Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры и полиморфизма генов второго класса комплекса гистосовместимости DMA и DMB

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры и полиморфизма генов второго класса комплекса гистосовместимости DMA и DMB"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 577.21+612.017

БОБРЫНИНА Власта Олеговна

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ВТОРОГО КЛАССА КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ DMA И DMB

03.00.15 "Генетика"

Г " од

1 1 СЕН Ш5

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1995 г.

Работа выполнена в лаборатории цитогенетики и молекулярной генетики НИИ детской гематологии (Москва) й в лаборатории иммунологии и молекулярной биологии института гематологии (Париж).

Научный руководитель: доктор биологических наук

О. В. Евграфов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Л.А. Певницкий кандидат медицинских наук А.А. Масчан

Ведущая организация: Гематологический научный центр РАМН, Москва

Защита диссертации состоится "_"_199 г.

в_часов на заседании Диссертационного Совета

Д 001.16.01 по адресу: Москва, 115478, ул. Москворечье, д. 1 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан "_"__199 г.

Ученый Секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук

профессор Л.Ф. Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Данная работа посвящена изучению полиморфизма и экспрессии двух новых генов DMA и DMB, обнаруженных в локусе второго класса комплекса гистосовместимости.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Исследование новых генов комплекса гистосовместимости DMA и DMB имеет значение прежде всего для углубления представлений о механизмах формирования иммунного ответа.

Определение аллелей белков комплекса гистосовместимости играет ключевую роль при выборе пары донор-реципиент. Успех трансплантации как способа лечения некура-бельных заболеваний сердца, печени, почек, легких, поджелудочной железы, костей, сетчатки в большой степени зависит от тканевой совместимости донора и реципиента. Особенное значение приобретает определение совместимости при пересадках костного мозга, когда неполная совместимость донора и реципиента требует иного, более интенсивного ведения больного после пересадки, а несовместимость по двум аллелям белков комплекса гистосовместимости приводит к реакциям отторжения. Подбор донора, идентичного по всем известным белкам комплекса гистосовместимости, не всегда позволяет избежать отторжения. В связи с этим встает задача поиска и анализа новых генов второго класса, ответственных за реакции типа "трансплантат против хозяина" и "хозяин против трансплантата".

В настоящее время также изучается роль комплекса гистосовместимости в развитии ряда ассоциированных с ним заболеваний. Подобных заболеваний насчитывается по различным оценкам несколько десятков, большинство из них имеют аутоиммунную природу. Изучение ассоциаций генов второго класса комплекса гистосовместимости и заболеваний аутоиммунной природы представляется важным как с точки зрения определения групп риска, так и изучения молекулярных механизмов развития заболеваний.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В ходе данной работы был показано отсутствие полиморфизма гена DMA, полиморфизм же гена DMB ограничивается тремя аллелями, характеризующимися однонуклеотидными заменами в третьем экзоне, при доминировании одного мажорного аллеля. Отсутствие полиморфизма в области, кодирующей антигенпрезентирующую область

молекулы DM свидетельствует против необходимости типиро-вать данные гены при трансплантациях.

Описаны различные формы матричной РНК гена DMB, две из которых могут приводить к существованию нетипичной для белков комплекса гистосовместимости второго класса конститутивной секреции формы р-цепи.

Предположено, что белки второго класса комплекса гистосовместимости участвуют в процессинге белков. На это указывают:

• жесткая малополиморфная структура димера DM,

• нестабильность его на мембране из-за отсутствия трансмембранного домена как минимум у половины молекул,

• описанные в настоящей работе особенности строения белка.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Результаты исследования полиморфизма генов DMA и DMB и их экспрессии свидетельствуют о том, что продукты этих генов не принимают участия в иммуноагрессивных реакциях, развивающихся в результате пересадки костного мозга, и, следовательно, их можно исключить из списка генов, по которым необходимо проводить типирование пары донор-реципиент при трансплантациях.

Обнаруженная ассоциация ревматоидного артрита с редкими аллелями гена DMB может быть использована для оценки генетического риска, а также для исследований этиологии этого заболевания.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью данной работы было изучение структуры и полиморфизма новых генов DMA и DMB, обнаруженных в локусе HLA второго класса.

Исходя из практической важности изучения генов второго класса комплекса гистосовместимости были сформулированы следующие задачи:

• изучить полиморфизм генов DMA и DMB,

• оценить необходимость молекулярно-генетического типирования генов DMA и DMB при трансплантациях,

• охарактеризовать экспрессию продуктов генов на уровне транскрипции в клеточных линиях и в крови здоровых доноров,

• исследовать ассоциации аллелей генов DMA и DMB с заболеваниями, для которых показана роль генов второго класса комплекса гистосовместимости.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫДВИГАЕМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Показано, что ген DMA не полиморфен. Определен полиморфный участок гена DMB. Определены частоты аллелей гена DMB.

2. Показано, что среди больных ревматоидным артритом повышен процент минорных аллелей гена DMB.

3. Найдено три формы мРНК гена DMB, одна из которых кодирует трансмембранный белок, а две другие — секреторную форму того же белка.

4. Показано, что различные формы мРНК гена DMB генерируются в результате альтернативного сплайсинга.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 116 страницах, содержит 6 таблиц и 31 рисунок. Список литературы включает 89 работ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации докладывались на совместном семинаре лаборатории ДНК-диагностики и лаборатории клинической цитогенетики ГНЦМГ, и лаборатории цитогенетики и молекулярной биологии НИИ детской гематологии.

ОБЪЕКТЫ И МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проводилась на:

• 30 гомозиготных по гаплотипам генов вторго класса комплекса гистосовместимости В-лимфобластоидной клеточных линиях, принятых для типирования на 10 Международной Конференции по Гистосовместимости. Использованные линии получены трансформацией вирусом Эпштейна-Бара лимфоцитов здоровых доноров белой расы (панель СЕРН).

• клетках крови здоровых доноров белой расы (40 образцов), китайского (13 образцов) и негритянского (17 образцов) происхождения.

• 17 образцах крови больных инсулинзависимым сахарным диабетом, 13 образцах крови больных базедовой болезнью и 38 образцах крови больных ревматоидным артритом.

Материалами исследования служили тотальная РНК и геномная ДНК, выделенные из клеток крови или линейных клеток.

МЕТОДЫ

1. Для выделения тотальной РНК использовали гуани-дин-изотиоцианатный метод с последующим ультрацентрифугированием в градиенте хлорида цезия, после центифуги-рования проводили фенол/хлороформную экстракцию.

2. Обратная транскрипция.

Для получения кДНК использовали набор для обратной транскрипции фирмы Boehringer Mannheim и смесь четырех дезоксирибонуклеотидов по протоколу фирмы.

3. Выделение геномной ДНК.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса использовали метод выделения ДНК из крови, предложенный в работе Lindblum and Holmund, 1988, через стадию выделения ядер с использованием фенол/хлороформной экстракции.

4. Для полимеразной цепной реакции использовали ре-комбинантную термостабильную полимеразу Taq-pol, фирмы Boehringer Mannheim, поставляемую со своим буфером и с 50 мМ раствором хлорида магния, все полимеразные цепные реакции проводили в конечном объеме 50 мкл.

Последовательности праймеров были выбраны так, чтобы амплификации можно было проводить при температуре отжига праймеров 60°С. Полимеразную цепную реакцию проводили на приборах Hybaid и Perkin Elmer.

Последовательности праймеров, приведены в таблице 1. Расположение амплифицируемых фрагментов указано на рис. 1.

г- - nsnsarci.ctu:) <:и ■■ •->< "

'j а?; •■ u>i? f.-n!г/.<ли йг-ач?'-.'»4 >д <•■,;!

' 'IT____naptt , ____

' --------- ------. JU^tt. XH1--

----- иаф» rv(->

ищу* ......"У«»*

Рис. 1. Расположение амплифицируемых участков кДНК DMA и DMB с номерами соответсвующих пар. На схеме также обозначены домены аиЪ цепей.

Табл. 1. Последовательности олигонуклеотидов использованных как праймеры для полимеразных цепных реакций.

Ген и номер тары Последовательности праймеров

DMA пара № 1 5'-GGGTCATGAACAGAACCAAGG—3' 5'—TCAGCGATAGGAAACCCTCTG-3'

DMA пара N9 2 5'-TGATGGGAAAATCCCGGTGTC-3' 5' — AATCAGTC АС CTG AG CÄAGG С—3'

DMB пара № 3 5'—ATGATCACATTCCTGCCGCTG—3' 5'—AGGCACCCTCGTGTTAAAAGG-3'

DMB пара № 4 5'—CCAGGATCCGTGCAAGTAGCCAAAACCACTCC—3' 5'—TGTAGGATCCTGCCTCTAGGAAATGTGCCATCC—3'

DMB пара № 4* 5' - G С AAGTAG С С AAAACC ACTCC—3' 5'—CCAGTCCCGAAGGATGGGCT—3'

DMB пара № 5'-GGTAGAGCACATTGGGGCTCC—3' 5'—CTTCAGGGTCTGCATGGGGG—3'

DMB пара № 6 5'—ACACCTGGGCTGTCCCCCATG—3' 5'-CCTCTAGGAAATGTGCCATCC—3'

DM В пара № 7 5'-GGGCCTGGGCCTCATCATCTTC-3' 5'-CCTCTAGGAAATGTGCCATGG—3'

5. Для определения конформационного полиморфизма од-ноцепочечной ДНК (SSCP) радиоактивные амплифицирован-ные фрагменты ДНК получали путем введения в амплифика-ционную смесь меченого по а-фосфору цитозина. Далее 2 ml каждого амплификата денатурировали в 48 ml краски, содержащей 95% формамида и 50 mM EDTA в течение 3-х минут при 94°С, после чего 4 ml каждой пробы наносили на гель. Для электрофореза использовали полиакриламидные гели, условия электрофореза - 0.5-кратный TBE, 17-20 W при +4°С в течение 15 часов, далее гель снимали на ватман, покрывали слоем SaranWrap и пленкой Hyperfilm-MP фирмы Amersham, после чего экспонировали 15-20 часов на -70°С,

6. Для денатурирующего электрофореза использовали 6% полиакриламидный гель, содержавший 50% мочевину и однократный TBE, электрофоретическое разделение фрагментов проводили при 40 Вт. Радиоавтограф получали как описано в предыдущем пункте за исключением того, что после

электрофореза гель высушивали и экспонировали ночь при комнатной температуре.

7. Определение нуклеотидной последовательности методом флюоресцентного сиквенирования.

В данной работе нуклеотидная последовательность ампли-фикатов определялась прямым сиквенированием по протоколу TAQ/Dideoxy Nucleotides Fluorescents фирмы Applied Biosystems. Результаты анализировали на системе автоматического сиквенирования Applied Biosystems DNA Analysis System, модель 373A.

8. Клонирование амплифицированных фрагментов кДНК.

Клонирование амплифицированных фрагментов, полученных в результате амплификации кДНК здоровых доноров в реакции с парой праймеров №4 проводили в векторе pBlu-escript KS+ (производства фирмы Stratagene), в сайте Eco R1 после дефосфорелирования. Для облегчения клонирования сайты были введены и в 5'-концы обоих праймеров. Лигиро-вание проводили в 3-х кратном молярном избытке амплифи-цированного фрагмента Т4-ДНК лигазой фирмы Boehringer Mannheim. Компетентные клетки линии TG1 готовили с использованием стерильного 10% раствора хлорида кальция. Отбор колоний проводили при помощи бело-голубого теста.

Выделение плазмидной ДНК проводили по методу щелочного лизиса (Maniatis et al, 1991).

9. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов ДНК проводили флюоресцентным методом по протоколу Applied Biosystem 373А с использованием праймера М13.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выравнивание аминокислотных последовательностей С1 домена b-цепи DM с известными С1 доменами.

В опубликованной в 1991 году работе Kelly было показано, что гомология Ь2 домена DM составляет всего около 30% с Ь2 доменами различных белков комплекса гистосов-местимости. В связи с этим возникает вопрос, сохраняет ли данный домен структуру, характерную для С1 доменов белков комплекса гистосовместимости. Для ответа на этот вопрос было проведено выравнивание с соответсвующими аминокислотными последовательностями некоторых белков комплекса гистосовместимости.

В таблице 2 приведен результат выравнивания экзонов генов DMA и DMB с некоторыми b-слоями С1 доменов нескольких белков комплекса гистосовместимости. В первой колонке таблицы указано происхождение последовательностей аминокислот: консенсус - мажорный аминокислотный мотив С1 домена, Ь2-ш - Ъ2 микроглобулин, МНС I аЗ, - аЗ домен первого класса комплекса гистосовместимости гистосовместимости, МНС II Ь2 - Ъ2 домен второго класса, комплекса гистосовместимости, CD1 аЗ - соответствующий домен CD1 рецептора, DMB Ь2 - Ь2 домен b-цепи белка: DM.

Таблица 2

b-слой В С

консенсусА Т L V С L V S G F Y Р G А V/I V W N G

Ь2-т N F L N С Y V S G F Н Р S D - 1 Е V D L L К N G Е

МНС1аЗ А Т L R с W А L G F Y Р А Е - 1 Т L Т W Q R D G Е

МНС IIЬ2 N L 1 V с S V S С F Y Р G S - 1 Е V R W F R N G Q

CD1 аЗ L Q 1 V с н V S G F Y Р К Р - V W V М W М R, G Е Q

DMBb2 V М 1 А с Y V W G F Y Р А Е - 1 т _ W R К N G 1С

Ь-саой Е

конс-D GTY LSS L Т V Р енсус

Ь2-т- SKDWSFY - LYYT Е; -

МНС DGT F Q К W А - V V V - Р -1аЗ

МНС NG- DWTFQ- LVMLE-IIЬ2

CD1DGT WYL R А - L EVAA-аЗ

DMB DWTYQTLSHLAL---Ь2

f

Y S С V Н FT PTEKDEYACRVNH S - - GEEQRYTCHVQH TVPRSGEVY ТС Q V Е Н

- - ■ - GEAADL SCRVKH

- Т Р S YGDT Y Т С V V Е Н

Между С и Е слоями находится интервал длиной около 40 нуклеотидов, включающий 12-нуклеотидный D слой. В последовательности DMB между С и Е слоями находится всего 16 нуклеотидов, не выравнивающиеся с консенсусом D слоя. Из этого следует, что в b-цепи DM С1 домен редуцирует боковую D петлю. Поскольку наиболее примитивным считается V-домен, имеющий в сравнении с С1 доменом дополнительно два b слоя -С'-С"-, можно предположить, что редукция еще одного слоя в b-цепи DM соответсвует дальнейшему развитию С1 домена, т.е. скорее дальнейшей специализации молекулы, чем ее более примитивному состоянию.

2. Определение транскриптов генов DMA и DMB.

Для того, чтобы определить, транскрибируются ли гены DMA и DMB, была выделена тотальная РНК клеток различных лимфобластоидных линий, проведена ее обратная транскрипция и выполнена полимеразная цепная реакция на тотальной кДНК клеток лимфобластоидных линий с использованием пар праймеров NN 1-4. Для удобства праймеры были выбраны так, чтобы при одинаковом составе амплифициро-вать фрагменты приблизительно равной длины — около 400 пн, что позволяет анализировать всю кодирующую последовательность DMA и DMB. Для проверки амплификации продукты реакции разделяли электрофорезом в 0.8% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Результат представлен на рисунке 2.

Рис.2. На рисунке обозначены пары праймеров, использованные в полимеразной цепной реакции и названия клеточных линий, кДНК которых использовалась как матрица. Маркером молекулярного веса является ДНК

рВК.322, обработанная рестриктазой Нае III.

Молекулярные веса амплификатов с первой, второй, третьей пары соответствуют ожидаемым. Ожидаемому молекулярному весу соответствует и наиболее тяжелый амплифи-цированный фрагмент, полученный при амплификации с четвертой пары. Причем все три полосы в амплификате, генерируемом с четвертой пары праймеров, существуют при концентрациях ионов магния от 1 до 7 мМ, что свидетельствует против того, что две полосы более легкого веса могут быть артефактами.

Различные культуры одной и той же клеточной линии (например, ЯБН, КАБОП, 16(ГОЬМ) могут давать как наиболее легкую, так и все три полосы (рис.За). Амплификация с данной пары на ДНК дает одну полосу (рис.36).

Рис. За Рис. 36

Полимеразная цепная реакция, выполненная на кДНК, полученной обратной транскрипцией с тотальной РНК, выделенной из крови здоровых доноров, тоже давала три продукта. 3. Анализ продуктов полимеразной цепной реакции с четвертой парой праймеров. 3.1 Электрофорез в денатурирующем геле.

Три амплифицированных фрагмента кДНК различного молекулярного веса, полученные в результате полимеразной цепной реакции с кДНК четырех различных клеточных линий, были разделены на агарозном форезе, очищены и 1/20 часть каждого образца была доамплифицирована с добавлением радиоактивного цитозина, далее пробы были нанесены на денатурирующий полиакриламидный гель.

Рис.4. Полученная картина позволяет предположить, что полоса про-~~ - - межуточного молекуляр-

ного веса (четыре средние дорожки) представляет ~ собой гетеродуплекс двух

других полос (по четыре V дорожки справа и слева),

различающихся по молекулярному весу. Направление электрофоретической миргации указано стрелкой.

3.2 Рестрикционный анализ гомодуплексных продуктов.

Согласно опубликованной нуклеотидной последовательности кДНК, амплифицируемый фрагмент ожидаемого веса должен иметь сайты рестрикции ферментов Bañil и Alul. Соответствующие рестрикционные карты представлены на рис.5.

Рис. 5.

м - Ban II : 264 ' 1 м. - + 204 ----►

Ь2-домен СП тм ЦП

Alu I: 123

<-----------

+

254

<.

+ 11 +

80

Два амплифицированных фрагмента кДНК, представляющих собой гомодуплексы, были разделены в агарозном геле, очищены, и обработаны ферментами рестрикции Ban II и Alu 1 (рис.6).

Подобная картина свидетельствует, что две гомодуп-лексные формы, получаемые в результате полимеразной цепной реакции, содержат третий экзон DMB. Поскольку поли-меразная цепная реакция с этой парой на геномной ДНК дает только одну полосу, можно предположить, что участки раз-

личной длины появляются в РНК в результате альтернативного сплайсинга.

Рис.6 Очевидно, ', ' " ' '. I '' [

что ферменты имеют в обоих

фрагментах неиз- , - | '^З

жененные сайты 264 второго экзона, в то время как сайты вне второго экзона в более легкой форме изменяют свое пол- U Щ 3 -'р ожение. w ;fj g

Ban И Alu I

¿Ж-'.'

4. Анализ полиморфизма генов DMA и DMB

4.1 Детекция фрагментов различной подвижности.

Для поиска точечных мутаций,свойственных генам комплекса гистосовместимости был использован метод SSCP.

Данный метод основан на различии электрофоретичес-ких подвижностей фрагментов одноцепочечной ДНК в неде-натурирующих условиях, отражающем различие нуклеотид-ных последовательностей амплифицированных фрагментов.

Четвертая пара праймеров была изменена так, чтобы амплифицировался только третий экзон (пара N4*) гена DMB, так как он содержится во всех фрагментах, амплифи-цируемых с кДНК. С кДНК 27 лимфобластоидных линий, гомозиготных по различным гаплотипам, были амплифициро-ваны фрагменты кДНК парами NN 1-3 и 4*. Для поиска полиморфизма данные фрагменты были проанализированы методом SSCP. Кодирующая последовательность в гене DMA оказалась неполиморфной, как и первые два экзона гена DMB. Третий экзон гена DMB представлен в рассмотренных гомозиготных лимфобластоидных линиях четырьмя паттернами электрофоретической подвижности (рис.7). Данные ре-

зультаты согласуются с результатами, независимо полученными F Sanders (1993) и М Carrington (1993), полученными при анализе второго и третьего экзонов генов DMA и DMB.

Из рисунка 7 можно заключить, что четвертый паттерн представляет собой сумму первого и второго паттернов.

Рис.7

Табл.3. Распределение клеточных линий по паттернам электро-форетической подвижности.

первый паттерн второй паттерн третий паттерн паттерн 1+2

AMALA LD54 ВМ16 KAS0116 РЕ 117

ВМ21 JVM ЕА STEIN LINE

BER SWEIG IBW9 TISI

СВ6В RSH JHAF

160DLM WT47 JESTOM

СОХ WT51 HD301

DBB WJR

DHIF SAVC

DUCAF ННКВ

JAF PLH

В таблице 3 представлено распределение клеточных линий по паттернам подвижности амплифицируемых фрагментов третьего экзона.

4.2 Определение мутаций, соответствующих различным паттернам подвижности.

Нуклеотидные последовательности линий СОХ, ВМ21, БРО, ВМ16,.ГЕБТОМ, Кэб! 16 были определены методом прямого флюоресцентного сиквенирования, и точечные замены, соответствующие различным паттернам БЗСР, сведены в таблицу 4.

Для того, чтобы оценить частоты различных мутаций были проанализированы образцы крови 40 здоровых доноров белой расы и 30 образцов клеточных линий, также полученных от здоровых доноров (панель СЕРН).

Табл.4. Точечные замены в третьем экзоне гена DMB.

номер кодона последовательность кодона аминокислота частота аллеля

653 GCG аланин 91%

653 GAG глутаминовая кислота 9%

653 GTG валин в здоровой популяции не обнаружен

758 ATT изолейцин 98%

758 ACT треонин 2%

Приведенные данные соответствуют результатам, независимо полученным при анализе вторых и третьих экзонов генов DMA и DMB Carrington и Sanderson в 1993 году.

Обобщая литературные данные и полученные результаты с точки зрения селекции можно рассчитать величину функционального давления g на молекулу DMB по формуле:

g=(An/Ln)(Ls/As), где An — среднее число замен аминокислот вне антигенпрезентирующей щели, As — среднее число мутаций, не приводящих к замене аминокислот, Ln — общее число аминокислотных позиций, в которых происходят

замены аминокислот, Ls — общее число кодонов, мутации в которых не приводят к замене аминокислот (Klein 1993), получаем, что g для гена DMA равна 0.021, а для DMB 0.026.

Приведенная формула предполагает, что для псевдогена g=l, а для гена, функционирование которого не допускает аминокислотных замен g=0. Величина функционального давления на гистоны составляет 0.004, для С-пептида инсулина g=0.201, а для интерферона b g=0.467. Функциональные гены первого и второго класса комплекса гистосовместимости имеют g около 0.33. Таким образом, локус DM находится под действием негативной (очищающей) селекции, пресс которой более чем на порядок превосходит таковой на остальные гены комплекса гистосовместимости.

Kelly в 1994 году на Первой Европейской школе по гистосовместимости в докладе о новых генах, обнаружены* в ло-кусе второго класса комплекса гистосовместимости, отметил, что иммунопреципитация цитоплазматической части Ь-цепи DM окрашивает не мембрану клетки, а эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи и различные эндосомы. Молекула DM не имеет сайтов связывания CD4,8 и не копреципи-тирует с инвариантной цепью.

Morris и Fling в 1994 опубликовали данные, свидетельствующие о том, что В-лимфобластоидные линии клеток 8.1.6, не способные стимулировать Т-клеточную пролиферацию, имеют делецию, захватывающую большую часть гена DMB, при трансфекции их кДНК DMB полностью восстанавливают способность к презентации. Линия 5.2.4, имеющая обширную делецию, захватывающую оба гена DM; LMP2,7; ТАР 1,2 восстанавливала способность к презентации при кот-рансфекции кДНК DMB и DMA. Неспособность этих мутан-тных линий стимулировать Т-клеточный ответ связывается авторами с тем, что молекулы DR в отсутствие DM заполнены продуктами деградации инвариантной цепи.

Все приведенные выше данные позволяют заключить, что истинная роль гетеродимеров DM - участие в процессин-ге белков второго класса комплекса гистосовместимости. Более того, если представить себе конкуренцию за связывание с антигенпрезентирующей щелью между продуктами деградации и экзогенными белками, при том, что молярная концентрация инвариантной цепи равна концентрации сайтов пре-

зентации, то становится ясно, что нормальная загрузка антигена возможна, только если в этом компартменте присутствует фактор, сорбирующий пептиды, происходящие из инвариантной цепи. Такая ситуация вполне объясняет обнаруженные структурные особенности генов 1ЭМ.

5. Анализ образцов крови пациентов, с заболеваниями, ассоциированными со вторым классом комплекса гистосовместимости

Определенные аллели белков второго класса комплекса гистосовместимости демонстрируют сцепление с рядом ауто-имунных заболеваний. В связи с этим был проведен гетеро-дуплексный анализ третьего экзона БМВ на образцах крови 40 здоровых доноров, 13 образцах крови больных базедовой болезнью, 17 образцах больных инсулинзависимым сахарным диабетом и 38 образцах крови больных ревматоидным артритом.

Только при анализе больных ревматоидным артритом оказалась повышена частота минорных аллелей гена ОМВ (11 из 38 среди больных и 3 из 40 среди контрольной популяции, р=0.025). Это тем более интересно, что по результатам Саг-пг^оп аллели ОМВ не имеют неравновесия по сцеплению с какими-либо аллелями других генов второго класса комплекса гистосовместимости.

Для объяснения участия минорных аллелей ОМВ в патогенезе заболевания необходимы дальнейшие исследования.

6. Анализ кДНК гена БМВ

Среди клонированных продуктов были обнаружены три типа нуклеотидных последовательностей разной длины. Фрагмент наибольшего молекулярного веса — "а" — соответствует опубликованной нуклеотидной последовательности кДНК гена ОМВ. Фрагмент наименьшего молекулярного веса — "б" — не имеет участка, кодирующего соединяющий пептид, весь трансмембранный и начало цитоплазматического домена. Есть и еще одна последовательность — "в" — также не имеющая данного участка, где вместо него включена новая последовательность.

На рисунке 8 представлено выравнивание трех последовательностей ДНК. Пунктиром в форме "б" обозначен отсутствующий участок кДНК последовательности, в фЬрме "в" существует вставка, после которой последовательность восстанавливается, недостающий участок также обозначен пунктиром. Сайты Mva 1 подчеркнуты.

Рестрикция по Mva 1 показала, что формы "а" и "б" представлены приблизительно поровну в амплифицирован-ных образцах, полученных как с кДНК линейных клеток, так и с кДНК из крови здоровых доноров, в то время как форма "в" присутствует в очень незначительном количестве (около 10 %) и только в кДНК из крови здоровых доноров.

Таким образом можно предположить, что все три данные формы генерируются транскрипцией одного и того же гена и альтернативным сплайсингом мРНК.

Присутствие в клетках крови дополнительной формы по сравнению с клетками В-лимфобластоидных линий может быть объяснено тремя гипотезами:

• трансформация линий вирусом Эпштейна-Бара приводит к подавлению одного из типов сплайсинга,

• линейные клетки синхронизованной пассажами культуры обычно находятся на одной стадии развития, минорная же форма может быть свойственна антигенпрезентирующим клеткам на определенной стадии дифференцировки,

• минорная форма может присутствовать в антигенпре-зентирующих клетках не В-лимфобластоидного ряда.

7. Исследование структуры гена DMB.

Для того, чтобы выяснить, не являются ли данные формы результатом альтернативного сплайсинга, на ДНК были определены нуклеотидные последовательности у границ доменов с использованием пар NN5-7. Последовательность, отсутствующая в форме "б", соответствует одному — четвертому — экзону, а новая последовательность формы "в" — началу третьего интрона (рис.9). Как донорный сайт в данном случае будет использоваться консенсус TG. Во всех экзонах сплайсинг происходит, как всегда в иммуноглобулиновых доменах между первым и вторым нуклеотидом в кодоне. На рисунке 10 показано, что эта последовательность продолжает рамку считывания новыми 9 кодонами и заканчивается ранним стоп кодоном. Вновь возникающая последовательность

не кодирует гидрофобных аминокислот и является слишком короткой для того, чтобы удержать молекулу в мембране.

Рис.8

GAGCCCATCCTTCGGGACTGGACACCTGGGCTGTCCCCCATG а

GAG СССАТССТТС G G G ACTG G А--------------------------------б

GAGCCCATCCTTCGGGACTGGAGTAAGTGTATGGCAGATGGA в

CAG ACCCTG AAG GTTTCTGTGTCTG CAGTG ACTCTGG G CCTG а

--------------------------------------------------------------------б

TGGAATTGGGTCAAAGCAGAGAAAATGAGATGTGGATCGATA в

G G ССТС АТС ATCTTCTCTCTTG GTGTG ААТС AG CTGGCGGAG а

--------------------------------------------------------------------б

CATG--------------------------------------------------------------в

AG CTG G CCACTCTAGTTACACTCCTCTTCCTGGGTCCAATTAT а

............--GTTACACTC CTCTTCCTGGGTCCAATTAT б

--------------GTTACACTC CTCTTCCTGGGTCCAATTAT в

Рис.9

раннний стоп кодон в новой рамке считывания

т

конец третьего экзона начало вставки формы "в"

ОЛОСССАТССТТСОООАСТСОАОТААОТОТЛТООСАаЛТСС.ЛТООЛЛТГЛОООТС GAGCCCATCCTTCGGGACTGGAgJ:aagtgtatggcagatggatggaattagggtc конец третьего экзона начало третьего интрона

конец вставки формы "в" начало

пятого экзона

АААОСАОАОААААТОАОАТОТООАТСОАТАСАТООТТАСАСТСС aaagcagagaaaatgagatgtggatcgatacatgg_tacatggta

третий интрон У

новый донорный сайт

Рис.10. Новая рамка считывания, возникающая во вставке, следующая: Glu Pro Не Leu Arg Asp Trp Ser Lys Cys Met Ale Asp Gly Trp Asn Stop GAG CCC АТС CTTCGG GAC TGG AGT AAG TGT ATG GCA GAT GGA TGG AAT TAG ggtcaaagcag

Сегодня существуют различные данные о водорастворимых белках комплекса гистосовместимости. В основном, речь идет о белках первого класса комплекса гистосовместимости, претерпевающих протеолиз на мембране клетки. Имеет ли это какое-либо функциональное значение — не известно. Альтернативно сплайсированные формы HLA-G обнаружены в перинатальном периоде. Функция их не совсем понятна. Альтернативный сплайстинг описан для некоторых видов аллелей DQB (Briata 1989, Senju 1991), и связан, по-видимому, с полиморфизмом некодирующей последовательности.

В эксперименте (Sharma 1991) показано, что введение молекулы второго класса комплекса гистосовместимости в комплексе с пептидом (91-103 позиции основного белка миелина или 139-151 позиции протеолипопротеина), может значительно уменьшить или предотвратить риск развития экспериментального аллергического энцефаломиелита, а в малых дозах облегчить клиническую картину заболевания.

Конститутивный альтернативный сплайсинг генов комплекса гистосовместимости обнаружен впервые. Также впервые обнаружена секреторная форма белков гистосовместимости. По поводу причин этого явления можно сформулировать несколько гипотез:

• альтернативный сплайсинг, элиминирующий трансмембранный экзон DM, может быть побочным продуктом работы механизма, альтернативно сплайсирующего трансмембранный экзон иммуноглобулинов,

• секреторная молекула может играть сигнальную роль, как большинство секреторных молекул клеток иммунной системы,

• отсутствие трансмембранной части b -цепи у большей части молекул DM не позволит этим молекулам образовывать

стабильные гетеродимеры на клеточной мембране и тем самым создавать "шумовой фон", снижая эфффективность рас-познования истинно презентирующих молекул.

Трансмембранная форма молекулы способна на поверхности клетки мимикрировать второй класс комплекса гистосовместимости, не выполняя функции распознования антигенов. В то же время молекула без трансмембранной части может сохранять функцию адсобции продуктов деградации инвариантной цепи в компартменте загрузки антигена. По данным Созвоп трансмембранная часть а- и Ь-цепей молекулы второго класса комплекса гистосовместимости определяет правильную конформацию гетеродимера и преимущественное образование гетеродимеров в сравнении с гомодимерами. Белки с измененными трансмембранными порциями способны образовывать гетеродимеры (видимо, за счет экстрацел-люлярной части), но такие молекулы не распознаются кон-формационнозависимыми антителами и не способны выходить на мембрану клетки. Если даже молекула ЭМ без трансмембранной части Ь-цепи и попадет случайно на поверхность клетки, такая нестабильная молекула на мембране должна диссоциировать, высвобождаяЬ-цепь и пептид, не мешая распознованию остальных белков комплекса гистосовместимости второго класса.

Кристаллографические исследования позволяют предположить, что гетеродимеры второго класса комплекса гистосовместимости скорее всего функционируют в виде бидиме-ров. В данном случае отсутсвие трансмембранной части Ь-цепи молекул предотвратит выход на поверхность гетеродимера БМ в ассоциации с нормальными молекулами второго класса комплекса гистосовместимости и соответсвенной понижение эффективной концентрации молекул второго класса комплекса гистосовместимости.

В заключение хотелось бы подчеркнуть, что приведенные в данной работе результаты свидетельствуют о том, что:

• белок ОМ, хотя и обладает невысокой гомологией с другими белками комплекса гистосовместимости, тем не менее имеет типичную структурную единицу - С1 домен,- общую для всех белков комплекса,

• полиморфизм белка БМ не связан с презентацией антигена, он отмечен вне области антигенпрезентирующей щели, гетородимер ЭМ ни в коей мере не может принимать участия в презентации — так как большая часть молекул не имеет на поверхности антигенпрезентирующих клеток стабильной конформации,

• в процессе эволюции молекула ОМ подвергалась значительному прессу очищающей селекции,

• функцией белка БМ является участие в процессинге белков второго класса, в частности - удаление продуктов деградации инвариантной цепи.

ВЫВОДЫ

1. Анализ полиморфизма кДНК, кодирующих а- и Ь-цепи димера ОМ, показал, что данный белок обладает не свойственной генам второго класса комплекса гистосовмес-тимости высоко консервативной последовательностью. Полиморфизм ограничивается четырьмя аллелями, различающимися однонуклеотидными заменами в третьем экзоне гена

эмв.

2. Обнаружена повышенная частота минорных аллелей гена БМВ в группе больных ревматоидным артритом.

3. В клетках здоровых доноров обнаружено 3 варианта мРНК, кодирующих Ь-цепь. Определение нуклеотидных последовательностей и экзон-интронных сочленений показало, что один из вариантов соответствует трансмембранному белку, сходному по структуре с белками, которые кодируются другими генами второго класса. Другие варианты мРНК образуются в результате альтернативного сплайсинга, приводящего в одном случае к удалению четвертого экзона, а в другом случае — к замене четвертого экзона на фрагмент третьего интрона геномной ДНК, что приводит к возникновению новой рамки считывания и раннему стоп-кодону. Эти варианты мРНК кодируют белки, лишенные гидрофобной трансмембранной части и, предположительно, являющиеся секреторными.

В клетках В-лимфобластоидных линий существует два варианта мРНК Ь-цепи. Во всех случаях сплайсинг осущес-

твляется между первым и вторым нуклеотидом кодона, как в других функциональных генах второго класса комплекса гистосовместимости. Все сайты сплайсинга соответствуют консенсусным.

4. Отсутствие полиморфизма генов DMA и DMB в области, соответствующей антигенпрезентирующей щели, исключает необходимость типирования по данному локусу для целей трансплантации.

Анализ литературных и полученных в работе данных позволяет предположить, что белки, кодирующиеся генами DMA и DMB, участвуют в процессинге белков второго класса комплекса гистосовместимости и не несут функции презентации антигена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бобрынина В.О., Moins-Teisserenc Н, Loiseau Р , Charron D "Полиморфизм новых генов второго класса DMA и DMB". Тезисы докладов Первого Российского Съезда Медицинских Генетиков. 1994 г., с.236

2. Бобрынина В.О., Moins-Teisserenc Н, Loiseau Р , Charron D "Альтернативный сплайсинг b-цепи антигена второго класса DM" Тезисы докладов Первого Российского Съезда Медицинских Генетиков 1994 г., с.237

3. V Bobrynina, Н Moins-Teisserenc, Р Loiseau and D Charron "New polimomorphisms within the human DMB coding region" abstract EFI and BSHI Joint Meeting, 8-11 March 1995, Brighton

4. H Moins-Teisserenc, V Bobrynina ,P Loiseau and D Charron " New polymorphisms within the human TAP1 and TAP2 coding regions" 1994 Immunogenetics v.40, p.242

5. H Moins-Teisserenc, К Bida, V Bobrynina, H Bour-deau-Esperou, E Glukman, P Loiseau and D Charron "HLA-DP and TAP2 typing in unrelated bone marrow transplantation" 1993 EFI and BSHI Joint Meeting, 20-23 April, Colona, p. 150

6. H Moins-Teisserenc, G Semana, M Alizadeh, P Loiseau, V Bobrynina, I Deschamps, G Edan, В Birebent, В Genetet, О Sa-bouraud and D Charron "TAP2 gene polymorfhism contributes to genetic susceptibility to multiple sclerosis" 1995 Immunogenetics 42.

Заказ № 235. Тираж 100 экз. Формат 148 х 210. Гарнитура Тайме. Бумага Кутсору Lux. Подписано в печать 14.06.95 г. АО «Астер». Москва, Вавилова 31, 1. 1995 г.