Клеточная специфичность регуляции экспрессии рецепторов пролактина в печени крыс

Богорад, Роман Львович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клеточная специфичность регуляции экспрессии рецепторов пролактина в печени крыс
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Клеточная специфичность регуляции экспрессии рецепторов пролактина в печени крыс"

Иаправахрукописи

БОГОРАД Роман Львович

Клеточная специфичность регуляции экспрессии рецепторов пролактина в печени крыс

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность 03.00.13 - физиология, 03.00.03 - молекулярная биология

Москва-2004

Работа выполнена в лаборатории эндокринологии кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова; в лаборатории гормонов и рецепторов Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научные руководители - доктор биологических наук О.В. Смирнова

доктор биологических наук, профессор П.М. Рубцов

Официальные оппоненты -

доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН, академик РАМН В.А. Ткачук доктор медицинских наук, профессор В.И. Кандрор

Ведущее учреждение - Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита состоится 15 ноября 2004 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного Ученого Совета Д501.001.93 Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 15 октября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного Ученого Совета, доктор биологических наук

Б А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из центральных вопросов эндокринологии и физиологии на современном этапе является проблема формирования тканеспецифичности гормонального ответа и регуляции его интенсивности. Становление тканеспецефичности реализуется на многих уровнях и, в частности, ключевым моментом является оценка вклада клеточных элементов ткани в ее совокупный ответ на определенный гормональный стимул.

Пролактин - один из важнейших регуляторов функциональной активности клеток разного типа. Функции пролактина в организме млекопитающих включают регуляцию роста, дифференцировки, размножения, метаболизма, осморегуляцию, иммуномодуляцию и регуляцию поведения (Bole-Feysot et al, 1998). Для понимания реализации многообразия его функций необходимо дифференциальное изучение действия пролактина на разные клеточные элементы в норме и при патологии.

Несмотря на то, что к настоящему моменту уже накоплено достаточно много данных относительно роли пролактина в регуляции множества функций организма, характер их дискриминации на тканевом уровне, а также многие аспекты реализации эффектов пролактина остаются невыясненными.

Пролактин осуществляет свои эффекты, взаимодействуя со специфическими мембранными рецепторами (ПрлР). Наличие нескольких форм, как самого гормона (Sinha, 1995), так и его рецепторов (Bignon et al, 1997; Ни et al, 1998; Horseman, 1999) предоставляют широкое поле для изучения его мультипотентности. У млекопитающих описано несколько функционально различных изоформ ПрлР (Bole-Feysot et al, 1998) - это длинная, с которой связывают проведение сигнала через основной путь рецепторов цитокинов, опосредованный активацией тирозинкиназ Януса и транскрипционных факторов STAT (signal transducer and activator of transcription); и короткая изоформа (или несколько разных коротких изоформ), которая, негативно действует на активацию белков STAT, препятствуя димеризации длинных изоформ, а, с другой стороны, ассоциирована с «тканеспецифическими» вариантами пролактин-индуцированных эффектов, примерами таких сигналов могут служить активация белка, ассоциированного с короткими ПрлР - 17 кетостероиддегидрогеназы 7 типа, и индукция пролиферации

в некоторых тканях димерами коротких изоформ ПрлР (Das and Vonderhaar, 1995;

РОС НАЦИОНАЛЬНА!I БИБЛИОТЕКА |

iFskm

Nokelainen et al, 1998). При этом специфика действия пролактина определяется, прежде всего, типом ткани-мишени, и присущим этому типу ткани соотношением изоформ ПрлР, а ответ ткани формируется из ответа ее клеточных элементов.

К настоящему моменту уже накоплено множество данных по экспрессии ПрлР и передаче его сигнала во многих тканях (Nagano and Kelly, 1994; Ouhtit et al, 1994; Morel et al, 1994), однако, за редкими исключениями (Yokoyama et al, 2003), только на уровне целого органа или на уровне перевиваемых клеточных линий (АН, 1998). Учитывая вышеизложенное, актуальным является сравнительное изучение экспрессии уровня ПрлР и соотношения его изоформ в разных клеточных элементах одной ткани и селективности их изменений в различных условиях. При этом оценка рецепторного звена пролактина может служить не только важнейшим инструментом для экспериментального анализа реактивности тканей при различных физиологических и патофизиологических состояниях, но и методом ранней диагностики, а также мишенью терапевтического воздействия в основных тканях-мишенях.

Ткани, зависимые от пролактина, относятся не только к репродуктивной оси, но включают иммунную систему, мозг, пищеварительный тракт. Печень является одной из центральных мишеней пролактина. Для изучения действия пролактина на печень (как, впрочем, и в остальных органах) необходимо знать его влияние на клеточные составляющие печени. Основным клеточным элементом печени являются гепатоциты, однако не меньшую функциональную нагрузку несут и эпителиальные клетки желчных протоков - холангиоциты, которые участвуют в секреции компонентов желчи и, в конечном итоге, формировании от 15 до 40% объема желчи, несмотря на то, что их доля в печени млекопитающих в норме составляет от 3 до 5% (Alpini et al, 1994).

Ранее в нашей лаборатории было установлено наличие избирательности влияния ряда факторов на экспрессию ПрлР в различных клеточных элементах печени: половые гормоны являются основными регуляторами ПрлР в гепатоцитах, в то время как для холангиоцитов, таким фактором является пролиферация, индуцированная, например, обструктивным холестазом (Петращук с соавт, 1996; Смирнова с соавт, 1998; Орлова с соавт, 1999). Однако, для установления характера пролактин-индуцируемого ответа клеток необходимо знать не только тотальный

уровень ПрлР, но также и соотношение их функционально различных изоформ в гепатоцитах и холангиоцитах при различных физиологических состояниях. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование на рецепторном уровне особенностей вклада разных клеточных элементов в суммарный ответ органа на пролактин при различных физиологических и патологических состояниях.

Для реализации настоящей цели нами были сформулированы следующие задачи:

1) Исследовать характер экспрессии ПрлР в различных клеточных элементах таких органов как яичники, матка, гипофиз, гипоталамус, печень самок крыс, для определения объекта дальнейших исследований - ткани, клеточные элементы которой обладают значимо различным и не гетерогенным уровнем ПрлР. В результате работы показано, что такой тканью является печень и ее основные клеточные элементы — гепатоциты и холангиоциты.

Необходимыми начальными этапами для решения дальнейших задач явились, во-первых, отработка в рамках настоящего исследования метода одновременного выделения гепатоцитов и холангиоцитов в виде фрагментов желчных протоков с проверкой качества разделения по дифференциальным маркерам и, во-вторых, отработка полуколичественного метода определения ПрлР и соотношения его изоформ на уровне мРНК, основанного на анализе накопления продуктов конкурентной полимеразной цепной реакции с применением внутреннего стандарта (Wang et al, 1997; Pi and Grattan, 1998).

Успешная отработка основных методов позволила сформулировать дальнейшие задачи:

2) оценить отличия гепатоцитов и холангиоцитов по тотальному уровню мРНК ПрлР, и уровням его короткой и длинной изоформ у самок крыс в норме;

3) исследовать действие половых гормонов на уровень мРНК ПрлР и соотношение его изоформ в гепатоцитах и холангиоцитах самок и самцов крыс;

4) проанализировать действие обструктивного холестаза на уровень мРНК ПрлР и соотношение его изоформ в гепатоцитах и холангиоцитах самок и самцов крыс. В рамках данной задачи важно было также оценить степень независимости действия обструктивного холестаза на экспрессию ПрлР от половых гормонов.

Поскольку прямая экспериментальная проверка эффективности и характера действия пролактина на разные типы клеток при описании состояний in vivo практически невозможна, необходимо было разработать альтернативный подход оценки особенностей ответа различных клеточных элементов печени на пролактин на основании уровня мРИК ПрлР и уровней мРНК его изоформ. Данная оценка позволит проанализировать вклад различных клеточных элементов в общий пролактин-индуцированный ответ органа. Таким подходом стала, разработанная нами, математическая модель для расчета эффективности разных типов действия пролактина на клетки и ее зависимости от уровня изоформ.

Это позволило поставить итоговую задачу: 5) оценить роль различных клеточных элементов печени в реализации и дискриминации эффектов пролактина на печень на основании математической оценки их ответа при различных физиологических и патологических условиях. Научная новизна. Установлено, что в яичниках, матке и печени экспрессия ПрлР существенно зависит от типа клеток. Обнаружено, что в отношении ПрлР холангиоциты отличаются от гепатоцитов в норме не только существенно более низким уровнем мРНК рецепторов, но и обратным соотношением их изоформ: в холангиоцитах, как и большинстве тканей, преобладает длинная изоформа рецепторов, в гепатоцитах же — короткая. Показано, что в отличие от большинства тканей в холангиоцитах половые гормоны не влияют ни на уровень мРНК ПрлР, ни на соотношение его изоформ. Выявлено также, что обструктивный холестаз является независимым от половых гормонов фактором регуляции экспрессии ПрлР, дифференциально действующим на разные клеточные элементы печени. В холангиоцитах он, в первую очередь, повышает уровень общей мРНК рецептора, а в гепатоцитах преимущественно влияет на соотношение изоформ. Отработан математический метод, который позволяет оценить вклад гепатоцитов и холангиоцитов в реализацию различных пролактин-индуцируемых каскадах у крыс разного пола в норме.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты, полученные в ходе настоящей работы, могут иметь значение для фундаментальной эндокринологии, так как не только расширяют представления о характере экспрессии ПрлР и их изоформ в основных клеточных элементах печени при различных функциональных

состояниях, но и позволяют оценить на основе этих данных соотношение и интенсивность эффектов пролактина, реализуемых через разные клеточные элементы и их вклад в реализацию эффектов в целой печени. Дифференциальная оценка разных форм рецепторов в различных клеточных элементах одного органа может широко применяться для анализа физиологических эффектов и их дискриминации на уровне ткани для большого числа различных гормонов и регуляторных веществ.

Практическая значимость полученных данных заключается в развитии представлений о половых отличиях в протекании патологических процессов в печени, например, индуцированных обструктивным холестазом; кроме того, получены новые данные об изменении чувствительности клеток печени к пролактину при обструктивном холестазе. Все эти данные позволяют направленно осуществлять поиск новых методов полепецифического фармакологического воздействия при различных болезнях печени.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на 6ой и 8ой Международной конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 1999, 2001), 11ОМ Международном конгрессе эндокринологов (Сидней, 2000), 4ОМ Всероссийском конгрессе эндокринологов (Санкт-Петербург 2001), 37ОМ Европейском конгрессе по изучению печени (Мадрид, 2002), 11ой Международной конференции «Математика. Компьютер. Образование» (Дубна, 2004), Объединенном конгрессе - 123* Международная конференция по системному подходу в молекулярной биологии, Зяя Европейская конференция по вычислительной биологии (Глазго, 2004), 120М Международном конгрессе эндокринологов (Лиссабон, 2004), на объединенных семинарах лаборатории эндокринологии МГУ и лаборатории гормонов и рецепторов ИМБ, на заседаниях кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. По теме диссертации опубликовано 12 работ. Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы описания материала и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 135 страницах, содержит 7 таблиц и 34 рисунка. Список литературы включает 251 источник.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Работа проводилась на половозрелых самцах и самках беспородных белых крыс весом 200-250 г, всего 83 животных.

Индуцированный обструктивный холестаз. Обструктивный холестаз индуцировали перевязкой общего желчного протока по методике, описанной Alpini et al, 1988. Животных забивали через 14 дней после операции для выделения клеток или забора тканей.

Гонаджтомия. Операцию проводили под легким эфирным наркозом согласно методике, описанной в Киршенбладт (1969). Часть животных через 2 недели подвергали перевязке общего желчного протока. Через 30 дней после гонадэктомии животных забивали для выделения клеток или тканей.

Параллельно с полными операциями нескольким животным делали ложные, которые исключали только воздействие на целевой орган.

Введение препаратов. Тестостерон-пропионат (3 мг/инъекция, в 0,2 мл пропиленгликоля) ежедневно в течение 3 дней вводили подкожно самцам через 30 дней после кастрации, эстрадиол (10 мкг/инъекция, в 0,2 мл пропиленгликоля) -вводили через 30 дней после овариэктомии в течение 3 дней подкожно. Ложно-оперированным и гонадэктомированным контрольным животным вводили соответствующий объем пропиленгликоля (Олейник с соавт, 1990). Животных забивали на 4ЫЙ день после начала введения препаратов для выделения РНК из ткани печени.

Отработка способа дифференциального выделения гепатоцитов и холангиоцитов

Основную часть экспериментов проводили на двух типах клеток печени (холангиоцитах и гепатоцитах), для чего в рамках настоящего исследования был отработан метод одновременного выделения гепатоцитов и холангиоцитов в виде фрагментов желчных протоков с проверкой качества разделения клеток по дифференциальным маркерам. Способ выделения фрагментов желчных протоков основан на методе предложенном группами проф. Алпини и Алваро (Alpini, Phillips et al, 1994; Alpini, Ulrich et al, 1994; Mennone et al, 1995; Alvaro et al, 1997). Контроль качества разделения проводили по морфологии и экспрессии

дифференциальных маркеров (рис. 1): для гепатоцитов - это глюкозо-6-фосфатаза, а для холангиоцитов - цитоксратин-19 (Афт Ы а1, 1994).

Рис. 1. Проверка качества дифференциального выделения различных типов клеток печени.

Микрофотография неокрашенных препаратов а - участки портального дерева, очищенного от гепатоцитов, цена деления - 0,5 см; б - изолированный фрагмент желчного протока- хл - холангиоцит, пр - просвет протока, цена деления 25 мкм, в — изолированные гепатоциты, цена деления 25 мкм.

г - амплифицированные методом ПЦР участки кДНК дифференциальных маркеров (холангиоцитов - цитокератин 19, Цк-19, гепатоцитов - глюкозо-6-фосфатаза, Гл-бФ), разделенные в агарозном геле и окрашенные бромистым этидием Дорожки 1 - печень интастной самки, 2 - печень самки с обструктивным холестазом, 3 - изолированные гепатоциты самки с обструктивным холестазом, 4-7 - изолированные холангиоциты самок: нормальных - 4,6 и с обструктивным холестазом - 5,7, М - маркеры длины, п н.

Иммуногистохимическая идентификация рецепторов пролактина и цитофотометрический анализ

Локализацию ПрлР в тканях крыс определяли непрямым иммунопероксидазным методом (Smirnova et al, 1994). Срезы фиксированной ткани, заключенные в парапласт, инкубировали после гидратации g мышиными моноклональными антителами (клон U5) против ПрлР крысы. В качестве хромогена использовали 3,3'-диаминобензидин.

Цитофотометрические измерения проводили на фотометрирующем микроскопе ЛЮМАМ И-3 при длине волны 520 нм, используя световой зонд диаметром 2,5 мкм.

Отработка метода полуколичественной оценки уровня мРНК рецептора пролактина и соотношения его короткой и длинной изоформ с использованием внутреннего стандарта

Метод полуколичественной оценки содержания мРНК ПрлР и соотношения его изоформ разрабатывали на основе анализа накопления радиоактивных специфических продуктов, соответствующих общему участку кДНК ПрлР, участку кДНК короткой изоформы ПрлР, и участку кДНК длинной изоформы, в гюлимеразной цепной реакции с внутренним стандартом (ген домашнего хозяйства - р-актин) (Pi and Grattan, 1998; Wang et al, 1997).

Разработка метода математической оценки активности пролактин-индуцированных сигнальных каскадов в тканях крысы, на основе измеренных уровня мРНК рецепторов пролактина и соотношения его изоформ

Для анализа физиологических последствий изменений уровня мРНК ПрлР и соотношения его изоформ нами была разработана математическая модель, позволяющая применить данные об активации пролактин-индуцированных каскадов, полученные in vitro, к данным об экспрессии ПрлР, измеренным in vivo.

Известные литературные данные по проведению сигнала ПрлР были формализованы в виде бимолекулярных уравнений химической кинетики. Константы скоростей реакций взяты из литературы (Gertler et al, 1997). Интенсивность пролактин-индуцируемых каскадов оценивалась как количество соответствующих пролактин-индуцированных димеров рецепторов в стационарном

состоянии. Интенсивность пути тирозинкиназ Януса/STAT белков, активируемых иролактином, определяется как количество комплексов пролактина с димером длинных изоформ ПрлР. Комплексы пролактина с гетеродимерами короткой и длинной изоформ ПрлР считаются неактивными. Комплексы пролактина с димером коротких изоформ ПрлР также не активируют каскад тирозинкиназ Януса/STAT белков, но определяют интенсивность предполагаемых тканеспецифических каскадов например (Das and Vonderhaar, 1994; Duan et al, 1997).

Адекватность модели, верифицировали с помощью экспериментальных данных, взятых из статей Goffin et al, 1996, Berlanga et al, 1997 и др. Собственные данные по содержанию мРНК ПрлР и соотношению короткой и длинной изоформ использовались для оценки интенсивности пролактин-индуцируемых каскадов в гепатоцитах и холангиоцитах крыс в разных физиологических состояниях: подставляя в модель измеренные данные, рассчитывали стационарные значения концентраций различных комплексов: интенсивность Jak/STAT пути концентрация комплекса пролактина с димером длинных изоформ ПрлР; комплексы пролактина с гетеродимерами короткой и длинной изоформ ПрлР считали неактивными; интенсивность предполагаемых тканеспецифических каскадов - комплексы пролактина с димером коротких изоформ ПрлР. Статистическая обработка данных

Статистический анализ результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0 («Statsoft Inc.», США). Проверку на соответствие выборок нормальному распределению проводили с использованием критериев: Хи-квадрат, Колмогорова-Смирнова, Шапиро-Уилкса: результаты цитофотометрического анализа экспрессии ПрлР соответствовали нормальному распределению и для них использовались параметрические критерии, для результатов анализа уровня мРНК ПрлР и соотношения его изоформ использовали непараметрические аналоги. Проводили анализ гетерогенности выборок с помощью параметрического метода ANOVA или его непарамстрического аналога - тест ANOVA Крускала-Уоллиса. Группы, для которых была доказана гетерогенность, анализировали попарно. Для анализа значимости наблюдаемых различий использовали t-критерий Стьюдента, и в качестве непараметрического аналога U тест Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Обоснование выбора ткани. Для выбора наиболее удачного объекта исследований мы, в первую очередь, провели иммуногистохимическое исследование зависимости экспрессии ПрлР от типа клеток в ряде органов самок крыс (яичниках, матке, гипофизе, гипоталамусе, печени) (рис. 2). Это позволило определить ткань, клеточные элементы которой обладают значимо различным и не гетерогенным уровнем ПрлР, и могут быть дифференциально изолированы.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Рис. 2. Цитофотометрический анализ интенсивности экспрессии рецепторов пролактина в клетках разного типа некоторых тканей самок крыс в период раннего эструса (здесь и на последующих рисунках данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего).

Яичники яйцеклетки (1), клетки гранулезы, по слоям в стенке проовулировавших фолликулов - внутренний (2), промежуточный (3), наружный (4), клетки желтых тел (5), интерстициальные клетки (б); Матка клетки желез эндометрия (7), клетки стромы эндометрия (8),клетки миометрия (9); Гипофиз: клетки переднего гипофиза (10); Гипоталамус, клетки гипоталамуса (11); Печень гепатоциты (12), холангиоциты (13). Достоверные отличия (р<0,05). * внутреннего от среднего и наружпого слоев гранулезных клеток фолликула; ** - клеток стромы эндометрия и миометрия от железистых клеток эндометрия; *** холангиоцитов отгепатоцитов.

Установлено, что этим критериям отвечает печень, основные клеточные элементы которой, гепатоциты и холангиоциты, контрастно различаются по уровню ПрлР. Ранее показано, что существуют физиологические (половое созревание) и патологическое (обструктивный холестаз) состояния, при которых интенсивность экспрессии ПрлР избирательно растет в холангиоцитах (Орлова с соавт, 1999), в то время как при других состояниях (изменение уровня половых стероидов) она избирательно изменяется в гепатоцитах (Бпипшуа е1 а1, 1994;

Garcia-Caballero, 2001; Klochn et al, 2001). Все это заставляет предположить, что данные клеточные элементы являются удачной моделью для исследования формирования ответа органа, и для оценки селективного вклада различных типов клеток в суммарный ответ на пролактин при физиологических и патологических изменениях.

2. Уровень мРНК рецептора пролактина и соотношение его изоформ в гепатоцитах и холангиоцитах самок крысы в норме. Количественная оценка уровня ПрлР и, особенно, соотношения его изоформ вплоть до последнего времени проводилась в печени лишь на уровне целой печени. Только в немногих работах проводились исследования in situ на различных клеточных элементах (Ouhtit et al, 1993, 1994), возможно в связи с трудоемкостью этого подхода. В более ранних работах было иммуногистохимически показано, что не только гепатоциты, но и другой важнейший тип клеток печени - холангиоциты - в определенных условиях экспрессирует ПрлР (Петращук с соавт, 1996; Орлова с соавт, 1998). Для определения характера ответа клеток, индуцированного пролактином, необходимо тестировать уровень и соотношение изоформ ПрлР. Иммуногистохимических методов идентификации изоформ ПрлР на данный момент не разработано. Самым надежным методом выявления изоформ ПрлР на настоящее время является их идентификация на уровне мРНК в дифференциально изолированных клетках. Мы провели полуколичественный анализ уровня мРНК ПрлР с внутренним контролем в гепатоцитах и холангиоцитах крыс в норме.

Показано, что в дифференциально изолированных гепатоцитах самок уровень мРНК ПрлР относительно высокий. При этом основная изоформа в гепатоцитах - короткая. Нам впервые удалось охарактеризовать холангиоциты с точки зрения уровней изоформ ПрлР в этих клетках. Установлено, что в отношении ПрлР холангиоциты отличаются от гепатоцитов в норме не только существенно более низким уровнем мРНК ПрлР, но и обратным соотношением их изоформ: в холангиоцитах, как и большинстве тканей, основной является длинная изоформа рецептора, более того короткая изоформа ПрлР в нормальных холангиоцитах не выявляется (рис. 3). Такие, достаточно существенные отличия в характере экспрессии ПрлР в этих двух клеточных типах позволяют предположить разные механизмы регуляции как транскрипции гена ПрлР, так и альтернативного

процессинга его пре-мРНК, учитывая, что выбор альтернативных экзонов в пре-мРНК ПрлР в гепатоцитах и холангиоцитах в норме носит противоположенную направленность. Экспрессия разных изоформ ПрлР предполагает, что если в гепатоцитах в норме доминирует «тканеспецический» пролактин-индуцированный ответ, то в холангиоцитах - это общие реакции, связанные с пролиферацией и т.д.

1 2345 6789 ЮМ

Рис. 3. Выявление продуктов амплификации кДНК изоформ рецептора пролактина в холангиоцитах разных групп крыс в сравнении с выявленными в гепатоцитах самок крыс с обструктивным холестазом (40 циклов ПЦР).

Короткая (ПрлРк, дорожки 1-5) и длинная (ПрлРд, дорожки 6-10) изоформы рецептора пролактина: в холангиоцитах: интактного самца — дорожки 1,6; интактной самки -дорожки 2,7; самца с обструктивным холестазом - дорожки 3,8; самки с обструктивным холестазом - дорожки 4,9; в гепатоцитах самки с обструктивным холестазом - дорожки 5,10. р-актин - внутренний контроль амплификации. М - маркеры длины, цифрами отмечены длины фрагментов ДНК, п.о.

Таким образом, полученные нами данные по уровню и соотношению изоформ мРНК ПрлР демонстрируют еще более радикальные отличия в характере экспрессии ПрлР в гепатоцитах и холангиоцитах, чем было выявлено иммуногистохимическими методами на уровне белка.

2. Влияние половых гормонов на уровень мРНК рецептора пролактина и соотношение изоформ в гепатоцитах и холангиоцитах крыс Влияние на гепатоциты. Установлено, что в гепатоцитах уровень ПрлР и соотношение его изоформ определяется, во многом, действием половых гормонов. Влияние половых гормонов на уровень ПрлР разнонаправлено (Рис. 4): эстрогены его повышают, а андрогены снижают; эти данные согласуются с известными

результатами, полученными на целой печени (Sakaguchi et я1, 1994). Нами впервые получено свидетельство того, что половые гормоны действуют однонаправлено на соотношение изоформ ПрлР в гепатоцитах, повышая долю короткой малоактивной формы (см. табл. 1). Эти результаты были дополнительно подтверждены при введении половых гормонов.

® 3 -о

2 л

ш . m 1 о

■

о ü" т 02 л г ш о о

2 1 1

самцы

гонадэкт. самцы

самки гонадэкт. самки Рис. 4. Влияние гонадэктомии на содержание мРНК рецептора пролактина в гепатоцитах крыс: А - самки и Б- самцы

Уровень значимости отличий (р<0,05): * - между гонадэктомированными и нормальными животными; ** между интактными животными разного пола. о.е. - относительные единицы.

Влияние на холангиоциты. Показано, что в отличие от большинства тканей в холангиоцитах половые гормоны не влияют ни на уровень мРНК ПрлР, ни на соотношение его изоформ (см. табл. 1).

Таблица 1. Соотношение мРНК короткой и длинной изоформ рецептора пролактина в

Группы Группы без обструктивного холестаза Группы с обструктивным холестазом

Гепатоциты Холангиоциты Гепатоциты Холангиоциты

Самки 10,2±0,6 б1 1,6±0,2а 0,5±0,04а

Самцы 4,0±0,3° 0 1,7±0,2а 0,5±0,1а

Овариэктомир. самки 2,8±0,2" 0 1,4±0,1а 0,4±0,05а

Кастрированные самцы ' 2,7±0,1в 0 1,6±0,5а 0,4±0,06а

- o.e. - относительные единицы (отношение мРНК короткой изоформы к мРНК длинной) 2 - короткая изоформа рецептора пролактина не выявляется; Уровень значимости различий (р<0,05):

а у групп с обструктивным холестазом и без него;6 в гепатоцитах интактных самцов и интактных самок;" в гепатоцитах гонадэктомированных и интактных животных.

Полученные результаты позволяют предположить, что половые гормоны

играют важнейшую роль не только в поддержании дифференцированного по полу

уровня ПрлР в гепатоцитах, но и в установлении доминирования в этих клетках короткой изоформы ПрлР, а значит реализации в гепатоцитах тканеспецифических сигналов пролактина. Доминирование в холангиоцитах длинной формы ПрлР свидетельствует о том, что в них, в отличие от гепатоцитов, основным путем реализации сигнала пролактина является каскад киназ Януса и факторов транскрипции STAT, тесно связанный с дифференцировкой и пролиферацией. При этом половые стероиды практически не принимают участия в регуляции соотношений сигнальных путей, активируемых пролактином в клетках желчных протоков.

3. Влияние обструктивного холестаза на уровень мРНК рецептора пролактина и соотношение изоформ в гепатоцитах и холангиоцитах крыс

Установлено, что обструктивный холестаз регулирует параметры экспрессии ПрлР и в холангитоцитах, и гепатоцитах. В гепатоцитах он влияет, практически исключительно, на соотношение изоформ рецептора, т.е. на направление альтернативного сплайсинга (см. табл. 1), повышая долю длинной изоформы, обладающей широким спектром активностей и не изменяя общий уровень рецептора (рис. 5). Действие обструктивного холестаза на уровень мРНК ПрлР в гепатоцитах самцов лишь отчасти сочетается с эффектом мужских половых гормонов.

самки гонадэкг. самки самцы гонадэкг. самцы

Рис. 5. Влияние обструктивного холестаза на содержание мРНК рецептора пролактина в гепатоцитах опытных групп крыс. Светлые столбики - группы без обструктивного холестаза, темные столбики - группы с обструктивным холестазом; о.е. - относительные единицы. * /?<0,05, уровень значимости различий между самцами крыс с обструктивным холестазом и без него.

В холангиоцитах обструктивный холестаз в первую очередь действует именно на общий уровень, существенно повышая его (рис. 6). Действие обструктивного холестаза на выбор альтернативных экзонов пре-мРНК ПрлР в холангиоцитах имеет противоположную направленность по сравнению с гепатоцитами, т.е. способствует появлению короткой изоформы рецептора (см. табл. 2,3).

Таблица 3. Содержание мРНК изоформ ПрлР в холангиоцитах разных групп крыс (о.е'.± стандартная ошибка среднего)

Группы Группы без обструктивного холестаза Группы с обструктивным холестазом

Короткая изоформа Длинная изоформа Короткая изоформа Длинная изоформа

Сачки 0,10±0,01 0,11±0,02а 0,28±0,02а

Самцы - 0,11±0,01 0,11±0,01а 0,24±0,03а

Овариэктомир. самки - 0,08±0,02 0,11±0,011 0,30±0,01*

Кастрированные самцы - 0,09±0,01 0,10±0,02а 0,21±0,02а

1 - o.e. - относительные единицы (отношение мРНК изоформ ПрлР к мРНК ß-актина);

2 - не выявляется;

ар<0,05 уровень значимости у групп с обструктивным холестазом и без него.

Кроме того, необходимо отметить, что действие обструктивного холестаза в холангиоцитах не зависит от действия половых гормонов, а в гепатоцитах лишь отчасти сочетается с действием мужских половых гормонов.

Полученные результаты позволяют предположить, что обструктивный холестаз существенно сдвигает направление пролактин-индуцированных сигнальных каскадов, реализуемых в клетках печени в норме. В гепатоцитах, по-видимому, возрастает роль пути активации тирозинкиназ Януса/STAT белков, связанного с длинной формой ПрлР, и характерного, для многих, в том числе и репродуктивных тканей. В холангиоцитах изменения носят более сложный характер, существенно усиливается данный путь, наряду с этим начинает проявляться тканеспецифический путь, связанный с короткой изоформой.

Однако, для того, чтобы сопоставить характер экспрессии ПрлР с дифференциальным вкладом пролактин-индуцированных каскадов в гепатоцитах и холангиоцитах в ответ целой печени на пролактин необходимо использовать специальные подходы (см. ниже).

4. Математическая оценка эффективности действия пролактина на гепатоциты и холангиоциты в различных состояниях. Проведенная с помощью разработанной математической модели оценка интенсивности пролактин-индуцируемых каскадов, позволила заключить, что у интакных самок и самцов крыс, несмотря на больший суммарный уровень ПрлР в гепатоцитах, чем в холангиоцитах, интенсивность пролактин-индуцированных каскадов тирозинкиназ Януса/8ТЛТ белков в последних даже выше (см. табл. 4). Это позволяет предположить, что, несмотря на низкую представленность холангиоцитов в нормальной печени, вклад этих клеток в пролактин-индуцированный ответ органа, связанный с пролиферацией клеток и дифференцировкой вполне сопоставим с вкладом гепатоцитов.

Анализ данных, проведенный с помощью математической модели высветил существенные половые отличия сдвига пролактин-индуцируемых каскадов в гепатоцитах при обструктивном холестазе. Если у самок интенсивность пролактин-индуцированной активации тирозинкиназ Януса в гепатоцитах возрастает более чем на порядок, то у самцов она не претерпевает практически никаких изменений (см. табл. 4). В холангиоцитах при обструктивном холестазе также существенно растет интенсивность пролактин-индуцированной активации тирозинкиназ Януса, причем у самок и самцов практически в равной степени. Этот факт, в сочетании с интенсивной индуцированной пролиферацией желчных протоков, позволяет предположить еще большее увеличение вклада холангиоцитов в реализацию пролактин-индуцированного ответа печени при обструктивном холестазе.

Таблица 4. Относительная интенсивность пролактин-индуцированного каскада тирозинкиназ Януса/STAT, предсказанная с помощью математической модели (%)'

Гепатоциты Холангиоциты

Животные без ОХ2 Животные с ОХ Животные без ОХ Животные с ОХ

Самки 100% 1880% 240% 1878%

Самцы 28% 28% 303% 1370%

Овариэкт. самки 139% 341% 141% 2116%

Кастрированные самцы 154% 203% 179% 1030%

"Рассчитывается как уровень пролактин-индуцированных димеров длинной формы по отношению к таковому уровню в гепатоцитах интактных самок; 2 ОХ - индуцированный обструктивный холестаз.

Данная модель позволяет также рассмотреть соотношение сигнальных каскадов, индуцируемых разными димерами ПрлР: пути тирозинкиназ Януса/STAT белков, индуцируемого димерами длинной изоформы, и предполагаемого «тканеспецифический» каскада, индуцируемого димерами коротких изоформ ПрлР. Если в гепатоцитах интактных самок доля пути киназ Януса/STAT белков составляет менее 1% от предсказанной общей интенсивности всех пролактин-индуцированных сигналов, то у самцов эта доля составляет в норме более 5%. У гонадэктомированных животных обоих полов она достигает в среднем 9%. При обструктивном холестазе возрастает до 20% независимо от половых гормонов (см. рис. 7).

В холангиоцитах интакных самок и самцов крыс доля пролактин-индуцированного каскада тирозинкиназ Януса/STAT белков составляет практически 100%, доля тканеспецифических путей, индуцируемых димерами коротких изоформ ПрлР, составляющая в норме ничтожный процент от общего пролактин-индуцированного сигнала в холангиоцитах, в холангиоцитах животных с обструктивным холестазом превышает 10% (см. рис. 7). ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы исследовали характер экспрессии ПрлР в двух основных клеточных элементах печени крыс в различных функциональных состояниях. Как показано в настоящей работе, уровень ПрлР и соотношение его изоформ в печени самок в норме (Nagano and Kelly, 1994) в первом приближении хорошо отражают параметры экспрессии ПрлР в гепатоцитах, однако совершенно не ясна ситуация с остальными типами клеток печени, и в первую очередь с холангиоцитами.

В рамках настоящей работы впервые удалось охарактеризовать холангиоциты с точки зрения экспрессии изоформ ПрлР: в этих клетках у самцов и самок в норме ПрлР практически полностью представлен длинной изоформой. Важно также отметить, что если в гепатоцитах характер экспрессии ПрлР имеет четко выраженную половую зависимость: у самок уровень ПрлР существенно выше, а также более выражено преобладание короткой изоформы, то в холангиоцитах уровень ПрлР относительно низок и не зависит от пола.

Рис. 7. Соотношение пролактин индуцированных сигнальных каскадов в гепатоцитах и холангиоцитах крыс разных групп, предсказанное с помощью математической модели. Гонадэктомированные самки и самцы объединены в общие группы.

Черный сектор - доля пролактин-индуциров'анного каскада тирозин киназ Януса/8ТЛТ белков (димеров длинных изоформ рецептора пролактина); серый сектор - доля пролактин-индуцированных «тканеспецифических» каскадов (димеров коротких изоформ рецептора пролактина); белый сектор - доля пролактин-индуцированных неактивных комплексов (гетеродимеров коротких и длинных изоформ рецептора пролактина).

Рассмотренные нами воздействия (половые гормоны и обструктивный холестаз) на экспрессию ПрлР в гепатоцитах и холангиоцитах приводят к не однонаправленным изменениям уровня и соотношения изоформ ПрлР в этих типах клеток. Показано, что половые гормоны действуют на экспрессию ПрлР только в гепатоцитах, разнонаправлено влияя на уровень мРНК ПрлР и однонаправлено на соотношение изоформ. Обструктивный холестаз оказывает свое воздействие на мРНК ПрлР и гепатоцитов, и холангиоцитов. Но, если в гепатоцитах он действует практически только на соотношение изоформ, то в холангиоцитах и на уровень, и на соотношение.

Такой характер изменений позволяет предположить разную роль гепатоцитов и холангиоцитов в реализации эффектов пролактина при различных физиологических и патологических состояниях.

С помощью математической модели удалось количественно оценить соотношение интенсивности пролактин-индуцированного каскада киназ Януса/STAT белков в гепатоцитах самок и самцов. Кроме того, установлено, что в печени нормальных животных гепатоциты и холангиоциты вносят практически равный вклад в активацию каскада, связанного с киназами Януса/STAT белками и играющего роль в индукции дифференцировки и пролиферации (у самцов роль холангиоцитов еще более выражена, чем у самок); однако преобладающим (от 76 до 90%) для целого органа являются тканеспецифические сигнальные каскады сопряженные с короткой изоформой гепатоцитов. Обструктивный холестаз пол-специфично изменяет интенсивность каскада тирозинкиназ Януса/STAT белков в гепатоцитах: у самок он возрастает в 18 раз по сравнению с нормой, при этом у самцов его интенсивность практически не возрастает. Этот результат может иметь значение для объяснения пол-зависимого развития некоторых патофизиологических состояний, например, преобладания компенсаторной пролиферации гепатоцитов у самок, а фиброзного перерождения печени у самцов при развитии обструктивного холестаза.

Математическая модель позволила выявить, что обструктивный холестаз повышает в холангиоцитах интенсивность пролактин-индуцированного каскада киназ Януса/STAT белков практически в 8 раз по сравнению с нормальными холангиоцитами, при этом, в отличие от гепатоцитов, в холангиоцитах самок и

самцов изменения пролактин-индуцированного каскада тирозинкиназ Януса/STAT белков при действии обструктивного холестаза одинаковы. Доля тканеспецифических путей, индуцируемых димерами коротких изоформ ПрлР, составлявшая в норме ничтожный процент от общего пролактин-индуцированного сигнала в холангиоцитах, в холангиоцитах животных с обструктивным холестазом достигает примерно 15%.

Полученные данные по изменениям экспрессии ПрлР и проистекающие из них, предсказанные в настоящей работе изменения эффективности и направленности действия пролактина, дают возможность предположить возможные направления регуляторной активности пролактина в печени при обструктивном холестазе. Так, усиление пролактин-индуцированного каскада киназ Януса/STAT белков, возможно, указывает на компенсаторную роль регуляции пролактина в гепатоцитах. В гепатоцитах пролактин стимулирует сигнальные пути, регулирующие белки семейства цитохромов Р450, которые позволяют снять интоксикацию гепатоцитов, за счет увеличения скорости превращения токсинов (Розен с соавт, 1991), регулирующие транспортеры желчных кислот в кананникулярный просвет (Ganguly et al, 1995; Liu et al, 1995). Кроме того, пролактин, по-видимому, участвует в стимуляции компенсаторной пролиферации гепатоцитов, в ответ на токсин-стимулированную их гибель.

В холангиоцитах пролактин за счет усиления активации каскада киназ Я1гуса/8ТАТ белков, вероятно, стимулирует пролиферацию желчных протоков, увеличение их полости и, таким образом, снижает внутреннее давление в системе желчных протоков. Усиливая экспрессию белка, реабсорбирующего желчные кислоты из просвета протоков, пролактин стимулирует выведение токсичных желчных кислот через альтернативный путь - почки (Trauner et al, 1999).

Таким образом, дифференциальная регуляция уровней изоформ рецептора пролактина в разных клеточных элементах одной ткани может служить механизмом дискриминации тканеспецифического ответа на уровне органа. В случае формирования пол-специфичности функций печени, а также изменения уровня половых стероидов изменение реакции печени на пролактин опосредуется, в первую очередь, гепатоцитами, в то время как при обструктивном холестазе существенную роль играют холангиоциты, это определяется как их все более

возрастающей долей в печени, так и резко увеличившимся уровнем ПрлР в этих клетках.

ВЫВОДЫ

1. На примере яичников, матки и печени крыс показано, что в разных типах клеток внутри одного органа интенсивность экспрессии рецепторов пролактина существенно различается. При этом, для печени, в отличие от других исследованных органов, характерна однородность уровня экспрессии рецепторов пролактина внутри каждого клеточного типа: и гепатоцитов, и холангиоцитов.

2. Обнаружена клеточная специфичность экспрессии рецепторов пролактина в печени крыс в норме, заключающаяся в разном уровне мРНК рецептора - относительно низком в холаш иоцитах, и, напротив, высоком в гепаюцитах -, а также в соотношении изоформ рецептора — в гепатоцшах доминирует короткая, в то время как в холангиоцитах выявляется только длинная изоформа рецептора.

3. Выявлены различия в регуляции экспрессии рецептора пролактина в гепатоцитах и холангиоцитах крыс половыми гормонами. На уровень мРНК рецепторов пролактина в гепатоцитах крыс женские и мужские половые гормоны действуют реципрокно, соответственно повышая и понижая его, а на соотношение изоформ рецепторов оба типа гормонов влияют однонаправлено, повышая долю короткой изоформы. В холангиоцитах женские и мужские половые гормоны не влияют ни на уровень мРНК рецепторов пролактина, ни на представленность изоформ рецептора.

4. Обструктивный холестаз дифференциально регулирует характер экспрессии рецепторов пролактина в генатоцитах и холангиоцитах: в гепатоцитах он действует преимущественно на соогношение изоформ рецепторов пролактина, повышая долю длинной изоформы независимо от пола животных. В холангиоцитах он существенно повышает общий уровень мРНК рецепторов пролактина, главным образом, за счет длинной изоформы, и индуцирует появление короткой. Действие обструктивного холестаза на экспрессию рецепторов пролактина в холапгиоцитах не зависит от пола.

Януса/STAT, ассоциированного с димерами длинных изоформ, у самцов практически не изменяет этот параметр. В холангиоцитах обструктивный холестаз также повышает интенсивность сигнала тирозинкиназ Януса/STAT белков (в 7,5 раз) независимо от пола, при этом в данном типе клеток также увеличивается доля каскадов, ассоциированных с димерами коротких изоформ рецептора пролактина.

Список печатных работ по теме диссертации

1. Богорад Р.Л., Коток Т, Смирнов А.Н., Туровецкий В.Б., Смирнова О.В. Экспрессия рецепторов пролактина в тканях репродуктивной оси крысы при дисбалансе пролактина в периовуляторный период // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2000 - Т.129. - №6 - С.712-716.

2. Коток Т., Богорад Р.Л., Смирнов А.Н., Туровецкий В,Б., Смирнова О.В.

• Влияние периовуляторного дисбаланса пролактина на экспрессию рецепторов

пролактина в клетках яичника крысы // Онтогенез - 2000 - Т.31 - №2. - С. 144151.

3. Bogorad R.L., Kotok Т., Smirnova O.V., Peryovulatory hyperprolactenemia: effect of the mode of prolactin receptor expression in rat reproductive organs // 11th International Congress of Endocrinology. Abstract book - Sidney, Australia - 2000, p.114.

4. Богорад Р.Л., Смыслова B.C. Изменение экспрессии форм мРНК рецептора пролактина в гепатоцитах самок крыс после перевязки общего желчного протока // Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» выпуск 6 - Москва - 2001 - с.495.

5. Богорад Р.Л., Смыслова B.C., Смирнов А.Н., Рубцов П.М., Смирнова О.В. Соотношение изоформ мРНК Рецептора пролактина гепатоцитов крыс: влияние обструктивного холестаза // Молекулярная Биология - 2002 - Т.36 - №1 - С.91-93.

6. Bogorad R.L., Rubtsov P.M., Smirnova O.V. Cholestasis induces shift of the short and long prolactin receptor (PrlR) mRNA isoform ratio in rat hepatocytes // Journal of Hepatology - 2002 - v.36 - s.l - p.68.

7. Смирнова О.В., Богорад Р.Л. Короткие формы мембранных рецепторов: образование и роль в проведении гормонального сигнала // Биохимия - 2004 -Т.69-№4-С.437-452.

8. Богорад Р.Л., Киликовский В.В. Разработка модели для предсказания силы ответа клеток-мишеней крысы на пролактин // Математика. Компьютер. Образование. Тезисы - Москва-Ижевск - 2004 - с.189.

9. Bogorad R.L., Kilikovski V.V., Smimova O.V. Mathematical prediction of intensity of prolactin-induced signal cascade in rat target tissues // 12th International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB)/ 3rd European conference on computational Biology (ECCB). Conference programme. - Glasgow, UK-2004-p. 180.

10. Bogorad R., Zenkova Т., Rubtsov P., Smirnova O. Prolactin receptors level and isoform ratio are differently regulated in rat cholangiocytes and hepatocytes under normal and cholestatic conditions // 12th International Congress of Endocrinology. Program and Abstract book - Lisbon, Portugal - 2004 - p.207.

11. Bogorad R., Kilikovski V., Smirnova O. Theoretical evaluation of degree of prolactin-induced JAK/STAT cascade activation from prolactin receptor (PrlR) level and its isoforms ratio in rat hepatocytes with different sex hormone status. // 12th International Congress of Endocrinology. Program and Abstract book - Lisbon, Portugal - 2004 - p.207.

12. Богорад Р.Л., Зенкова Т.Ю., Рубцов П.М., Смирнова П.М. Влияние обструктивного холестаза и половых гормонов на соотношение двух альтернативных изоформ мРНК рецептора пролактина в гепатоцитах крысы // Биохимия - 2004-Т.69-№10-С. 1371-1380.

Отпечатано в копицентре Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел. 939-3338 Заказ № 64 тираж 100 экз. Подписано в печать 06.10.2004 г.

i î 8 3 9 í

РНБ Русский фонд

2005-4 14696

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Богорад, Роман Львович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. РЕАЛИЗАЦИЯ ЭФФЕКТОВ ПРОЛАКТИНА В КЛЕТОЧНЫХ ЭЛЕМЕНТАХ ПЕЧЕНИ (литературный обзор).

1.1. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ.

1.1.1. Строение печени, ее клеточный состав.

1.1.2. Физиологические функции печени. Участие различных клеточных элементов.

1.1.3. Функции клеток печени при развитии некоторых патологических/компенсаторных состояний.

1.1.3.1. Регенерация печени.

1.1.3.2. Фиброгенез.

1.1.3.3. Холестаз.

1.2. ФУНКЦИИ ПРОЛАКТИНА.

1.2.1. Общие положения.

1.2.2. Секреция пролактина.

1.2.3. Функции пролактина.

1.2.4. Действие пролактина на отдельные клеточные элементы печени.

1.2.4.1. Действие на гепатоциты.

1.2.4.2. Действие на холангиоциты.

1.3. РЕЦЕПТОРЫ ПРОЛАКТИНА И РЕАЛИЗАЦИЯ ЕГО ЭФФЕКТОВ.

1.3.1. Особенности строения рецептора пролактина.

1.3.2. Строение гена рецептора пролактина и его транскрипция.

1.3.3. Сравнительный анализ изоформ рецептора пролактина млекопитающих. Механизмы образования.

1.3.4. Механизм действия пролактина через собственные рецепторы.

1.3.4.1. Димеризация рецепторов.

1.3.4.2. Участие внутриклеточных белков-посредников в проведении сигнала рецепторов пролактина.

1.3.4.3. Интернализация и ядерная транслокация.

1.3.4.4. Роль короткой и длинной форм рецептора пролактина в проведении сигнала.

1.3.4.5. Процессинг рецептора.

1.3.5. Регуляция экспрессии мРНК рецептора пролактина.

1.3.5.1. Уровень рецепторов пролактина. Регуляция транскрипции.

1.3.5.2. Регуляция альтернативного сплайсинга пре-мРНК рецептора пролактина: соотношения короткой и длинной изоформ.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ.

2.1.1. Животные.

2.1.2. Реактивы.

2.2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ.

2.2.1. Хирургические операции.

2.2.1.1. Индуцированный обструктивный холестаз.

2.2.1.2. Кастрация самцов.

2.2.1.3. Овариэктомия самок.

2.2.2. Введение препаратов.

2.2.3. Приготовление препаратов клеток и тканей для анализа.

2.2.3.1. Подготовка тканей для иимуногистохимического анализа.

2.2.3.2. Подготовка ткани печени для ПЦР-анализа.

2.2.3.3. Разработка способа дифференциального выделения гепатоцитов и холангиоцитов.

2.2.4. Иммуногистохимическая идентификация рецепторов пролактина в тканях крыс.

2.2.4.1. Приготовление срезов.

2.2.4.2. Иммуногистохимическая идентификация рецепторов пролактина.

2.2.5. Цитофотометрическое определение интенсивности ПрлР-позитивного окрашивания.

2.2.6. Выделение РНК из тканей и изолированных клеток.

2.2.7. Синтез первой цепи на выделенной РНК.

2.2.8. Введение метки в олигонуклеотиды.

2.2.9. Постановка полимеразной цепной реакции.

2.2.10. ДНК-блотинг (Саузерн-гибридизация).

2.2.11. Клонирование фрагментов короткой и длинной изоформ рецепторов пролактина.

2.2.12. Разработка метода полуколичественной оценки уровня мРНК рецептора пролактина и соотношения его короткой и длинной изоформ с использованием внутреннего стандарта.

2.2.12.1. Уровень мРНК рецепторов пролактина.

2.2.12.2. Соотношение и уровень мРНК короткой и длинной изоформ рецепторов пролактина.

2.2.12.3. Обоснование контрольной группы.

2.2.13. Разработка метода количественного сопоставления уровня мРНК рецептора пролактина в гепатоцитах и холангиоцитах с использованием внешнего стандарта.

2.3. ВЫЧИСЛИТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ.

2.3.1. Разработка метода математической оценки активности пролактин-индуцированных сигнальных каскадов в тканях крысы, на основе измеренных уровня мРНК рецепторов пролактина и соотношении его изоформ.

2.3.1.1. Формулировка модели.

2.3.1.2. Верификация модели.

2.3.2. Статистическая обработка данных.

Глава 3. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА В КЛЕТКАХ РАЗНОГО ТИПА САМОК КРЫС.

3.1. СУБКЛЕТОЧНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПРЛР-СПЕЦИФИЧНОЙ

• ОКРАСКИ

3.2. ЯИЧНИКИ.

3.2.1. Фолликулы яичников.

3.2.2. Желтые тела.

3.3. МАТКА.

3.4. ГИПОФИЗ И ГИПОТАЛАМУС.

3.5. ПЕЧЕНЬ.

Глава 4. УРОВЕНЬ мРНК РЕЦЕПТОРА ПРОЛАКТИНА И СООТНОШЕНИЕ ЕГО ИЗОФОРМ В ГЕПАТОЦИТАХ И ХОЛАНГИОЦИТАХ САМОК КРЫСЫ В НОРМЕ.

Глава 5. ВЛИЯНИЕ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ НА УРОВЕНЬ мРНК РЕЦЕПТОРА ПРОЛАКТИНА И СООТНОШЕНИЕ ИЗОФОРМ В ГЕПАТОЦИТАХ И ХОЛАНГИОЦИТАХ КРЫС.

5.1. ВЛИЯНИЕ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ НА ГЕПАТОЦИТЫ.

5.2. ВЛИЯНИЕ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ НА ХОЛАНГИОЦИТЫ.

Глава 6. ВЛИЯНИЕ ОБСТРУКТИВНОГО ХОЛЕСТАЗА НА

УРОВЕНЬ мРНК РЕЦЕПТОРА ПРОЛАКТИНА И СООТНОШЕНИЕ ИЗОФОРМ В ГЕПАТОЦИТАХ И ХОЛАНГИОЦИТАХ КРЫС.

6.1. ВЛИЯНИЕ ОБСТРУКТИВНОГО ХОЛЕСТАЗА НА ГЕПАТОЦИТЫ.

6.2. ВЛИЯНИЕ ОБСТРУКТИВНОГО ХОЛЕСТАЗА НА ХОЛАНГИОЦИТЫ.

Глава 7. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЙСТВИЯ ПРОЛАКТИНА НА ГЕПАТОЦИТЫ И ХОЛАНГИОЦИТЫ В РАЗЛИЧНЫХ СОСТОЯНИЯХ.

7.1. ГЕПАТОЦИТЫ.

7.2. ХОЛАНГИОЦИТЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клеточная специфичность регуляции экспрессии рецепторов пролактина в печени крыс"

Пролактин - один из самых многофункциональных гормонов млекопитающих. Его многочисленные функции включают регуляцию роста, дифференцировки, размножения, метаболизма, осморегуляцию, иммуномодуляцию и регуляцию поведения [Bole-Feysot et al, 1998].

Пролактин осуществляет свои эффекты, взаимодействуя со специфическими мембранными рецепторами (ПрлР). Несмотря на то, что к настоящему моменту уже накоплено достаточно много данных о механизмах проведения сигнала через рецепторы пролактина, многие вопросы, связанные с его тканеспецифичными эффектами, остаются нерешенными.

Наличие нескольких форм, как самого гормона [Sinha, 1995], так и его рецепторов [Hu, et al, 1998а; Bignon et al, 1999; Horseman, 1999] предоставляют широкое поле для изучения его мультифункциональности. У млекопитающих описано несколько функционально-различных изоформ ПрлР, обычно - это длинная с которой связывают проведение сигнала через основной для рецепторов цитокинов путь, связанный с активацией тирозинкиназ Януса, и короткая (или несколько разных коротких изоформ), которая, с одной стороны, негативно действует на активацию тирозинкиназ Януса, а, с другой стороны, ассоциирована с «тканеспецифическими» вариантами пролактин-индуцированных эффектов [Das and Vonderhaar, 1995; Nokelaen et al, 1997]. При этом специфика его действия определяется, прежде всего, типом ткани-мишени, и присущим этой ткани соотношением изоформ ПрлР, а ответ ткани формируется из ответа ее клеточных элементов.

К настоящему моменту уже накоплено множество данных по экспрессии ПрлР и передачи его сигнала во многих тканях [Nagano and Kelly, 1994; Ouhtit et al, 1994; Morel et al, 1994], однако, за редкими исключениями [Yokoyama et al, 2003], только на уровне целого органа или на уровне перевиваемых клеточных линий [Ali, 1998]. Учитывая вышеизложенное, актуальным является сравнительное изучение экспрессии уровня ПрлР и соотношения его изоформ в разных клеточных элементах одной ткани и их изменений в различных условиях. В связи с этим целью настоящей работы является: исследование на рецепторном уровне особенностей вклада разных клеточных элементов в суммарный ответ органа на пролактин при различных физиологических и патологических состояниях.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: Исследовать характер экспрессии ПрлР в различных клеточных элементах таких органов как яичники, матка, гипофиз, гипоталамус, печень самок крыс, для определения объекта дальнейших исследований - ткани, клеточные элементы которой обладают значимо различным и не гетерогенным уровнем ПрлР, и могут быть дифференциально изолированы.

Установлено, что этим критериям отвечает печень, основные клеточные элементы которой, гепатоциты и холангиоциты, контрастно различаются по уровню рецепторов пролактина. Дополнительным преимуществом этого выбора было то, что ранее в нашей лаборатории было установлено наличие избирательности влияния ряда факторов на экспрессию ПрлР в различных клеточных элементах печени: половые гормоны являются основными регуляторами ПрлР в гепатоцитах, в то время как обструктивный холестаз - в холангиоцитах [Петращук с соавт, 1996; Смирнова с соавт, 1998, Орлова с соавт, 1999]. Однако, для установления характера пролактин-индуцируемого ответа клеток этих данных совершенно недостаточно, необходимо знать не только тотальный уровень рецепторов пролактина, но также и соотношение их функционально различных изоформ в гепатоцитах и холангиоцитах при различных физиологических состояниях.

Необходимыми предпосылками решения дальнейших задач являлись, во-первых, отработанный в рамках настоящего исследования метод одновременного выделения гепатоцитов и холангиоцитов в виде фрагментов желчных протоков с проверкой качества разделения по дифференциальным маркерам и, во-вторых, отработанный нами полуколичественный метод определения уровня рецепторов пролактина и соотношения его изоформ на уровне мРНК, основанный на анализе накопления продуктов конкурентной полимеразной цепной реакции с применением внутреннего стандарта [Pi and Grattan, 1998].

В дальнейшем, при работе с печенью крыс как удобным модельным объектом, были поставлены и решены следующие задачи:

• оценка отличий гепатоцитов и холангиоцитов по таким параметрам как уровень мРНК ПрлР, и уровни его короткой и длинной изоформ ПрлР у самок крыс в норме;

• сравнительное исследование действия половых гормонов на уровень мРНК ПрлР и уровней его изоформ в гепатоцитах и холангиоцитах самок и самцов крыс;

• сравнительное исследование действия обструктивного холестаза на уровень мРНК ПрлР и соотношение его изоформ в гепатоцитах и холангиоцитах самок и самцов крыс. В рамках данной задачи важно было также установить, действует ли обструктивный холестаз на экспрессию ПрлР опосредовано через изменение уровня половых гормонов или его действие независимо от половых гормонов;

• оценка вклада различных изоформ и изменения их соотношения при различных физиологических и патологических условиях в реализацию разных типов эффектов пролактина с помощью разработанной нами математической модели. Поскольку прямая экспериментальная проверка эффективности и характера действия пролактина на клетки крайне затруднительна, а при описании состояний in vivo и практически не возможна, необходимо было разработать альтернативный подход оценки вклада различных клеточных элементов печени в общий пролатин-индуцированный ответ печени на пролактин на основании уровня мРНК рецепторов пролактина и уровней мРНК его изоформ. Таким подходом стала, разработанная нами, математическая модель для расчета эффективности действия пролактина на клетки и ее зависимости от уровня изоформ. Данная модель позволяет сопоставить не только уровень рецепторов пролактина и соотношение его изоформ с описанными в литературе результатами оценки интенсивности пролактин-индуцированных каскадов in vitro, но анализировать новые экспериментальные данные.

Использование настоящей модели и полученные данные об уровне изоформ в разных типах клеток позволили нам оценить вклад гепатоцитов и холангиоцитов в реализацию различных пролактин-индуцируемых каскадов у крыс разного пола в норме. Кроме того, при использовании данных о действии половых гормонов и обструктивного холестаза на уровень мРНК рецепторов пролактина и соотношение его изоформ в гепатоцитах и холангиоцитах самок и самцов крыс, нами установлена степень влияния этих параметров на эффективность действия пролактина в зависимости от типа клеток печени.

В результате проведенной работы получены новые данные, позволяющие сопоставить вклад гепатоцитов и холангиоцитов в реализацию различных эффектов пролактина в печени при различных функциональных состояниях.

Установлено, что холангиоциты отличаются от гепатоцитов в норме не только существенно более низким уровнем мРНК рецепторов пролактина, но и обратным соотношением их изоформ: в холангиоцитах, как и большинстве тканей преобладает длинная изоформа рецептора, в гепатоцитах - короткая. Показано, что в отличие от большинства тканей в холангиоцитах половые гормоны не влияют ни на уровень мРНК рецепторов пролактина, ни на соотношение его изоформ. Продемонстрировано также, что обструктивный холестаз является независимым от половых гормонов фактором регуляции экспрессии рецепторов пролактина, дифференциально действующим на разные клеточные элементы печени. В холангиоцитах он, в первую очередь, повышает общий уровень мРНК рецептора, а в гепатоцитах преимущественно влияет на соотношение изоформ.

Математическая оценка интенсивности пролактин-индуцируемых каскадов, позволила заключить, что в печени интакных крыс и гепатоциты, и холангиоциты с равной эффективностью проводят сигнал пролактина, опосредованный активацией тирозинкиназ Януса, однако преобладают, по-видимому, тканеспецифические сигналы, которые реализуются через короткую изоформу рецептора, доминирующую в гепатоцитах. Математическая модель высветила существенные половые отличия сдвига пролактин-индуцируемых каскадов в гепатоцитах при обструктивном холестазе. Если у самок интенсивность пролактин-индуцированной активации тирозинкиназ Януса в гепатоцитах возрастает более чем на порядок, то у самцов она не претерпевает практически никаких изменений.

Результаты, полученные в ходе настоящей работы, могут иметь значение для фундаментальной эндокринологии, так как не только расширяют представления о характере экспрессии рецепторов пролактина и их изоформ в основных клеточных элементах печени при различных функциональных состояниях, но и позволяют оценить на основе этих данных соотношение и интенсивность эффектов пролактина, реализуемых через разные клеточные элементы, и их вклад в реализацию эффектов в целой печени. Практическая значимость полученных данных заключается в развитии представлений о половых отличиях в протекании патологических процессов в печени, например, индуцированных обструктивным холестазом, что создает основы для пол-специфического фармакологического воздействия.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Богорад, Роман Львович

111 выводы.

2. Обнаружена клеточная специфичность экспрессии рецепторов пролактина в печени крыс в норме, заключающаяся в разном уровне мРНК рецептора - относительно низком в холангиоцитах, и, напротив, высоком в гепатоцитах -, а также в соотношении изоформ рецептора - в гепатоцитах доминирует короткая, в то время как в холангиоцитах выявляется только длинная изоформа рецептора.

4. Обструктивный холестаз дифференциально регулирует характер экспрессии рецепторов пролактина в гепатоцитах и холангиоцитах: в гепатоцитах он действует преимущественно на соотношение изоформ рецепторов пролактина, повышая долю длинной изоформы независимо от пола животных. В холангиоцитах он существенно повышает общий уровень мРНК рецепторов пролактина, главным образом, за счет длинной изоформы, и индуцирует появление короткой. Действие обструктивного холестаза на экспрессию рецепторов пролактина в холангиоцитах не зависит от пола.

5. Анализ экспериментальных данных с помощью разработанной математической модели позволяет предположить, что в гепатоцитах действие обструктивного холестаза пол-специфично, у самок он резко повышает (более чем в 18 раз) интенсивность пролактин-индуцированного сигнала тирозинкиназ Януса/БТАТ, ассоциированного с димерами длинных изоформ, у самцов практически не изменяет этот параметр. В холангиоцитах обструктивный холестаз также повышает интенсивность сигнала тирозинкиназ Януса/БТАТ белков (в 7,5 раз) независимо от пола, при этом в данном типе клеток также увеличивается доля каскадов, ассоциированных с димерами коротких изоформ рецептора пролактина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Первым этапом действия пролактина является связывание с мембранными рецепторами. Рецепторы суперсемейства рецепторов цитокинов, представителями которых являются ПрлР димеризуются после взаимодействия с одной молекулой гормона [Bole-Feysot et al, 1998]. Характер индуцированного гормоном сигнала зависит от того, какие изоформы рецептора участвуют в этом взаимодействии. Пролактин-индуцированные димеры длинных изоформ рецептора активируют основной для данного класса рецепторов каскад (Jak/STAT, см. п. 1.3.4.) [Bole-Feysot et al, 1998], короткая изоформа негативно модулирует активность длинной [Berlanga et al, 1997; Perrot-Apllanat et al, 1997], и, кроме того, пролактин-индуцированные димеры короткой формы проводят ряд «тканеспецифических» сигналов. А значит, сила и характер ответа клетки на пролактин определяется уровнем ПрлР и соотношением его изоформ. Ответ же целой ткани/органа складывается из соотношения ответов ее клеточных элементов.

Мы исследовали характер экспрессии ПрлР в двух основных клеточных элементах печени крыс в разных функциональных состояниях. Уровень ПрлР и соотношение его изоформ в печени самок в норме [Nagano and Kelly, 1994] в первом приближении хорошо отражают параметры экспрессии ПрлР в гепатоцитах, показанные в настоящей работе, однако совершенно не ясна ситуация с остальными типами клеток печени, и в первую очередь с холангиоцитами. В рамках настоящей работы впервые удалось охарактеризовать холангиоциты с точки зрения экспрессии изоформ ПрлР: в этих клетках у самцов и самок в норме ПрлР практически полностью представлены длинной изоформой рецептора. Важно также отметить, что если в гепатоцитах характер экспрессии ПрлР имеет четко выраженную половую зависимость: у самок уровень ПрлР существенно выше, а также более выражено преобладание короткой изоформы, то в холангиоцитах уровень ПрлР относительно низок и не зависит от пола.

Рассмотренные нами воздействия на экспрессию ПрлР в гепатоцитах и холангиоцитах (половые гормоны и обструктивный холестаз) приводят к разнонаправленным изменениям уровня и соотношения изоформ ПрлР в этих типах клеток. Показано, что половые гормоны действуют на экспрессию ПрлР только в гепатоцитах, разнонаправлено влияя на уровень мРНК ПрлР и однонаправлено на соотношение изоформ. Обструктивный холестаз приводит к изменениям содержания мРНК ПрлР и в гепатоцитах, и в холангиоцитах. Но, если в гепатоцитах он действует практически только на соотношение изоформ, то в холангиоцитах на суммарный уровень рецепторов, и на соотношение изоформ.

Такой характер изменений позволяет предположить разную роль гепатоцитов и холангиоцитов в реализации эффектов пролактина при различных физиологических состояниях.

На основе данных об уровне изоформ ПрлР, можно судить о характере и интенсивности действия пролактина на клетки лишь в самом общем виде. Так как прямая экспериментальная оценка интенсивности пролактин-индуцированных сигнальных каскадов in vivo крайне затруднена, нами была разработана математическая модель, построенная на результатах такой оценки в экспериментах in vitro, которая дала возможность провести сравнение характера действия пролактина на гепатоциты и холангиоциты в рассмотренных физиологических состояниях.

Эта модель позволяет оценивать интенсивность альтернативных пролактин-индуцированных сигнальных каскадов и сравнивать их в разных функциональных состояниях клеток.

Гепатоциты являются уникальными клетками-мишенями пролактина: с одной стороны, они обладают одним из самых высоких уровней ПрлР, а с другой, основной изоформой ПрлР в них является короткая изоформа. Роль преобладания короткой изоформы ПрлР, а также механизмы проведения сигнала в гепатоцитах, в которых реализуются разнообразные эффекты пролактина, до сих пор до конца не выяснены.

Практически с момента описания основного пути проведения сигнала через рецепторы суперсемейства цитокинов в начале 90ых годов короткие изоформы рецепторов пролактина [Goffin et al, 1998], лептина [Ghiíardy et al,

1996] и некоторых других, в цитоплазматическом домене которых отсутствовала последовательность, ответственная за активацию каскада Jak/STAT, принято было рассматривать как неактивные формы рецепторов. Постепенно стала формироваться гипотеза о том, что короткие изоформы негативно модулируют активность длинной изоформы ПрлР, димеризуясь с ней под действием гормона и блокируя, таким образом, передачу сигнала. В случае ПрлР эта гипотеза нашла подтверждение в ряде работ [O'Neal and Yu-Lee, 1994; Berlanga et al, 1997; Perrot-Apllanat et al, 1997]. В экспериментах in vitro было показано, что, искусственно увеличивая долю короткой изоформы в клетках, удается существенным образом подавить проведение сигнала через Jak/STAT каскад димерами длинных изоформ ПрлР. Таким образом, низкая доля длинной изоформы ПрлР может играть следующую роль: небольшие увеличения ее содержания, не влияя на общий уровень рецептора, могут приводить к значительному увеличению интенсивности основного Jak/STAT каскада. Это подтверждается при помощи разработанной математической модели взаимодействия пролактина с рецепторами.

Однако можно предположить, что негативная модуляция активности длинной изоформы - это не единственная функция короткой изоформы ПрлР. В ряде работ показано, что короткая изоформа способна проводить сигнал пролиферации в эпителиальных клетках [Das and Vonderhaar, 1995], что, по-видимому, осуществляется через активацию каскада МАР-киназ и некоторых других белков (Vav, фосфолипаза Су и др.). Таким образом, при проведении сигнала такими короткими формами изменяется соотношение активированных вторичных посредников, спектр модифицированных эффекторных белков, а следовательно, и характер ответа клетки на гормональный стимул.

В последнее время было показано, что короткие формы рецепторов, кроме всего прочего, имеют собственные пути проведения сигнала, не характерные для длинных форм. Так, короткая форма пролакгинового рецептора в желтых телах ассоциируется с белком PRAP (белок, ассоциированный с рецептором пролактина), который является 17-кетостероиддегидрогеназой 70Г0 типа [Duan et al, 1997; Nokelainen et al, 1998]. Экспрессия 17-кетостероиддегидрогеназы этого типа выявлена также и в гепатоцитах крыс [Breitling et al, 2001]. Этот и другие альтернативные механизмы передачи сигнала пролактина можно условно назвать «тканеспецифическими».

Роль коротких и длинных форм рецепторов может также различаться на этапе интернализации гормон-рецепторных комплексов. Короткие формы ряда рецепторов интернализуются с большей скоростью, чем длинные, что показано не только для рецепторов пролактина [Vincent et al, 1997], но и для рецепторов лептина [Barr et al, 1999; Uotani et al, 1999]. Это может быть связано с тем, что, например, у короткой формы рецепторов пролактина есть два мотива, увеличивающих скорость интернализации, против единственного мотива у длинной формы [Vincent et al, 1997]. Особое место занимают короткие формы рецепторов во внутриклеточном транспорте гормона между функционально различными мембранами определенных клеток. В ряде случаев поступление гормон-рецепторных комплексов внутрь клетки приводит не только к расщеплению гормона и рецептора, но и к транспорту гормона и/или гормон-рецепторного комплекса к ядерной мембране, что в свою очередь может индуцировать активацию "неклассического" ядерного пути проведения сигнала белково-пептидных гормонов [Смирнова, 1999]. Подтверждением этому является обнаружение внутри ядер пролактина и его рецепторов [Орлова с соавт, 1999] и многих других гормонов и ростовых факторов [Keresztes et al, 1999; Marti et al, 1991], a также эксперименты in vitro по действию пролактина на очищенные ядра клеток [Buckley et al, 1988; Buckley et al, 1992] и связывание в ядре рецепторов инсулина [Radulescu et al, 1995а,b] и пролактина [Knopp et al, 1994; Ouhtit et al, 1994b; Rao et al, 1995].

Физиологическая роль коротких форм рецепторов может заключаться также в трансцитозе гормонов, т.е. в специфичном внутриклеточном транспорте гормонов с одного функционального участка клеточной мембраны на другой, что ведет к активному переносу высокомолекулярных гормонов через физиологические барьеры (в частности гематоэнцефалический и гепатокананикулярный барьеры). Для ПрлР не было проведено таких исследований, но показано, что короткая форма лептинового рецептора способна переносить гормон через выращенные на мембранах монослои почечных клеток собак линии Madin-Darby in vitro [Hileman et al, 2000]. Косвенным свидетельством такой роли коротких форм рецепторов лептина и пролактина in vivo может служить высокий уровень их экспрессии в хороидном сплетении, месте интенсивной генерации ликвора и возможном месте активного переноса гормонов через гематоэнцефалический барьер [Nagano and Kelly, 1994; Bjorbaek et al, 1998], а также снижения эффективности переноса лептина в мозг у крыс, лишенных короткой формы лептинового рецептора [Kastin et al, 1999; Kastin and Pan, 2003].

Следовательно, в гепатоцитах крысы роль преобладания короткой изоформы ПрлР может заключаться как в негативной модуляции активности длинной изоформы и создании условий для тонкой регуляции чувствительности клеток к пролактину, так и в проведении дополнительных сигналов, обладающих специфичностью по отношению к ткани, полу, физиологическим условиям. Кроме того, возможно, выполняя «транспортные» функции короткие изоформы рецептора опосредуют «неклассический» ядерный путь реализации сигнала пролактина и переносят гормон через балки гепатоцитов.

Важно отметить, что, как показано нами, в холангиоцитах крыс в норме короткая изоформа практически отсутствует. Это позволяет предположить, что в этом типе клеток действие пролактина связано в основном лишь с активацией Jak/STAT-каскада, каскада МАР-киназ и некоторых других.

Несмотря, на значительно более низкий суммарный уровень ПрлР в холангиоцитах, по сравнению с гепатоцитами, предсказанная интенсивность пролактин-индуцированного Jak/STAT каскада в первом типе клеток у самок несколько выше, чем во втором, как показано нами с помощью математической модели. Это связано с практически полным отсутствием в холангиоцитах короткой формы ПрлР, сдерживающей проведение сигнала длинными формами. Значит, на основании проведенной нами оценки с помощью разработанной модели можно предположить, что если гепатоциты в основном реализуют «тканеспецифические» эффекты пролактина, то холангиоциты вносят основной вклад в реализацию эффектов, опосредуемых Jak/STAT каскадом.

Кроме изучения экспрессии ПрлР и соотношения его изоформ в нормальных гепатоцитах и холангиоцитах крысы, нами исследована возможность дифференциальной регуляции физиологических эффектов в этих типах клеток под действием пролактина (примеры эффектов приведены на рис. 33, 34).

Действие пролактина на гепатоциты проявляет четко выраженный половой диморфизм. Это определяется как разным уровнем ПрлР, так и разным соотношением изоформ рецептора в гепатоцитах самок и самцов. Нами показано, что в гепатоцитах и мужские и женские половые гормоны действуют однонаправлено, повышая долю короткой изоформы, и, таким образом, увеличивая интенсивность предсказанных математической моделью «тканеспецифических» путей реализации сигнала пролактина, при этом важно отметить, что женские половые гормоны оказывают свое действие в большей степени, чем мужские. Возможно, это связано с прямым влиянием эстрогеновых рецепторов на некоторые кофакторы альтернативного сплайсинга [АиЬое^ е1 а1,2002, 2004а, 2004Ь].

В нормальных холангиоцитах половой диморфизм эффектов пролактина не проявляется. Отсутствие влияния половых гормонов на уровень и соотношение изоформ ПрлР в холангиоцитах, показанное в настоящем исследовании, возможно, указывает на использование иных механизмов регуляции транскрипции и альтернативного сплайсинга, чем в гепатоцитах, например, на транскрипцию гена ПрлР с других промоторов. К настоящему времени специфичность использования промоторов гена ПрлР изучена только на целых органах [Ни е1 а1, 1996; МоШгир е1 а1, 1996], данных по их активности в отдельных типах клеток нет. Таким образом, обнаруженное действие половых гормонов на характер и силу ответа клеток на пролактин носит в печени дифференциальный характер - оно выражено в гепатоцитах, но не в холангиоцитах.

Другим важнейшим фактором, регулирующим характер экспрессии ПрлР и эффективность действия пролактина на печень, является обструктивный холестаз. Стимуляция пролиферации гепатоцитов [Piccoletti et al, 1997]

2. Усиление экспрессии белков плотных и щелевых контактов, поддержание гепато-кананикулярного барьера [Miyoshi et al, 2001; Trauner et al, 1998]

3. Увеличение внутриклеточной концентрации кальция [Viilaba et al, 1991]

4 Увеличение экспрессии натрий-зависимого переносчика таурохолата [Ganguly et al, 1997]

5. Увеличение экспрессии экспортера желчных кислот [Liu et at, 1995]

6. Увеличение экспрессии цитохромов Р450, поддержание половой дифференцировки их экспрессии [Розен с соавт, 1991]

7. Стимуляция переноса в желчь иммуноглобулинов класса A [Larkin et ai, 2003]

КОН71 Просвета и степени ветвления протоков

Пролакти

Рис. 34. Действие пролактина на холангиоциты (прямые и косвенные данные)

1. Стимуляция пролиферации холангиоцитов [Ог1оуа е1 а1, 1998]

2. Стимуляция формирования просвета протока и ветвления протоков [Огтапс1у е! а1, 2003]

3. Увеличение концентрации кальция [УШаЬа еЛ. а1, 1991]

4. Усиление экспрессии белков щелевых контактов [СоПагеэ-Вигаго е1 а1, 2001]

Как показано в настоящей работе, действие обструктивного холестаза на клеточные элементы печени также дифференциально, если в гепатоцитах он действует преимущественно на соотношение изоформ, то в холангиоцитах и на общий уровень ПрлР, и на соотношение его изоформ. Важно отметить, что хотя общая направленность действия обструктивного холестаза, по-видимому, не опосредуется половыми гормонами (см. Главу 6), конечный эффект на уровне интенсивности пролактин-индуцированной активности Jak/STAT каскада различается в гепатоцитах самцов и самок крыс. Как предсказано при помощи математической модели, интенсивность этого каскада в гепатоцитах самцов не изменяется, при этом у самок она возрастает более, чем в 18 раз. Для холангиоцитов также показан рост интенсивности этого каскада при обструктивном холестазе. При этом если в гепатоцитах удельная доля Jak/STAT каскада при обструктивном холестазе возрастает, то в холангиоцитах она несколько снижается. Эти изменения, вероятно, определяются разнонаправленным изменением характера альтернативного сплайсинга в этих типах клеток под действием обструктивного холестаза.

То, что обструктивный холестаз индуцирует факторы, регулирующие альтернативный сплайсинг, было показано на примере некоторых G-белков: при обструктивном холестазе уровень длинной изоформы белка Gas не изменяется, в то время как содержание короткой значимо падает [Bouscarel et al, 1998]. Обструктивный холестаз может влиять как на уровень, так и на активность факторов сплайсинга, хотя экспериментальные данные о возможных механизмах пока отсутствуют.

Кроме обструктивного холестаза на альтернативный сплайсинг ПрлР в клетках печени действует еще такое комплексное воздействие как геморрагическая травма, при этом доля длинной изоформы в гепатоцитах сильно снижается. Природу таких воздействий на альтернативный сплайсинг в печени специфична и не связана с общим травматическим эффектом, так как соотношение длинной и короткой изоформ ПрлР при гемморрагической ишемии печени и при обструктивном холестазе изменяется в противоположенные стороны.

Таким образом, при обструктивиом холестазе интенсивность пролактин-индуцированного Jak/STAT каскада и в гепатоцитах, и в холангиоцитах усиливается. Однако характер изменений общего ответа этих клеток на пролактин в условиях холестаза противоположен: в гепатоцитах происходит снижение доли «тканеспецифических» эффектов, в холангиоцитах же напротив такие эффекты проявляются. Хотя механизмы влияния обетруктивного холестаза и половых гормонов на уровень изоформ ПрлР разнятся, конечные изменения, индуцированные холестазом, в гепатоцитах носят пол-зависимый характер, а в холангиоцитах они не зависят от пола животного.

Эти данные важно учитывать при рассмотрении возможных путей терапевтической коррекции различных печеночных патологий регулирующих уровень пролактина и/или его рецепторов. Так, если патологическое состояние затрагивает в первую очередь холангиоциты, то нет необходимости поиска пол-специфических воздействий, в случае поражения гепатоцитов при поиске воздействий необходим учет полового диморфизма.

Полученные данные об изменениях экспрессии ПрлР и вытекающих из них, предсказанных в настоящей работе изменениях эффективности и направленности действия пролактина, дают возможность предположить возможные направления регуляторной активности пролактина в печени при обструктивном холестазе.

Усиление пролактин-индуцированного Jak/STAT каскада указывает на компенсаторную роль регуляции пролактина в гепатоцитах. Изменения в гепатоцитах, стимулируемые пролактином, позволяют снять интоксикацию гепатоцитов, за счет увеличения скорости превращения токсинов [Розен с соавт, 1991], транспорта желчных кислот в кананникулярный просвет [Ganguly et al, 1995; Liu et al, 1995]. Кроме того, пролактин, по-видимому, участвует в стимуляции компенсаторной пролиферации гепатоцитов, в ответ на токсин-стимулированную их гибель.

Для нормального функционирования печени необходимо, чтобы гепатоциты сохраняли полярность, а также удерживали плотные контакты между собой, для изоляции крови и желчи. Для ряда других тканей (молочная железа, островки Лангерганса) показано, что пролактин стимулирует формирование плотных и щелевых контактов, и, таким образом, участвует в формировании барьерных функций органа [Collares-Buzato et al, 2000; Miyoshi et al, 2001; Nguyen and Neville, 1998; Nguyen et al, 2001]. В случае обструктивного холестаза это также проявление компенсаторных механизмов поддержания барьера, нарушенного в печени при холестазе [Bode et al, 2002; Fallon et al, 1995; Kojima et al, 2003; Takakuwa et al, 2002].

Трансцитоз иммуноглобулинов типа А в желчь [Larkin et al, 2003], позволяющий повысить защитные функции организма от инфильтрации кишечной флорой, значительно усиливающейся при обструктивном холестазе [Ogata et al, 2003], возможно также является точкой приложения иммунорегуляторных свойств пролактина, аналогично тому как это происходит в молочной железе [Rincheval-Arnold et al, 2002].

Предсказанное снижение «тканеспецифических» каскадов также, возможно приводит, к ряду компенсаторных изменений. Так, например, снижение активности 17-кетостероиддегидрогеназы 7 типа (PRAP, белка, ассоциированного с короткой формой ПрлР) приводит к уменьшению скорости превращения эстрогенов в активные формы [Duan et al, 1997; Labrie et al, 2000; Peltoketo et al, 1999], что важно в условиях обструктивного холестаза, когда дезактивирующие функции печени в отношении половых гормонов снижены.

При обструктивном холестазе пролиферирующие холангиоциты усиливают чувствительность не только к пролактину, но и к секретину [Alpini et al, 1994b], эстрогенам [Alvaro et al, 2000]. В холангиоцитах пролактин за счет усиления активации Jak/STAT каскада, вероятно, стимулирует пролиферацию желчных протоков, увеличение их полости и, таким образом, снижает внутреннее давление в системе желчных протоков. Усиливая экспрессию белка, реабсорбирующего желчные кислоты из просвета протоков, пролактин стимулирует выведение токсичных желчных кислот через альтернативный путь - почки [Trauner et al, 1999]. В холангиоцитах, в отличие от гепатоцитов, при обструктивном холестазе увеличивается предсказанная доля «тканеспецифических» каскадов. Для желчных протоков это, возможно, имеет важное значение, так как таким образом возможно локальное дополнительное увеличение концентрации активных эстрогенов, имеющих сильное стимулирующее действие на пролиферацию холангиоцитов [Alvaro et al, 2000; Alvaro et al, 2002].

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Богорад, Роман Львович, Москва

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций // М.: Наука - 1994

2. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. // М: Практика -1999

3. Киршенблат Я.Д. Практикум по эндокринологии // М.: Высшая школа -1969 С.174-175 С.

4. Масюк А.И. Молекулярные и клеточные механизмы желчеотделительной функции печени // Успехи физиол. наук 1990 - Т.21 - С. 18-35

5. Олейник Н.В., Смирнова О.В., Розен В.Б. Особенности пол-дифференцирующего действия половых стероидов на рецепторы андрогенов // Пробл. эндокринол. 1990 - Т.36 - С.61-66

6. Орлова, А.Н., Смирнова, О.В., Туровецкий, В.Б., Смирнов, А.Н. Ядерная манифестация рецепторов пролактина в гепатоцитах крыс и влияние на нее пролакгина // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. -1999а Т. 127 - С.579-582

7. Орлова А.Н., Смирнов А.Н., Смирнова О.В. Роль пролактина в регуляции некоторых функций клеток печени после перевязки общего желчного протока // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 19996 - Т. 127 - С.573-575

8. Петращук О.М., Смирнов А.Н., Смирнова О.В. Рецепторы пролактина в клетках желчных протоков в онтогенезе крыс // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. -1996-Т.122 -С.669-672

9. Подымова С.Д. Болезни печени // М.: Медицина -1998

10. Розен В.Б. Основы эндокринологии // М.: Издательство МГУ 1994

11. Розен В.Б., Матарадзе Г.Д., Смирнова О.В., Смирнов А.Н. Половая дифференцировка функций печени // М.: Медицина 1991

12. Рубцов П.М. Структура и экспрессия генов рецепторов гормона роста и пролактина // Вестник Акад. Мед. Наук 1994 - Т. 12 - С. 19-23

13. Рубцов П.М. и Лонина Д.А. Гетерогенность 5'-нетранслируемой области мРНК рецептора пролактина печени крыс // Мол. Биол. 1996 - Т.ЗО - С.330-338

14. Смирнова О.В., Петращук О.М., Смирнов А.Н., Индукция экспрессии рецепторов пролактина в холангиоцитах самцов и самок крыс после перевязки общего желчного протока // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1998 - Т. 125- С.66-70

15. Смирнова, О.В. Новый уровень трансдукции гормонального сигнала: прямой ядерный путь действия белково-пептидных гормонов // Биол. Мембр.- 1999 Т.16 - С.199-211

16. Ташке К. Ведение в количественную цито-гистологическую морфологию // Бухарест: Издательство Академии социалистической республики Румынии -1980 С.29-33

17. Угрюмов М.В. Современные методы иммуногистохимии и гистохимии // Итоги науки и техники, серия «Морфология человека и животных» 1991 -Т.15 -С.23

18. Хем А., Кормак В. Гистология. Т. 4. Пер. с англ. М.: Москва - 1983

19. Aguado L.I. and Ojeda S.R. Prepubertal rat ovary: hormonal modulation of beta-adrenergic receptors and of progesterone response to adrenergic stimulation // Biol. Reprod 1986 - V.34 - P.45-50

20. Akker S.A., Smith P.J., Chew S.L. Nuclear post-transcriptional control of gene expression // J. Mol. Endocrinol. 2001 - V. 27 - P. 123-131

21. Ali S., Edery M., Pellegrini I., Lesueur L., Paly J., Djiane J., and Kelly P.A. The NB2 form of prolactin receptor is able to activate a milk protein gene promoter. Mol. Endocrinol. 1992 - V. 6 - P.1242-1248

22. Ali S. Prolactin receptor regulates Stat5 tyrosine phosphorilation and nuclear translocation by two separate pathways // J. Biol. Chem. 1998 - V.273 - P.7709-7716

23. Alison M. Liver stem cell: a two compartment system // Curr. Opinion Cell Biol. -1998-V.10-P.710-715

24. Alpini G., Lenzi R., Sarkozi L., Tavolini N. Biliary physiology in rats with bile ductular cell hyperplasia. Evidence for a secretory function of proliferated bile ductules // J. Clin. Invest. 1988 - V.81 - P.569-578

25. Alpini G., Lenzi R., Zhai W.R., Slott P.A., Liu M.H., .Sarkozi L., Tavolini N. Bile secretory function in intrahepatic billiary epithelium in the rat // Am. J. Physiol. 1989 - V.257 -P.G124-133

26. Alpini G., Phillips J.O., Vroman B., LaRusso N.F. Recent advances in the isolation of liver cells // Hepatology 1994a - V.20 - P.494-514

27. Alpini G., Ulrich C.D., Philips J.O. Pham L.D., Miller L.J., LaRusso N.F. Upregulation of secretin receptor gene expression in rat cholangiocytes after bile duct ligation // Am. J. Physiol. 1994b - V.266 - G922-928

28. Alpini G., Glaser S.S., Ueno Y., Pham L., Podila P.V., Caligiuri A., LeSage G., LaRusso N.F. Heterogeneity of the proliferative capacity of rat cholangiocytes after bile duct ligation // Am. J. Physiol. 1998 - V.274 - G.767-775

29. Alvarez E.O., Banzan A.M. Behavioral actions of prolactin locally applied into the hyppocampus of adult female rats // J. Neural Transm. 1994 - V.95 - P. 17-28

30. Alvaro D., Mennone A., Boyer J.L. Role of kinases and phosphatases in the regulation of fluid secretion and C1-/HC03- exchange in cholangiocytes // Am. J. Physiol. 1997 - V.273 - G303-313

31. Alvaro D., Alpini G., Onori P., Franchitto A., Glaser S.S., Le Sage G., Folli F., Attili A.F., Gaudio E. Alfa and beta estrogen receptors and the biliary tree // Mol. Cell. Endocrinol. 2002 - V.193 - P.105-108

32. Amaral M.E., Ueno M., Carvalheira J.B., Carneiro E.M., Velloso L.A., Saad M.J., Boschero A.C. Prolactin-signal transduction in neonatal rat pancreatic isletsand interaction with the insulin-signaling pathway 11 Horm. Metab. Res. 2003 -V.35 - P.282-289

33. Arden K.C., Boutin J.M., Djiane J., Kelly P.A., Cavenee W.K. The receptors for prolactin and growth hormone are localized in the same region of human chromosome 5 // Cytogenet. Cell. Genet. 1990 - V.53 - P.161-165

34. Auboeuf D., Honig A., Berget S.M., O'Malley B.W. Coordinate regulation of transcription and splicing by steroid receptor co-regulators // Science 2002 -V.298 - P.416-419

35. Auboeuf D., Dowhan D.H., Li X., Larkin K., Ko L., Berget S.M., O'Malley B.W. CoAA, a nuclear receptor coactivator protein at the interface of transcriptional coactivation and RNA splicing // Mol. Cell. Biol. 2004b - V.24 - P.442-453

36. Barr V.A, Lane K., Taylor S.I. Subcellular localization and internalization of the four human leptin receptor isoforms // J. Biol. Chem. 1999 - V.274 - P.21416-21424

37. Basman N. and Baker A. Basic function of the liver // Diseases of the liver and biliary tract // Eds. Gitnick G., Labrecque D.R., Mody F.G. St. Louis Mosby Year Book, 1992

38. Baumann G. Growth hormone binding protein 2001 // J. Pediatr. Endocrinol. Metab. 2001 - V.14 - P.355-375

39. Baxter R.C. Measurments of growth hormone and prolactin receptor turnover in rat liver // Endocrinology 1985 - V.117 - P.650-655

40. Beach J.E., Tyrey L. and Everett J.W. Serum prolactin and LH phase a of delayed versus direct pseudopregnancy in the rat // Endocrinology 1975 - V.96 - P.1241-1248

41. Ben-Jonathan N., Arbogast L.A., Hyde J.F. Neuroendocrine regulation ofprolactin release 11 Prog.Neurobiol. 1989 - V.33 - P.399-447

42. Berlanga J.J., Fresno-Vara L.A., Marti-Perez J., Garcia-Ruiz J.P. Prolactin receptor is associated with c-src kinase in rat liver // Mol. Endocrinol. -1995 V.9 - P.1261-1467

43. Berlanga J.J., Garcia-Ruiz J.P., Perrot-Aplanat M., Kelly P.A., Edery M. Two short form of prolactin receptor silence prolactin induction of the beta-casein gene promoter // Mol. Endocrinol. 1997 - V.ll - P.1449-1457

44. Bjorbaek C., Elmquist J.K., Michl P., Ahima R.S., van Bueren A., McCall A.L., • Flier J.S. Expression of leptin receptor isoforms in rat brain microvessels //

45. Endocrinology 1998 - V. 139 -P.3485-3491

46. Bode H.P., Wang L.F., Cassio D., Leite M.F., St-Pierre M.V., Hirata K., Okazaki K., Sears M.L., Meda P., Nathanson M.H., Dufour M.H. Expression and Regulation of Gap Junctions in Rat Cholangiocytes // Hepatology 2002 - V.36 -P.631-640

47. Bole-Feysot C., Goffln V., Edery M., Binart N. and Kelly P.A. Prolactin and its receptor: actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in prolactin receptor knockout mice // Endocrin.Rev. 1998 - V.19 - P.225-268

48. Bouscarel B., Matsuzaki Y., Le M., Gettys T.W., Fromm H. Changes in G protein expression account for impaired modulation of hepatic cAMP formation after BDL//Am. J. Physiol. 1998 - V.274 - G. 1151-1159

49. Bowen J.M., Telleria C.M., Towns R., Keyes P.L. Downregulation of long-form prolactin receptor mRNA during prolactin induced luteal regression // Eur. J. Endocrinol. 2000 - V.143 - P.285-292

50. Boyer J.L. Bile duct epithelium: frontiers in transport physiology // Am. J. Physiol. 1996 - V.270 - P.l-5

51. Breitling R., Krazeisen A., Moller G., Adamski J. 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 7 an ancient 3-ketosteroid reductase of cholesterogenesis // Mol. Cell. Endocrinol. - 2001 - V.171 - P.199-204

52. Buckley A., Putnam C., Montgomery D., Russell D. Prolactin administration stimulates rat hepatic DNA synthesis // Biochem. Biophys Res. Commun. 1986 -V.138 - P.1138-1145

53. Buckley A.R., Crowe P.D., Russell D.H. Rapid activation of protein kinase C in isolated rat liver nuclei by prolactin, a known hepatic mitogen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1988 V. 85 - P.8649-8653

54. Buckley A.R., Montgomery D.W., Hendrix M.J., Zukoski C.F., Putnam C.W. Identification of prolactin receptors in hepatic nuclei // Arch. Biochem. Biophys. -1992-V.296-P.198-206

55. Burns, C.G., and Gould, K.L. Connections between Pre-mRNA processing and regulation of the eukaryotic cell cycle // Post-transcriptional processing and the endocrine system / Ed. Chew S.L. Basel: Karger, 1999, P.83-100

56. Campbell K.M., Sabla G.E, Bezerra J.A. Transcriptional reprogramming in murine liver defines the physiologic consequences of biliary obstruction // J. Hepatol. 2004 - V. 40 - P. 14-23

57. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 1987 -V.162- P.156-159

58. Clevenger C.V., Sillman A.L., Prystowsky M.B. Interleukin-2 driven nuclear translocation of prolactin in cloned T-lymphocytes // Endocrinology 1990 -V.127 - P.3151-3159

59. Clevenger C.V., Medaglia M.V. The protein tyrosine kinase P59fyn is associated with prolactin (PRL) receptor and is activated by PRL stimulation of T-lymphocytes // Mol. Endocrinol. -1994 V.8 - P.674-681

60. Clevenger C.V., Kline J.B. Prolactin receptor signal transduction // Lupus 2001 -V.10 - P.706-718

61. Clevenger C.V., Furth C.A., Hankinson S.E., and Schuler L.A. The role of prolactin in mammary carcinoma // Endocrine Reviews 2003 - V.24 - P. 1-27

62. Collares-Buzato C.B., Leite A.R., Boschero A.C. Modulation of gap and adherens junctional proteins in cultured neonatal pancreatic islets // Pancreas -2001 -V.23-P. 177-185

63. Dabeva M.D., and Shafritz D.A. Hepatic Stem Cells and Liver Repopulation // Sem. Liv. Disease 2003 - V.23 - P.349-361

64. Dardenne M., de-Moraes M. do C., Kelly P.A., Gagnerault M.C. Prolactin receptor expression in human hematopoietic tissues analyzed by flow cytofluorometry // Endocrinology 1994 - V.134 - P.2108-2114

65. Darlington G. Molecular mechanisms of liver development and differentiation // Curr. Opinion Cell Biol. -1999 V.ll - P.678-682

66. Darnell J.E., STATs and Gene Regulation // Science 1997- V.277- P.1630-1635

67. Das R., Vonderhaar B.K. Transduction of prolactin's growth signal through both long and short forms of the PRL receptors // Mol. Endocrinol. 1995 - V.9 -P.1750-1759

68. Das R., Vonderhaar B.K. Involvment of SHC, GRB2, SOS and RAS in prolactin signal transduction in mammary epithelial cells // Oncogene 1996 - V.13 -P.1139-1145

69. Davis J.A., and Linzer D.H. Expression of multiple forms of the prolactin receptor in mouse liver // Mol. Endocrinology 1989 - V. 3 - P.674-680

70. Devost D., Boutin J.M. Autoregulation of the rat prolactin gene in lactotrophs // Mol.Cel.Endocrinology 1999 - V.158 - P.99-109

71. Diehl A.M. Roles of CCAAT/enhancer-binding proteins in regulation of liver regenerative growth // J. Biol. Chem. 1998 - V.273 - P.30843-30846

72. Djiane J., Daniel N., Bignon C., Paly J., Waters M., Vacher P., Dufy B. Prolactin receptor and signal transduction to milk protein genes // Proc.Soc.ExpBiol.Med. -1994 V.206 - P.299-303

73. Duan W.R., Farmer T.G., Albarracin C.T., Zhong L., and Gibori G. PRAP, a prolactin receptor associated protein: its gene expression and regulation in the corpus luteum // Endocrinology 1997 - V.138 - P.3216-3221

74. Eng F.J., and Friedman S.L. Fibrogenesis. I. New insights into hepatic stellate cell activation: the simple becomes complex // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 2000 - V.279 - P.G7-G11

75. Eppig J., Chasnel F., Hirao Y., O'Brien M.J., Pendola F.L., Watanabe S., Wigglesworth K. Oocyte control of granulosa cell development: how and why // Hum. Reprod. 1997a - V.12 - P.127-132

76. Eppig J., Wigglesworth K., Pendola F., Hirao Y. Murine oocytes suppresses expression of luteinizing hormone receptor messenger RNA by granulosa cells // Biol. Reprod. 1997b - V.56 - P.976-984

77. Eppig J., Pendola F., Wigglesworth K. Mouse oocytes suppress cAMP induced expression of LH receptors mRNA by by granulosa cells in vitro // Mol. Reprod. Dev. - 1998 - V.49 - P.327-332

78. Erickson G.F., and Shimasaki S. The Role of the Oocyte in Folliculogenesis // Trends Endocrin. Metab. 2000 - V.ll - P.193-198

79. Fallon M.B., Mennone A., Anderson J.M. Altered expression and localization of the tight junction protein ZO-1 after common bile duct ligation // Am. J. Physiol. 1993 - V.264 - C.1439-1447

80. Fallon M.B., Nathanson M.H., Mennone A., Saez J.C., Burgstahler A.D., Anderson J.M. Altered expression and function of hepatocyte gap junctions after common bile duct ligation in the rat // Am. J. Physiol. 1995 - V.268 - P.C1186-C1194

81. Frame M.K., de Feijter A.W. Propagation of mechanically induced intercellular calcium waves via gap junctions and ATP receptors in rat liver epithelial cells // Exp. Cell. Res. 1997 - V.230 - P. 197-207

82. Frawley L.H, Boockfor F.R. Mammosomatotropes: presence and functions in normal and neoplastic pituitary tissue // Endocr. Rev. -1991- V.12 P.337-355

83. Freemark M., Nagano M., Edery M., Kelly P.A. Prolactin receptor gene expression in the fetal rat // J. Endocrinol. 1995 - V.144 - P.285-292

84. Friedman S.L. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury // J. Biol. Chem. 2000 - V.275 - P.2247-2250

85. Gall J.A. and Bhatal P.S. A quantative analysis of the liver following the ligation of common bile duct // Liver 1990 - V.10 - P.33-36

86. Galsgaard E.D., Nielsen J.H., Moldrup A. Regulation of prolactin receptor gene expression in insulin-producing cells // J. Biol. Chem. 1999 - V.274 - P.18686-18692

87. Ganguli S., Hu L., Menke P., Collier R.J., Gertler A. Nuclear accumulation of multiple protein kinases during prolactin induced proliferation of Nb2 lymphoma cells // J. Cell. Physiol. 1996 - V.167 - P.251-260

88. Ganguly T.C., Liu Y., Hyde J.F., Hagenbuch B., Meier P.J., Vore M. Prolactin increase hepatic Na+/taurocholate co-transport activity and messenger RNA post partum // Biochem J. 1994 - V.303 - P.33-36

89. Ganguly T.C., O'Brien M.L., Karpen S.J. Regulation of the rat liver sodium-dependent bile acid co-transporter gene by prolactin // J. Clin. Invest. 1997 -V.99 - P.2906-2914

90. Garcia-Caballero T., Mertani H.M., Lambert A., Gallego R., Fraga M., Pintos. E, Forteza J., Chevallier M., Lobie P.E., Vonderhaar B.K., Beiras A.,

91. Morel G. Increased expression of growth hormone and prolactin receptors in hepatocellular carcinomas // Endocrine 2000 - V.12 - P.265-271

92. Gass G., Harris J., Ormandy C., Brisken C. Using Gene Expression arrays to Elucidate Transcriptional Profiles Underlying Prolactin Function // Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia-2003 V. 8 - P.269-285

93. Gaudio E., Onori P., Pannrale L., Alvaro P. Hepatic microcirculation and peribiliary plexux in experimental biliary cirrhosis: a morphological study // Gastroenterology 1996-V.l 11 -P.l 118-1124

94. Genty N., Paly J., Edery M., Kelly P.A., Djiaane J., Salesse R. Endocitosis and degradation of prolactin and its receptor in Chinese hamster ovary cells stably transfected with prolactin receptor cDNA // Mol. Cell. Endocrinol. 1994 - V.99- P.221-228

95. Ghilardi N., Ziegler S., Wiestner A., Stoffel R., Heim M.H., Skoda R.C. Defective STAT signaling by the leptin receptor in diabetic mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996 V.93 - P.6231-6235

96. Goffin V., Kelly P.A. Prolactin and growth hormone receptors // Clin.Endocrinol (Oxf) 1996a - V.45 - P. 247-255

97. Goffin, V., Kinet, S., Ferrag, F., Binart, N., Martia, J.A., Kelly, P.A. Antagonistic properties of human prolactin analogs that show paradoxical agonistic activity in the Nb2 bioassay // J. Biol. Chem. 1996b - V.271 -P.16573-16579

98. Goffin V., Ferrag F., Kelly P.A. Molecular aspects of prolactin and growth hormone receptors, In: LeRoith (ed) Advances in Mol.Cell.Endocrinol. V.2, JAI Press - 1998 - P.l-33

99. Gutzman J.H., Rugowski D.E., Schroeder M.D., Watters J.J. and Schuler L.A. Multiple Kinase Cascades Mediate Prolactin Signals to Activating Protein-1 in Breast Cancer Cells // Mol. Endocrinol. 2004 - doi:10.1210/me.2004-0187

100. Herbert D.C., Ishikawa H., Rennels E.G. Evidence for the autoregulation of hormone secretion by prolactin // Endocrinology 1979 - V.104 - P.97-100

101. Hileman S.M., Tornoe J., Flier J.S., Bjorbaek C. Transcellular transport of leptin by the short leptin receptor isoform ObRa in Madin-Darby Canine Kidney cells // Endocrinology 2000 - V.141 - P. 1955-1961

102. Hinuma S., Habata Y., Fujii R., Kawamata V. A prolactin-releasing peptide in the brain // Nature 1998 - V.393 - N06688 - P. 272-276

103. Horseman N.D. Editorial: famine to feast growth hormone and prolactin signal transduction // Endocrinology - 1994 - V.135 - P.1289-1291

104. Horseman N.D. Prolactin receptor diversity in humans: novel isoforms suggest general principles // Trends Endocrinol. Metab 2002 - V.13 - P.47-48

105. Hu Z., Dufau M. Multiple and differential regulation of ovarian messenger RNAs and their expression // Biochem.Biophys.Res.Commun. -1991 V.121 -P.219-225

106. Hu Z.Z., Li Z., Dufau M.L. Multiple and tissue-specific promoter control of gonadial and non-gonadial prolactin receptor gene expression // J. Biol. Chem. -1996 V.271 -P.10242-10246

107. Hu Z.Z., Li Z., Guan X., Meng J., Dufau M.L. Steroidogenic Factor-1 is an essential transcriptional activator for gonad-specific expression of promoter I of the Rat prolactin receptor gene // J. Biol. Chem. 1997 - V.272 - P. 14263-14271

108. Hu Z.Z., Li Z., Dufau M.L. Prolactin receptor gene diversity: structure and regulation // Trends Endocr. Metabol. 1998a - V.9 - P.94-102

109. Hu Z.Z., Meng J., Dufau M.L. Transcriptional regulation of the generic promoter III of the rat prolactin receptor gene by C/EBPp and Spl // J. Biol. Chem. 1998b - V.273 - P.26255-26235

110. Hu Z.Z., Zhuang L., Meng J., Leonidires M., Dufau M.L. The human prolactin receptor gene structure and alternative promoter utilization: the generic promoter hPIII and the novel promoter hPN // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1999 - V.84 -P.1153-1156

111. Hu Z.Z., Meng J., Dufau M.L. Isolation and characterization of two novel forms of the human prolactin receptor generated by alternative splicing of a newly identified exon 11 // J. Biol. Chem. 2001 - V.276 - P.41086-41094

112. Hu Z.Z., Zhuang L., Meng J., Tsai-Morris C.H., Dufau M.L. Complex 5' genomic structure of the human prolactin receptor: multiple alternative exons 1 and promoter utilization // Endocrinology 2002 - V.143 - P.2139-2142

113. Hunter S., Koch B.L., Anderson S.M. Phosphorylation of cbl after stimulation of Nb2 cells with prolactin and its association with phosphatidylinositol-3- kinase // Mol. Endocrinol. 1997 - V.ll - P.1213-1222

114. Ihle J.N. Signaling by the cytokine receptor superfamily. Just another kinase story // Trends Endocr. Metabol. 1994 - V.5 - P. 137-143

115. Ihle J.N. STATs: Signal transducers and activators of transcription // Cell -1996 V.84-P.331-334

116. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of E. coli with plasmids // Gene 1990 - V.6 - P.23-28

117. Ishii M., Vroman B.T., LaRusso N.F. Morfologic evidence of receptor-mediated endocitosis of epidermal growth factor by isolated bile duct epithelial cells // Gastroenterology 1988 - V.94 - P.A550

118. Jabbour, H.N., Clarke, L.A., Bramley, T., Postel-Vinay, M.C., Kelly, P.A., and Edery, M. (1998) J. Mol. Endocrinol., 21, 51-59.

119. Jahn G.A., Edery M., Belair L., Kelly P.A., Djiane J. Prolactin receptor gene expression in rat mammary gland and liver during pregnancy and lactation // Endocrinology 1991 - V.128 - P.2976-2984

120. Janne O.A., Moilanen A.M., Poukka H., Rouleau N., Karvonen U., Kotaja N., Hakli M., Palvimo J.J. Androgen-receptor-interacting nuclear proteins // Biochem. Soc. Trans. 2000 - V.28 - P.401-405

121. Jolicoeur C., Boutin J.M., Okamura H., Raguet S., Djiane J., Kelly P.A. Multiple regulation of prolactin receptor gene expression in rat liver // Mol. Endocrinol. 1989 - V.3 - P.895-900

122. Jumaa H., Guenet J.L., Nielsen P.J. Regulated expression and RNA processing of transcripts from the Srp20 splicing factor gene during the cell cycle // Mol. Cell. Biol. 1997 - V.17 - P.3116-3124

123. Jumaa H., Nielsen P.J. The splicing factor SRp20 modifies splicing of its own mRNA and ASF/SF2 antagonizes this regulation // EMBO. J. 1997 - V.16 -P.5077-5085

124. Kastin A.J., Pan W., Maness L.M., Koletsky R.J., Ernsberger P. Decreased transport of leptin across the blood-brain barrier in rats lacking the short form of the leptin receptor // Peptides 1999 - V.20 - P.1449-1453

125. Kastin A.J., Pan W. Peptide transport across the blood-brain barrier // Prog. Drug. Res. 2003 - V.61 - P.79-100

126. Kelly P.A., Djiane J., Postel-Vinay M.C., Edery M. The prolactin/growth hormone receptor family // Endocrine Reviews 1991 - V.12 - P.235-251

127. Keresztes M., Boonstra J. Import(ance) of growth factors in(to) the nucleus // J. Cell. Biol. 1999 - V.145 - P.421-424

128. Kitamura T., Ogorochi T., Miyajima A. Multimeric cytokine receptors // Trends Endocr. Metabol. -1994 V.5 - P. 8-14

129. Kline J.B., Roehrs H., Clevenger C.V. Functional characterization of the intermediate isoform of the human prolactin receptor // J. Biol. Chem. 1999 -V.274 - P.35461-35468

130. Kline J.B., Clevenger C.V. Identification and characterization of the prolactin-binding protein in human serum and milk // J. Biol. Chem. 2001 - V.276 -P.24760-24766

131. Kline J.B., Moore D.J., Clevenger C.V. Activation and association of the Tec tyrosine kinase with the human prolactin receptor: mapping of a Tec/Vavl-receptor binding site // Mol. Endocrinol. 2001 - V.15 - P.832-841

132. Klint J., Robertson M.C. and Friesen H.G. Episodic secretory patterns of rat prolactin determined by bioassay and radioimmunoassay// Endocrinology 1982 -V.lll - P.350-352

133. Kmiec Z. Cooperation of liver cells in health and disease // Adv. Anat. Embriol. Cell. Biol. 2001 - V.14 - P.l-107

134. Knopp J., Zaliberova Y., Jurcovicova J., Torda T., Brtko J. Cross-linking of iodinated prolactin to rat liver nuclear protein // Endocr. Regul 1993 - V.27 -P.26-28

135. Kojima T., Yamamoto T., Murata M., Chiba H., Kokai Y., Sawada N. Regulation of the blood-biliary barrier: interaction between gap and tight junctions in hepatocytes // Med. Electron. Microsc. 2003 - V.36 - P. 157-164

136. Kullak-Ublick G.A., Stieger B., Hagenbuch B., Meier P.J. Hepatic Transport of Bile Salts // Seminars in Liver Disease 2000 - V.20 - P.273-292

137. Labrie F., Luu-The V., Lin S.X., Simard J., Labrie C., El-Alfy M., Pelletier G., and Belanger A. Intracrinology: role of the family of 17-hydroxysteroiddehydrogenases in human physiology and disease // J. Mol. Endocrinol. 2000 - V.25 - P. 1-16

138. Larkin J.M., Coleman H., Espinosa A., Levenson A., Park M.S., Woo B., Zervoudakis A., Tinh V. Intracellular accumulation of plgA-R and regulators of transcytotic trafficking in cholestatic rat hepatocytes // Hepatology 2003 - V.38 -P.1199-1209

139. Lebrun J.J., Ali S., Ullrich A., Kelly P.A. Proline-rich sequence-mediated JAK2 association to the prolactin receptor is required but not sufficient for signal transduction // J. Biol. Chem. 1995 - V.270 - P.10664-10670

140. Lee J. and Boyer J.L. Molecular Alterations in Hepatocyte Transport Mechanisms in Acquired Cholestatic Liver Disorders // Seminars in Liver Disease 2000 - V.20 - P.373-384

141. Liquita M.G., Catania V.A., Sanchez-Pozzi E.J., Mottino A.D. Ovine prolactin increases hepatic UDP-glucoroniltransferase activity in ovariectomized rats // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996 - V.278 - P.921-925

142. Liu Y., Ganguly T., Hyde J.F., Vore M. Prolactin increases mRNA encoding Na+ -TC co-transport polypeptide and hepatic Na+-TC co-transport // Am. J. Physiol. 1995 - V.268 - P. 11-17

143. Liu Y.X., Peng X.R., Liu H.Z., Chen Y.J., Ny T. Prolactin regulation of tissue type plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor type-1 gene expression in eCG-Primed rat granulosa cells in culture // Biol. Reprod. 1998 -V.59 - P. 409-416

144. Marchuk D., Drumm M., Saulino A., Collins F.S. Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products // Nucleic Acids Res. 1991 - V.19 - P.1154

145. Marti U., Burwen S.J., Wells A., Barker M.E., Huling S., Feren A.M., Jones A.L. Localization of epidermal growth factor receptor in hepatocyte nuclei // Hepatology 1991 - V.13 - P.15-20

146. Marzioni M., Glaser S.S., Francis H., Phinizy L.J., LeSage G., and Alpini G. Functional Heterogeneity of Cholangiocytes // Sem. Liv. Disease 2002 - V.22 -P.227-240

147. Maurer R.A., Erwin C.R., Donelson J.E. Analysis of 5' flanking, sequences and intron-exon boundaries of the rat prolactin gene// J. Biol. Chem. 1981 - V.256 -P. 10524-10528

148. McAveney K.M., Book M.L., Ling P., Chebath J., Yu-Lee L. Association of 2',5'~oligoadenylate synthase with the prolactin receptor: alteration in Prl-inducible statl signaling to the IRF-1 promoter // Mol. Endocrinol. 2000 - V.14- P.295-306

149. Mennone A., Alvaro D., Cho W., Boyer J.L. Isolation of small polarized bile duct units // Proc. Natl. Acad. Sci. USA- 1995 V.92 - P.6527-6231

150. Michalopoulos G.K. and DeFrances M.C. Liver regeneration // Science 1997- V.276 P.60-66

151. Mick C.C., Nicoll C.S. Prolactin directly stimulates the liver in vivo to secrete a factor (synlactin) which acts synergetically with the hormone // Endocrinology -1985 V.116 - P.2049-2053

152. Miyoshi H., Rust C., Roberts P.J., Burgart L.J., Gores G.J. Hepatocyte apoptosis after bile duct ligation in the mouse involves Fas // Gastroenterology 1999 -V.117-P.669-677

153. Mizoguchi Y., Kim J.Y., Enami J., Sakai S. The regulation of the prolactin receptor gene expression in the mammary gland of early pregnant mouse // Endocr. J. 1997 - V.44 - P.53-58

154. Morel G, Ouhtit A, Kelly PA, Prolactin receptor immunoreactivity in rat anterior pituitary // Neuroendocrinology 1994 - V.59 - P.78-84

155. Mui A.L. and Miyajima A. Cytokine receptors and signal transduction // Progress in Growth factor Research 1994 - V.5 - P. 15-35

156. Murphy L.J., Tachibana K., Friesen H.G., Stimulation of hepatic insulin-like growth factor-I gene expression by ovine prolactin evidence for intrinsic somatogenic activity in the rat // Endocrinology 1988 - V.122 -P.2027-2033

157. Murray, M.V. Role of phosphorilation in the pre-mRNA splicing // Post-transcriptional processing and the endocrine system / Ed. Chew S.L. Basel: Karger, 1999, P.83-100

158. Nathanson M.H. and Boyer J.L. Mechanisms and regulation of bile secretion // Hepatology 1991 - V.14 - P.551-566

159. Nathanson M.H., Burgstahler A.D., Mennone A., Fallon M.B., Gonzalez C.B., Saez J.C. Ca2 waves are organized among hepatocytes in the intact organ // Am. J. Physiol. 1995 - V.269 - P.G167-G171

160. Nevalainen M.T., Valve E.M., Ingleton P.M., Harkonen P.L. Expression and hormone regulation of prolactin receptors in the rat dorsal and lateral prostate // Endocrinology 1996 - V.137 -P.3078-3088

161. Nguyen D.A., Neville M.C. Tight junction regulation in the mammary gland // J. Mammary Gland Biology and Neoplasia 1998 - V.3 - P.233-246

162. Nguyen D.A., Parlow A.F., Neville M.C. Hormonal regulation of tight junction closure in the mouse mammary epithelium during the transition from pregnancy to lactation // J. Endocrinol. 2001 - V.170 - P.347-356

163. Nicoll C.S., Baldocchi R.A. Evolutionary origin of prolactins, growth hormones and placental lactogens // In: Imura H, Shizume K, Yoshida S, (eds) Progress in Endocrinology Excperta Medica, Amsterdam, V.2, P. 1379 -1384, 1988

164. Nishikawa S., Moore R.C., Nonomura N., Oka T. Progesterone and EGF inhibit mouse mammary gland prolactin receptor and beta-casein gene expression // Am. J. Physiol. 1994 - V.267 - P.C1467-1472

165. Niswender, G.D., Juengel, J.L., Silva, P.J., Rollyson, M.K., and MCIntush E.W. Mechanisms Controlling the Function and Life Span of the Corpus Luteum // Physiol. Rev. 2000 - V.80 - P. 1-29

166. Nolin J.M. Intracellular prolactin in rat corpus luteum and adrenal cortex // Endocrinology -1978 V.102 - P.402-406

167. O'Neal K.D., and Yu-Lee L.Y. Differential signal transduction of the short, Nb2, and long prolactin receptors // J. Biol. Chem. 1994 - V.269 - P.26076-26082

168. Ogata Y, Nishi M, Nakayama H, Kuwahara T, Ohnishi Y, Tashiro S. Role of bile in intestinal barrier function and its inhibitory effect on bacterial translocation in obstructive jaundice in rats // J. Surg. Res. 2003 - V.115 - P.18-23

169. Okamura H., Zachwieja J., Raguet S., Kelly P.A. Characterization and applications of monoclonal antibodies to the prolactin receptor // Endocrinology -1989 V. 124 - P.2499-2508

170. Orlova A.N., Smirnova O.V., Smirnov A.N. Appearance and functions of prolactin receptors in cholangiocytes after common bile duct ligation // Pathophysiology 1998 - V.5 - Suppl.l - P.230

171. Ormandy C.J., Graham J., Kelly P.A., Clarke C.L., Sutherland R.L. The effect of progestins on prolactin receptor gene transcription in human breast cancer cells // DNA Cell. Biol. 1992 - V.ll - P.721-726

172. Ouhtit A., Morel G., Kelly P. Visualization of gene expression of short and longforms of prolactin receptor in the rat // Endocrinology 1993 - V.133 - P.135-144

173. Ouhtit A., Morel G., Kelly P. Visualization of gene expression of short and long forms of prolactin receptor in the rat digestive tissues // Am. J. Physiol. 1994a -V.266 - G807-815

174. Ouhtit A., Ronsin B., Kelly P.A., Morel G. Ultrastructural expression of prolactin receptor in rat liver // Biol. Cell. 1994b - V.82 - P.169-176

175. Paku S., Schnur J., Nagy P., Thorgeirsson S.S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver // Am. J. Pathol. 2001 - V.158 -V.1313-1323

176. Parrola M., Cheeseman K.H., Biocca M.E., Dianzani M.U., Sater T.F. Isolation and characterization of biliary epithelial cells from normal rat liver // J. Hepatol. -1988 -V.6 P.175-186

177. Peltoketo H., Luu-The V., Simard J., and Adamski J. 17a-Hydroxysteroid dehydrogenase (HSD)/17-ketosteroid reductase (KSR) family; nomenclature and main characteristics of the 17HSD/KSR enzymes // J. Mol. Endocrinol. 1999 -V.23-P. 1-11

178. Perrot-Applanat M., Gualillo O., Pezet A., Vincent V., Edery M., Kelly P.A. Dominant negative and cooperative effects of mutant forms of prolactin receptor // Mol. Endocrinol. 1997a - V.ll - P. 1020-1032

179. Perrot-Applanat M., Gualillo O., Buteau H., Edery M., Kelly P.A. Internalization of prolactin receptor and prolactin in transfected cells does not involve nuclear translocation // J. Cell. Sci. 1997b - V.110 - P.1123-1132

180. Pezet A., Ferrag F., Kelly P.A., Edery M. Tyrosine docking sites of the rat prolactin receptor required for association and activation of STAT5 // J. Biol. Chem. 1997 - V.272 - P.25043-25050

181. Philips I.D., Anthony R.V., Buter T.G., Ross J.T, McMillen I.C. Hepatic prolactin receptor gene expression increases in the sheep fetus before birth and after Cortisol infusion // Endocrinology 1997 - V.138 - P.1351 -1354

182. Pi X., and Grattan D. Differential expression of the two forms of prolactin receptor mRNA within microdissected hypothalamic nuclei of the rat // Mol. Brain. Res. -1998 V.59 - P.l-12

183. Pi X., Voogt JL. Mechanisms for suckling-induced changes in expression of prolactin receptor in the hypothalamus of the lactating rat // Brain. Res. 2001 -V.891 - P.197-205

184. Pi X., Zhang B., Li J., Voogt J.L. Promoter usage and estrogen regulation of prolactin receptor gene in the brain of the female rat // Neuroendocrinology 2003 - V.77-P.187-197

185. Picoletti R., Bendinelli P., Maroni P. Signal transduction pathway of prolactin in rat liver // Mol. Cell. Endocrinol. 1997 - V.135 - P.169-177

186. Poupon R., Chazouillkes O. and R. E. Poupon R.E. Chronic cholestatic diseases // J. Hepatol. 2000 - V.32 - Suppl. 1 - P. 129-140

187. Radulescu R.T. From insulin, retinoblastoma protein and the insulin receptor to a new model on growth factor specificity: the nucleocrine pathway // J. Endocrinol. 1995a - V.146 - P.365-368

188. Radulescu R.T. The 'LXCXE' hydropathic superfamily of ligands for retinoblastoma protein: a proposal // Med. Hypotheses. 1995b - V.44 - P.28-31

189. Rao Y.P., Buckley D.J., Buckley A.R. The nuclear prolactin receptor: a 62-kDa chromatin-associated protein in rat Nb2 lymphoma cells // Arch. Biochem. Biophys. 1995 - V.322 - P.506-515

190. Rappaport A.M., Borowy Z.J., Lougheed W.M., Lotto W.N. Subdivision of hexagonal liver lobes into a structural and functional unit // Anat. Rec. 1954 - V. 119-P. 11-33

191. Rappaport A.M. The microcirculatory acinar concept of normal and pathological hepatic structure // Beitr. Path. 1976 - V. 157 - P.215-243

192. Reddy P.M. and Reddy P.R. Effect of prolactin on DNA methylation in the liver and the kidney of the rat // Moll. Cell. Biochem. 1990 - V.95 - P.43-47

193. Richardson B.P. Evidence for a physiological role of prolactin in osmoregulation in the rat after it's inhibition by 2-bromo-ergokryptine // Br. J. Pharm. 1973 - V.47 - P.623-624

194. Rincheval-Arnold A., Belair L., Djiane J. Developmental expression of plgR gene in sheep mammary gland and hormonal regulation // J. Dairy Res. 2002 -V.69 - P. 13-26

195. Robb-Gaspers L.D., Thomas A.P. Coordination of Ca2+ signaling by intercellular propagation of Ca2+ waves in the intact liver // J. Biol. Chem. 1995 -V.270 - P.8102-8107

196. Rui H., Lebrun J.J., Kirken R.A., Kelly P.A. JAK2 activation and cell proliferation induced by antibody-mediated prolactin receptor dimerization // Endocrinology 1994 - V. 135 - P. 1299-1306

197. Russell D.L., and Richards J.S. Differentiation-Dependent Prolactin Responsiveness and Stat (Signal Transducers and Activators of Transcription Signaling in Rat Ovarian Cells // Mol. Endocrinol. 1999 - V.13 - P.2049-2064

198. Rycyzyn M.A., Reilly S.C., O'Malley K., and Clevenger C.V. Role of Cyclophilin B in Prolactin Signal Transduction and Nuclear Retrotranslocation // Mol. Endocrinol. 2000 - V.14 - P.1175-1186

199. Sakaguchi K., Ohkubo T., Sugiyama T., Tanaka M., Ushiro H., Nakashima K. Differential regulation of prolactin receptor mRNA expression in rat liver and kidney by testosterone and oestradiol // J. Endocrinol. 1994 - V.143 - P.383-392

200. Sato K., Yabuki K., Habata T., Maekawa T. Kuppfer cell inactivation prevents lipopolysuccharide-induced structural changes in the rat liver sinusoid: an electron microscopic study // Hepatology 1996 - V.23 - P.788-796

201. Schuler L.A., Nagel R.J., Gao J., Horseman N.D., Kessler M.A Prolactin receptor heterogeneity in bovine fetal and maternal tissues // Endocrinology - 1997 - V.138 - P.3187-3194

202. Shirota M., Banville D., Ali S., Jolicoeur C., Boutin J.M., Edery M., Djiane J., and Kelly P.A. Expression of two forms of prolactin receptor in rat ovary and liver // Mol. Endocrinol. 1990 - V. 4 - P.1136-1143

203. Sinha Y.N. Structural variants of prolactin: occurrence and physiological significance // Endocrine Reviews 1995 - V.16 - P.354-369

204. Smirnova O., Petraschuk O., Kelly P. Immunohystochemical localization of prolactin receptor in rat liver cells: I. Dependence on sex and sex steroids // Mol. Cell. Endocrinol. -1994 V.105 - P.77-81

205. Smirnova O., Orlova A. Functional role for prolactin receptors of ratcholangiocytes under conditions of obstructive cholestasis // J. Hepatol. 1999 -V.30-S1 - p. 143

206. Spagnoli F.M., Amicone L., Tripodi M., Weiss M.C. Identification of a bipotential precusor cell in hepatic cell lines derived from trangenic mice expressing cyto-met in the liver // J. Cell Biology 1998 - V.143 - P.1101-1112

207. St-Pierre M.V, Kullal-Ublick G.A., Hagenbuch B., and Meier P.J. Transport of bile acids in hepatic and non-hepatic tissues // J.Experimental Biology 2001 -V.204-P. 1673-1686

208. Takakuwa Y., Kokai Y., Sasaki K., Chiba H., Tobioka H., Mor M., Sawada N. Bile canalicular barrier function and expression of tight-junctional molecules in rat hepatocytes during common bile duct ligation // Cell. Tissue. Res. 2002 - V.307 - P.181-189

209. Takikawa H., Wako Y., Sano N., Yamanaka M. Changes in biliary excretory mechanisms in bile duct-ligated rat // Dig. Dis. Sci. 1996 - V.41 - P.256-262

210. Telleria M., Farmer T.G., Zhong L., Clarke D.L., Albarracin C.T., Duan W.R., Linzer D.H., Gibori G. The different forms of the prolactin receptor in the rat• • corpus luteum: developmental expression and hormonal regulation in pregnancy //

211. Mol. Endocrinol. -1998 V.12 - P.544-555

212. Touraine P.H. and Kelly P.A. Homology modelling of rabbit prolactin hormone complexed with its receptor // Proteins: Struct. Func. Genet. -1997- V.27 P.459-468

213. Tracy T.F., Goerke M.E., Bailey P.V., Sotelo-Avila C., Weber Tr. Growth-related gene expression in early cholestatic liver injury // Surgery 1993 - V.114 -P.532-537

214. Trauner M., Meier P.J., Boyer J.L. Molecular pathogenesis of cholestasis // N. Engl. J. Med. 1998 - V.339 - P.1217-1227

215. Trauner M., Meier P.J., Boyer J.L. Molecular regulation of hepatocellular transport systems in cholestasis // J. Hepatol. 1999 - V.31 - P. 165-178

216. Trott J.F., Hovey R.C., Koduri S., Vonderhaar B.K. Alternative splicing to exon 11 of human prolactin receptor gene results in multiple isoforms including a secreted prolactin-binding protein // J. Mol. Endocrinol. 2003 - V.30 - P.31-47

217. Uotani S., Bjorbaek C., Tornoe J., Flier J.S. Functional properties of leptinreceptor isoforms: internalization and degradation of leptin and ligand-induced receptor downregulation // Diabetes 1999 - V.48 - P.279-286

218. Van Cauter E., L'Hermite M., Copinschi G., Refetoff S., Desir D., Robyn C. Quantitative analysis of spontaneous variation of plasma prolactin in normal man // Am. J. Physiol. 1981 - V.241- E355-363

219. Villaba M., Zabala M.T., Martinez-Serrano A., de la Colina R., Satrustegui J., Garcia-Ruiz J.P. Prolactin increases cytosolic free calcium concentration in hepatocytes of lactating rats// Endocrinology 1991 - V.129 - P.2857-2861

220. Vincent V., Goffin V., Rozakis-Adcock M., Mornon J.P., Kelly P.A. Identification of cytoplasmic motifs required for short prolactin receptor internalization // J. Biol. Chem. -1997 V.272 - P.7062-7068

221. Vonderhaar B.K. Prolactin involvement in breast cancer // Endocrine-Related Cancer 1999 - V.6 - P.389-404

222. U., Lohmann T., Sokolova O., Eigenthaler M. Prolactin receptor signaling during platelet activation // Horm. Metab. Res. 2003 - V.35 - P.228-235

223. Wang D.S., Dou K.F., Li K.Z., Gao Z.Q., Song Z.S., Liu Z.C. Hepatocellular apoptosis after hepatectomy in obstructive jaundice in rats // World J. Gastroenterol. 2003 - V.9 - P.2737-2741

224. Wang Y., O'Neal K.D., Yu-Lee L. Multiple prolactin receptor cytoplasmic residues and Statl mediate PRL signaling to the interferone regulatory factor-1 promoter // Mol. Endocrinol. 1997 -V.ll - P.1353-1364

225. Yasui T., Murakami T., Maeda T., Oka T. Involvement of gonadal steroid hormone disturbance in altered prolactin receptor gene expression in the liver of diabetic mice// J. Endocrinol. 1999 - V.161 - P.33-40

226. Yokoyama Y., Kitchens W.C., Toth B., Schwacha M.G., Bland K.I., Chaudry I.H. Upregulation of hepatic prolactin receptor gene expression by 17beta-estradiol following trauma-hemorrhage // J. Appl. Physiol. 2003 - V.95 - P.2530-2536

227. Zabala M.T. and Garcia-Ruiz J.P. Regulation of expression of the messenger ribonucleic acid encoding the cytosolic form of phosphoenolpyruvate carboxykinase in liver and small intestine of lactating rats // Endocrinology 1989 - V. 125 - P.2587-2593

228. Zhang W., Liu H., Han K., Grabowski P.J. Region-specific alternative splicing in the nervous system: implications for regulation by the RNA-binding protein NAPOR // RNA 2002 - V.8 - P.671-685

229. Zogopoulos G., Albrecht S., Pietsch T., Alpert L., von Schweinitz D., Lefebvre Y., Goodyer C.G. Fetal- and tumor-specific regulation of growth hormone receptor messenger RNA expression in human liver // Cancer. Res. 1996 - V.56 -P.2949-2953.

230. Я хочу выразить самую искреннюю признательность своим научным руководителям д.б.н. О.В. Смирновой и проф. П.М. Рубцову за увлекательную тему, за прекрасную атмосферу, советы и помощь на каждом этапе работы.

231. Мне также хотелось бы поблагодарить В.В. Киликовского (доц. каф. Медицинской информатики и кибернетики РГМУ): без его участия идея математического моделирования не нашла воплощения в этой работе, а также за советы по статистической обработке данных.

232. Выражаю глубокую благодарность зав. лабораторией Эндокринологии д.б.н. А.Н. Смирнову, а также прекрасному коллективу лаборатории: Т. Зенковой, Е.В. Покровской, В. Смысловой, Т.А Щелкуновой, за дружеское и внимательное отношение.

Информация о работе

Богорад, Роман Львович
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.13

Диссертация

Клеточная специфичность регуляции экспрессии рецепторов пролактина в печени крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы