Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Са2+ - зависимая регуляция Na+, K+-АТР-азы эритроцитов крысы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Са2+ - зависимая регуляция Na+, K+-АТР-азы эритроцитов крысы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ

На правах, рукописи

ПАНКШКИНА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

УДК 577.352.4

Са2+-ЗАШСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ На+,К+-АТР-азы ЭРИТРОЦИТОВ КРЫСЫ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических- наук

Пущино-1995

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, ст.н.с.

ПЕТРУНЯКА В.В.

доктор биологических наук, Новоселов В.И., кандидат биологических наук Щипакина Т.Г.

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского.

Защита диссертации состоится 1995" г. д.

заседании специализированного совета Д 200.22.01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (142292 Московская обл., г. Пущин?, ИТЭБ РАН).

•

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат разослан "2.0 " ^ Н '»чаА "1995~г.

Ученый секретарь Специализированного совета, /[А кандидат биологических наук 7

П.А.Нелшович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность теми.

Одна из существенных функций биологических мембран 5еспечение избирательной проницаемости для веществ, ранспортируемых в процессе жизнедеятельности клетки в среду и из реды в клетку. Мембранные белки, осуществляющие транспорт Na+, Са2+ и If4", сопряженный с гидролизом АТР, участвуют в еравновесном распределении ионов, внутри клетки, . изменение оторого приводит к запуску целого ряда биохимических событий, акопившиеся данные свидетельствуют о существовании быстрых, и ножественных механизмов регуляции АТР-зависимого транспорта Na+ К+ с участием вторичных внутриклеточных мессендаеров.

Са2+-АТРаза плазматических мембран играет ведущую роль в оддержании низкой концентрации Са2+ (10-7М) в цитозоле. Изучение егуляции этого фермента приобрело особенно большое ■ значение в" вязи с открытием регуляторной функции ионов Са2+ в клетках. :е смотря на многочисленные попытки изучения влияния ионов Са2+ на ©гуляцюо Na+,K+-Hacoca плазматических мембран, вопрос до сих пор стается невыясненным. Результаты исследований, свидетельствующих >б активации Na+ ,К+-АТРазы ионами Са2+ в концентрации ниже I цМ, ;овольно неоднозначны из-за неопределенности условий проведения «спериментов. Противоречивы данные не только об активирущем действии Са2+, но также о регуляции активности Na+,K+-ATPa3H вдогенными протеинкиназами; окончательно не выяснена природа и !еханизм действия Са2+-зависимых эндогенных регуляторов.

Б то же время, результаты многочисленных исследований 'ормональной регуляции ионтранспортирующих АТР-аз на интактных слетках плохо согласуются с данными, полученными на выделенных гемОранах. Эти несоответствия во многом объясняются ^контролируемым нарушением нативного комплекса эндогенных эегуляторов при выделении мембран.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было выяснение , участия эндогенных ;а2+-зависимых регуляторов и протеинкиназ в функционировании 1а+,К+-АТРазы плазматической мембраны эритроцитов крысы.

Для этого в работе были поставлены следующие конкретнь задачи:

1. Отработать методику получения перфорированных мембрг эритроцитов, исключающую длительную процедуру получени вывернутых везикул с неконтролируемой отмывкой регуляторов.

2. Оценить влияние ингибитора На+,К+-АТРазы уабаина н активность Са2+-АТРазы в присутствии эндогенных регуляторов.

3. Исследовать зависимость активности На+,К+-АТРазы о концентрации Са в присутствии и отсутствии эндогенны регуляторов.

4. Изучить влияние Са2+-зависимого эндогенного ингибитор Иа+,К+-АТРазы на чувствительность фермента к уабаину, К+ фуросемиду.

5. Определить возможное наличие в мембранах эритроцито Ка+,М^+-АТРазы и уабаин-нечувствительной фуросемид ингибируемой Ыа+-АТРазы.

6. Исследовать действие сАМР на Са2+-зависимую регуляцк йа+,К+-АТР83ы.

Научная новизна. .

Показано, что при измерении активности Иа+,К+-АТРазы ка] уабаин-чувствительной компоненты общей АТР-азной активности ] присутствии Са2+ и Са2+-зависимых регуляторов вносит« существенная ошибка, обусловленная Са2+-зависимым действие» уабаина на Са2+-АТРазу. Неспецифическое влияние уабаина на Са2+-АТРазу свидетельствует о невозможности использования уабаина дун идентификации активности Ка+,К+-АТРазы на фоне Са2+-АТРазы. Показаны Оа2+-зависимые активация и ингибирование На+,К+-АТРазы, зависимость Са2+ регуляции активности фермента от ионов подавление сАМР Са2+-зависимой активации Ка+,К+-АТРазы.

Выявлено, что при микромолярных концентрациях Са2+ частично теряется чувствительность Ка+,К+-АТРазы к уабаину и резко падаеч ее сродство к К+.

Практическая ценность.

Результаты настоящей работы расширяют представления о механизмах регуляции функционирования ионтранспортирунцих АТР-аг плазматической мембраны эритроцитов крысы. Они могут быть

юпользованы для выяснения этиологии целого ряда заболеваний, связанных с нарушением Са2+- и Na+/K+-oöMeHa.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы из НО наименований. Диссертация изложена на 91 странице машинописного текста, включая 10 рисунков и 4 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для приготовления сред в работе использовали KCl, лимонную кислоту, KHgPO^ и СаС03 марки ос.ч., MgClg, HCl, H2S04 - х.ч., «олибдат натрия и малахитовый зеленый - ч.д.а., трис, HEPES, голбутамид, кальмидазолиум (R24571) - "Serva" (ФРГ), сапонин -"Chemapol" (Чехословакия), полимиксин Б - "Sigpia" (США), цинатриевую соль ATP - "Sigma" (США) и "Reanal" (Венгрия), уабаин, EGTA "Fluka" (ФРГ). Растворы готовили на Зидистиллированной воде.

Основным объектом исследования были эритроциты, выделенные из свежей гепаринизированной крови самцов белых беспородных крыс и крыс линии fflstar весом 180-200 г.

Эритроциты получали из крови 3-кратной промывкой переосавдением на центрифуге при 1500g по 10 мин. Промывочная среда содержала 20 мМ трис-НС1-буфер, pH 7,4 (при 20°С), 130 шМ KCl, 0,37 mM MgClg. Из плотного осадка получали 10%-ную суспензию в среде, содержащей 130 mM KCl (или KCl + NaCl в зависимости от условий эксперимента), 20 mM HEPES-трис, pH 7,4, 10 гоМ лимонную кислоту, 3 или 8,3 mM MgCl2 (для получения 50 или 370 |Ш свободного Mg2"1").

Сапонин в конечной концентрации 0,04% добавляли в суспензию эритроцитов. Мембраны эритроцитов, перфорированных сапонином и отмытых от эндогенных Са2+-зависимых регуляторов, получали осаждением на центрифуге в течение 30 мин при 16000g (4°0) в среде с 2 mM EGTA. Осадок суспендировали в среде без EGTA, переосаждали и разводили этой средой до объема, равного объему исходной 10%-ной суспензии эритроцитов.

Для измерения АТР-азной активности 100 р.1 полученной суспензии эритроцитов или мембран добавляли к равному объему среда инкубации, содержащей 130 mM КС1, или 130 mM NaCl, или 130 тМ (КС1+ NaCl) в заданном соотношении, 3 или 8,3 mM MgCl^, 20 mM HEPES-трис (рН 7,4 при 37°С) и 10 шМ цитрат, 2 mM АТР (натриевую или калиевую соли), 2 mM EGTA и СаС12 в концентрации, необходимой для получения [Са2+] от 0,1 до 60 цМ, и выдерживали при 37°С 10 мин в термостате с вибратором. Реакцию останавливали добавлением равного объема холодного 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. После осаждения белка в супернатанте определяли неорганический фосфат по методу (Muszbec L., SzabaT., Fesus Ь., 1977). Активность Ш+,К+-АТРазы рассчитывали как разность мевду суммарной АТР-азной активностью Ша+,К+-АТРазы, Са2+-АТРазы и М^+-АТРазы) и активностью уабаин-нечувствительных и/или натрий-независимых АТР-аз (Са2+-АТРазы и Мй2+-АТРазы). При использовании уабаина (1тМ) учитывали выявленное нами Са2+-зависимое действие его на Са2+~АТРазу. Са2+-АТРазную активность измеряли в безнатриевой среде и рассчитывали ее как разность мевду суммарной активностью Са2+-АТРазы и М^+-АТРазы в средах, содержащих 0,1 - 60 цМ Са2+, и активностью М^г+-АТРазы в среде без Са2+ (с 1 mM EGTA).

Концентрации ионов Са2+ и Mg2"1" в инкубационных средах рассчитывали с использованием констант стабильности комплексов Са2+, big2* и Н4 с EGTA, цитратом и АТР цри 37°С и ионной силе 0,16 (Durham А.С.Н., 1984). Среды с заданными концентрациями Са2+ (при постоянных заданных концентрациях Mg2"1") получали смешиванием в необходимых пропорциях двух растворов: с максимальной концентрацией ионов Са2+ (60 (Ш) и без кальция после доведения рН при 37°С в каждом из них. Это обеспечивало постоянство рН и, таким образом, постоянство констант связывания Са2+ и Mg2"^ с хелаторами при получении малых объемов сред с заданными

концентрациями а также способствовало уменьшению ошибок

измерений объемов сред и исходных (концентрированных) растворов СаС12 и ЕСТА.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка метода измерения активности ионтранспортных АТРаз в эритроцитах крысы в присутствии эндогенных регуляторов.

Плазматическая мембрана эритроцитов - это уникальный природный объект исследования ионтранспортных АТРаз. Отсутствие внутриклеточных кальциевых пулов и Са2+/Иа+-обменника в самой мембране позволяют исследовать Са2+-зависимую регуляцию Ш+,К+-АТРаз на основе практически модельной, но, тем не менее, нативной системы.

К настоящему времени сведения о регуляции Ма+,К+-АТРазы ограничиваются хорошо установленной ролью Са^+-зависимого ингибитора кальнэктина и сообщениями о действии эндогенных протеинкиназ на активность фермента Эти сведения не могут отражать истинных свойств АТРазы в клетках, так как получены в условиях, искажающих структуру и состав мембран. Исследования регуляции фермента проводятся либо в детергентных растворах, либо на изолированных везикулах мембран, подвергнутых многочасовым воздействиям сред с низкой ионной силой, с хелаторами двухвалентных катионов и т.д. Такие воздействия, как известно, не только изменяют белковый состав мембраны за счет отмывания белков и белковых регуляторов, но изменяют локализацию и распределение липидов в мембране, также участвующих в обеспечении нормального функционирования АТРаз. Разнообразие условий обработки мембран приводит к тому, что часто даже в одной серии экспериментов абсолютные значения кинетических параметров АТРазы или АТР-зависимого транспорта Са2+ могут варьировать более чем в 10 раз. Все это позволяет считать, что ограниченность сведений о регуляции Са"+- и Ыа+,К+-АТРаз обусловлена недостатками методов исследования.

Учитывая вышесказанное, для оценки роли эндогенных регуляторов в активации и ингибировании Ка+,К+-АТРазы мембран эритроцитов мы исключили длительную процедуру получения вывернутых везикул с неконтролируемой отмывкой регуляторов, использовав сапонин,

который позволяет обеспечить доступ к внутренней поверхности мембран. Способность сапонина при взаимодействии с холестерином мембраны образовывать в ней поры, проницаемые для белков, позволила, не затрагивая липидное окружение АТРаз, не только контролировать внутренние концентрации ионов и АТР, но и обеспечить отмывку или добавление эндогенных регуляторов, устранить ингибироваше АТРаз возникающими при их работе ионными градиентами.

Активность Ыа+,К+-АТРазы в бескальциевой среде.

В перфорированных сапонином эритроцитах в бескальциевой среде активность Иа+,К+-АТРазы не проявляется в области 0-3 тМ , максимальна при 30-125 тМ Ыа+ и не зависит от [К1"] при Рис 1. Зависилостъ ативнаст Яог ,К?-АТРази ап соотношения ионов N0* и К* при [СсР*] = О.

соблюдении суммарной заданной концентрации ионов 130 тМ. Полумаксимальная активация ионами достигалась при

концентрации 15 тМ (Рис.1). Полученная зависимость активности уабаин-чувствительной АТР-азы от концентрации Ыа+ и К1" при О |Ш Са2+ для перфорированных сапонином эритроцитов идентична данным для Ш+,К+-АТР-азы в отмытых нативных и реконструированных мембранах (Ргезз1еу Т.А., 1988) эритроцитов.

Влияние уабаина на активность Са2+-АТРазы.

Уабаин считается специфическим ингибитором Ыа+,К+-АТРазы. Со времен открытия На+,К+-АТРазы уабаин используют для идентификации активности этого фермента как маркерного белка плазматических мембран и при исследовании свойств АТР-азы.

упто?^ /-(лар-мин

300' 200100-0J

Ма/К.шМ

т-г-<$—I-

5/П5 «/^5 "/105 425Д

о.

В связи с необходимостью идентификации активности а+,К+-АТРазы на фоне высокой активности Са2+-АТРазы наш было зоверено действие уабаина на Са"+-АТРазу в присутствии вдогенных Са2+-зависимых регуляторов и обнаружено, что 0.5-1.0 í уабаин в безнатриевой среде при концентрации Са~+ до 0.7 цМ сгивирует Са2+-АТРазу (максимально в 2 раза при 0.2 (хМ Са'+), а эи концентрации Са2+ от 1.0 до 60 цМ на 20-30% ингибирует 12+-АТРазу (Рис.2, кривая 2). При этом ингибируемая доля

активности Сай+-АТРазы по абсолютной величине сравнима с активностью На+,К+-АТРазы в среде

9 .

без Са~ . Это осложняло использование уабаина при измерении ктивности Ш+,К+-АТРазы. Отмывка мембран средой с ЕБТА устраняла действие уабаина на Са^-АТРазу (Рис.2, кривые 3,4) во всем диапазоне концентраций Са. . На основании этих результатов можно сделать вывод, что Рис.2. Влияние уабаина на активность Са"+-АТРазы.

1 - эритроциш-котролъ, 2 - эритроциты + 1 тМ уабаим, 3 - лелбрапы-контролъ, 4 - лелОраны + 1 тМ уабаш

баин не влияет непосредственно на Са -АТРазу, а действие его осредованно каким-то Са2+-зависимым регулятором. Все это зволяет считать, что использованный нами подход для изучения ияния Са2+ на Ка+,К+-АТР-азу без применения уабаина дает змокность получать наиболее достоверные результаты. Учитывая сутствие активности Яа+,К+-АТРазы при Ша+] < 3 тМ, ее ределяли как разность между активностью АТР-аз в среде,

+ х

держащей и На и К (по 65 шМ КС1 и N301), и активностью в еде, содержащей 130 тМ КС1 и не более 3 гаМ

Действие фуросемвда на активность Са2+- и Ка+,К+-АТРаз.

ФуроселшЭ и его производные широко используются в качестЕ ингибиторов системы облегченной диффузии (симпорта) одновалентны ионов и хлорных каналов. Мы исследовали влияние фуроге»"чда н Са2+- и Иа+,К+-АТРазу в перфорированных эритроцитах крысы условиях, сохраняющих эндогенные Са2+-зависимые регулятор АТР-аз. Было установлено, что действие фуросемида на активност Са2+-АТРазы сходно с действием уабаина в среде без натрия ( отсутствие активности Иа+,К+-АТРазы) и этот эффект зависит о Са2+. Ыа+,К+-АТРаза в бескальциевой среде активировалас фуросемидом при концентрациях Иа+ ниже насыщающих (30 тЫ максимальная активация при концентрации Ыа+ ниже 5 шМ). Боле

того, фуросемид вызыва появление уабаинзависимо АТР-азной активности даж при концентрации Ка+ о 0.5 до 3 тМ, когда актив ность Ма+,К+-АТРазы прак тически не выявлялас (Рис.3, кривые 2,3). При шМ Ыа+ повышение концен трации фуросемида от 50 ц до 1 шМ активировал На+,К+-АТРазу до максиму ма, достигаемого без фу росемида при Ша+] = 3 тМ. Показанное действи фуросемида на Иа+,К+- АТР

Рис.3. Зависимость активности ,К+~АТРази эритроцитов от действия 1 тМ фуросежида при [Са2+] = 0. 1 - контроль, 2-6 присутствии 100 \Ш фуросежида, 3-в присутствии 1 тМ фуросежида

азу может свидетельствовать о повышении сродства фермента к На

Влияние Са2+ и на активность Ыа+,К+-АТРазы в эритроцитах и их тенях. ■

тто й эр-мии

У« 5 '0/«0 Я/Ш »/«О 25/(05 50/100

Для того, чтобы подтвердить существование в мембране эритроцитов АТР-зависишго Na+/Mg^+ транспорта (Luedi Н., íchatzmam H.J., 1987; Frenkel E.J. et al., 1989; Gunter T. et il., 1990), мы проверили влияние ионов Mg2"1" на активность гредполагаемой Na+-ATPa3u. Активность фермента исследовали в [рисутствии 10 |Л Са'"+ и заданных концентраций свободного магния ■ от 50 до 600 р.М и рассчитывали как разность между АТР-азной ¡ктивностью в среде с 130 шМ NaCl (или 65 гпМ NaOl + 65 Ш КС1) и (ктивностьго в среде с 130 mM KG1. Было показано, что [редполагаемая Иа+~АТРаза является К^-зависимой, так как не фоявляет активности в среде только с NaCl; не зависит от концентрации свободного ; на 50% ингибируется 1 mM зуросемэдом. Такие результаты указывают на то, что в эритроцитах, го-видимому, не существует Na+,Mg^+-ATPa3H, и что сами ионы Mg2"1" ta активность Na+,K+-ATPa3H не влияют.

Однако действие Са2+ на активность Ш+,К+-АТРазы существенно зависело от наличия в среде конов Mg2"!" При определении зависимости активности Na+,K+- АТР-азы от концентраций Са в присутствии 50 цМ свободного Mg2"*" было выявлено только ингибирование

Na+,K+-ATPa3H при концентрации Са2+ 0.3-0.4 цМ с полумаксимальным ингибиро-

^____ингибированием при 0.7 цМ

г 'ъ ' ^ ' а Т~' 5 и полным - выше 1 цМ Са2+

(Рис.4, кривая 1). При Рис.4. Зависилостъ активности Ка+ ,К*-АТРазы от концентрации Caz+ в перфорированных сапонином эритроцитах (1,2) и 3 лелбранах, стжытых средой с EGTA (3). 1 - 50 \iM 2,3 - 370.\Ш

[Mg2"*"] = 370 jjJá, что примерно соответствует его внутриклеточной сонцентрации, повышение концентрации Са2+ в интервале 0.3-0.7 |iM зызывало активацию Ыа+,К+-АТРазы (максимальную при 0.5-0.7 цМ), а

знше 2 [.Ш - небольшое подавление (относительно активности в среде

Оез Са2+) (Рис.4, кривая 2). Необходимо отметить, что степеш активации Иа+,К+-АТРазы эритроцитов, полученных в разные дни j разных животных одного пола и возраста, варьировала в широкиз пределах - от 27 до 337%, в то время как ингибирование былс относительно постоянным (Рис.5). Отмывка мембран эритроцито! средой, содержащей 2 шМ EGTA, полностью снимала действие Са2+ на Na+,K+-ATPa3y при 370 цМ

Выявленное в наших экспериментах ингибируюцее действие Са2+ на Na+,K+-АТРазу при низкой концентрации Mg2* (50 цМ) оказалось гораздо более выраженным и наблюдалось при более низких концентрациях Са , чем ранее было показано для интакт-ных эритроцитов в присутствии ионофора А23187 (Вгош A.M., Lew V.L., 1983а) и для плазматичес-Рис.5 Прилеры активации Na*,К+-АТРазы ионали Са?*, полученные для эритроцитов разных крис в разные дни. 1 = 370 [jJf.

•ких мембран некоторых типов клеток, полученных при неконтролируемых, но, по-видимому, достаточно высоких концентрациях Са2+ (Skou J.S., 1957; Ylngst D.R., 1988). Почти такая же высокая чувствительность к ингибируицему действию Са2+ (полумаксимальное ингибирование при 1 |Ш Са2+) была показана для' Na+,K+-ATPa3H мембран эритроцитов при добавлении к ним очищенного белкового Са2+-зависимого ингибитора ксиънсшшна, выделенного из цитоплазмы эритроцитов (Ylngst D.R., 1988). Это свидетельствует о полной сохранности эндогенных Са2+-зависимых регуляторов в мембранах перфорированных сапонином эритроцитов и о высокой степени приближения к нативным условиям регуляции Na+,K+-ATPa3H в избранной наш экспериментальной модели.

Наблюдавшаяся активация Na+,К+-АТРазы ионами Са2+ в присутствии 370 цМ Jig2"1" качественно близка к той, которая наблюдалась ранее в мембранах синаптосом мозга крыс в отсутствие

Са2+-М^+-ЕСТА-буфера (Fowls D.A. et al.t 1983) и в замкнутых тенях эритроцитов (Fostnov Yu. V. et al., 1977; Орлов С. H., Шевченко А. С., 1978). В этих исследованиях не поддерживались

о |

точно заданные концентрации Са с внутренней стороны мембран из-за отсутствия кальциевого буфера (Powis D.A. et al., 1983) и неконтролируемого снижения концентрации свободного кальция внутри замкнутых теней эритроцитов, вследствие работы СаЛ+-насоса (Postnov Yu. V. et al., 1977; Орлов С. Н., Шевченко А. С., 1978). Однако область концентраций Са2+, максимально активирующих. Ыа+,К+-АТРазу (0.4-0.5 |хМ) совпала с полученными нами данными (Рис.4). Активация На+,К+-АТРазы наблюдалась также в эритроцитах под действием разбавленной сыворотки крови (Chipperiield A.R.,

1983), в гепатоцитах под действием вазопрессина, ангиотензина II и норадреналина (Wong Sh.M.E., Chase H.S., Jr., 1988; Berthon В. et al., 1983; Caplod Th. et al., 1985; Lynch C.J. et al., 1986; Lynch C.J. et al., 1987), в лимфоцитах - под действием лектинов-митогенов (Averdunk R., Laui P.К., 1975; Гуковская А.С.,

1984), агентов, повышающих концентрацию Са в цитозоле. Поскольку активация и ингибирование Na+,K+~ATPa3H ионами Са2+

полностью устранялись после отмывки мембран средой с EGTA, то можно считать, что в бескальциевой среде от мембран отмываются по крайней мере два регулятора Na+,K+-ATPa3U - известный ингибитор кальнактин (Yingst D.R., 1988) и неизвестный активатор. Существенные различия в действии активатора в эритроцитах, полученных от разных животных в разные дни, говорят о том, что его количество и/или активирующая способность модулируются дополнительными факторами. Отсутствие активации фермента при низкой концентрации Ms2* дает возможность предположить, что действие активатора может регулироваться системой фосфорилирования-дефосфорилирования белков, ферменты которой (протеинкиназы, протеинфосфатазы и нуклеотидциклазы) обычно активируются достаточно высокими концентрациями (Nestler Е. I., Greengard Р., 1984; Clari G, et al., 1987). Кроме того, возможно, что ионы Jig2* сами могут модулировать связывание активатора с мембраной или ферментом.

Учитывая относительно слабое действие ингибитора кальнактина при выраженном эффекте активатора в присутствии высокой концентрации (Рис.5), можно предполагать, что существуют конкурентные взаимодействия мезвду двумя Са2+-зависимыми регуляторами за места связывания с Иа+,К+-АТРазой. При этом

активатор имеет более высокое сродство к Са , а действие ингибитора в его присутствии (или в присутствии Mg2*) существенно подавляется.

Влияние Са2+-зависимого эндогенного ингибитора Na+,K+-ATPa3H на чувствительность фермента к уабаину, Na+, К+ и фуросемиду. Na+-ATPa3a.

Известный теперь ингибитор Иа+,К+-АТРазы - кальнактин - не был в свое время исследован в отношении его влияния на сродство АТР-азы к Na+, 1С4" и уабаину, что является необходимым при оценке его эффективности в условиях in vivo. В работах по исследованию действия этого ингибитора для идентификации активности Ыа+,К+-АТРазы использовали уабаин (Ylngst D. R., 1988), хотя не было изучено действие кальнактина на чувствительность фермента к уабаину и не учитывалось влияние уабаина на Са2+-АТРазу. Поэтому все это могло способствовать искажению истинных свойств кальнактина. С другой стороны, в наших экспериментах измерение активности' На+,К+-АТРазы как Ма+-зависимой компоненты общей АТР-азной активности могло быть артефактным, если бы в эритроцитах существовала так называемая Ыа+-АТРаза (Proverbio F. et al., 1982; Marín R. et al., 1985; Proverbio F. et al., 1991), обнаруженная в базолатеральных мембранах эпителиальных клеток нефронов крысы и морской свинки. Фуросемвд в концентрации 1-2 тМ был предложен для ее идентификации. Активность этого фермента наблюдалась только в присутствии микромолярных концентраций Са2+ (25-28 (iM), не подавлялась уабаином и полностью ингибировалась 1 шМ фуросемидом и этакриновой кислотой.

Поэтому мы исследовали влияние эндогенного Са2+-зависимого ингибитора на сродство йа+,К+-АТРазы к Na+, К+ и уабаину, а* также проверили возможность существования в эритроцитах На+-АТРазы.

При исследовании сродства Na+,K+-ATPa3H к ионам натрия и калия в присутствии 10 цМ Са2+ было обнаружено, что сродство фермента к К+ резко снижалось. В этих условиях величина полумаксимальной активации для К+ возрастала до . 42 шМ (Рис.6, кривая 2), в то время как в бескальциевой среде она составляла менее 1 mM (Pressley Т.А., 1988). Полумаксимальная активация ионами натрия в присутствии 10 рМ Са2+ достигалась при 15 шМ (Рис.6). Такое же значение было получено нами в экспериментах с

ито^Я/Ьгр-мим

Иа/К.тМ

Рис.6. Зависилостъ ашидност -АТРаэи от

Иа/К-соотношенш в эритроцитах (1,2) и лелбранах, отхытых средой с ЕвТА (3,4). О (1,3) и 10 уЛ (2,4).

бескальциевой средой при идентичном

соотношении концентраций Ыа+ и

При микромолярных концентрациях Са2+ в перфорированных сапонином эритроцитах 1 тМ уабаин ингибировал лишь 65% активности Ыа+,К+-АТРазы (Таблица 1 ). При

(Са2+)

Таблица 1. Влияние микромолярных концентраций Са

ингибирование №1+,К+~АТРазы уабанном и фуросемидом.

2+

на

Процент ингибирования

[Са2+], цМ Перфорированные эритроциты Мембраны, отмытые с ЕСТА

+1 гоМ уабаин +1 тМ фуросемид +1 тМ уабаин и 1 тМ фуросемид + 1 шМ уабаин

1.0 5.0 10.0 60.0 100 91.2 65.0 65.0 33.3 23.0 о о о о о о о о о о о о о о о о

9 +

[Са1- ] < 1 ¡Ш уабаин в этой концентрации полностью подавлял активность Ыа+,К+-АТРазы. При [Са2+3 = 5-60 цМ ингибирование снижалось от 90 до 65%. При одновременном использовании уабаина и фуросемида 1 шМ фуросемид при [Са2+] = 5-60 цМ ингибировал

узяши-нечуветвительную составляющую активности Ка+,к+-АТРаза.

После отмывки мембран средой с 2 i EGTA активность Na+,K+-ATPa3a и ее чувствительность к уабаину уже не зависели от присутствия Са2+: полумаксимальная активация для ионов калия составляла менее 1 тМ, а уабаин полностью ингибировал активность фермента (Рис.6, Таблица 1). Действие самого фуросемида слабо зависело от Са2+. При [Са2+] = 0.1-5.0 цМ наблюдалось частичное ингибирование активности Na+,K+-ATPa3tí от 17 до 40%, максимальное при 0.7 цМ Са в области наблюдаемой наш Са -зависимой

Полученные данные показали, что эндогенный ингибитор, скорее всего - ксиъ-нактш, в присутствии микромолярных концентраций Са2+ резко снижает сродство Ыа+,К+-АТРазы к К+ (величина полумаксимальной активации для ионов калия возрастает от 0.5 до 42 тМ). Это говорит о Рис.7. Действие фуроселида на активность Na+ ^-АТРазы эритроцитов при концентрациях Са2+ = 0.1-5.0 цй. 1 - контроль, 2 - + 1 тМ фуроселид.

том, что в условиях ln vivo, где активирующая фермент концентрация К+ с внешней стороны составляет 5 тМ, ингибитор может практически полностью подавлять активность Na+,K+-ATPa3H и приводить к выравниванию градиентов Na+ и К+ через плазматическую мембрану. Из Рис.6 видно, что ингибирование в области 5 тМ К+ составляет около 95%. Снижение сродства к К+ в присутствии Са2+ и эндогенного ингибитора хорошо коррелирует со снижением сродства к уабаину, который, как известно, взаимодействует с К+-связывающим участком молекулы фермента. Последний результат позволяет объяснить некоторые расхождения с данными (Yingst D.R., 1988) о степени ингибирования Иа+,К+-АТРазы кальнактином, так как авторы использовали уабаин для идентификации активности фермента, не проверив эффект кальнактина на сродство к уабаину.

активации фермента (Рис.7, кривая 2).

Показанное нами снижение сродства Ма+,К+-АТРазы к уаОаину и К+ в присутствии микромолярных концентраций Са2+ и эндогенного ингибитора может, вероятно, внести коррективы в интерпретацию данных о существовании так называемой Иа+-АТРазы (Proverbio Р. et al., 1982; Marín R. et al., 1985; Proverbio P. et al., 1991). Активность этого фермента выявлялась только при изоляции мембран в присутствии микромолярных концентраций Са2"1" и устранялась при отмывке мембран средой с EDTA. Этот фермент был нечувствителен к уаОаину, но полностью ингибировался 1 тМ фуросемидом или этакриновой кислотой. В наших экспериментах на эритроцитах остаточная активность Ма+,К+-АТРазы также полностью подавлялась 1 шМ фуросемидом в присутствии 10 рМ Са и 1 тМ уабаина. В итоге полученные нами характеристики этой остаточной активности Na+,K+-ATPa3H совпали с описанными свойствами Na+-ATPa3H. Такое совпадение ставит под сомнение существование Na+-ATPa3H. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эндогенные Са2+-зависимые регуляторы могут не только изменять активность На+,К+-АТРазы, но также модулировать ее чувствительность к сердечным гликозидам и диуретикам типа фуросемида.

Влияние сАМР на Са2+-зависимую регуляцию Na+,K+-ATPa3H.

При исследовании действия сАМР-зависимой протеинкиназы А на

активность Ыа+,К+-АТРазы было показано, что сАМР в концентрации

10 рМ подавлял активность фермента в перфорированных эритроцитах

до 40% в бескальциевой среде, снимал Са -зависимую активацию при ?+ 2+ 0.5-0.7 рМ Са и мог восстановить Са -зависимое ингибирование

почти до 100% при 1-2 рМ Са2+ (Рис.8). Однако, как и при

активации Ыа+,К+-АТРазы 0.5-0.7 рМ Са2+, мы наблюдали

индивидуальные различия в степени подавления Са2+-зависимой

активации фермента, что указывает на существование других

факторов, участвующих в регуляции На+,К+-АТРазы.

Но, тем не менее, в 10% экспериментов наблюдалась активация №а+,К+-АТРазы в присутствии 10 рМ сАМР. Известно, что Ла+,К+-АТРаза может фосфорилироваться не только протеинкиназой А, но и протеинкиназой С. По-видимому, активность фермента и его доступность для того или иного агента зависят не только от *аличия эндогенной регуляции, но и от его состояния Еюсфорилированного или дефосфорилированного - в момент забора срови. Вполне возможно, что у протеинкиназ С и А одни и те же

. I Ь-

p\molf{/h эр-мин

Рис.й. Mtíüc.тбие сАМГ на Со:" -зависимую активацию Na+ ,К*-АТРазы эритроцитов. Сплошная линия контроль, штриховая - в присутствии 10 pJf сАМР. а-в - варианты, для разных образцов в разные сезоны.

места фосфорилирования Na+,K+-ATPa3H (Ser- и Thr- остатки), но расположенные в разных участках молекулы фермента, и, вследствие этого, различное действие. Поэтому первоочередность действия той или иной протеинкиназы и предопределяет дальнейший

статус Иа+,К+-АТРазы в условиях in vitro независимо от экстраклеточных добавок.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе был предложен и использован метод измерения активности ионтранспортируицих АТР-аз, позволяющий исследовать механизмы регуляции активности Na+ ,К+-АТРазы мембран эритроцитов крысы в условиях, возможно максимально приближенных к нативным.

Проведено детальное исследование действия физиологических концентраций ионов Са2+ на активность Na4,К+-АТРазы

плазматичесних мембран эритроцитов. Впервые было показано, что в активации На+,К+-АТРазы участвует Са2+-зависимый белок-активатор, проявляющий свое действие при весьма низких" концентрациях Са^+ С 1 ¡лМ). При более высоких концентрациях ионов Са" О 1 цМ) в процесс регуляции фермента включается ингибитор На+,К+-АТРазы -кальнактин, существенна сникающий сродство фермента к К+ и уабаину.

Физиологические концентрации (300-500 цМ) являются

необходимым условием для функционирования белка-активатора. Снижение концентрации магния до 50 |Ш устраняет действие активатора и выявляет эффект ингибитора фермента даже при низких

О 1

концентрациях Оа" (< 1 цМ). Высказано предположение, что регуляция активности На+,К+-АТРазы Са2+-зависимыми факторами модулируется системой фосфорилирования-дефосфорилирования, чувствительной к ионам магния.

Тщательные исследования регуляции активности Ыа+,К+-АТРазы позволили сделать ряд существенных выводов методического характера, которые необходимо учитывать при постановке экспериментов с АТР-азами: 1) Сравнение свойств Ма+,К+-АТРазы, проявляющихся в присутствии микромолярных концентраций Са2+, со свойствами описанной ранее На+-АТРазы показало их идентичность, ^а этом основании сделано заключение, что существование последней ложет быть артефактом. 2) Было обнаружено, что уабаин в условиях, сохраняющих внутриклеточные регуляторные факторы, может влиять на активность Са2+-АТРазы, что осложняет использование его для идентификации Ыа+,Х+-АТРазы в присутствии микромолярных концентраций Са2+.

Было изучено действие диуретика фуросекида на активность

| I О А.

Ча ,К - и Са~ -АТРаз. Фуросемид значительно повышал сродство Ча+,К+-АТРазы к Иа"1" в бескальциевой среде, тогда как в присутствии Са2+ фуросемид практически не оказывал на него злияния. Эффект же фуросемида на Са2+-АТРазу не отличался от эффекта уабаина и так же зависел от Са2+.

ВЫВОДЫ

. Разработан метод измерения активности ион-транспортных АТР-аз эритроцитов, позволяющий сохранить эндогенную Са2+- зависимую регуляцию ферментов. Метод основан на перфорировании

эритроцитов сапонином в среде с заданными параметрами (рН, концентрации ATP, EGTA, Са2+, Kg2"1", К+, Na+ и т.д.) при использовании двойного буфера (цитрат-EGTA) для поддержания концентраций ионов Са2+ в широком диапазоне. .

2. Показано, что специфический ингибитор Na+,К+-АТРазы уабаин оказывает влияние на активность Са2+-АТРазы, а именно: при ССа2+] < 0.7 уабаин активирует Са2+-АТРазу, а при [Са2+] > 0.7 pJi - ингибирует ее. Выявлено, что влияние уабаина опосредовано Са2+-зависимыми белками-регуляторами. Влияние уабаина на активность Са2+-АТРазы свидетельствует о некорректности использования уабаина для идентификации Ыа+,К+-АТРазы в присутствии микромолярных концентраций Са2+ на фоне Са2+-АТРазы.

3. В эритроцитах кроме известного Са2+-зависимого ингибитора -кальнактина - существует Са2+-зависимый активатор Na+,K+-ATP-азы. Эти регуляторы обладают различиями в сродстве к Са2+ и к Na+,K+-ATPa3e, что позволяет набдюдать эффект активатора при концентрации Са2+ 0.4-0.7 цМ и конкуренцию с ним ингибитора при более высоких концентрациях Са2+.

4. Активирующее действие ионов Са2+ существенно зависит от присутствия ионов Kg2"1". Активация Na+,K+-ATPa3H наблюдается при физиологических концентрациях ионов Mg24' - 370 yJd. Снижение концентрации Mg24" устраняет действие активатора и многократно усиливает эффект ингибитора.

5. При микромолярных концентрациях Са2+ эндогенный ингибитор, возможно кальнактин, существенно снижает сродство Ыа+,К+-АТРазы к К+ и уабаину, более чем в 100 раз увеличивая величину голумаксимальной активации фермента для ионов калия и на треть снижая ингибирующее действие уабаина. Выявленные свойства уабаин-нечувствительной компоненты активности Na+,K+-ATPa3H в присутствии микромолярных концентраций Са2+ и эндогенного ингибитора совпадают со свойствами описанной ранее Ыа+-АТРазы, что ставит под сомнение существование последней.

6. Показано, что фуросемид, предлагаемый ранее для идентификации Na+-ATPa3H, активирует Na+,K+-ATFa3y в бескальциевой среде и вызывает значительное проявление ее активности при концентрации Na+ до 3 шМ, когда активность фермента практически не выявляется. Это может свидетельствовать скорее всего о повышении сродства Na+ ,К+-АТРазы к ионам Na+.

7. Поскольку изменение концентрации Mg24" от 50 до 600 ¡дМ не

оказывает влияния на ^-зависимую АТР-азную активность, то не подтверждается . - существование в эритроцитах Na+/MgF+-АТРазы-

8. При действии 10 цМ сАМР наблюдается подавление активности фермента в перфорированных эритроцитах до 4-0% в бескальциевой среде, снижение Ca -зависимой активации при 0.5-0.7 цМ Са2+

Oj,

и восстановление Ca -зависимого ингибирования почти до 100% при 1-2 |лМ Са2+.

9. Действие фуросемида на активность Са2+-АТРазы сходно с действием уабаина в среде без натрия (т.е. в отсутствие активности Ыа+,К+-АТРазы) и этот эффект так же зависит от Са2+.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Петруняка В.В., Панюшкина Е.А., Северина Е.П. Активация и ингибирование Na+,K+-ATPa3H мембран эритроцитов эндогенными Са2+-зависимыми регуляторами. Са^-зависимое действие уабаина на Са2+-АТРазу. // Биологические мембраны, 1990, т.7, N4, стр.352-358.

2. V.V.Petrunyaka, E.A.Panyushkina, E.P.Severina and S.N.Orlov.

The ATPase activity of saponin-treated rat erythrocytes: regulation by monovalent cations, calcium, ouabain, and. furosemide. // Blochimica et Biophysica Acta, 1990, 1030, 279-288.

3. Панюшкина E.A., Петруняка В.В., Северина Е.П., Орлов С.Н. Влияние фуросемида на активность Na+,К+-АТРазы и Са2+~АТРазы мембран эритроцитов крысы. // Цитология, 1990, т.32, N9, стр.943-944.

4. Петруняка В.В., Панюшкина Е.А., Северина Е.П. Ингибирование и активация Na+, К+-АТРазы мембран эритроцитов крысы Ca , Mg2"1" и сАМР-зависимыми эндогенными регуляторами. // Цитология, 1990, т.32, N9, стр.945-946.

5. Петруняка В.В., Панюшкина Е.А. Оценка роли эндогенных Са2+-зависимых регуляторов и протеинкиназ в активации и ингибировании ионтранспортных АТРаз. //.Цитология, 1991,

Т.33, N11, стр.49-54.

6. " Петруняка В.В., Панюшкина Е.А. Взаимодействие Са2+ и протеинкиназ в регуляции ионтранспортирующих АТР-аз

плазматических мембран. // Биологические мембраны, 1991, т.8, N11, стр.1138-1139.

7. Паншкина Е.А., Петруняка В.В. Эндогенный Са2+-зависимый ингибитор Ыа+,К+-АТРазы эритроцитов изменяет чувствительность фермента к уабаину, калию и фуросемиду. // Биологические мембраны, 1994, т.11, N1, стр.7-11.

22.11.94 г. Зак.бЗбОР. Тир.160 экз. Уч.-изд.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПЩ РАН