera A.K., Kuhn R.J., Smith J.L. Structure of the flavivirus helicase: Implications for catalytic activity, protein interactions, and proteolytic processing // J. Virol. 2005. - Vol. 79. - P. 10268-10277.

216. Yamshikov V.F., Companc R.W. Regulation of the late events in flavivirus protein processing and maturation // Virology. 1993. - Vol. 192.- P. 38-51.

217. Zanotto P.M., Gao G.F., Gritsun et al. An Arbovirus cline across the Northern Hemisphere // Virology. 1995. - No. 210. - P. 152-159.