Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гетерогенность и протеолиз пролактина лактирующих животных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гетерогенность и протеолиз пролактина лактирующих животных"

РГ6 од

2 О СЕН 1393

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ, БИОХИМИИ И ПИТАНИЯ _СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ животных

На правах рукописи УДК 591.147/591.360

МАРИНЧЕНКО

Геннадии Васильевич

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ И ПРОГЕОЛИЗ ПРОЛАКТИНА ЛАКТИРУЮЩИХ ЖИВОТНЫХ

03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

БОРОВСК

1993

Работа выполнена с лаборатории физиологии и биохимии лактации Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных.

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор А. Г. Малахов; доктор биологических наук, профессор И. К. Медведев; доктор биологических наук, профессор В. А. Першин.

Ведущее учреждение — Физиологический институт им. академика Л. А. Ухтомского Санкт-Петербургского государственного университета.

специализированного Совета д.ютл/ди при вгШИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Адрес: 249010, г. Боровск, Калужская обл., ВНИИФБиП с.-х. животных.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Защита состоится

1993 г. на заседании

Ученый секретарь специализированного Совета

Автореферат разослан

В. И. Дуди и

ОБЩ ХАРАКТ ЕРИСТ1ЖА

Актуальность проблемы. Большой интерес к гормональной рв- • гуляши лактадки связан с необходимостью решения ряда проблем сельскохозяйственного молочного производства, а такие задачами медицины. Регуляция лактации осуществляется комплексом гормонов, который включает пролектин, гормон роста, инсулин, глюкокорти-иоидн (или АКТГ), эстрогены и тиреоиДные гормоны (Азимов и др., 1936, 1968; Закс, 1964; Перпшн и др., 1968; Тверской, 1972; Грачев и др., 1973; Медведев и др., IS73; Лагодак и др., 1979; сowla and Tindal, 19?1|. Tucker, 1974). Необходимость пролактина в процессах инициации и поддеряания секреция молока доказана большим числом работ, выполненных на разных видах животных. Однако остается не ясным значение пролактина в подцеркания установившейся лактации у жвачных. Пролактин оказался не эффек- " тивннм для стимуляции лактации коров. До настоящего времени мало изучены конкретные бкохЕличесние механизмы действия про-лактина. Ограниченность знаний в отой области снижает эффективность использования эндокринных препаратов в сельском хозяйстве и затрудняет развитие новых методик и технологий, способствующих максимальному проявлению генетического потенциала молоаноЗ продуктивности. '■

. Физиологические эксперименты свидетельствуют, что у лакирующих животных не весь пролактин крова используется для подцераания лактации. Анализ этих данных приводит к мысли о молекулярной гетерогенности пролактина в крови животных. Разделение экстрактов гипофиза и препаратов очищенного пролай- • типа демонстрирую? неоднородность синтезируемого гормона, как по заряду, так и по молекулярной массо. Эти различия в строении существенно сказываются на биологической активности разных форы пролактина. В связь с этим, представляет большой интерес исследование форм пролактина в крови сельскохозяйственных ¡штатных в период камлогенеза. лактогенеза и лактопоээа. Mown ожидать, что формы пролактина, секретируемые аденогипофизом, модпфицирувтея при взаимодействии с белками крови или фергеен-тами ткаяей-шншней." С'нанЕЯ в этой области гесы/а ограничены.

7 лсштирущих животин* концентрация пролактина в cito~ ротке крови увеличивается в несколько раз в ответ на стимулы,

связанные о вскармливание*: потомства иди доением. Показано, что концентрация рецепторов пролактнна б молочной квлезе значительно повышается к концу беременности и максшдальна при интенсивной секреции молока (Зряков, IS78; Djiane et al.,-197?« Heyden et al«, 1979i'S£Lkai et al.,1985j Griaoon et al., 1988). Однако особенности связывания пролайтипа в ткани молочной железы при интенсивной лактации но изучены. Остается неясным значены физиологических с тагу лев, воэникаицях при вскармливании потомства 'шщ доении говвотшх в регулдпЕи связывания, и развитая ЕЛ*ектсв пролактина в молочной келезе. Выяснение этих связей является исключительно валыым для понимания и решения многих проблем физиологии лактации и молочного животноводства. '

Зависимость лактации от многих факторов затрудняет анализ прямых эсМгекгов пролактша в молочной келазе и условий, необходимых для проявления его действия. В рамсах концепции опосредованного действия пептидных гормонов Сазерленда (Sathorland, 19?2). за последние 20 лет множество соединений были проанализированы как возможные посредники лактогенного эффекта пролактина. Однако и по настоящее время ключевые реакции биохимического механизма действия пролакиша не выяснены. Между тем, данные морфологических исследований продемонстрировали, что пролайтин шш его-фрагмента способны накапливаться внутри клеток лактирупцей молочной кедезы, причем накопление происходит синхронно с освобождением ткани от молока (Holla et al,, 1980-, 19§5). Эти данные, а таксе успехи в лзучении опосредуемого рецепторами эндоцнтоза; открытие рецепторов пептидных гормонов на внутриклеточных структурах, заставляют более пристально обратиться к изучению судьбы самого пролакткна, связываемого секреторной тканью. Изучение тканевого метаболизма и участвующих в этом процессе ферментов необходимо при исследовании биохимического механизма' действия этого гормона как важнейшего фактора регуляции биосинтеза молока.

Дель и' задачи исследований. Целью работы явилось изучение молекулярной гетерогенности пролактина в крови с.-х. животных, регуляции связывания и протеолитического процессинга гормона в молочной железе иа разных стадиях лактации и при беременности. • * 2

В задачи исследований входило:

I. Изучить формы пролактнва в крови квачных гивотннх.

- исследовать формы пролахтина, секротируемого при ДОв-ЕИИ ЖИВОТНЫХ.

- исследовать соотношение олигомершпс форм гормона в igjo-ви в различные периода лектащш и при бэременвости.

- провести сравнение молекулярных вариантов пролактана в крови и молоке коров.

- изучать взаимодействие пролактана о снвороточннки белками крови.

П. Изучить связывание прслакткка молочной г.елезой.

- сопоставить дкнеллшу и гетерогенные fopm гормона в циркулирующей крсви г люфа молочной желвэы.

- выяснить влияние экзогенного пролактана на связывание горшпа е ткани.

- определить влияние физиологических стимулов на динамику связывания и протеолпз пролактана в галочной ге.тезо.

С. Исследовать субклеточную локализацию и свойства проте-кназ молочной г.елезы, гпдролизугщих пролактин.

ЗУ. Исследовать пептидные фрагмента пролактана, образующиеся на начальник стадиях протеолпза под действием тканевых

протснЕвз.

Научная новизна. Впервые ксследовано содержание олиго».:ервнх (i..cnof,:ep, дшер и ассоцкатк) форм пролактша в крови сельскохозяйственных ижотных - коров и kos. Установлено, что соотношение концентрации гетерогенных форм пролактина в крови зависит от стадии лактации и беременности. Показано, что флзполо-гические фактора, стшулирущве интенсивную секрецию пролактана, способствуют освобождение гормона из оденогядофиза в форш мономера. Физиологическая стимуляция молочной делэзи при доении, наряду с повышением койцентрздпп прогагакна в крови, способствует болео актгшноиу связиганию горнона её ткг-пями. Многократное повышение концентрация пролактина при введении экзогенного гормона енняает связывание пссяедуждах порций гормона в молочной келезо.

Впергне изучены протеолитнчосвие ферменты молочной келе-зы, гидролизуюцие пролактш. Обнаружены видовые различия в

активности этих фермантов у грызунов и жвачных. Проведена идентификация протеиназ, изучена их субстратная специфичность, локализация в секреторных клетках. Разработаны овоообы выделения о очистки тканевых протэвваз, определены их физкко-хи-шаческиэ свойства. Выявлены особенности протеолиза пролактша разных ввдов кивотных и пептидные фрагменты, образующиеся на начальных стадиях гидролиза гормона. Впервые проведен анализ строения про лак тина разных ввдов шботшх как субстратов для - действия экзо- и эвдопептвдаз. Показано, что строение С-кон-цевых фрагментов пролактша гомологично строешш пептидов, способных ингибировать протаглазц серинового типа.

Теоретическая и пгакткчсская вначыюстъ работы. Результаты исследования углубляют фундошнтгихиыс грс-дста1у.оыл $бзкохо-гии к биохимии лавтазик в области молекулярной гетерогенности и свойств разаих фори лактогениого горкона у ::Еачшх в сьязи о функциональным состоянием молочной .-хзлази, доказывают важное значепиэ оптамизацил параметров доения для стимуляция секреции и связывания пролакгана в .молочной железа. Эти данные могут быть использована в аивотиоводствэ для повышения молочной продуктивности.

Результаты доследования протеолиза пролактина в молочной келезе и ферментов расширяют представления молекулярной эадо-кршюдогиа о биохимических механизмах, контролирующих действие пролактша в клетках-мишенях. На оснований проведанных разработок опубликованы методические рекомендаций по способам получеяая и анализу свойств радаоактивно-мвчэннх пептидных гормонов. Разработано 9 рацпредложений.

Апробация работы. Основные материалы диссертации долокены на 13-м (Алма-Ата, 1979) и 14-м (Баку, 1983) Всесоюзных съездах физиологического общества И.П.Павлова; на конференции молодых ученых и специалистов Нечерноземной зоны, Ленинград, 1981г.; на международном молочном конгрессе, Москва, 1982; на Всесоюзном симпозиума по биохимии с.-х. животных, Витебск, 1982; на 6-ы (Львов, 1982), 7-м (Алма-Ата, 1986), 8-м (Баку," 1990) Всесоюзных ошяюзиумаг по физиологии в биохимии лактации; на Всесоюзной конференции по физиологии, биохимии а ии/ таада с.-х. животных, Боровой, 1985$ на ВсеооюзноЙ научно-тех-ническо! конференция по использованию гормональных препаратов 4

в животноводства, Дубровицы, Московской обл., 1991; Annuel Meeting American Dairy Sci Association, Horth Carolina, Halligh, 1990)-.

Публикация результатов чззледованяя. Прадсгавлэнний в диссертация материал нзлопон в 53 научных трудах.

Объем работа. Диссертация включает ввздэниа, обзор литературы, описания материала и мэгодов исследований, кзлол.ониэ результатов исследования, заключенно, вывода и практические лрэдяо-глния. Диссертация содержит 374 страница машинописного текста, 63 рисунка и 31 таблицу, Сллоок литературы включает 578 источников, в том числе 499 на иностранных языках.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, БЫНОСШЬЕ НА ЗАЩИТУ

1. Пролактин крови стачных яшзотних готорогонон по молекулярным размерам. Содержание олагоыарных форм пролактина -мономэра, димера, высокомолекулярных ассоциатов зависит от стадии лангацш и беременности.

2. Физиологическая стимуляция молочной железы при доении, наряду с повышением концентрации пролактина в крови, способствует связывании гормона её тканями. Повышение концентрации пролактина в крови отрицательно сказывается на связывании последующих порпдй гормона молочной железой»

3. Связывание пролактина в молочной железе сопровождается протеолитичаским процессиигом гормона тканевыми протеика-зами. Протеиназн секреторных клеток, способные осуществлять гидролиз пролактина в нейтральной среде, являются фэрмонтами серинового типа и локализуются в мембранах ядер а внутренних мембранах митохондрий. Начальные стадии гидролиза пролактина в лизосомальном пути метаболизма осуществляются катепсином D.

4. Тканевые лротэлназы молочной железы жвачных и гцзунов обладают видовыми особенностями в свойствах и регуляции.

5. Начальные стадии протеолиза пролактина заключается в гидролизе внутренних пептидных овязэй белковой глобулы с последующим освобождением специфического набора пептидных фрагментов. ' '

2. МШРИШ И МЕТОДЫ ИССЛВДОВАНИЙ

Эксперименты проведены на 40 козах и 50 коровах вивария

Всесоюзного НИИ генетики п разведения с.-х. животных и совхозов Ленинградокой области. Для опытов с применением радиоактивных материалов использовано 800 лактирущих крыс линии Вистар вивария Института Физиологии им. И.П.Павлова АН C0ÖP. Нивотныэ находились в стандартных условиях содержания и кормленая.

Основной экспериментальный материал, представленный в диооертации, получен в период с 1979 по 1992 гг.

Препараты высокоочищэнного пролактина поставлялись Национальным Агентством по исследованию гормонов гипофиза при Национальном Институте Здоровья, США (liafcional Institute of Diabetic and Digestive and Kidney Diseaatjs, Baltimore, Maryland, USA).

Наследование молекулярной гетерогенности пролактина в крови, молоко и лш|>е молочной хелезц проводили на коровах айвой массой 500-600 кг, 1-5 лактации и среднесуточным удоем 17 кг. В опытах на козах использовала глвотных массой 28-40 кг, 1-3 лактации и суточным удоем 0,5-1,5 кг. Эксперименты на звачных проводили в весенне-летний пэриод. Кормление проводилось в соответствии о типовыми рационами,' обесаечпваэди:<т потребности мшогяых в основных элалюнтах питания с учетом физиологического состоящая, и продуктивности. Содержание гетерогенных §орм пролактина в крови коров и коз изучали в различные паушды беременности и лактации. Динамику и формы пролактина в лдафе молочной железы авачных исследовали в период максимальной лактации.

Отбор проб крови у коров и коз проводили пункцией яремной взны или сонной артерии, которую опрративним методом выводили под кожу шея (Алиев, 1974). Пробы лимфы получали путем катетеризации главного лимфатического протока молочной хелазы (Тараненко, 1968). Концентрацию пролактина в биологических яадкостях определяли твердофазным радиоиммунологичоским методом. Пептидные гормоны, меченые изотопом I* получала по разработанной наш методике о приманенном лактопероксидазы, оорбированной на фосфате пиркония. Лактопероксидазу выделяли из молока воров по методу Иорраоона. Гомогенность и иммуноре-аативаость меченых горцонов контролировали гзль-хроматографи-"аВ*в оочетании о вммуноооаздениэм. Применялись кроличьи анти-

оывсротки, получсшшо в лаборатории к стандартам пролактида.

При исследовании гетерогокшх верк. пролектгна образцы плазмы крови глп .иььфЕ подвергал*: гель-хроматографии на сефа-дексах а-юо или а-лзо в колонках размером 75::2,2 ом и 65x1,5 см. Пробы молока перед разделением обезжиривала двукратным цонтрифугированкек при ЗООО обДсш в течение 30 мпн^т. Гранулы казеинов осаздели центрифугированием обезжиренного молока в з'льтрацентрифуге ш>-65 (ГДР) при 100000® в течение 20 мин, осадок отбрасывали. Б колонки вносили 1,5-3,0 мл плаэш кровп, лимфы или растворимой фракции молока. Для эл»-ироваиия использовали 0,02 М натрий фосфатный буфер, содержащий 0,15 И N301, I иг/т ЕСА и 20 г/л мертшлата (рН-7,4). Обычно применяли 4-5 хроматографаческих колонок, работающих одновременно с подачей фракций-в коллектор 5-яанальким перистальтическим насосом. Фракции элтата собирали по 3,2 и 2,2 мл из колонок диаметром 2,2 мм и 1,5 мм соответственно. Колонки были откалиброваш с помощью шлекулярннх стандартов фермы Свривах, Гдепоя. После гель-хро.матографи: каячую фракцию элю-ата яо I 1,ш ггр^иосили в поллэтллоновые пробирки (размером 1и::36 ¡.л), обработанные алтисквороткой на пролакгзн (по 2 или 3 параллелыша пробы)-. Содержание гетерогенных форм пролакта-■на во фракциях определяла! радиоишунологнчзским методом. В ка-чостве стандартов использовали препарата овечьего пролактина пхн-г-51?} нти-р-з^; 1АСШС-сРН1,-1в и пролайтина крупного рогатого скота лш-Р-в?! ЛЛГ-р-з^! извА-ъп?1.-Б1. Измерение радиоактивности п пробах п первичную обработку датах проводили на приборо Ког.лыо-Гагаа Ш'Л, Швеция).

Субклеточино 'фракции тианп колочиой холозм рвдодяля диф-'"''оренциальнпм понтр?Лугярово1и!Зи гоиогпнаточ. Длл этого охлач-доляую ткань кздальчплп на кусотга 0,5-2 г.;м, простат« для освоболдешля от Волков шлояа 0,25 ;,[ сахарозой к гомогзшзиро-валл в стеклянных гомогенизаторах со средой - 0,25 М сахароза, содержащая 0,01 М Трис-НС! буфор, рН-7,4. Гомогенат фильтровали через нейлоновые фильтры для удаления негомогенизированной 'ткани. 'Зубклоточпш фракция осагдали цснтрифугироваипэм гтдагаплп: ядтрная - бООя хГО -кт; г.этохоядргмьиая - 3300^ х 1С мпн; липозог.пльгпя - 25000 г, хЮ шя. В гжслзриичитах на 1':;зшз колотшой голоза коз лязосошльпу» фракция долили1на дао

подфракщш, состоящие из рыхлой и плотной части осадка грубых лизосом; Микросомальную фракцию осаждали при 96000 е х75 мин. Использовали рефрижераторные центрифуги - К-70, РС-6, ультрацантрифугн - Уко-бо и чр-65 (ГДР). Степень очистки субклеточных структур контролировали по активности ферглентов-маркёров: цигохромокоидаза, бэта-глицерофосфатаза, б'-нуклао-тидаза, глюнозо-З-фосфатаза и сукцинатдегидрогеназа (Гаврилен-ко и др., 1975; ЗсЬоп оь о1., 1979)«

Очищенные адра получали после обработки ядерной фракции тритоном Х-100 и центрифугирования в 2 М раствора сахарозы (й!уег et а1., 1977). Мембраны ядер выделяли гепариновым методом (Н11йоЪгап<1 еб а1., 1976). Очистку МИТОХОНДРИЙ ПРОВОДИЛИ центрифугированием в градиента плотности сахарозы. Наружные мембраны и митопласты (внутренние мембраны и матрикс) выделяли при обработка митохондрий дигитонином и Лубролом РХ с последущим центрифугированием при 144000 6 в течение I часа (ОгевшяаИ;, 1974),

Для определения активности протеиназ использовали меченые изотопом I125 пептидные горшни (ПРЛ, СТГ, ЛГ, ФСГ, инсулин), меченый гемоглобин, а танде синтетические хромогенные субстраты. Меченые субстраты получали ферментативным радаойо-дированием стандартных гормонов. Скорость гидролиза субстратов определяли при-37°по накоплению в среде радиоактивных продуктов, не осакдаэшх 10% IX/, Нейтральные протеазы определяли в 0,02 М Ыа, К-фосфатиом али Тряс-КС1 буферах, рН-7,4; кислые протеазы - в 0,2-0,02 М Глицин-НС1 буфере или в буфере На^НРО^ - лимонная кислота, рН-3,0-3,5. Буферные растворы содержали 0,5 М НаС1 и 0,3% ЕСА. для предотвращения действия неопецифичэских протеаз. Конечная,концентрация меченых гормонов в среда 10 нг/мл.

Выделение, очистку и определение молекулярной массы ферментов проводили методами жидкостной хроматографии: гель-филь-тращш, ионообменной и аффинной хроматографии. Жидкостную хроматографии высокого давления в колонках сферогель тзк ей 2000 (Япония) применяли при анализе фрагментов, образующихся при гидролизе пролактина разных видов (Хроматограф фирмы Бекман, США). В этих :г.а целях применяли разные модификации электрофо-"рбза в ПААГ, Применявшиеся методики подробно'описаны в наших

публикациях.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ 'ЛШЩОВАНШ 3.1. Гетерогенные формы пролактина в крова и молоке жвачных животных

Известны три олигоморнае форма пролактина, постровнные,из мономера с молекулярной массой 23 кД. К ним относятся собственно мономер,' димерная форма (мол.м. - 40-50 кД? и высокомолекулярные формы (мол.м. овыоа 100 кД). Образование молекулярных вариантов пролактина является одним из возможных механизмов регуляции его биологического действия.

Контрольные эксперименты, выполненные на лактирующих крысах линии Вистар с использованием 12®1-ПРЛ, показали, что высокомолекулярные форш пролактина могут секрзтироватьоя гипофизом, а также появляться в крови при связывании мономэра о сывороточными белками. Методическая постановка экспериментов на жвачных предусматривала наблвдэние форм ПРЛ, сонретируемнх гипофизом и возникающих при aro циркуляции в крови.

3.1.1. Про лак тип крови лактарущих коз In vivo И in vitro

В опытах на лактирующих козах доение вызывало многократное повышенно концентрации пролактина в крови за счет секреции мойомара и дилера (свободный пролавтая). Содержание высокомолекулярных форм пролактина в пробах не превышало 10% и не изменялось при доения (Рас.Г). При циркуляции в крови (60 мин посла доения) концентрация свободного пролактиаа поотепэнно снижалась, при этом связывания гормона с оивароточннмя белками не наблвдалось. Хранение или инкубация сыворотки крови приводят к частичному не Ьпоцифяческому связывания мономэрного пролантана о образованием форм, имеющих мол. массу свнш? 150 кД.

3.1.2. Соотношение олигом^риых форм пролактина в крови у коз при беременности и в различные периода лактации

У суягных коз (ТаблЛ) относительное содерданив мономера ПРЛ за 72-52 суток до окота составляло 75,I±L,7%, димара . Z4,3+1,7% при общей концентрации иммуяорэактивного пролактина 33,3 иг/мл. За 45-25 суток до окота концентрация гормона увеличивалась до 59,5 нг/мл, при этом мономер составил 67,9¿I3,IÍ,

Рис Л. Изменение уровня свободного (II) и связанного ПРЛ (I) в плазма коз. По оси ординат - концентрация фракций иммунорзактиввого ПРЛ в плазма (нг/мя). По оси абсцисс -время относительно начала доения. 1-3 - подопытные животные .

а дааер - 32,1±13,0#. За 20-4 суток до окота концентрация про-лакташа в крови шло изменялась и в среднем равшшаоь 53,7+ ¿4,5 нг/мя, из ниг 91,4$ составил мономер, а 6,6^ приходилось на долю диморной формы. Парод самым окотом (3-0 суток) у всех коз резко возрастал общий уровень гормона в крови - в среднем до 193,1 нг/мл. Относительное содор. канна мономера составляло 82,4^2,5^, а дЯмэра 17,6^2,5Я. Базальиый уровень-гормона через 10-15 дней посла окота снижался болэа чам в 2 раза, приг чом основной формой ПРЛ в крови становился мономэр - Э9,0± ±0,9$.

В период максимальной лактацаа оодорсшп иошмэрнзй Форш пролактина в плазма крова чзззз 7-10 шщ после доения составляло 50,8^1,35? от всего иммунорвактивного пролактина шэш, дилера - 9,2±1,3# (Рис.2). К концу лактации количество саботируемого пролактина сшшшось от 146,2^12,7 яг/мл до 39,7^4,3 нг/ыл. Бри этом относительная концентрация димерной -форш возрастала до 39,9^5,(Р < 0,01).

ДО

Таблица I

Содержание гбторогешэос Ферм прсогакгина в плазме коз в период беременности в начале лактации

Дни относительно окота

Ж коз -(73- -52) -(45-25) -(3-0) (10-15)

щ (нг/ мл) .моно-д-.зр ПРЛ (нг/ 1.1Л) дитар % 1.Х Е0- мер ¡0 Прл (нг/ га) дш.;ер 1/-0Н0- ^ер а ПРЛ (кг/ гл) дш.;ер иск о-

282 31,1 27,4 72,6 157,6 17,2 82,8 230,7 12,98 87,0 51,0 С 1С0

316 38,1 21,7 78,3 26,8 84,3 15,7 233,6 15,7 64,3 56,0 0 100

13 30,9 25,5 74,5 55,8 17,4 62,6 246,4 12,3 87,7 75,4 0 1С0

зсо - 29,2 22,4 77,6 119,0 21,5 78,5 .94,0 4,5 95,5

323 - 28,5 19,2 80,8 136,1 25,6 74,4 95,6 0,6 59,4

М 33,4 24,9 75,1 59,5 32,1 67,9 193,1 17,6 82,4 74,4 1,С 99,0 ±я ±2,4 41,7 -1,7 +25,0 ¿13,0 +13,1 +27,0 +2,5 +5,5 +9,3 +0,8 +0,9

Объем элюата, Мл.

Рис.2. Гетерогенные форма пролактина (ПРЛ) в плазме крови лаятирующих коз. Вверху у животных №№ 280 и 289 в период максимальной интенсивности лактации (июль), внизу -№ 287, 283 - в конце лактации (октябрь). Хроматография плазмы на оефадексе. с-150 в колонках 78x2,2 см; I - ди-мер ПР."./, 2 - мономер.

3.1.3. Гетерогенные формы пролактина в крови п молоке коров

У коров б период стельности, -также как и у суягных коз, наблюдаются существенные концентрации димерной формы ПРЛ. В период близкий к отелу содержание димера снижается до 8,9% (за 3-4 дня до отола), мезду 89-77 днем оно составило 15,6$. За 2-3 суток до отела наблвдаэтся резкое увеличение концентрации ПРЛ в крови. Этот многократный подъем пролактина свя-зивают с окончанием беременности а переориентацией метаболизма к интенсивному биосинтезу молока. В плазме крови коров в день отела преобладает лролактин в форме мономера с мол.мас-

сой 23 кД,-95,4^13,0%. Ассоциированные форш гормона (с мол. массой больше.100 кД) в этот период отсутствуют. И только небольшая часть проб крови содержит пролактян в димерной форме 4,6^13,0"ъ. На 3-6 месяце лактации мономер ПРЛ у лакирующих коров преобладает над другими формами, его концентрация составляет 91,0±р,8$ от всего иммунореакгивного гормона плазмы4.' крови. Относительная концентрация дилера составляла 8,1±0,4#.

Повышение концентрации пролактина у коров перед отелом приводит к накоплению высоких концентраций ишунореактивного гормона в молозива. Пролактпн, попадающий в альвеолы, имеет ва;;1Н09 значение кшс для самой ткани в период интенсивного лактогенэза, так и для вскармливаемого потомства. Особенно . высок уровень продантика в молозива в первые три удоя с варьированием концентрации от 50 до 600 нг/ют растворимой фракции молозива (в среднем 202,9^214,8 нг/ш, п=15). При гель-хрома? тографии с послодукщш рздпоишуноаналпзом фракций в растворимой фракции молока выявлены две форма пролактина - мономер 83,6^10,О/о и высокомолекулярная форма. Последняя олюяруется п свободном объеме колонок с сефадексом в-юо (мол. масса свыше 100 кД) и составляет 16,4^10,ОЙ от общего количества ПРЛ в пробах. Поскольку в день отела в плазме крови коров высокомолекулярной формы пролактина не обнаружено, то мошш заключить, что она образуется в самой ¡лодочной железе при вза- . пмодействии мономера ПРЛ со связывающим белком. Присутствие этого комплекса. пролактина в молоке первых удоев может отражать те селективные механизм!, которые приводят к интенсивному. накоплению гормона в альвеолах в конце периода стельности.

3.1.4. Накопление ишунороакгивного 1251-ПРЛ и продуктов его метаболизма в молоке

Для выяснения вопроса о происхождении'высокомолекулярной формы пролактина, идентифицированной в молоке коров, проведаны . эксперименты на лактирующих крысах линии Вистар, получавших внутривенные инъекции 1-11РЛ.

Хроматографией в колонках с сефадексом а-гоо и сефарозе 6В установлено, что белковые метаболиты пролактина в молоке неоднородны. Гель-хроматографией выявлено три пика радио'актив-

ности с юл. массой свыше. 200 кД, пик с мол., массой 68 кД и иммунореактивный мономер 1251-ПР.11. Содержание нативного мономера на превышало 3-5$ от воай радиоактивности, поступающей в молоко. Таким образом были получены доказательства того, что высокомолекулярный комплекс гоолактина образуется непосредственно в молочной железе и только небольшая доля нативного гормона проникает из крови в альвеолы лактирущих животных.

3.2. Влияние'доения на динамику пролактпна в крови и лимфа молочной :.;елези

Концентрация пролактина в интерстициальном пространства и в лшд}е - молочной железы изменяется в соответствии с интенсивность» связывания гормона секреторными клетками. В опытах на козах параллельно определяли динамику пролактина в крови и лтфе молочной железы. 7 всех животных доение вызывало резкий подъем (+105$) концентрации пролактина в крови (Табл.2).

Таблица 2.

Динамика пролактина в крови (средние данные)

Время в

Коза № 162

Коза 15 189 Коза й 191

Средние данные по козам

мин ' И т м и 1.1 т и ш

-20 > 40,0 1,7 45,6 1,9 44,6 2,5 43,4 2,1

-10 44,6 2,4 46,2 .2,1 47,0 8,8 45,9 5,4

-О- 54,1 ' 1,4 45,4 4.9 51,6 4,3 50,6 3,8

10 102,0 1,9' 95,8 8,Г 78,6 7,2 92,1 6,3

12 110,4 1,3 108,0 7,5 ' 105,2 13,0 107,8 8,7

17 122,1 0,9 92,4 6,0 99,6 10,0 104,7 6,7-

20 120,3 2,9 87,0 7,0 89,0 7Д 98,7 6,0

30 101,1 3,6 65,4 8,3 57,4 4,3 74,6 5,7

40 67,1 3.7 53,4 3,3 44,6 3,1' 55,0 2,8

50 . 54,3 3,2 48,4 3,3 46,8 3,3 49,7 3,3

60 49,2 1,2 46,4 3,1 43,6 1.4 46,4 2,1

70 48,3 3,3 38,0 7,0 43,1 5,5

" Накоимаиьная концентрация пролактина в крови достигалась на 7-12 минуте от начала доения. Повышение концентрации пролакти-14

на в лигфЗ' молочной железы (Табл.Э) отмечалось несколько позднее, чем в крови - макс ¡шум достигался только на 30 минуте и был ниже в среднем на 55,6±2,1 нг/ш (Р< 0,001), или на 46,6$ от уровня в крови. После окончания доения уровень гормона в крови и лимфе снижался. На 60 минуте разница концентраций про-лактина в крови и лимфе составила только 4,0±1,0 нг/мл.

Таблица 3.

Динамика пролактияа в лимфе (средние данные)

1па,(с. Коза К 162 Коза № 169 Коза № 191 Средние дан-• выв по козам

мин----

м и II т И т и т

-30 26,3 2,4 24,6 1,8 28,8 2,7 26,5 2,3

-20 25,7 3,6 28,2 4,4 36,8 4,1 30,2 4,0

-0- 30,0 3,2 28,2 4,4 29,8 2,0 29,4 3,3

10 38,3 3,9 33,4 4,2 41,4 4,4 37,7 4,2

' 20 46,6 3,5 42,0 3,9 54,0 1,7 47,5 3,2

30 54,0 1,4 48,8 8,0 53,8 6,0 52,2 5,8

40 54,5 2,9 43,8 6,0 48,4 4,8 48,9 .4,7

50 51,3 1,1 36,2 2,9 36,2 "4,3. 41,2 3,1

60 50,5 1,2 36,0 3,3 40,4 7,8 42,3 4,9

70 48,6 1,1 32,8 2,3 40,8 7,2 '40,7 4,4

60 45,1 1Д 28,6 2,7 40,4 5,3 38,0 3,4

90 36,6 5,2 29,4 3,9 39,4 7,8 35,1 5,9

100 33,5 5,3 27,6 4,1 36,6 7,5 32,5 5,8

НО 26,6 4,1 26,6' 4,4 31,8 2,7 28,3 3,8 •

120 21,6 7,4

Сравнение концентрации "етерогошшх форм пролактина в крови и лимуе показало, что во всех случаях содермте шно-мерной формы в лим£е много шшэ, чем в крови (рис.З). Содержание димера в ллмре относительно кропи менялось незначительно. Таким образом, при прохождении из крови в межклеточную г.пдкость и далее в лимфу молочной келвзы наблвдается исчезновение мономерной формы пролактина в результате связывания и . метаболизма гормона.

пм 1

нг/ил

5ог

20Ь *

Объем элюага, Мл.

' 1

Рас.З. Содержание мономерной (I) и димарной (2) форм пролактина в плазме крови (А) и лии£е (Б) молочной желези козы. Гель-хроматографая 3,5 мл ллаз:ш (7-10 та от начала. доения) и лшфи (25-30 мин от начала доения).

Аналогичные закономерности выявлены при исследовании им-мунореактивных форм пролактина у коров (Рис.4). Максимальная концентрация пролактина в ла.\*$а достигалась у коров на 20-30 минута после начала доения. При относительной концентрации мономера и диыэра в крови 83,7±1,и 16,3±2,3$, в лимфе со-дертлнаа этих форм составило С4Д±8,2$ и 35,9+7,2$, т.е. концентрация моаомарного ПРЛ в лимфа была существенно наш, чв111 в крови, что свидетельствует о более активном связывании в молочной железа пролактина в мономерной форма.

3.3. Влияние экзогенного пролактина на оодор/лцяэ гормона в крова а лимфа У лактируших коз экзогенное введение пролактина в дозе 0,4 иг в начале доения (шн-р-б-п) биологическая активность '35*0 МЕ) существенно увеличивало пик концентрации гормона в

крови - до 170,0 нг/мл, что на 61,8$ вшпо максимальной концентрации гормона при обычном доении. В ходе последовательных доений с инъекцией гормона количество пролактина, оттекающего от молочной железы с лимфой, возрастало. Причем, после третьей-четвертой инъекции отношение максимальной концентрация пролактина в крови и в лимфе приближалось к единице (Рис.5)?, т.е. уровень гормона в крови и лимфа не различался.

40

20

10 ■

X

6

wA^-V

1 5 >& о и о

ч Й 5 0 д лл .41 и/ 8 /1 ■ км

ю 30 ю

Номера фракций

30

50

Рис.4. Содержание моаомерной (I) а димерной (2) форм пролактина в плазме крови я лим$о молочной железы коровы "Дочка", а, б -пролактин крови на 7-10 мин от начала доения; в, г -пролактин крови на 50-60 мин от начала доения; д,. в -пролактин в лимфе на 20-30 млн от начала доения.'

Сл/Ск 1.0 г

0.6

0.8

А-Ж

1

■Ах

0.2

12 3 4 5 Инъекции, И

Рис.5. Отношение максимальных концентраций пролактина в лимфа и крови при инъекциях экзогенного гормона в начале доения. I - у козы й 191, 2 - у козы К 282. По.оси ординат - отношение максимальной концентрации гормона в .тамфа (сд) к максимальной концентрации в крови (С^). ,

Связываниз пролактина в молочной яелеза осуществляется специфическими рецепторами пролактина (дактогенные рецепторы). Наблодазмый ■эффект можно обменить насыщением рецепторов избыточным гормоном, а также действием механизмов обратной регуляции чувствительности (или числа) лактогенных рецепторов В молочной железе (Caff et al., 1979'. Djiana et al., 19B0). Полученные данные, показывают, что эффект суммируется при многократном вводонии экзогенного пролактина с интервалом в 1014 часов. В опытах с введением пролактина не начале доения, а через 60 минут, когда концентрация собственного гормона в крови у коз возвращалась к базальному уровню, не происходило повышения оттока пролактина с лимфой молочной железы. Максимальная концентрация эндогенного и экзогенного гормона в крова ооотавляла 83,0^2,7 и Ю3,7±5,4 нг/мл соответственно, а в

лимфе 60,5±3,7 и 56,7±14,0 нг/мл. Разница максимальных концентраций экзогенного пролактина в крови и лимфе составляла 47,0± ±4,6 нг/мп пли 45,3$ от уровня в Крови, что свидетельствует о существенном связывании экзогенного гормона тканью молочной железы.

При введении тех ае доз экзогенного пролактина между доениями эта разница значительно меньше. В опытах с введением пролактина через 6 часов после утреннего доения концентрация пролактина в крови составляла 100,0±5,7 нг/мл. При этом максимальный уровень пролактина в лимфэ был 76,0±2,8 нг/мл. Разница концентраций составила 24,0^2,9 нг/мл (Р< 0,02), то есть вдвое мэньпго, чем в опытах с введением гормона через 60 минут после доонпя. Следовательно, наиболее активное связывание пролактина клетками'молочной железы происходит в момент доения. Таким образом, доение не только стимулирует поступление пролактина из адоногипофиза в кровь, но одновременно способствует повышении активности связывания гормона.

•3.4. Влияние раздраконил афферентных рецепторов молочной железы на связывание и метаболизм пролактина в ткани

Связывание экзогенного пролактина изучалось в условиях подавления секреции эндогенного гормона. Секреции эндогенного гормона подавляли бромкрштин-мезидатом (СВ-154, Сандоц, Швейцария) . Па фоне действия бромкрштша, в яремную вену коз в точение 100 машут шфузнровали пролаитпц с постоянной скоростью 0,17 мл/шн при конгентраю! 0,14 мкгДд. Применяли препарат '¡Ш-р-35 с биологической активностью 32,2 №. В первой серии опытов изучали динамику концентрации окзогеняого ШГ при пнфузии без доения (отсутствует раздражение афферентных рецепторов молочной желэзн), при этом отмечалось постепенное повышение уровня пролактина в крови животных (Рис.6). Концентрация гормона достигала максимума 66,7+3,9 нг/мл через 40 минут. Затем уровень гормона скитался, хотя параметры ин-фузии оставались постоянными. Через 60 мм содержание пролактина в крови составило 55,6+3,3 нг/мл, п через ГОО мин 43,8± +3,5 пг/кл. Это сш'Хенпе котздентрлгата экзогенного гормона мсп!о объяснить повшеплом скорости свЯэкншул в организме, на фоне хронического подавления сокрогоп; эндогенного пролал-

тина. Сходный эффект стимуляции собственных рецепторов наблю-, дали в печена лактируидих крыс при введении экзогенного пролактина (ноэа вt а1., 1982). Во второй серии животных доили во время инфуэшз, начиная доение через 30 мин после, начала введения ЕРЛ (Рис.7). К 30 м«нуте концентрация гормона достигала уровня 60,4±4,7 нг/ыл, с началом доения животных происходило снижение концентрации гормона до 48,1±5,5 нг/мл. Это снижение вызывалось доением и продолжалось около 20 минут.' Затем концентрация пролактина снова повышалась, достигая на 65 минуте уровня 62,2^2,9 нг/мл и оставалась в этих пределах до конца инфузии.

Рис.6. Динамика концентрации пролактина в крови лаити-рующих коз при инфузии гормона с постоянной скоростью. Стрелка - начало инфузии. По оси абсвдсо - время в мин относительно начала инфузии. По оси ординат - концентрация пролактина в нг/мл.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что доение животных действительно способствует росту интенсивности пог-* 'лощения пролактина в организме. Б 3-й серии опытов, опорожне-

нг/мл 70 г

—<-—-1-1_I '

-20 0 20 40 60 80 100МИН.

низ молочной яелезы производили через катэттэр. В этом случае яе яаблвдалось существенных изменений динамики пролантина относительно контрольной серии без доения. Таким образом, заметное снижение концентрации гормона в крови достигалось при условии раздражения чувствительных рецепторов молочной железы при доении. Это свидетельствует в пользу того, что доение способствует активизации связывания пролактина в ткани молочной железы.

В экспериментах с использованием радиоактивно меченого пролактина было показано, что связывание гормона в молочной железе сопровождается его протеолитичоскиы гидролизом. Эти результаты согласуются с современными представлениями о том,, что благодаря эндоцитозу комплексы пептидных гормонов о рецепторами погружаются внутрь клеток-мишеней, где может осуществляться их протеолитический процессинг (Görden et al., 1982i Kellsy et al., 19&,+). Следовательно, динамика деградации пролактина в молочной железе также зависит от интенсивности связывания гормона лактогеняыми рецепторами секреторных клеток. В экспериментах, выполненных на лактирупцих крысах линии Вистар было проведено сравнение скорости протеолиза ■^51-пролактина эксплантатами молочной железы. Наиболее высокая пролактин-дэградирузощая активность была обнаружена в тканях с максимальным опорожнением от молока, при вскармливании потомства. Отсадка крысят от матери снижала скорость протеолиза гормона тканью на 60/1 (Р < 0,01). Причем, это не было связано с переполнением тканей молоком, из-за отсадки матери. Возвращение крысят и стимуляция молочных желез при сосании повышала скорость протеолиза пролактина этими тканями до контрольного уровня. Если часть сосков делала нэдоступными для крысят, то при сосании остальных скорость протеолиза пролантина повышалась и в первых.

Результаты проведенных экспериментов позволяют заключить, что акт сосания стимулирует механизмы, ответственные за про-тоолитичэское расщепление пролактина в молочной .-голоза. По современным представлениям протеолиз пептидных гормонов в. тканях-миионях осуществляется после интерналнзацщ в клетку. гормона, связанного рецепторами. В соответствии с этим, по- . вышение пролактсш-деградируицей активнооти в эксплантатах

молочной железы можно объяснить тем, что физиологическая стимуляция молочных аелез способствует активации аппарата лакто-генных рецепторов и опосредуемого рецепторами эндоцитоза в ' секреторные клетки.

Рио.7. Влияние доения на динамику концентрации пролак-тина при ипфузии гормона о постоянной скоростью (I) и обычном доении (2). Стрелки: а - начало инфузии; б -начало доения (без инфузии ПРЛ и действия бромкриптина). Обозначения те же, что и на рис.6.

В целом полученные- результаты свидетельствуют о важном значении физиологически адекватной стимуляции молочных аелез ' как для механизмов секреции пролактша, так и для согласованной активизации связывания лактогенного гормона.

3.5. Протэиназы молочной железы, гидролиэуюцив пролактин

Связывание пролактина в молочной железе сопровождаевся быстрым протеолизом гормона. В экспериментах на лактирующих крысах анализировалась динамика связывания и протеолиза пролактина в молочной железе (Рио.8). Из тканей экотрагиро-'ьадся выоокоыолеяулярный комплекс пролайтана о белком, пред-

положительно рецептором, продукта протеолиза и мономер ПРЯ. Гидролиз гормона отмечался уде через 3-5 мин после внутривенного введения гормона аивотннм. Экстрагируемый высокомолекулярный комплекс подвергался протеолизу, как и мономер.

%

Рис.8. Динамика деградации овечьего ^®1-пролактина, (1ÍIH-P-S11, США), в молочной железа (А) и почках (Б) крнс. Содержание (в относительных %) мономера (I), продуктов деградации (2) и высокомолекулярных комплексов (3) в экстрактах тканей. По данным гель-хроматографии на сефадексе G-150 в колоннах 50x1,2 см. По оси абсцисс - время в минутах.

Методами хроматографии продукты окончательной деградации 1251-пролактина были идентифицированы кан ^51-тироЗин а анионы

I. В крови животных не было обнаруаено ферментов, способных осуществлять гидролиз 12®1-пролактина. Прямое исследование протеиназ молочной железы, осуществляющих гидролиз пролактина, составляло определенные трудности. Скорость протеолиза пролактина ткани in vitro сильно замедаяетоя. При инкубации эксплантатов, содержащих связанный 1251-пролактин, за 2,5 часа гидролизовалось только 15% мономера. В экспериментах in vivo такой уровень протеолиза достигался за .4 минуты. Использование совершенствованных нами методических приемов позволило достоверно определять протэолиз меченого пролактина in vitro. В суспензии эксплантатов тканей молочных кадез существенная

пролактин-деградарующая активность бита зарегистрирована в облаоти нейтральных рН. При гомогенизации тканей наблюдали резкое повышение скорости гидролиза пролактина в киолой среде.

В молочной железе было выявлено два типа лротеиназ, способных осуществлять протеолиз пролактина: протеиназн, активные в нейтральной и слабо основной среде (рН-7,0-9,0), а такяе ферменты, имеющие максимум активности в кислой среде около рН - 3,0. Активность кислых протеиназ сулчственно повышается при обработке гомогенатов детергентами.

3.5.1. Субклеточная локализация, пнгибиторный анализ и субстратная специфичность лротоицаз ткани молочной лшлезы лактирующих крыс

Локализация фзрмецтов, способных осуществлять протеолиз пролактина в молочной желозе,. определяется при разделении гомогенатов на субклеточные фракции. При этом активность протеиназ во фракциях субклоточннх структур резко возрастает относительно гомогената. Макстмальцая активность-протеиназ, имеющих оптимум рН в нейтральной среде, локализовалась в ядерной и митохондриатьной фракциях. Протоиназц с максимумом активности при кислых рН локализовались, главным образом, во фракции лизосом (Рис.9). Во фракции мпкросом, содержащей плазматические мембраны и лактогенннё рецепторы, пролактин-доградирухвдая .активность в нойтральной среде была очень низкой, а в ряде случаев не определялась совсем. Полученные данные свидетельствуют, что рецепция пролактина секреторными клетками и его протеолиз морфологически разобщены.

При гидролизе нескольких пептидных гормонов выявлена относительная субстратная специфичность протеиназ (Рис.10). Скорость гидролиза овечього пролактина нейтральными протеа-зами митохондриальной фракции в 2,7 раза ниже, чем пролактина крыс (Р< 0,0027). Гормоны, не имеющие рецопторов в молочной железе (ЛГ и ФСГ), ферментами этой ткани гидролизовались' относительно слабо. Замочена высокая активность протеиназ мо-лочно&делезы при гвдролпзе гормона роста, что объясняется высокой гомологией строения соматотропина и пролактина. Максимальная' активность протеолиза инсулина в молочной железе локализуется в растворимой фракции цитозоля. В настоящее вре-

Рис.9.Распределение пролактин-даградирущэй активности по субклеточным фракциям молочной железы при рН-7,4 (п= 10) и при pli 3,0 (п= 8). По оси абсциео -Г -гомоге-нат, Я - ядерная фракция, M - штохондриальная, Л -лизо-сомальная, Мн - микросомальная, С - супоркатант. По оси ординат - активность протеаз- в ф!.1 деградированного кПРЛ за 100 мин, на мг белка субклеточных фракций.

Рис.10.Скорость деградации 12^1-пролактина крыо и других нескольких овечьих гинофизарных гормонов в субклеточных фракциях молочной квлеэи. I - ядерная, 2 - мито-хоцдриальная, 3 - лизосомальная фракции. По оои ординат-скорость деградации меченых гормонов в фМ/мг за 100 мин, при 37°.

мя похожая протеиназа многих других тканой идентифицирована как специфическая инсулиназа (Duckworth, 1989). Путем анализа действия ингибиторов выявлено, что протеолитическая активность в ядерной и митохондриаяьной фракции молочной железы связана с присутствием циотеиновых и сериновых протепназ (Табл.4).

Таблица 4 •

Действие ингибиторов сульфгидрильных и сериновых протеаз на пролакткн-деградируодуга активность в ядерной,митохоя-■ дриатьной и лизосомальной франции молочной железы

т Реагент Концентрация Ядерная Митохондри-альная Ллзосоыаль-ная

pH - 7,4

Контроль _ 100 100 100

I. К-этгшшге-имид 0,001 м 59,5*10,3 95,2*2,2 67,2*8,1

2. п-хлор\;ергу-ркбонзоат 5'10~4М 0,0 76,2 56,9*26,5

3. Глутатион (восст.) 0,005 м 149,1*8,7 64,6*2,4 163,8*7,7

4. Цистеиа 0,04 м 91,9*5,6 37,0*1,1 . 73,2*11,2

5. ¿ешыматилсуль-фонилфторид 0,001 м 42,5*8,4 18,4*2,5 104,6*1,5

6. Дифондлкарба-милхлорцд 0,001 м 8,8*9,6 11,0*10,1 74,3*2,5

7. Ингибитор трипсина I мг/гал 46,1*5,1 15,8*3,7 86,8*4,1

В лизосомальной фракции наиболее сильным иигибирукдал действием обладал п -хлорморкурибензоат. Это свидетельствует

TOS

об участии цистэиновых катепсинов в деградации л*""1-пролак-тана. Однако этот роагент полностью но предотвращает гидролиз гормона в лизосоыах.

3.4i,'2. Протеиназы молочной лолэзы -коз, деградирующие пролайтин и инсулин

Протеиназы молочной г.елозы последовали у коз в разгар лактации к на стадии запуска при инволюции секреторных клеток.

Учитывая выраженную гетерогенность клеточного состава молочной железы коз, особое внимание уделяли совершенствованию методов выделения субклеточных: фракций, степень очистки которых контролировали по активности фэрментов-маркэров. В субклеточных фракциях молочной малезы лактирующих коз активность нейтральных пролактин-деградирующих- протаинаэ-была очень низкой -но более 6,0 фМ/мг. Это'на порядок ниг.э, чем активность соответствующих ферментов в молочных ;;;олезах лактирущях крыс. В стадии естественной инволюции :келезы уровень активности нейтральных протеиназ оставался низкпм. Проявлялась тенденция к увеличению активности в растворимой фракции цатозоля до 17,8± ±6,8 фМ/мг, п=4. Максимальная активность кислых протеиназ," гидрблизующих овечий 12^1-ПРЛ, была выявлена в лизосомальной подфракции {¡2 (80,1±Ю,1 фМ/мг). Эта активность в 4 раза превосходила активность во всех остальных субклеточных фракциях, что свидетельствует о лизосомальном проиохоадэнии фермента. На стадии инволюции секреторных клеток у коз наблвдалооь повышение активности кислых протеиназ во фракции цитоплазмати-часних белков на 181$, а в митохондриалыюй фракции на 4115?. Эти данные согласуются с представлениями о том, что при инволюции повышается проницаемость мембран лизосом, что Приводит к повышению активности лизосомалышх гидролаз в цитоплазме секреторных клоток с одновременной активизацией образования аутофагосом путем захвата других субклеточных структур (Короленко, 1983; Коеп1а, 1984-).

Hat.ui обнаружены значительные различия в скоростях гидролиза пролактнна и инсулина нейтральными протеиааэами. В молочной :.;елезо коз происходит с высокой скоростью протеолиз инсулипа, причем максимальная активность нейтральной протеи-нлзп, специфичной к инсулину, локализуется в растворимой Фракции цитозоля (£06,1+71,1 фМ/ыг, п=8)'. При естественном прекращении лактации у коз активность этого фермента повышалась на 105$. Сопоставляя полученные данные с особенностями лактогенного действия пролактнна у жвачных моано предположить, что низкая активность нейтральных протеиназ молочной железы по отношению к пролактину сникает эффективность протзолитичес-кой модификации гормона п это отраясается на уровне биологического действия. Такое предположение не противоречит другим эк-

спериментальнын данным и поддерживает гипотезу о взхном значении протоолитяческого пронессинга гормонов, обладающих лактогенным действием.

3.5.3. Лизосомальный путь деградации пролактина в молочной £0лозо: кинетика гидролиза пролактина катепсином О и образующиеся фрагменты

Лизосомы тканей чувствительны к деГстр.ыо гормонов и'осуществляют большое чиоло функций, связанных как с катаболичес-ной деградацией субстратов клетки, так и с регуляцией метаболических дутой посредством ограниченного протеоллза ферментов, а также гормон-рецепторных комплексов (Сагреп^ег et а1., "19В6; Непе11 еъ а1., 1987). Как у крыс, так и у коз максимальная скорость протеолиза пролактина во фракциях, обогащенных лизосомада, наблвдалась при рН - 3,0-4,5. Лротэиназу, ги-дролизукэдую пролактин, солюбилизировали обработкой лизосомаль-ной фракции Тритоном Х-100. По данным гель-хроматографиш на сзфадексе в-юо молекулярнгя масса фермента 45 кД. При применении бактериальных ингибиторов было выявлено 100$ ингиби-рование формонта пепстатином - специфическим ингибитором ка-тепсина I) (Табл.5).

'• . Таблица 5.

Действие ингибиторов на солюбйлизировашше

лизосомалыше протеазы

№ Реагент Концен-тращш Остаточная активность С.»)

I. Контроль - 100

2. Пепстатин 10 мМ 0

3. Лейпептин 2 i/í-I 42,9

4. Глутатион воест. В мМ 158,3

5. Дитиозритрит 12 мМ 125,2

" 6. Меркаптоэтанол 12 мМ 131,2

.' 7. о Соевый ингибитор трипсша 0,1 мг/мл 89,4

6. Фенйлмэтилсуль-фонилфторид 0,1 и! Л 90,6

Результаты исследования физико-химических свойств и ин-гибиторный анализ приводят к заключению, что начальные стадии протеолиза пролактина в лцзосомах осуществляются катепсином в. Этот фермент является типичной лизосошльной протеиназой аопараганового типа, функции которой во многом не выяснены.

Для исследования особенностей гидролиза пролактша катепсином в проводилась' очистка этого фермента из лизосомаль-ной фракции молочной аелезы. В ходе экспериментов было получено 10 партий катепсина Б. Фермент, очищенный в 320 раз, полностью ицгибировался лепстатином и не ингибировался п -хлормеркурибензоатом, что указывает на отсутствие существенной примеси цистеиновых протеиназ. Исследовано влияние соотношения концентраций фермент/субстрат на скорость'гидролиза 12^1-про-лактина.

При рН 3,3 катопсин в молочной железы осуществляет гидролиз гормона по нескольким пептидным связям. Лимитирующей стадией является гидролиз внутренних связей в молекулах пролактина, что приводит к образованию крупных пептидных фрагментов. При изменении соотношений фэрмент/субстрат от 1:1 до 1:3 происходит ускорение гидролиза пролактша. Константа Ми-хаэлиса для этих концентраций ПРЛ составила - 2,7хЮ""®'М, а для денатурированного гемоглобина - 4>5х10~5 М. На основании кинетических данных производился подбор оптимальных соотношений концентрации вате псина и и пролактша в среде. При электрофорезе в гэлях полиакриламцца на начальных стадиях про-теолиза выявлены фрагменты с гюл. массой 10,3 и 9,6 кД. С увеличением глубины протеолиза пролактина в гидролизатах происходит накопление пептидов 6630, 3020, 1680 и Г040 дальтон. Продолжительная инкубация с ферментом при рН-3,3 приводит к глубокому гидролизу гормона до пептидов менее I кД. В опытах на функционально активных клетках в эндоцитозцых везикулах и лл-зосомах обычный уровень рН составляет 5,0-5,5. Этот диапазон рН, по нашим данным, является областью быстрого возрастания, активности катепсина п клеток молочной млезц. Небольшие изменения рН в этом диапазоне сильно изменяют скорость гидролиза пролактина и других субстратов. Этот факт представляется вгшшм для регуляции направленности и скорости лизосомального гидролиза пептидных гормонов и их комплексов с рецепторами в

физиологических условиях.

3.4.4. Сериновая протеиназа ядер секреторных клеток молочной железы

К настоящему времени открыто существование специфического связывания некоторых пептидных гормонов с изолированными ядрами, ядерной мембраной, нуклеоплазмой и конденсированным хроматином (Бездробный, 1984; Smith, 19S7; Rakowicz et al., 1987). Накапливающиеся данные формируют представление, что связывание некоторых поптвднцх гормонов с ядром клеток-мишеней являотся этапом в реализации их долговременных эффектов. Результаты, полученные при очистке ядер и последующем выделении мембран, доказывают, что протепназы, гидролизугощле про-ладтин, ассоциированы с мембранными структурами ядер секреторных клеток молочной железы. (Табл.6).

Таблица 6.

Очистка протеиназ из ядер сокреторных клеток молочной железы, гидролизующлх пролактцн

Фракция Объем мл Белок мг/мл Всего болка Выход Акт-ть болка протеаз Суммарная активность

Гомогенат 410 5,05 2071 100 1,2 2485,2

■Неочищенные ядра II 1,0 II 0,53 17,0 187,0

Очищенные ядра 2,5 2,6 7,7 0,37 11,0 84,7

Ядерные оболочки г 3,0 6,0 0,29 55,0 330,0

Солюбшшзи- роваыные протеиназы 2 2,4 4,8 0,23 39,6 190,1

Протеиназа ядер весьма кестко связана с мембранами, она не со-лзобилизируется при обработке целым рядом детергентов, хотя при этом 70$ мембранных, белков переходит в раствор. Солюбшш-зацию^дротеиназ удается осуществить в 0,5 М калий фосфатном буфере рН - 8,1-8,2, при этом 65$ белка мембран переходит в раствор, -а активность возрастает в 4,5 раза. Молекулярная масса фермента по данным хроматографии на оефадексе о-?5

24 кД. Оптимум pli при гидролиза ^I-IIPI в диапазоне рН - 7,v? 9,0. В области нейтральных: рН от 6,8 до 7,8 происходит разкое повышение активности фермента, что является потенциальной возможностью рехуляции активности форманта в физиологических условиях. Иигпбиторним анализом протеинаэа ядер идентифицирована как фермент соршшвого типа. Обнаружена зависимость активности фермента от сульфгндрилышх рецептов, особенно в оолюбиллзировапном состоянии. .Чейпептин на оказывал влияния па активность 'очищенной протеиназы, что доказывает отсутствие нримаси лизосомалышх катепсинов.

3.5.5. Нейтральная протегшаза внутренних мембран митохондрий клеток молочной железы

А

Нами показано, что в митохондриях секреторных клеток молочной :.'.олози локализуется протеинаэа, способная с высокой скоростью гидролизовагь пролактин ц гормон роста. Эти протеи-назы не изучены. В экспериментах на лактирующих крысах и козах была доказана локализация фермента в митохондриях секреторных клеток, разработаны способы выделения и очистки фермента, изучены физико-химические свойства. После очистки и разделения митохондрий на составные элементы активность протеи-назн концентрируется во фракции внутренних мембран (Табл.7).

При применении комплекса ингибиторов выявлено, что активность фермента лигибируется на 95^ и более фенилметплсуль-фонилфторвдом, дпфешшшрбамилхлоридом ж ингибитором трипсина сои. Лротеоллз пролактина слабо активировался сульфгидрильнн-мп реагентами - цистеином, глутатионом, дитиотреитолом, что мод от быть связано не только о чувствительностью к ним фермента, но и с облегчением протеолиза при восстановлении ди-' сульфидных связей в самом пролактинз. Хелатирукхцио агенты -йдГА. и о-фонантролин снизали активнооть протеииазы на 20-40$. Таким образом, ингибиторннй анализ приводит к заключению," что исолодуемый фермент является сориновой металлзавиошлой про-тешщзой.

Разработана методика очистки и солмбилизацин матохонд-риальной протаиназ'ц с применением аф$шшоЙ хроматографии на иммобилизованном ингибиторе трипсина. Оптимум рН фэрмонта 7,5-9,0. Очищенный фермент быстро инактивируется даае при замораживании 0-(-15°)0. Протеинаэа гидролизует нативные гор-

31

моны: крысиный и овечий пролактин; овечий гормон роста; бычий инсулин и денатурированный гемоглобин. Константа Млхаэлиоа по отношения к денатурированному гемоглобину 1,2x10"^ и Ю-6 М для овочьего ^1-ПРЛ.

Таб.чица 7.

Распределение протеолитичзской активности и активности ферментов-маркеров в субмигохондриальных фракциях ^

Фракция • Протеолит. активность Р Цчтсхром-оксидаза усл. од. Глутаматде-гядрогеназа усл.ед.

Митохондрии ноочищошшо 37,Ь±13,8 0,65^.0,25 0,55+0,13 .

Митохондрии после очистки 93,8+15,1 1,82±р,73 1,0310,81

Нарушив мембраны ■ 9,1+2,3 0,41+0,06 0,12+0,09

Матрикс 0,6^0,2 0,1510,12 4,22+1,65

Внутренние мембраны 131,0±14,5 2,5110,92 •0,51+0,24

1. Единицы активности цитохромокепдазы

А550 б !,шн на * мг болка субклеточных фракций

2. Единицы активности глугаматдопщрогеназн

^340 8 шш на * мг ^0Лка субклеточных фракций

3.5.6. Гидролиз пролактина мембранные протеяназами

Специализированные протеиназы осуществляют контроль физиологических функций как со стороны образования рагуляторных пептидов, так и со стороны их деградации. Исследованы особенности гидролиза натавного пролактина разных водов животных с применением охарактеризованных момбраннх протеиназ ядер и митохондрий секреторных клеток молочной лелезы лактпрующих крыс. Результаты исследования гидролпзатов пролактина методом жидкостной хроматографии высокого давления (ЗХВД) выявили, что набор пептидов, образующихся .при протеолизо крысиного а овечьего пролактинов, в основном одинаков. При рН - 0,1-8,3 и 37°С скорость гидролиза крысиного пролактина была выше, чэм овечьего. 'Замечено, что протаолиз гормонов начинается с разрыва внутренних пептидных связей белковой глобулы без диссо-

циации на фрагмента. Ото приводит к увеличению эффективного радиуса молекул и кажущейся молекулярной масои мономэра от 23 кД до 32 кД. В дальнейшем при гидролизе освобождаются круп-нив фрагменты пролактина - 14 кЛ и 7-9 кД. Интенсивно накаплив ваится относительно мелкие пептида - 4 кД, 3 кД, 2,5 кД, 1,5 кД и меньше I кД. Результаты анализа гидролизатов пролактина методом электрофореза в восстанавливавших условиях выявили существенные видовые особенности в расщеплении крысиного и овечьего пролактинов протэиназой штохондриальных мембран. Пролактин крыс относительно быстро гидролизузтся с накоплением фрагментов 15 кД, 9 кД, 4 кД, 3 кД и меньше 3 кД. Это направление протзолиза является преимущественным при низких-соотношениях концентрации фермент/субстрат и является фазой специфического гидролиза по наиболее доступным связям гормона. В этих условиях'методом электрофореза регистрируется накопление в среде пептида 15 кД, да;:;е при продолжительной инкубации пролактина о ферментом I, 2, 3 и 4 часа. Мелкие пептиды при этой исчезают в результате деградации. Протеолпз овечьего пролактина происходил иным образом. Фиксировались фрагменты Э кД, 4-4,5 кД и менее 3 кД. Образования фрагмента 15 кД отмечено не было. Таким образом, начальные стадии протеолиза пролактина тканевыми протеиназами молочной железы осуществляются путем расщепления внутренних пептидных связей. Направление и скорость протеолиза определяется специфичностью ферментов и видовыми особенностями в строении молекул пролактина. Недавно показано, что фрагмент пролактина 16 кД способен стимулировать клеточную пролиферацию (С1арр эъ а1., 1988). Свойства отдельных фрагментов пролактина свидетельствуют в пользу их физиологической значимости.

3.6. Анализ строения пролактина и.других эволжционно родственных гормонов

Пролактин, гормон роста и плацентарные лактогены образуют группу родственных гормонов, обладающих строением и перекрывающимися эффектами у разных видов адвотннх. Результаты анализа строения концевых фрагментов пролактина показали,что этот гормон защищен от действия большого числа амино- и карбо-ксипоптидаз, благодаря остаткам Рго-2 и дисульфидам петлям

на N - и С-нонцах. Строение С-кошдевого диоульг'.илноптада пролактина млокопитащих и рыб гомологично строению пептидов, способных ингибирозать сернновые протеиназы. Эти пептиды имеют строение д'исульфпдной петли с остатка;,и лизина пли аргинина внутри. Пептид, образующий петлю на С-конце молекул пролактина, шкот легко отадзпляться при действии сериношх протеин'аз, поскольку соединен с остальной частью молекулы последовательностью из 16 аминокислотных остатков, где оОр пептидных связей образовано лпз;шо;л л.тл аргинином. В структуре и -концевой дисульфиднои по тли пролш:тина млекопитающих обращают на себя внимание консервативные остатка 1'го-;; д Рго-Л, которые являются сайтами для атаки протеазами, чувст-вительныш к пролпну. Этот я -концовол додекаиоптид пролактина млекопитающих является потонциалышм ингибитором про Линзависимнх протеиназ, которые участвуют в регуляции метаболизма физиологически активных пептидов. Таким образом, особен- . ности первичной структуры пролактина в совокупности с прост-ранотвопным строением молок/л определяют селективность начальных стадий протеолитичеокого процеосинга гормона в тканях-мишенях. При ограниченном протоолизо пролактина возмогло освобождение функционально активных фрагментов.

ВЫВОДЫ

I, Пролактин крови квачцих аивотних но однороден, а представлен несколькими оллгомерными формами с разлнчшодзйоя молекулярной массой: мономер - 23 кД, дииер - около 48 кД, ассоциаты - свыше 100 кД. Относительное содержание гетерогенных форм пролактина в крови'зависит от физиологического состояния ашвотннх. В крови у корон и коз не обнаружено связыва- • ния эндогенного пролактина с стюроточннмл белками. Цеченып -пролактин способен связываться с сывороточными балками крови.

2. В заключительный период беременности происходит интенсификация секреции пролактина, при этом основной формой гормона крови является мономер. Во время отела уровень пролактина достигает максимальных концентраций с преобладанием мономера (95,41). В начальный период лактации в крови ;лзачных животных (коровы, козы) пролактин также циркулирует прэиму-

щественно в форма мономера, относительное содержание которогоо свыше 90$ от всего гормона плазмы. По ходу лактации происходит постепенное сшшииа количоотва саботируемого пролактина о повышением относительного содержания димерной формы. Во вторую половину лактации содержание димара у коз достигает 39,7%.

Таким образом, основная роль в становлении и поддержании лактации принадлежит пролаитину в мономерной форме. Факторы, стимулирующие интенсивную секреции пролактина, способствуют освобождению гормона из аденогипофиэа в форме мономера.

3. сшзиологачески адекватная стимуляция молочной железы при доении, заряду с повышением концентрации пролактина в крови, способствует более активному связываний гормона её • тканями. Молочная иола за лактирувдих животных связывает про-лактиц преимущественно в мономерной форме.

4. Многократное введение .экзогенного "пролактина при доении снижает эффективность связывания последующих порций гормона в молочной келоза. Это ведет к увеличению концентрации гормона в лимфе. Эффект дозозавиоим в выраяен слабое при ион-цвнтрациях экзогенного гормона, не превышающих максимальный уровень эндогенного гормона при доении.

5. Метаболизм пролактина в секреторных клетках молочной :,;елэзн осуществляется по нескольким направлениям, Основное количество пролактина подвергается пратеолитическому процес-сингу под действием тканевых протеаз. Продукты протеолиза пролактина частично возвращаются в кровяное русло, частично поступают в молоко. Иативннй мономер пролактина такдв способен проникать в молоко. Наиболее высокая концентрация пролактина регистрируется в молоко первых удоев.

6. фракция плазматических мембран секреторных клеток молочной дэлозы, содержащая лактогешша рецепторы, не содержит протеаз, способных осуществлять гидролиз пролактина. Эти и другие полученные дашшо доказывают, что рецепция и протео-литичаскин процессинг пролактина морфологически разобщены, т.е. осуществляются в разних компартментах клеток.

7. 3 лизосомальном пути метаболизма начальные стадии промолиза гормона осуществляются аспарагиновой протеиназой -катепспном о. Цистеиновые иатепсины участвуют в окончательно!1. деградации освобоздаюшдхся пептидных фрагментов. Началь-

ныв стадии протеолиза пролактиаа, очищенным катапоином б, заключаются в гидролизе внутренних пептидных связей с освобождением группы относительно крупных фрагментов. При продолжительной инкубации гормона о ферментом осуществляется глубокий гидролиз пролактина до пептидов с молекулярной массой меньше I кД. .

8. Протеиназы молочных желез лакирующих коз и крыс линии Виотар, способные осуществлять протеолиз пролактина в нейтральной среде, локализуются в ядрах и митохондриях секреторных клеток. Максимальная концентрация специфической ин-оулиназы регистрируется в раствори?.«« белках цигозоля. Нейтральные протеиназы секреторных клеток молочной железы специфичны по отношению к лактогенним гормонам. Пептидные гормоны, не имеющие рецепторпв в молочной железе (ФСГ и ЛГ), слабо гидролизуются этими ферментами.

■ 9. Протеиназн ядер-и митохондрий клеток молочной железы идентифицированы как ферменты серинового тала, овязанныэ с мембрана!,ш. Исследованы физико-химические характеристики этих протеиназ, разработаны способы их солюбиллзаций и очистки. Гидролиз пролактина мембранно-связанными оериновыми про-теиназами осуществляется путем расщепления внутренних пептидных связей о образованием группы фрагментов. На начальных стадиях протеолиза освобоздаются наиболее крупные фрагменты • о молекулярной массой 14 и 8 кД. Обнаружены видовые особенности в направлении и скорости протоолиза пролактина. Пролак-тин крыс менее устойчив к гидролизу, чем.овечий или бычий пролактин. В ткани молочной аелэзы лакирующих коз активность оериновых протеиназ на порядок нижа, чем у крыс, что свидетельствует о существенных различиях регуляции и метаболической активности секреторных клеток этих видов алвотных.

'10. Окончание лактации и инволюция молочной келезы наряду о активизацией лязосомальных протеиназ повышает активность специфической инсулин-деградирующей протеиназы в цитоплазме секреторных клеток.

Анализ отроения пролактина разных видов животных свидетельствует, что специфическая структура концевых фрагментов защищает его молекулы от протеолиза под действием амино- и карбокслпептвдаз. С-концевые участки пролактина, а такие эво-

люционно родственных гормонов - СТГ и ПП, потсроены гомологично пептидам, способным инГибировать сериновыа протеазн.

N-концевой; доденапептвд пролактина млекопитающих может проявлять ингибиторные свойства и протаиназаы, специфичным к остаткам пролина.

Практические вывода и предложения

I. Для получения пептидных гормонов, меченых изотопом 1251 с сохранением биологической активности, разработан новый ферментативный твердофазный способ, основанный на применении микрокристаллического фосфата циркония в качестве сорбента для лактопероксидази.

'2. Для анализа меченых пептидных гормонов на гомогенность и иммунораактивность рекомендуется хроматографичэоний опоооб, комбинированный с иммуноосакденаем.

3. Разработаны новые способы выделения, оолюбшгаэации я очистки сериновых протеаз молочной железы - ферментов, которые являются специфическим инструментом для оелективпого гидролиза пролактина я выделения его фрагментов.

4. Разработана в рекомендуется модифицированная методика очистки катепсина D из ткани молочной железы.

5. Для более полного использования генетического потенциала молочной продуктивности с.-х. животных рекомендуется организация доения с наибольшей оптимизацией параметров стимуляции организма животных. Физиологически адекватное доение активирует секрецию лантогенннх гормонов, связывание пролактина в молочной аэлззо, увеличение'содержания найболее активной мояомерной формы пролактина в крова гшвотных,

6. Ври разработке способов гормональной стимуляции лактации необходимо учитывать, что многократное введение экзогенного пролактина блокирует связывание гормона в молочной железе.

7. Представляется перспективным дальнейшее изучение и использование синтетических фрагментов гормона пролактина как возможных регуляторов функций секреторных клеток молочной *а-лезы.

СПИСОК РАБОТ ОЛУБШЖОВАШЬК ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тарананко А.Г., Маринчонко Г.Б. Динамика накопления про-лактина в органах лактируицих крыс и его субклеточное рас цредвлениа в ткани молочной яелозы//Пробло,да зндокринол,-

1976.- Т.22.- * I.- С.61-66.

2. Маринчснко Г.В., Гараненко А.Г. Деградация иролактина в молочной железо лактпругацих крыс//Проблеш эвдокринол.-

1977.- Т.23,- Л 5.- С.88-92.

3. Маринчонко Г.В., Федосимов В.А., •Тараненко А.Г. Свободный и связанный пролактин в крови локирующих коз//5 Всесоюзны симпозиум по физиол. и биохим. лактации.-Тоя. докл.- Ленинград.- 1978.- С.92.

4. Маринчонко Г.В. Аналитическая ионообменная а гель-хроматограф ия болковнх гормонов, меченых радиоязотопами//Пробломн эндокринол.- 1979,- Т.25,- № 4.- С.80-85.

5. Федосимов З.А., Марплчон..о Г.В., Таранонко А.Г. Гетерогенные формы ггролактина в крови лакирующих коз//Совремзинне достижения физиологии п биохимш лактшдчл, Наука.- 1981.-С. 108-112.

6. Маранченно Г.В. Получение пролактпна I*25 методом о применением лактопероксидазы, сорбированной на фосфата циркония //Проблемы эндокринол.- 1981,- Т.27.- № 5.- С.54-58.

7. Маринчонко Г.В. Иослодовгшпз мота юлп.гла нрояактина У лакирующих ¿.ияотных//Бшлотень ВЛЖТл.- 1981,- В.49.- С.24-30.

8. Марипчзпко Г.В., Хамракулов У., Таранонко А.Г. Концентрация I! фор:.".1 прсмштшт п крови и Лзлро молочной Г.ЗЛОЗК ллк-тарутазт еоз в-с^язч о долит п шп.зкцдялл ркзэгэдного горионо//<гизиол. -Л. им.Сеченова АИ ССОР,- 1Й82.- Т.68.-

№ 10.- С.1444-1450.

9. Хамракулов У., Маринченко Г.В. Форш пролактина в крови у коз в конца бероменност:1//Всвсопзн.конф. молодых уч. и спей; Нечерн. зоны РСФСР "Проблемы генотшш л сэдокц. о/г животных".- Тоз. докл.- 1981.- Л.-Пушкин.- С.73-74.

10, Таране нко А .Г., Йаршгашю Г.В., Гл.мракулоь У. Пути стимуляции молочной продуктивности горноианп//Млгдупар. ыэ-

лочный конгресс.- М.- 1982.- 0.36.

11. Маринчэнко Г.В. Пролактня-даградирулцие протеазы в ткани молочной лолззн а почках лаитарунда животнше//Всвооюзн. ош, по биохим. с/х животных.-Тез. докл..-Витебск,-1982,- 0.101.

12. Маринченко Г.В., Тарананко А.Г., Хамрааулов У. Влияние стимулов доения на катаболизм пролактина в молочной аадд-зе//Всесоюзн, сшш. по биохим. с/х н-х.-Тэз. доял.-Витебск,- 1982.- 0.132.

13. Маринчэнко Г.В. Деградация пролай тина в молочной аэлеза -возмогшая связь о горша-рацепторным вэаимодайотви9ад//Всо-соазн. симп. по физиол. и биохим, лактации.-Таз. докл.-'

1982.- С.109. '

14. Хамракулов У., Маринчоико Г,В., Таралевко А.Г. Роль стимулов доения и концентрации пролактина а.регуляции связывания гормона в молочной железе//Всео. оимп. по фазиол. и биохим. лактации.- Тез. докл.- Дьвов,- 1982.- С.110.

15. Хамракулов У., Мар^нчашо Г.В., Тараленко А.Г. Гетерогенные формы пролактина в плазме коз/Лзбвконвй биол. журнал .

1983,- Л 3.- 0.30-34. ,

16. Хамракулов У., Маринчэнко Г.В., Тараненко А.Г. Влияние инъекций экзогенного пролактина на"динамику концентрации эндогенного ПР1 в крови и лимфа молочной аелезы коз//Уз-бекский биол. зурнал,- 1983.-й 3,- 0.24-25.

17. Маранченко Г.В. Специфические протеазы, деградирующие цро-лактнн в молочной железа, субклеточная локализация а аяга-биторный анализ//Биохиг,шя.- 1985,- Т.50*- № 2.- С.200-210.

18. Маринченко Г.В. Система специфических аротеаз, деградиру»-. щах пролантиа в мембранах ядер, матохойдрий я в лнзосоцаг

ткани молочной :юлезц//ДонЛ. АЙ СССР.- 1985,- Т.280.- Л 6.-С.1479-1484, ■ ' •

19. Маринчевво Г.В. Деградация 1251-продакгиыа в молочной железе и почках лак тирующих крца//Иробле!.щ эпдокрйнол,-1985.- Т.31.- * 3.- С.49-54.

20. Хамракулов У. Маринченко Г.В. Влияние раздрагаяай чувствительных рецепторов молочной железа коз ва динамику вонцон-трациа пролактина цра инфузаа//Еагл.ВНИИРГЗ.- 1985.- В.82. С.7-10.

21. Хрошчева Р.П., Маринченко Г.В. Нейтральные протоазы ми-тоховдрий молочной .'¡елазы, деградирующие пролактин//Бюлл. ВШМРГЛ.- 1985,- В.82.- С.18-23.

22. Маринченко Г.В. Яизосомальннй путь деградации пролактина в молочной яэлаза лаКтиругадях .;;ивотных//7 Воес. симп. по физиол. ибиохям. лакт.- Тез. докл.- Алма-Ата.- 1986.0,4-5.

23. Маринченко Г.В., Хрошчева Р.П. Протеазы молочной железы коз, деградирующие пролактин и иноулин; субклеточное рао-продолзняэ и субстратная опоцнфичностъ/Бадд. ШШРП.-1986.- В.91.- С.25-31. ■ .

24. Щейникова Е.А., Маринченко Г.В. Свойства протеиназ ядерных мембран оократорных плеток молочной хэлезы//В сб.; "Физиолого-биох-'м. основы реализации генетического потенциала молочностп/ТВНИИРГХ- Л.- 1988.- С.63-76.

25. Маринченко Г.З, Радвойодирование пептидных гормонов//Ме-тодичосюш рекомендации.-ЗШЙРГI.- Л.- 1988,- С.27.

26. Маринченко Г.В., Хропычева Р.П. Лизосомальшй путь деградации пролактина в молочной жэлезэ: кинетика гидролиза про лак там катепсиног* D и образующиеся фрагмента//Биохи-мия.- 1989.- Т.54.- № 4.- С.629-639.

27. Маринченко Г.В. К биохимическому механизму действия пролактина. Гомология строения концевых фрагмэнтов пролактина с циклическими пептидами - ингибиторами протеиназ//8 Всес. сш.ш. по физиол. и биохим. лактации, Баку.- 1990,-Тез. докл.- М., ВАСХНИЛ.- 1990.- С.6-8.

28. Маринченко Г.В., Макнамара Д. Лнгпбирование иноулин-де-градарующей протаинази -тропой ткана коров пролактином и гормоном ростаУ/8 Всес. симп. по физиол. и бмохшл.лактации, Баку.- 1990.- Таз. докл!- М.ВАСХШ1Л.- 1990.- С.8-9.

29.Тимофеева Ы., Маринченко Г.В. Динамика пролактина, гормона роота, кортизола, инсул1ша, тироксина, трийодтиронина в плазме крови коров в конце беременности и в начале лактации/^ Всес. сиш. по физиол. л биохш. лактации, Баку.-19*90.- Тез. докл.- М., ЙАСЛШ.- 1990.- C.99-I00.

30. Щейникова'Е.А., Маринченко Г.В. Характеристика фрагментов,' образующихся при гидролизе пролактина протеипазой мембран ядер секреторных клеток молочной жэлезн//8 Всес. симп. по

физиол. и биохим. лактации, Бак у.- 1990,- Таз, докл., М., ВАСХШ11.- 1990.- C.I29-I3I.

31. Маринченко Г.В. Анализ отроения ковцавых фрагментов ПР1 как потенциальных субстратов сзриновшс и пролин-специфи-ческих протаиназ//Биохиыля,- 1991.- T.5S.- Л 5,- 0.771-778

32. Маринченко Г.В., Хамракулов.У., Лебедев В,А., Тимофеева 1.1,А. Гетерогенные формы пролактина в крови и молозиве жвачных :Ы1вотннх//Физиол. курнал им. Сеченова, АН СССР,-1991,- Т.77,- ft II,- C.I08-II6.

33. Marinchenko G.V., Мс Hamara G.P., Becker-Khalel В., Sun S., Parmley К. Growth horaona and insulin effects and proteolysis in adipose from pregnant and lactating bovines//J." ifairy Sci.- 1990.- 73.- Suppl H.1- P.f99.

3't. tlarinchenlco G.V. , I.lc Нашага Я.Р., Bsckar-Khalel В.,Parmley K. Growth hormone Altera Metabolic Effects and Proteolysis of Insulin in Adipose Tissue During lactation //Proc. Soc. Exp. Biol Ива.- 1992.- V.200.- N.1.- F.57-66.

35. Хропычева Р.П., Маринченко Г.В., Федооимов B.A. Гидролиз пролактина сершовой протеиназой митохондрий секреторных клеток молочной келозц//Биохимия.- 1992,- Т.57,- Ji 6,-С.345-955.