Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетический механизм реакции синтеза АТР, катализируемой F1-F0-АТРазой субмитохондриальных частиц

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Галкин, Михаил Александрович, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

па правах: рукописи "УДК 577.152.6

ГАЛКИН Михаил Александрович

КИНЕТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ СИНТЕЗА АТР, КАТАЛИЗИРУЕМОЙ F^-АТРазой СУБМИТОХОНДРИАЛЬНЫХ

ЧАСТИЦ

03.00.04. -Биологическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук профессор А. Д. Виноградов

Москва - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Оф.

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................3

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ...................................................................5

лголп mrmnA'nmT.t с V^UOV^r JlJTXi з rJoi..................................................................................О

ГЛАВА 1. ПРЕПАРАТЫ АТРаз FjF0 ТИПА..................................................6

ГЛАВА 2. СТРУКТУРА Н+- АТР - СИНТЕТАЗЫ..........................................9

2.1. Структура фактора Fj....................................................................................9

2.2. Структура фактора F0..................................................................................13

ГЛАВА 3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АТРАЗЫ СО

СВОИМИ ЕСТЕСТВЕННЫМИ ЛИГАНДАМИ...........................................18

3.1. Связывание нуклеотидов с факторам Fj..................................................18

3.2. Функции центров прочного связывания нуклеотидов...........................21

3.3. Функционально-важные аминокислотные остатки, входящие в состав нуклеощцсвязывающих центров.................................................................................22

3.4. Связывание фосфата с фактором Fj.........................................................25

3.5. Взаимодействие FjFq-АТРэзы с ионами металлов.................................25

ГЛАВА 4. РЕАКЦИИ, КАТАЛИЗИРУЕМЫЕ F^-АТРазой.....................27

4.1. Реакция синтеза АТР...................................................................................27

4.2. Реакция гидролиза АТР...............................................................................33

ГЛАВА 5. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМЕ

ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ Н+-АТР- СИНТЕТАЗЫ.

5.1. Гипотезы сопряжения............................... ....................................................36

5.2. Структурно-функциональные основы сопряжения............. ....................44

ГЛАВА б. ПРОБЛЕМА ОБРАТИМОСТИ АТРАЗНОЙ РЕАКЦИИ..........48

6.1. Эффекторы FjFq-АТРэзы...........................................................................56

Grp.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................................................59

ГЛАВА 1. ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ..................... ................................. ......59

ГЛАВА 2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ................................................................62

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...................................................................67

ГЛАВА I. КИНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РЕАКЦИИ СИНТЕЗА АТР..................67

ГЛАВА П. "СКРЫТАЯ" Д£н+ -ЗАВИСИМАЯ АКТИВАЦИЯ (Mg2+)ADP-

БЛОКИРОВАННОЙ АТРазы......................................................................................84

ГЛАВА Ш. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА "СКРЫТОЙ" Дцн+ -ЗАВИСИМОЙ

АКТИВАЦИИ (Мй2^)АОР-БЛОКИРОВАННОЙ АТРазы.....................................87

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.......................................................................93

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................102

ВВЕДЕНИЕ

Синтез ATP в митохондриях осуществляется сложным протеолигоэдньш комплексом - FjFq-АТРнзой. Для протекания реакции синтеза АТР необходим трансмембранный градиент протонов (Дщ+) . В ходе A[Ijj+- зависимого синтеза АТР осуществляется сопряжение векторного переноса протонов и скалярной реакции образования фосфоэфирной связи. Механизм этого сопряжения не установлен, несмотря на большое количество экспериментальных данных. Большинство авторов, изучая гидролиз или синтез АТР, явно или неявно отождествляют механизмы прямой и обратной реакции. Однако целый ряд экспериментальных данных, касающихся взаимодействия АТРазы с нуклеотидами и другими естественными лигаддами, указывает на то, что механизмы синтеза и гидролиза АТР могут различаться. Прежде всего это вытекает из существования односторонних ингибиторов АТРазы (тормозящих только либо АТРазную, либо АТР синтетазную активность). Одним из таких ингибиторов является ADP. Преинкубация АТРазы с ADP в низкой концентрации в присутствии ионов магния приводит к гистерезисному поведению фермента в АГРазной реакции. При этом блокируется гидролиз АТР, однако скорость синтеза АТР не меняется. Подробное изучение параметров (М$2+)АОР-зависимого торможения АГРазной активности привело к возникновению гипотезы о различии путей синтеза и гидролиза АТР, катализируемых митохоцдриальной АТРазой. Согласно этой гипотезе, фермент может находиться в двух функционально различных состояниях: "синтетазном" и "щдролазном", а переход из одной формы в другую контролируется нуклеотидами - ADP и АТР. В связи с этим становится очевидным, что нельзя исходя из данных о гидролизе АТР судить о механизме синтстазной реакции. Следовательно, необходим обстоятельный кинетический анализ реакции синтеза

АТР} как таковой. Недавно в нашей лаборатории проведен кинетический анализ решщии ГИДролиза AT?, катализируемой препаратом суомигохондриальиьис частц (AS-СМЧ). Поэтому целесообразно провести исследование кинетического механизма АТР синтстазной реакции на этом же типе препарата фермента, что и было осуществлено в данной работе.

Содержание данной работы состоит из : 1) обзора литературных данных; 2) экспериментальной часта, включающей методы и результаты наших исследований; 3) обсуждения полученных данных; 4) выводов, следующих из нашей рабош.

В обзоре литературы будет описана структура Н^-АТР-синтазы, а также приведены данные, касающиеся: а) взаимодействия АТРазы с субстратами и продуктами реакции; б) параметров реакций синтеза и гидролиза АТР; в) участия ионов металлов в катализе и регулировании активности АТРазы; г) современных представлений о механизме синтеза АТР; д) проблемы обратимости АТРазной реакции.

В экспериментальной части будут изложены данные, полученные нами в ходе кинетического анализа АТР синтетазной реакции. Нами определены параметры реакции синтеза АТР для препарата AS-СМЧ из сердца быка, сопряженных субстехиометрическими количествами олигомшщна. Нами установлено, что помимо субстратов - комплекса Mj^ADP и моноаниона неорганического фосфата - для протекания реакции синтеза необходим ион Сродство субстратов и Mg2+ к ферменту не зависит от величины Apjj-h

Также в ходе исследования установлено, что (Mg^^)ADP-блокированная АТРаза под действием ДДц+ переходит в форму фермента, остающуюся неактивной в реакции гидролиза, но способную мгновенно активироваться при снятии ДЦЦ + •

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

СМЧ - субмитохондриальныс частацы;

А-СМЧ, AS-СМЧ - различные типы субмигохондриальных частиц; ОЧА - ашихзмицин-чувстщггслъная АТРаза;

Fj, MFj, CFj, EFj, TFj - АТРазы (сопрягающие факторы) митохондрий, хлорогшастов, Е. соН, термофильной бактерии PS3.

Fq - мембранный компонент - АТР-синтазы;

Ajljj+ - трансмембранная разность электрохимических потенциалов протонов;

АТР - аденозинтрифосфорная кислота;

ADP - аденозиндифосфорная кислота;

NTP ( ГГР, GTP, СТР, UTP) - нуклсозидтрифосфаты;

Pj - неорганический фосфат;

NADH, NAD+ - шжешшамидадеыиндинуклеотид ( восстановленная и окисленная формы);

ФЕП - фосфознолпируват; ПК - пируваткиназа; ЛДГ - лактатдегидрогеназа; ЭДТА - этилендиаминтстраацетат;

HEPES - К-2-гидроксиэтилпиперазин-К-этансульфоновая кислота; Трис - трис- (гидроксимстил)аминомстан;

FCCP - карбоншшианид-3-фторфенилгидразон (разобщитель);

Nbf-Q - 4-хлор-7-шпробенэофуразан;

DCCD-NjN'-дихщклогсксилкарбодиимид;

FSBA - 5-р-флуоросульфонилбснзоил-адснозин;

FSBI - 5-р-флуоросульфонилбензоил-инозин.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ПРЕПАРАТЫ АТРаз FjFq ТИПА

Ферменты, относящиеся к классу протон-транслоцирующих FjF0-ATPa3, катализируют реакцию образования фосфоангидридной связи между j} и у-фосфатными группами АТР, сопряженную с трансмембранным переносом протонов. Отличительной особенностью АТРаз FjFq - типа является то, что синтез/гидролиз АТР катализируется ими без образования ковалентного фосфорного интермедиата в ходе катаютшческого цикла. FjF0-ATPa3bi обнаружены в самых различных источниках: митохондриях (MFjF0), хлоропластах (CFjFq), фотосиитезирующих и дышащих бактериях. FjFq-ATP-синтетазы из разных источников сходны по своему строению и имеют однотипный механизм синтеза/гидролиза АТР.

Процесс окислительного фосфорилирования у высших эукариот и грибов связан с функционированием нескольких полиферментных систем, локализованных во внутренней мембране митохондрий. К ним относятся:

1) ферменты дыхательной цепи, обеспечивающие окисление субстратов дыхания, последующий перенос электронов к молекулярному кислороду и образование трансмембранного градиента электрохимического потенциала протонов (Дрд+);

2) собственно Н^-АТР-синтаза, катализирующая AjJjj+- зависимый синтез АТР из ADP и неорганического фосфата;

3) трансяоказы, осуществляющие транспорт нуклеотидов, фосфата и субстратов дыхания в митохондрии.

В течение многих лет известно, что FjFq-АТРэзы состоят из двух частей: фактора Fj, отвечающего за катализ реакций синтеза и щдрешиза АТР, и фактора Fq, практически полностью погруженного в мембрану и обеспечивающего векторную транслокацию протонов по градиенту Еще

Э. Ракером было отмечено, что Fj имеет шаровидную форму с диаметрам 9а ангстрем [116]. Фактор Fj связывается с фактором FQ за счсг так называемого "стебелька", длина которого составляет примерно 45 ангстрем. Фактор Fj является водорастворимым белком и способен с высокой скоростью гидролизоватъ АТР. Его можно отделить от мембраны различными воздействиями: обработкой мочевиной, органическими растворителями ( например, хлороформом [28], бромидом натрия [213]. и кардиолипином, хелатирующими агентами [77] , хаотропными солями ( например, NaSCN ) [77], а также ультразвуком [166].

В настоящее время существует несколько типов препаратов АТРазы, в той или иной степени удобных для проведения структурных или функциональных исследований.

1) Субмнтйхондрнальные частицы (СМЧ). Их получают при обработке суспензий митохондрий ультразвуком в анаэробных условиях. СМЧ представляют собой замкнутые везикулы, образованные внутренней митохондриальной мембраной, вывернутой "наизнанку". При ультразвуковой обработке внешняя мембрана митохондрий разрушается. СМЧ содержат нативную FjF0-ATPa3y и компоненты дыхательной цепи. Известно несколько типов препаратов СМЧ [32]. ЕТРН (phosphorylation electron transport particles) получают, озвучивая суспензии митохондрий в среде, содержащей ATP, MgC^? МпС^» сукцинат ( "магний-марганцевые" ЕТРН). В присутствии MgClj и АТР в среде озвучивания получают ETPH-(Mg^+) частицы. При наличии ЭДТА в среде озвучивания получают ETPH-(EDTA) частицы, характеризующиеся гораздо более низким отношением Р:0, чем препараты, получаемые в присутствии ионов металлов и АТР [32].

Препараты СМЧ с высокой скоростью способны гидролизоватъ АТР. Особенностью магний-марганцевых СМЧ является то, что этот препарат способен катализировать Ajl- зависимые реакции (окислительное фосфорилирование, обратный перенос электронов и другие) без искусственного

сопряжения. В то же время препарат AS-СМЧ, получаемый в нашей лаборатории, требует специальной обработки для исследования энергозависимых процессов ( см. раздел "Методы исследования").

2) Олнгомяцсш-чувспиггельная АТРаза (ОЧА) является минимальной структурной единицей, обладающей свойствами мембранного фермента. Впервые препарат ОЧА был получен в лаборатории Ракера в результате экстракции СМЧ халатом, последующей очистки фракционированием сульфатом аммония и центрифугированием в градиенте сахарозы [198]. Аналогичный препарат был получен в лаборатории Хатефи [81]. После реконструкции с фосфолипидами очищенный фермент катализировал Р- АТР обмен, АТР-зависимую протонную транслокацию и окислительное фосфорилирование [198].

3) Растворимый фактор Fj. Он представляет собой высокоактивную АТРазу (активность до 200 мкмоль/мин/мг) [231] . Фактор Fj незаменим при проведении структурных исследовании (в частности , для анализа связывания нуклеотидов и других естественных лигандов АТРазы). В отличие от СМЧ и ситагомицин-чувствительной АТРазы, АТРазная активность Fj не блокируется низкими концентрациями DCCD и олигомицина. Действие упомянутых ингибиторов на мембраносвязанную АТРазу связано с тем, что они блокируют протонный транспорт через FQ ]. Препараты, аналогичные комплексу V и ОЧА, могут быть легко встроены в протеалипосомы. Ракером и Сгокениусрм была осуществлена реконструкция бакгериородопсина (свето-активируемой протонной помпы) и F|FQ-АТРазы из митохондрий сердца быка в фосфолипидные везикулы (из соевых бобов) ¿179], Реконструированные везикулы при освещении поглощали внутрь протоны, а в темноте выпускали их. Встроенная в них АТРаза была способна катализировать синтез АТР.

TiiTiA в /"iTpTJTJ-lr ГГ-» ГП 1 ТтТ лгг<тк |ТТ1||'|1|1ГГ1 Г1ТТ

lJlABA 1. tlPyKiyrA jti - Л1Г - шшглллы.

2.1. Структура фактора Fj

Растворимый фактор Fj был впервые выделен из митохондрий сердца быка Пульманом и соавг. в I960 г. £176]* Его молекулярная масса составляет по разным данным от 347 до 371 кДа. Митохондриальный фактор Fj как из тканей высших животных , так и других зукариот халодолабилен: при 0 - 4°С медленно инактивирустся его АТРазная активность, причем инактивация коррелирует с диссоциацией фактора Fj на отдельные субъединицы ¿167}. Кратковременное { в течение нескольких минут ) нагревание при 50 - 60 С в присутствии АТР суспензии инактивированного на холоду Fj (или CFj) приводит к полной или частичной реактивации его АТРазной активности ( при этом для активации хлоропластного Fj требуется еще глицерин) ¿136, 167]. Холодовая инактивация ускоряется при наличии в растворе различных анионов и предотвращается в присутствии метанола, гшщерала, ADP и др. Мембраносвязанная АТРаза не чувствительна к холоду. Митохондриальный Fj состоит из 6 типов субъединиц: а, р, у, 5, б и IFj. В настоящее время известны их полные аминокислотные последовательности [220].

Таблица 1. Молекулярные seca субьединнц митссюндряальнсго Fj, определенные с помощью электрофореза (В) или на основании первичной аминокислотной последовательности

субьединивд А В

а 55164 53000

Р 51595 50000

г 30141 33000

8 15065 17000

е 5652 7500

Таблица 2. Субьединичный состав F| из различных источников.

митохондрии Е. coli хлоропласта

а а а

е ß ß

Y г г

OSCP 5 S

S е е

е - j

ингибитор - ?

В таблице 2 представлены данные по гомологии субъединиц фактора Fj из различных источников: митохондрий сердца быка ( колонка 1 ) ; Е. coli; хлоропластов . О гомологии судили на основании данных по секвенированию. Вдцно, что 5 субъединица митохондрий соответствует s субъединице бактериального и хлоропласшого Fj. Хота OSCP присутствует только в составе митохондриального Fj, однако гомологичной ему оказывается 5 субъединица из хлоропластов и бактерий.

аир субъединицы содержат нуклеощцсвязывающие центры; видимо, поэтому они высококонсервативны в эволюции. Минорные субъединицы мало консервативны , но содержат ряд инвариантных последовательностей , которые, по-видимому, ответственны за их взаимодействие с аир субъединищми. Помимо упомянутых нами субъединиц, в состав MFj входит белок-ингибитор ( IFj) i.175]; он связывается с р субъединицей фактора Fj [124]. Он имеет молекулярную массу 10500 Да (из данных по седиментации в сахарозном градиенте ). При наличии белка-ингибитора Fj - АТРаза неактивна. IFj может быть легко отделен от Fj при повышении pH среды и ионной силы. Белок -ингибитор защищает АТРазу от холодовой инактивации; Fj-АТРаза, блокированная белковым ингибитором, может быть полностью активирована за 2 минута при 65°С.

Структура и стехиометрия субъединиц Fj изучается давно, и с помощью разнообразных методов установлена гексагональная структура F3 и стехиометрия азРзуЗб. Это было показано, в частности, с помощью электронной микроскопии Бокемой и соанг. ¿35]. Было найдено, что шесть белковых масс, представляющих собой, по-видимому, крупные субъединицы (три а и три (3) расположены в гексагональном порядке. На ряде микрофотографий в центральной части Fj обнаруживали седьмую белковую массу, которая представляет собой комплекс минорных субъединиц - ySe. Гексагональная структура показана и для хлоропластного Fj [36]; на основании данных электронной микроскопии и биохимических исследований можно предположить, что CFj имеет форму выровненной тригональной антипризмы ( 11,5 х 11,5 х 8,5 нм ), причем аир субъединицы располагаются в 2 слоя ( в одном - а, в другом - р ) 194], Анализ содержания тиоловых групп и остатков триптофана и тирозина в субъединииах фактора TFj также свидетельствует в пользу гексагональной модели £237], Б лаборатории Капалди был проведен анализ трехмерной структуры и взаимного расположения субъединиц фактора EFj с помощью криозлектронной микроскопии в тонком слое аморфного льда [91]. Важной особенностью этого метода является то, что замораживание образца происходит настолько быстро, что он сохраняет свою нативную структуру. Была подтверждена гексагональная структура F}. Было установлено, что аир субъединицы располагаются по периферии Fj в одном слое и вытянуты в направлении, перпендикулярном относительно мембраны. В центральной части молекулы обнаружена каналоподобная полость (диаметром 30-40 А), в которой можно видеть седьмую белковую массу, прилегающую к одной из а/р пар на одном из концов и