Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ РИБОСОМ И РИБОСОМНЫХ СУБЪЕДИНИЦ СЕМЯН ГОРОХА PISUM SATIVUM

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ РИБОСОМ И РИБОСОМНЫХ СУБЪЕДИНИЦ СЕМЯН ГОРОХА PISUM SATIVUM"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОКИМИИ м. АЛ. БАХА

Я-М666

Н* цмм! ружс

ЧУМИКИНА

КЗУЕНИЕ РИБОСОМ Н РИВОСОМНЫХ СУБЪЕДИНШ! СЕМЯН ГОРОХА ПБСМ ЯДТТГПМ

О 3.00X4 - бплсп

А В ТО РЕФЕРАТ

Двсс«рггвшв, преастм пчшоа м сжише у чей ой ствамж кмшяовта бкивгяческжх науж

Москва - 1874

■'■ - ; " y ■'■' ^ \.'y ",■ ' y-''("Y1 > - ■ "'V- V." ' . ■ - - ь ¡' V ' .

• • 'A KA Д Б UIÍ Я ' • H AT К С С С Р' . - ' V . " "'М-, фдаи лшива дастиетт''вгошш'-'а«и'А.я.ьшл .•'• v'-; 4 ***

■' " V-1/ '

"-.ÍV---.V- ; "

V- л:-".-' '

* ' 1 4

Ва правах ^дгтлшси

ï'.t!'.'' i

á'.'^y

Г f * •

ш.

ЧумиЕина Лцгааяла Васильевна

л , : • И37ЧШИЕ ?ИЕОООМ ИРИБОООМНЫХ СУБЬЕШИЦ СШЯН ТПРОУД РШМ ; ' ЗАТГТОИ ь* ■

Л (Специальность 03.00.04, биологическая гадая)

л.

гЛ- ví'-;

А В I О Р Е Ф Е Р A T диссертадая, прадотятшжной на соискание учекойстепена кандидата биологических наук

■ \ W'í' i-

Москва, 1374 г.

ГПзатгиготк Invrnv I>*-£!hotíj» ГЯвС!!'-' - t ' iïW.

j.AEiîi.':.: ; ff, l/^i^J

. 'M

' /

ч

-л У ■ ' -

у'. ■■'■ • •••'^'Работа. шполнена влвйррБторик анзшводстеж Орщсва-^ Т

■■ ■^:,v: V -Двяава Иаотятута '(¿сдиж;«.' А*Н.Бвха АН. СССР, v 'У :

; '--Я '■ - ' ■;'■>, ..»V^ ■'■"■ ■ v..:.-:-* 1 V.' У1." 1 ' ]-■'■' „Vv!..'-"{■.

i-;'Í!í. ^. " Л : ■.' ' ■ . ' ■ Г '""! " . • ■ :;V

'.• - 1 . "Д."'-..-:.. < --------л. .,■■■.-■:■.-..,.■ ■. ■.--,;.*■;,■ -■. ■>;.■.(.■,.-_ ,■',.л^Д-о'"-;

чяев-ворреспоадевг АН СССР, проф. В.Л,Крвтов«ч' . v ? г ; • ;

t;-вацдцдат биалагячв^ктг наук Е.АЛ'умыевская

. ./доктор бволапгасяах ваукЗ.ОЛпа*нтвр , ч'

Офвщальше оппотавта:

- ij ■■■■

'Ч У S-

бяожшпесажх тук Р»С.Шакуаов У ' --Д : 1

льшй отэыв раОота направлена в Межфакуяь- •:,••"•'* • тетсхую хаоораторшэ биооргадачесяоа хишш МГУ '. /•;>•/ /У-.

■ '.'ViTs.'-í.' i'*",.)'<J:C- v,¡; "'-i i;'''A 1 ) - ' ', * - - ' У

■ . ' ; , Автореферат рааослиш''1' ** 17 * v'- ^январе " - -• -

; с ' ' ' ^ Flmarra диссертация состоится " 14 ["- ' марта - Íg74 г. • - \ 0.

. ' * \ ' '' ".- RA ^Or»*iTTOTTTww" TpaünHt ' Плмш Лпяата 1ац»ця1 Иигчпвм гг: ''* " "'

С дсссертадаеЙ мшсао'олттакоитггься в библиотеке йисти-

j?. .■■ii^i.^i-'j;: -■■.-.i!' v-VCV • ■" ' .-t. ^ ■".¡1-tj'. _

: л.;;тута. , , , ,, • .л ■ ■■ . ;;;,.cV

• V:;/ \ ';; - Учвявй о«1фет«фь • • ' • ; • ' о У-'4''

"jyj ■ . J" • AtrniipiuaiW ВДуК , Л','* ' ■ ь '

\ ; ' - I / ''. ^ (НЛЦЕьячеов) V Л

.: • ..-..•.•.л

y. ' '*;• Семена Ш^ПЛТ Г^^Т^НИИ* ;апбпй уятсшьяур -■■ . - •••' '•••.• !" д :. 'биологическую систему» развитие которой ссщювоидается об-' д чл V

ратимюии переходами от состояние роста и развитая к состо-. .V4 -у,'?. ". '.. явив ; покоя и глубокой репрессии процессов жизнедеятельности*'-и ^ _ : * V, В ' созревающих семенах ■ за фазой ' интенсивного - синтезам за- '. , ~ * V ■ м

паевых балков следует ¿период пониженной метаболнчесхойак-f.. y тивностя,. завероагпяйся почти •додяам прекращением обмена •- ' "V v>; : .< .<'.'. ' ко времени дегидратации сыан. При набухании семян в опре-. ч ■ VT .^делешшх'температурных-условиях метаболический покой пре-^-- ; ч : - ч ,-рывается и происходит, возобновление активного метаболизма.'■ • Л' •'' У~. • ;'и синтеза белка,-начинается рост s развитие. Биологические ' '/.v ; : .-'.'систем. с четко выраженными сдвигами з обмене, сопроводда-. ". /* ^ :Г-Д-' •. нцимся деактивацией'и актавадаей белкового синтеза, пред» -, : ..- ..*, . - 7 ставдяют бодыаой интерес два выяснения регуэяторных меха- - ' _ •''.

: " назмов процесса синтеза белка .в клетке, Одним из подходов . • . . -.' : к решению »той проблем» является изучение состояния а фукк- ' и. • v ; г. ; i 'пин рибосоиного аппарата в различные периода онтогенеза V.' t V,. î,. д ^ ¡ v.-^ï-./cei^'pacTeHBe. ..О/судьбе рибоссмного аппарата в период за- S; Ь

|V / вершения созревания семян а перехода их к состоянию покоя * \ *. ■ " "Vvi; a ó том, как отражается.обезвоживание шетоплазш клеток . . 1': ' V 'семядолей идя"зародышевой оси на состоянии, свойствах л ■ ,*"■. .„'-- • у. функции рибосом известно сравнительно мало. V

; . .-"'••* Талям , образом, вопрос о наличии и степени. структурной. . '. /> '

-, : К полноценности рибосом в сухах зрелых семенах растений ив-• > ' •".г тересен с; точки- зрелая'влияния-физиологического состояния.г - ^

'р"-.:-- -."•» организма или ткани на рибосшвый яппярпт.клетет»: в связи,, .. - • '. л;. ''"..;.-;*. с проблемой.потери семенами всхожести и .проблемой регуля-' 4'VíV'-'-'í' • -.j, цаэ синтеза'белка7при переходах от активного'.метаболизма

■*■■'* к CDKOP. , .. ;/ V ■ 'i- 1 -•.. • , У / „ S' '. .*

;. , / О Дятшпя. работа посващена исследованию рибосом ^рибосом- ^

.4,'них субъ«уоппщ, вкдвденних из покоящихсястада1,гороха ¿. '

£1шзза -ScfelTUa !>■ > • :íi.."УС,".'.-.'."L"■

■ ■ i

- Л ... - . *

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЕ ■

Работу проводили на сухвх зрелых семенах гороха pisan ' sativum L.'" сорта "Победитель**. Семена хмели КХЙ-ную всхожесть и испо:Еьзоватась 0ез кает)Й-лшЭо1фед8аритш1ьасй си^^^^^^^^: работки. '' ;ч'. . ■'■.■ '■■■;;''' V ^

. ' Выделение рибосом ярибосомных суДъершвш. Семена иэ- _ • мельчала в кофемолке до получения тонкой цуга. Рябосошвы-, *делклж в трис-стандартшж буфере (0,05м трис, ,0.03м, 1% s0¿, ' 0.02&I KCl, fft-, 7,4-7,6), содержащем 0,25м сахарозу. ХЪмо-гекат центрифугировали Ю мая при 6 ООО об/кин и 20 манЭ, при 20 000g . К надосадочвой жидкости добавляли трито^х . ч. ЮО до коветаой конценграции 0,5£. Рибосома осаждали цент- • i рифугированием при 140 000g в течение 90 мин.. В некоторых;.';"-случаях ркбосаш .шдучаш бе» использования детергента иш в присутствии дезоксяхолата натрия (ДОХ) в концентрата V 0,5^ в 1,0%. Очищенные препараты рибосом получали однократ--шшпереосаждением в.угловом роторе, а ер еосахдеии ей через -сдой 1м сахарозы н фракционированием л сахарозном градаен-'' ■'те.''' > ' ; ,. i'-.j ^ ■ ¿

- Г- Для выделения изолированных субъединиц использовали зональное центрифугирование в сахарозном градиенте смеси, суЗьединиц,' образующихся при диссоциации рибосом в 5-4^*-. ■" буфере <0,5м KCl, 0,01м % s04, 0,05м трис, рН-7,6), Гра-диентготовилинатом же буфере. СуОъедашда опагдяди аз '' соответствующих фракций градиента в угловом роторе при 60 ООО об/мин'в течение 4 часов. Большую суОьеданнцу, (БС)' дополнительно чистили от цримесей ш1гоЛ су0ьедашщ (иС) : ; путем центрифугирования суспензии БС.через слой 2м саха- • : розы при 50 ООО об/иин в течение 2,5 часов.Всв операции по'шдэленяи и очистке ряб ос см в субъедашщ проводили* при О 0-4°С» : ■_>;■

Из 100 г сухих семян можно подучить окало 130 иг рибо- ' сол. Препараты рибосом хорошо переносят длительное гране- • Hze при -20° без изменения растворимости и седшентаци- : онншс свойств. Замореливаше препаратов - субъедапиц yiya~ -шает жх растворение и увеличивает количество агрелрупв»-ге материала*11оатому субъедивида использовали для авали- ■

♦ V.:

за сразу после ; .• . • ' .;

. Содержание РНК в рабосомах и стбьедиюпуц: определяла /д.-

^ойитройптометрическя: ^Сштдн.ч19581: ; содержание белка - " по методу Лоури ( Ъожгт ) «• ', ' •;'•.' : V",;

1 Плавучую плотность рибоссми'субьедиетц, фиксированных 4% формальдегидом,;определяли методом равновесного центра-фупфованияв градиенте плотностиСвС!. Дня этоЧ цела ис~\ ■.■,'.,. '„-.'■.-' пользовала преформированныв линейный или ступенчатый гра--даенты, приготовлеяаыена триэтаноламин (ТЭА)-ставддртном ' ; '''■ буфере; содержащейЧЯ формальдегид. Плавучую плотность х

растворов СвС1 и вешмуедах частиц рассчанивали по соот^ ; ветствуицему.уравнению ( шюеглй. Неаг«, 19б2)с учетом ^ "' '"■ V поправка ва показатехь преломления буфера, содержащего ...; ' формальдегид. - Процентное содержание белка«доделала во . ; ч . ^

амшфичесжой формуле: % белка*• (овчюашшв и да. 1969). - ; V..'.' - -.■-■■■■'■Л

г"' СедимеятадиопнмЯ анализ рибосом ж субъединкц проводили • \ ' • . ' ^ в шаштическоа у^традентрифуте.,£^ченняв^^получали ;- Л, " ■, экстраполядаёй коэффициентов седиментации к бесконечному . V -. ; \ : ; разведении иди центрифугированием о использованием ТФ-оп- ■ . ■; *; г V о ? гака, Седиментац^онный анализ рРНК. проводили центрифуги- ' ^

•V' Г рованием в сахарозном градиенте с использованием рРНК «и- • !. • : . вотшх'рибосом;в качестве маркера. ■■-'..,■ - V

Рибосомннй' белок получали децротеиттзадией рибосом Зы .,:■

. ; .ЫС1 в присутствия'4к гючевиш.( Ьр^'^аак.-ювоп, П965)* * \:

• ~Электрофорез основных белков рибосом и рабосомшх субъеди- ■'', ^ ? ' ' ниц проводили в полаакриламидном геле (ПДГ) по методу РеЛ- V

"■/.у-сфальда и др. (не1жГе1а, 1962 К Электрофорез кислых-.бел- '

" ЕСВ проводил! по ДэВИСу 196*) в присутствия 6м МО— ' • ; ' .

чевиди.. Гели окрашивали 0,2^-еым раствором амидового чер-, ного в смеси метанол - уксусная вколота - вода (5:1:5). ^ ■"■ г Электрофорез в ПАГ. содержащем Еодеоклсудьфат натоин \ .1, ;■'''■.-■>' -•-•(№). проводили по методу Вебера и Осборв(«вЪ«1-,Овоохп,л9бЭ). ' "Отдельные детали из работ Шалиро и др.(»сЬар1го ее -

Л» Л9Ь7) * Вхвла и Траута (В1ск1«, "¿г»ис, 1970>. :

- чДля определенш1Шлекулярного.веса всех вждтмх зон белков -

' строили кривую зависимости относитедьноД подиошоста 7 . : стандартных белков.от логарифма их молекулярного веса. Рас-

1 -"л

:■. ■'■.. . /'

>-/ ; Г.;.--

,. _ стояние» пройденное белюои, деленной ва расстояние, ;т>оа-'- ^ денное однавреиеьж».1фаскай, дает величину относатеаной г Ч. шдашюста. Зщгиш^подшдашстеа.гайдевше "дли;сИшгаввдЧ"^'-г зон рибоссы и субъеджшщ, использовали для определения их ,: - ^ ^ ■ . молекулярного веса ш: калибровочной криво«. -■■■■ "Ч^ ■ЧЧЧ^.^Ч V Аминоиисдотшй сосгая белка: рибосом: и; субьедащц: опреде-.' ^ЧЧ' * , дали, в: автоматичесхш анализаторе аминокислот' -Ч шдель ЬТД (Япония) ш кегодг ШтаИна и др.в*' •

■ ,. .РЕЗГЛИ&Щ 'ШЯЗЩЗЗВАНМЙ •

ЧЧЧ.-'- "л- Анадзэ пикроссвюыЙ аракщя 'Ч-Ч -о .■'

Ч Ч.;; Проведенный вами анализ мофосошов фракция клеточнох-о ' -

экстракта семяв гороха по:азал. что данная фракция тасщнсн Ч .•'" г. родва и состоит, из - свободных ГШ-частиц и быстро седиментп-: ~; •л ':; ругщето материала (рис 1,2 а ). Полная сшшбвлазация этого '; материала и отсутствие. прироста лпт.т.п^, в области■ сво- ' *I оодшх РЩ-частиц после обработай «ифосшвой фракдоиде- , '.Л* „. тергентом свидетельствует о том, что' быстро седамевтиру®-'1.'' "Ч ' .

■ ВИЙ.материал имеет лихюпротеадную природу, во не содерэдт '•"'Ч^ЧЧ освобождаема детергевтом рибосом, обычно класснфкдедо- / ' '"-Ч .

. мах как "связанные с м€м5раыами рибосомы*. Анализ фракцаи : ' структур, оспждапзгсхся в интервале В ООО - 20 ОООб , так-. ; Ч ^ лее. показал отсутсвие в ней освобождаемых детергентом-рябо-' ^ ' / .сом. - Таким образом, вам не' удалось обнаружить: связанных с -'^Ч иекбранаыа рибосом ни в шароссынсД: фракций клетки,: на' эо^:^ ;\Ч' фракциях, седимевтируюсях при более низких скоростях. Как-;» \.Ч,

• росомвая фракдая меточного экстракта сешв горохаЗв пери- *^Ч.Г од покоя состоит из свободней: РНП-частиц и большого воли-Ч;0 ■''■У'-Л

• чества мембранного «ютериада, не содержащего .рибосс* дредставлппсего собой, до всей вероятности, фрагменты гддд- ' '•'Ч- ' ;

Я них' мемЗрав'гретакулуиа.; '-^Ч "Ч '^"У'1'; ' -

^ Седвиевтадисыный'аввдиа РИД-частад и акстрвд-/ '' ^

'.те и в препаратах рибосом различвой ст2яевв очистки (рис ' Ч' -Ч .4/ ' .2 а,в,г) показал, что они.достаточно гомог'еиш и представ-'. • •"леш в основном часящамя с коэффшиентами седимантагоа ' : ' Г •' 73-76й ; Пстатта'обнаружить кдцшзиеяты>^п»д^'рдтнх7гШ,> ' '' ^ •: '

медленнее ядя с^тред 'гтазатого юасгонэдта^ сдазадасз» ма-; , - • .

лоуспашо!.. ч •.••• "••/•; - ; г ^ - > '. ; ч ;

.'. Высокое содержание связанши« с мембранами рибосои вив-"• '/.

. • тенсявное развитие, грануяяриаго ретикуяума' характеров 'дяя ' ' • .. ' • С

V клеток,-;осутествляпцих секреторные .функции. По даяния 4

" се-V

... ... .

..-.-.... - ..... _ . . .,-...,.. ,-л-. ■■ ';■■■ V,= • • ., vi

t . электронной шкроскошя . в клетках1 запягдгтеЙ ; аарешаш te- V -, ;; . • • мядодеД- потаденае гранулярного'ретнкуаума с пра- ' : .' ; '

крепленными • к мембранам ркЗосшаш совпадает по ; времени; с ;

'■;} '.-У.Склетк^сшхается. Ко времен» дегидратацижсешш груОый ре-

i " : ;такудум постепенно фрагиентирует и:почтя полностью исчеза-- / vt^-K' ■.>■,

i 'er (вала, мвгс^, *. )» а здетгтрошо^шютннв.частида , , ; V /

< • • дибо совсем не просматриваются а ддтотшзие теток ■ ( далА, ; f, \ ; v ^ , vV ;

Marker, /»966 ), либо наблпдаятса в виде' свободнкх часпщ <;-./ ' ' ■V^ y.'';-

(Briàxi^ etTu/.,. тДО)« to нашм даввш в клетках ce«s- v " . j • ч'-^^.далеЛ поюэящхся семян гораха;система грубых мембран рети-

стеутстэует'и все jeöocae^ аададятся в --л'\

. свободном состоянии*

"I *

■ ■.■■'^'vfr'-;. Действее тритона х ТОО »• дезотсяхолата 'у .i.y^'v

■ ■^■•■■^^^'■л'";.'^- натрия на m6oe<mri catsatjnpoi& ■. ■*,■' Vj ;

® Ц^^ дучае-^ очвстш рш^оссм от меьвршшсс.затрязве- • . .' < '. нлй целесообразно сйио использовать, обработку клетсгшого .. v -:- :1;-^.

. 1 экстракта ка^т-либо детергентои.. Тритон хЮО и-ДД в V. • v ' '.ц'- оданаковоЗ мере хоршю солпбвдшзвровали мембранный кате-:_ У;' V^. ряад.: Оадаако;необходаш Шда"увере1шость^ что, исаояьзова» : > л -, V-*. • : ше детергента ые.вдегчег за собсД изменения в дарактерис- - !. • ■'Vv^V .V" .тиках жсследусшх рябосш и не становатся причиной : асттв-у -

ления яаяих-либо артефактов«''В.связи с эткк бсш> оровере-*'.• • . • V . 'ш д^ствае увдзаншлс детергентов на щбосаы семян ropo-"v-'í ;;' ха^ На: освованхи результатов, > 1федставлепних- на ряс. 3, ^ S-vV^','1

мохно сказать^..что'JCEty• в протиаогащштпсть.тратоау, ж- - ^

г'. fWWftT ИТ1РИМП»' ггвпДпт» junVwrm, : . кV' "

' ¿^ЙЕтщдащыа аналиа ыеточнаго; obpa-^-'" ,

* - «к.. - :.',.. ', :

V .к

■ ; • ' -Л': -

* V- Р110 I* Фракционирование в .сахарозном градиенте макросом- '. ' ^

' V * - - ««глм* -»._■* . С пал/. V1 —Т* с___"'" *__"____'___' " • •__' •• г ■ : 'А.

Л1-''.:

детергентов на ~;;-у... седамектагрго ри-. -■■ ■1 ■ >/. ■ босом-в аналлти- '- - ' 'ческоЛ ультра- ...:■'. ' ".", центрифуге ■ -'

, а)рибосомы,' " '; :

- деленные' с. три- .ч ч"- >';>.) тоном (верх) и V-. .'-'.""'ч "--

- без детергента ■ V- г-

без детепгента '

ШШ Г:: :■ ^ П '; «етгб) '.;: & I #

" • ч" V '. 'V - '

в)нег • '. , .

'седо, выделен- . [ ше е ДОХ; в)не ■ прамытне-рибо-■

-■„' сош .(верх) И/ ■> >

тот яе препарат " % ' * •'•• ' -после добавления ■

_; ДОХ перед эапол- ■'.

" ■ негаем ячейки ■■*'"■ > -

^';(пиз); г) центрифуга?. 20000 к (грубый . экстракт) (верх); -тот-же препарат после добавленгя тоитона (низ) и д) •

••УЛ-;-.»"

■.ТОЙ1

ЛОХ перед заполне- --1,-ниеи ячейки. Буфер всюду 0,01м трис,"

. ..________А : 0.01м Концепт* • / ь '

•. || ... , . I -рация, тритона и. ЛОХ 0,5$. 37040об/кан . 1 , : 1 в "а";'42040 об/кан в' остальных слу- %

; .*' .'■■■ ' •*..'•.. чаях. : . .Ч"^--^--'-'^-'^'-. " ^ .

. ■■;■'■■ : I I

'■ l

Л*'*,

- s ; ^

I -i /

i; ,■ . -j Л1"-

liiV. ; "

■ V-' ' ■■ Í

. . - ' I ' Í ' > ,

■V;í С

'У - v.

- t • - •'

iV V

■V' ,V

"Ж i.'

;рис 3. Влияниедетергентов, на седиментацию непроаытых

рлбосга« в, сахарозна*,градиенте , ; ^

А» В- без детергента,'Б- после обработка ДОХ (0,555), ' Г -,после обработка трзтонсм (0,5>). 0сталыше условая, ^ как на рис Г, Б. - .•.. ' V-,

ботки его каадамиз детергентовЧрио 2 г,д), атаете анаг,-.. ллзпрепаратоврибоссм, выделенных после такой обработан-' '■ . (рас 2 а,б) а'аиа^з робосом,.вдделенннх без детергента, [но обработанных ДОГ перед опытом (рис 2 в), подтвердили первоначальное наилвдение и показала, что ops обработке ДОХ цршсходат'дассоцяащя рибосом на 2 более, легких ком- . 1 понента. В условиях стандартного буфера частичная диссопи-

- arjirg TKaftCTpnTtÁTTHUY'pwrtfwñM при тг^р^яи-ррягртг

ДОХ - 0,25&, полная - при конаентр^гли. равноЯ О.б^ Ни- ' каких видами: изменении седимевтащошшх свойств рибосом .при'обработке их тритонсм обнарухено не бы^ Складива- - ' -доов впечатлениечто тритон".более нейтрален по отношении • к исследуемы рибоссмамнможетбить использован ори. ах , выделении.' Однако, _ используя тритон upa; '/«делении рибосом, ш во кногиж случаях контролировали возможность его • влияния на' ьослсдуеш^ рк<5оссш путемодаовреаенного, анализа . пр~епаратов выделенных без обработка детергентом. Это да-; вало возможность избежать* с одной стороны, артефактов при исследованцясвойств и состояния рдбосомвпокоящнхея : сеиенах, асдругой стороны, асследовать более детально ; действие тритона нафизнко-хшогческае своЗстварябосом.

М V ' ( : > ■■}'. V ¡V " •■ .- • V . . • .-I " • ; - • . . • . * . , • ,1 . • ^ „ • . •

■^ЧЧЧ.-Ч Ч<Ч ;Ч"' ■■■ . у- Л'.:у-.-.-'^.-г";- .• -\</лЧ -г>.<

'-.Ч. -X¡.-у,-''-'ч. чч. -Ч ',• ••.Ч--;-.ч: Ч ЧЧ-¿.ЧЧЧ

- :: - : л - 'у -- 10 - ;

' ^ • ;Ч Обнарухенаня ва«оГч|вствятельгость рибосш семян горен- ЧчЧ' ; • > - " !

ха к ДД деляеткецадесообрачти использование данного де-;. Ц '* ''.: Ч тергента в целях лучшей счистет рнбоссм,' но представляет У О-несомненный яятерес для долее детального иэученаг хщ)ак~ ' '

. тера действия жеваного детергента на растительные рибосо-Ч/•^/Ч-Ч: ':■ • км. НпгШдаашя наш/диссоциация свободных, ве. связанных.' • ЧчЧЧ Ч ? • . ' И Р' шмбранаии рибосом; сухих семян гороха при обработке их . - * . '•''.-Ч ] ДОХ.вряд ли.шацвается простым поналенаем содержания М^Ч •' - ••'••'•

V-! ; ; ® инкубационной среде в результате' связывания ерт детер^ '-Ч V!: гейтом» П^ концёятращв.ДОХ 0,5-0,7£ (0,012 0,018 к) '•'' л ■ " 1

. хавизк действия детергента _ва* р^осаш'остается • вёясш^ V . ^у в требуют специального изучения. Наиболее вероятным мео^'Ч-Ч Ч^'Ч'Чч' Ч том действия детергента на рибосош является белковая Ч ;;. ,4 х'' ■ белков рибосом этому вон- ; : % • " Д'

Ч УЧ. росу! уделялось: рообое. внимание. ' ■ЧЧ Ч ' Д-:-у''/ /• Ч;: г? V

Ч^'Ч-'ЧЧЧ:' Ч^Ч^Ч Ч' '' • ^Ч'ЧЧ.''

ЧЧ ^'-у т. Ч 1 Об спая ~ характе рицтияа • рибоссм " V Ч Ч ,, ^! / • '*-'-.'*

;Сед>м£дтащк>ннцй анализ.Ш1-частид.:изолированных^из" Ч;'- Ч-Ч^-сухих семая гороха, потазад, тео они весьма гомогенны ,» : ЧЧ: ; ; . Ч/ у.^;^ (рас 2а), имеет конставту. седамеятада'равную .79 ед. Свед-. • :'•.Ч,' ' ; ,' :,* берга (рис 5) и могут быть отнесены к классу 80з , рибосом.' , * . / • ;^•'.' ИЖ. исследуемых структур.седшентирует в сахарозном гра-;; • ■ •

:. даенте'(¿як; 4) в виде'двух рРНК высокого моле^шгрного . -^'Чс' 'веса,'ота из которих ваоюго легче тятелой ^ЯОС ¡г %\ • рибосом," вторая хе близка'по скорости седиментаош к Ч--.-'

рРЯК.^^Таким 'обрайо*,":"ИИ-•;: : пичвой р!Ж ^датодлазматячесюкс рибосом шехих растений. : Ч/ Ч' На'основаяии этого мЬ«ш>.сказать,,что.изошрованше^ <,, ;-г;

с . -у. сухих; семян' гороха РНП-частнпн представляют собой цито^ Ч'-: .- - г, ~

; »'■.->'..'■■ ■' ■ " ■.■■-а ^^ ••"■•••

■■'> ::'.•'••.". ' . • II.,1 .• .'*■ < * •>■ ■ > '■..■■■■■■■ 1-,. V-. : ■■■■ ■ ' ■ ■ -г-. •• >...

/.'•?/. * • * •; .V : * • '. * Ряс 4.'Распределение в гра- '.ч •'• •.> • •.

■ ■ /Д , ' • i - ¡-г дпентв концентрация сахароз' ■

I ^ /II , .-' аы РНК рибосом семян гороха ./■■:--;;.

■# к ;»| • • ' - > (--•-■-) и РНК аиэотних •'- Г "

/ М IЛ|, ' -г- рибосом —-•). - >

{• Ц.'Л • * Ротор : гш -50 центрифуга'. ' •

I* И/И • СКБ-60; 50 ООО об/ьин! < -

... I !. 11 »1 *. г -2,5 часа; градаент С-20% ' ••'* ■ :••..

I X Н-1\ | '4 ; на буферех т-ацетат 0,01м, С * г'

п Т I /Л/~ »\ . : о,1м. 1^5,2. V.';. л.^-

- 0,1; ../ V I V . рибосалы в0,6> додедал- .■ .• ' * ■;

Ч". -V . /, .Г. • \ /™\ . сульфате ла на том та буфе-.* ■',•

'^■^-■■■л-'-Уу- .' ' - - у-.9- ре. .. . •

¿л:? ■

, ..'Л >

•'-", г. * •. г

.■.'".';' V - ;/ '*' '' ":Ч "Г/"V- ■ \ -V -л'

^ • Рис.5. Загистаюсть коа$^п5»еытов седкментадаи ., ' "■гЛ. '

^ ; ОибОСОИ,' бОЛЬООЙ.»1' 11аЛОЙ *суб"ЬеД11Н1ОД от ■ • '

^ . ;, .•'' концвктрадш; ' Г. ' '• •- '•: ; ' ;' • ■ ■.'

^ /У'.-:

* ■ : Таб.ттиття Т '

Характеристика препаратов рибосом,' 1

".' очищенных разными способами - • .

О

■У "; >

Способ очистки : Щ / :': '

'-.У/ I. Рибосомы, полученные. ■ ■ . '-*'■•*: ■ >:

Щи 140 ООО е ' - . 35 . ' 65 - 1,7-1,8 .1,40-1,60 ■

■ ■: 2. Рибосомы,/ полученные '■'.■-. V..". .'. . ;

. при-140 ООО в ,. промытые . .-- . --'. ■.:. ,■.■■■'. -.:

• ' , однократным переосавде- ■■■■ - '■;. ^

наем при той же скорости 45-40 55-60 1,9^1,7 1,70-1,50- ..

; 3. Рибосому, полученные :■ \ ■ ' .. : : : ■

■' . осаждением сразу через ■■■ : Ч :

:'V I м сахарозу : ;:-„ * 37 . 63 1,9-1,8 1,53-1,62 ■■",:

' 4. Рибосомы; полученные'.. '■:'''■■■¿У'

ч • ' • пря 140 ООО ей промытые <. ; ^

■ Л ■ . .переосаждением через .. : ■ „ -л ■ '

( . ; I м сахарозу - ' 48-49 . 52-51 1,9-2,0 .1,64-1,72 , '

'■/,'■■ " - 5. Рибосомы, полученные. ■' ■'--''"':'

■ при 140 ООО £, проштые , • : _-л.>.:

■ ■'->■ ■-.■■■' ■' осаждением-через 1м са- ■ -,; ■■.■-.':'■■*.!-■' .л; * ■.:■■

харозу а очшценные в са-- ^

V: • ^ харозном градиенте - 49-51 51-49 1,9-2,0 1,68-1,72 .

: IIШ : г :" ±.- V - = «-5 ! ' 'У 'I '";;

%......, .. . . _ 2?0 260 ЗОО . .'

:? ■ 1 - ■ ■.".,-., .■1 > . Рис 6. Спектры поглощения в УФ ■ ' ■"*;. / •

ные свидетельствует также о тем, что процесс обезвоживания - .';-■ Г' >■-.,' цитоплазш клеток семялдлей гороха при дегидратации семян >.. /л-^''

в период их полного созревания не сопровождается нарушена- - 1 , 'г.' ем компактной структуры ^рибосом вдавой-лабо деградацией ; ■

• • рибосомной РНК, ' Л -■ -' ^ ■..-■-■ - г

•'■'.-туг; V — .Ы - * ; ^ .„• - •••••.. •. : •-..••

. -''V' ■ ■, ■': ^ ' V,. !>■■ • Г! г-: ,а ; IV х . Г-л;.', -.с4 г .'<- : .■.

"ч : - -1. г 7 ,

С »л'У-:

Я:

; Л

^ 1 'у" •.

ш V V

г", л '* Г У

^ ^

„ .4 ••••••• < • '«V '

Ч» у- V- * ■;. .*

Уу'/;У 'л-;'

;у: . ■: '. .'л .

Г'-1

--'.."/Л-',--;:V

I-' V V и -'у^теЖгу

■ ■■ ■: ■* •* .. »--'Л-л.-1-.V- •

' Рис 7 г Распределение. рвбосш в градиенте цжотвостж V^'.;;'У У>

.-V. "■*. ХЛОРИСТОГО Щ53ЯЯ • ■':■'.-.-;>■• ' г. •/ ;

■.■^Л;',-!'I - рибосош,г шдытапюв без детергента,г -'."-V:-■ ^V.-

у ^^.Относительное содержание белка в препармах рибосом по ;. •.-; ( -V;'.--< мере очистка' постепенно уменьшается; ао» -дастатят» = уровня К-' . У-\У> £ • • \остается;.постоаншм в мшэ мекаетса щш'дальнейшем у.;.' , у; ; переосаждениа (табл. I).' Сосгшешэдида образш .взмет- ;;; У;- •• . ютея характеристика спектров погдосенвя в Уй и отоосотедь- •'У-.',; :• • /•• ,•• \иое'содержа/ае РНК^Очшаегшые препараты-давала в спектр, ' •

для рибонукдеовротеяда с максацрмам потдощендя ;;'-..у ^ ¡'У', ;' ■ около 260 нм и: мишшумом - при;* 235 ш к величинаю. ** 1 / '

/ • Е^ао л ^60 / Ь^дусоответетаешю".'ранними 1+91 - 2,00 и -

' / Ух,б8 - 1,72.(рис в), у.-.. :. ^-У-У,,;,

: При равновесном:оентрЕ1фугйраван!1И в градиенте олотноста ' -. .: •г ," ' '. ? > препарата , рибосом давали одну узкую полосу' в. зоне > _.'•:

'.; ^ ; ;плотностью: 1,545 г/см3 (рис 7). Поскольку распределение в . , ' градиенте,плотности Са& завискт только ат'.веаичиш'хиа^\ .;

] .

;; вучеЛ шютности, ■ которая: определяется' соотношение», РНЕ и;

■лг у ;-

; : п илптоттурми-г ттр^ттярятат, ^ тг>, _ЕДОТ-

•'У ' ~^кэстес£ анализ да<ет.возможность опредапать содержание ' У.;'';',., \ бедка я РНК а препаратах рйосш и ода1Мть степень.;гете- ' \ С;. : /1, ^ ^У- ..рогенноста:анализируемой фракщя;в отшашет-ж.состава вдо- . -> . ■ 'ддщхлв нее, чшипонентов^- Из шдучеишт' ааии результатов у

"' у! ' •' следует»!что рабоссш,.ат1Шр13ва]дац,аз -сухах се!вн 'горо^ "

у; У' г" : у : ^ У -У

* Г

^ ■ ■ \ ■ 4 ■■ '1

• • > — • ■■ -

• I. г ' :

' г'-Л.'-

;зса;'-" представлены частицами,. имеюдами одинаковый или очень близкий-состав» и.что относительное содержание белка в

■ них .составляет 50-5155." Величины плавучей плотности рзбо-

■ сом; выделенных без детергента и после обработки:клеточ-ното »кстрякта*5р1гтон1)Мг{коаечная концентрация 1%) сли" г. • ЖЕ (0,5% h;IS) оказались очень близкимии составили'со-•" ответственно д. ¿545 т/см3,1,550 г/сы3 и 1,552 г/см3. Это v означает, что данные детергенты в указанных концентрациях,

' но ушгагеятгг татай-лиДр д^етрптепНИУЯТрт гЬсдедувШХ ри6о^"\ CCM» V.■.; ■'■■■ ../:.'■.'.'■■' - ■ 1 :.

Сраетпгтедьаое изучение плавучей плотности: рибосом, ш-л делеяшх из сухих и прорастающих семан, показало их пол- . : ну» идентичностью/До всей вероятности, активация рибосом- " нсгоалпярята, которая - происходит щя прорастании семян, не.коррелирует с жоличестввнкша изменениями в 6ejmDBofi -у" тасти рибоссж. ' ' ,г - • ./Ч-Ч .:*."■ '

v -Из значен^

"(1,3 хЮе и 0,7 х 10е даяьтоа и относи-

тельного содержания белка, определяемого' по величине - пда-; вучей плотности,\ следуетг 'чт0 абсолютное содержание белка ;в803 рибосомах покоящихся сешн - гороха' составляем около ' 2 i ! Ю6дальтон. В . этой отношении исследуемые шзаирибоссь-мы сходны с рибосомами, выделенными из проростков гороха ; (;Phaí3 Heraa» 197дЛ Такие образом, присутствующие .' В I клетках задасаиаей даренхиш-семадодей в период метаболического докоя рибосомы не обнаруживают дефицита общего содержания белка, ' нарушения компактной структурышшдегра-•дадаврГНК'.,"' ■ ;-'■ ' -':- * >; ■..'..

:.;',:.*', Г Изучение процесса диссошадии /

^ - Важным биологическим; свойством рибосом," ; связанным с их ' /функцией, является способность, к обратимой диссоцзащш на: 2 субьеданицы." С: этой целью нами было изучено -'поведение . рибосом семян гороха в трис-буфере (0,05'м):%1) при пони- • 'женш-.кош1ентраши ионов Мб+; 2) при доведении концентра-„цни йонов К^ в отсутствие экзогенного магния; 3) в сале-

• ' • • ■1 , ■ ■■1 ^ . -- \ -1 '' • . ■ ■ 1 - , , . 1 : -г-г- *".-/■■ ч И ■ .-»■-■■-> ■ - ■ ! I л- ■■ < ■

/ I* гд ^ ¿й |I™^^^"'Вас'в Садамента-'

а)- ЮГ4« (¿V4 у : г уч.— '№» ч 0,05 м КС1 (верх) I Л • • 0.0005 м Ыв, ч. .- - > ' У*' У • 0,05 м КС1' (нлэ);У : '• • ОГО,025м и 0.05м у .'У У" ч : КС1; э) ОДк КС1 • • . , : • • У;"Л'У\ (веох) и 0.0м КС1 ; . •;У;-.У ____ . • (низ); г) 0.5м КС1< у-,.

'•„: • ..••• • .^'-Инкубасзя'20-сасов;. •' .Л • Г' " " ■ при 6\. Скорость У У-..: У ■.* ..Цвнтрифугпровадля•'- :' ••' • •; :42 СИ0гоб/ман. чУ",:' УУУУ.-У 'Уштетжал; съемки ->-.■-■' - ■■: . • . 4-!СН. л • . • . • -

■ >"1

V'"У/■'-А вам буфере (0,5м КС1) пршраздичжм-од у. Исдатана*е условия о^^ с тота зpeш!я;•cтeпeш-noл-' .. у; ноги диссоциации,' скорости седиментации,. соотношения; обраТ. ) •. ..зуицихс^ субъединиц и степени обратшюсти диссоцаацла.'"- / ^ ; Оги^залось, что исслецусше.рибосош устойчхш/в среде сЛ 'ш>нцентраще8 1)%>, равной 0,0001м (рас ва)» Очевидно,для. ; ;V';".;;'оохраненил^пэучаевлых; рибосом в недиссодаированнсм состоя-

• С •' ним ^ необходима достаточно нд зкая концентрация в среде. ^ \.;• .; Это свидетельствует о тсм»учто сродство.субъединац и проч-. ■.. ¡-.^ >." 7— : ность их ассодаацац.в исследуешх структурах значительно . ^

г;'ваше, ■ чем в бшетериальных рибосомах, и что изучаеше ка- : .--'ч''-. л. ма датоплазматчческие рибосом* растений схода: в этом от-' •' : .ч-1л-' ношении' с 'другими рибосшзми РОв класса. " / .''л ;

; !-:!;у ' При полном удалении' экзогенного магния'- в условиях низ- - •;'

'• . .' . . <ой ио.чиой силы,асходнае 80а рибосомы полностью исчезает' * : Су

* (отс 66)1 Обсазташаяся пои атом гетеоогенная1 смесь села- ■■:

. в данных условиях продукты диссоциации:оказывается неус-

тойчивыми' и. прстерпевапт: различные _ структурные; превраще—г >. ния^ Повышение концентрации одновадентных тагаонов до .0, 1м

Ч-Ч?.' * , ' - .

^ 1П. * ■■ ^

' О ...

J. i ■:-■■ ■ rl>

^ - ^рИЙЩаа ■ " » -, '}/'■' i'-

--j V ■.

V-f.V"-, -Г-,л -, 'Ii "

-¿-¡iv-vVp-,r ö 'СсЁшентапш рибосш по

ШФШШ.

Ж .ШШГ • • • . , • .

-..;. -i >. ._-..'(■■■■.■. ' • " >'•'! v-;Í.Í Гт; >''■ Ч' "Ч*

... ..oiri^omiu Я П flFlM У.V .'. '

-O.iiM КС1-С1ШЗ); иккубадая в^ X is'n.en .1 ;чйс;np-i..2C •.Д ;. -.Чу.' • -.-VL^^.^VeV ствбихизяггшпее дейсг- : •

-^■¿■„.^ • /-я" "сявбдлмздрутее дейст- .....

' - вие»: во дисооднэдм .¿¿я•,этга* становится.неполной (рис 8в • ; ;; ^верх).;Дальнейяже:подышензв ионов К* до 0,3-0,5м приводу / ;7.;; , полной диссоои1щш!, во становятся критическим для стру*- - ; * л ' ftfipn?угтт'у™1 ". чем свидетельствует 4

f ноаенае двух компонентов *и появление продуктов деградадаи ', '«. , .

■V'ií,'"..Í'-j..Ч ■ J'! • •

- "i - ■ ; Up,i--':.- "...■i1-:' ' ,- ■ . !■ 1 r ^

и..-

"-Н

■'■. I .■ ■'О, ■. .".: -..:.:-■ , ■. ■■. -■ ^ ..у, " ■ ,.; '. .2' ■■. - ■ .*■■■ 1' ' - -.г V , ■

:';. (рис 8в низ,: 8Г); Введение ионов в солею®; ; > : .'л оказывает мметвое влияние ва яросйсс дасссоиацяи.ж твре»-^ ' ' '/Ч::-.• '

. V" 0,(Ям не*препятствует ладной джссодкапси рхбосс« в о,5м-; :;. КСХ, но недостаточна два сохранения стабильности субьсди-; ^ •'. •. ющ (рис 9 г).

-Ксшцентраош'^аше'

0,01и в том жесо»- .'¿к ' аом буфере, др-Еддзвсиу.4 является удовлетворительной дне •. .•••''..'

поддержания структуры суЛедвпщ, но недостаточна дет ,< V'достижения полной (г^^^.Л!").. '•,

ря-йнйй П,ПТц, лттас^ртД тута ДЖССОЦИЙЦКИ'-.:. V

• всследуе»кх рибосом в 0,5м ЕСХ. В '»тих условиях рвбоссмы ■ . семян гороха быстро полностью ж 'обратимо десесшдрурт' на ' -> ^_- 2 субъедышш, седциентирудяде:о коэффидкиттаии 51—54в" ^ у-и 31-34Б(рис;9 а,б) и.нахададаеся в. соотяпшешги, близком. :;,:^;\ К'теоретическжу. Седошентадиояшгй и длотвостной;анализы'; г ', .показали, что субьедавици, образующиеся в 0,5м ЕЛ при''* '" 0,01м • имеют константы седиментация 5в,5'и 38,6 ед. ^ 'Сведберга и, следовательно, представайте .собой тшшчш*е о для 80г рибссом 60& и 408 субъедивиш СрисЗДО );:'что ' •• »', величина' плавучей олотности исходшх рибосом, а, следова-^ ..•*.;... тедьво.к содержание в них белка,' складывается из величин' ч .у плавучих плотностей состявлячаих ух' субъединип. Это озна-. '..чгчт, что ;весь белок, арисутствуюиий в;80э \ рибосомах, об- Ч^Л

наруживается в 2 субъединшшх и,; следовательно^, двссодаа- К""' •'.' . У ■^ч'; дая'.рибосом'не сопровождается их депротеинизасией. Таким' образом^шавленле условий ддссодаадаи показало, ; что' ри- ; • ' • боссмы се»яв терох^более устойчивы к диссошпоии, чем • " ' •. ^ ' ''•" А •; :.. ;.''. бактбриахьяые 70г рибосош', во дегко диссошшруют в со- - ; V-"* ' ' :левом буфере' с 1^;.что полнота диссоаяадги! и стабильность . ^ .. '.образующихся строго зависят как от 'абсолютного

Л,': содержания ионов К4",1 так.и от соотншения К*/ А^Г в ереде.. : :; Способность' риб1жсм к обратимой диссоциациич свидетельству-'. • •. < ' ! ет в какой-то мере об их структурной полноценности и'об. ;. -.^: . ¡ 1 . 'г ' •'итсутствии явных дефектов в области контактирующих участ- \' ;' ' ^^^

экстракта 'детергентами

■ X . t- ■ " '

Т • ; ' i'*

У:-'1-"

■-Л". ■

'vs-.-/ 4 ' .

• Í.s; " • i

/ \

' v ' • " л

-' ...

' = •>:■: .■ i'' ■ i

Рио io V. Распределение;' С/_-> ' рибосом в рнбосомвых. :• '•'. V оубмданиц в градиен-г, те алотыоста хлористой . ' • • го цеэая •

у Д'г,'.'

'. ,j i4.+. ■. * ° ! -.^ ■

на способность выделяемых при этом рибосом обратзво дассо- . , даровать в сааевш буфере о ч наседиментациопше и . ' • /-'.'.'• шготностшв характеристики обраэутаихся субьедиииа. ... :

Важно также отметить, что в солевом буфере с Ы^диссо-* . .• •', цвацая рибосом, выделенных аз прорастающих сеыян. гороха, ; ' ' .' всегда была неполной. Таяим образок, в отличае от рябосом " сузих семян; которые весьма однородны по своему поведению J г: в укяэанвнх.. условиях». популяция; 603 рибосом»-..шдедяешх ° Ч1 > из прорастающих. сешщ,в этсм отношении была тетсрогенна и . ;

. всегда, содержала-дояр устойчивых к диссоциации рибосом^.'; ; Исследование Цроцесса доссовдациц" животных 80S рибосом Ч показало, что в солевом буфере с jreiro' íKCCoc^pyBT .';'}?■

• ■ - 1 • s

■ ■;■ ■ .V .;■ ■

. t

Г - Л', ■ ' -. Ч

.лишь те рибосош, которые >закончили■трансляции и свободна от кРНК а вептидил-тРНК. Транслирудцае рибосомы в этих условиях-стабильны и для своей диссоциации требутт предва-; ратедьного освобождения от мРКНи синтезируемого пептида' ; (lUtrtia et ai.у i969j Palvey, Staehelln, 1970). Различное ' отношение. ахах двух видов 80s рибосом к условиям диссоца-■ ации может быть использовано'при ссютветствугоях условиях для оценки доли активно реботаших рибсюом и для харегтв-растики имевшегося пула 80s "рибосш. Обнаруженная щми ,: способность рибосом сухих семян гороха легко диссоцвиро-, , вать в солевом буфере; с: без предварительной обработки пуромиданом щш^цреаошдгбадаи в ' беислеточной системе угае-энвает на то» что данные рибосош свободш от «РНК и синтезируемого пептида! Это даетосыование полагать, что в клетках семтдолей при созревании по мере завершения синтеза специфических i запасшх белкови постепенного.перехода' семян к фазе.покоя создаются условия, прецятствупцие инициации, но не алиетпие на адонгацип, в результате чего :. прсжсэсодит накопление закончивших трансляцию непрохтаюш-ровачных рибосом. Возможночто. накопление; недрограммиро-' данных рибосом в ■ определенный момент онтогенеза семян pao-тений может иметь физиологический сзшсл и играть опреда-деннув регуляторнув роль прл переходаи я»т"Н"У метаболизм - покой —.активный метаболизм. ■■

•. . • "Шделегде и обдая характеристика рибоссмнах'

'(■■ ; '•••': ■' ".стбъедигош : '.л

V-.V:" Для : дальнейшего исследования субъединиц, в частности, для сравнительного анализа их белковой части, для изучение их седиментационных свойств., необходимо было получить препарата максимально очищенных изолированна субьединиц. .Л *;'. Важныммомевтсм в;получёюп* субьединицрибосом вукнриотов .является'выбор усдовий ддя достдеиия подвой¡ диссоциации ■... свободных от мРНК и .'пептидил-тРНК .80s - рибосом. ; Поскольку такие /рибосомы при диссоциации находится в состоянии рав^ -' новёсия с образутаимися^ суйъе®ивкцами,г то' сдвигая равнове-

. Л * > ' '

4 •.'. л<

М

РвсЦ:. Др*"д*ондрота1Яв •. риОосшшмхсуОъедшиц в -сахарозшж* х^адиеяте>у у'-.- -

29 Л:

рршщции

' /

•,л

ШМш

__I скорость! ___

I Зфоза^б^з^6»?!^^ бу- < " фбре*

сне в сторону дассоцаадии, можно легко перейти граащу'ус- '¡у

■ тойчивостя 'субидашиц и, достигнув полноты' диссодаащш, -оо^ууу лучить при эта» структурно измененные (развернутые шш.де-^ууу;

' протемшзовавдае) сувьедияаш. Из проведенного вами ассл*- * У. доваодя процесса дассациадог. рибосом с«шн:гороха, и из ана-лаза некотормс характерно так субъеданиц," образзтанхса в со-* ^ -у 'левом бзфере с м|М0,5м КС! я 0,01м следует»;что? .''^у Д-

полная дассоциация в этих условиях протекает без-потериу :' • , субьеданиоамк белка,что субъедаяицы сохраняют свою ко»-^ •

■ дактнур структуру а способность к спонтанной'реассодаадаа, у ' приводящей к образованно 80э компонента, надомииашего по у^уг своим свойствам исходные рибосома! Это давало основание 'Луу • •

усчитать, что указанные,условия'дассопвация являются'вполнеУ-уГ,.

удовлетворительными и могут быть использованы для выделения ^' ''изолированных суОъеддшаи'Следующая задача.заключалась в\у^ . тел*» чтобы "избежать взаимного загрязнения и деструкции суб-ь»у единиц в процессе выделения, от есть:при'разделении•и осах- .'.' - дении. образугпахся■ при дассощащи частиц» Седаментацгов—./ '>.-.. ний анализ препаратов субъеданиц», шделешшх из'соответст- , ; у'вухдах фракций сахарозного градиента Срис - П) ■ показал .от—*у у' .-,?сутсвие каких-либо;прамесей в препарате валой; суйъединнда-/ ' (ЫСГ) инадичиеде£кого компонента: в препарате' большой еубъ^Уу ' единада(БС) (рас 12 в,е). Анализ РНК.:указанных препаратов \; ;. •

1 ' ЬУ

л:..-..

"ШЁИ

Ржо 12. Седнмевтадая t - единад в аналитической

. . ч. 4 - ,

IÓOCOH исубъ-цевтрифуге -

и" >«

в

Ыа-аце-

м-

■ vJl

татном буфере, содержащей 0,1« маСХ я.0,5« ДЕЯ; ej ЕС в К-% буфере; ;■"*) ьС после дополнительной очистки;- ' * ,

з) ВС, обработанная ДСН, как в "г* и "д"; и) ЕС (верх) и -' до (низ) .после диализа против K-Mg буфера 20 час при 6 ;: к) 1С (верх) я мС (низ) после диализа против трис-буфера, содержащего 0,025м КОХ и 0,СХ)0Хм % БОл; л) БСГ(верх) и МС(низ) после диализа против стандартного буфера; ■: м) (БС + 1С) после диализа против стандартного буфера» ' Спорость центрифугирования 52040 об/мин и интервал сьемки 8 мин в "г,д,э"; в остальных случаях - 42040 об/мин; - ; \t-1&-2I0. Скорость седиментации шр&кева как bWf2o*

содтвердал это. наблюдение и показал, что легкий компонент в 1фепарате ЕС, очевидно». обусловлен примесью ШС.Додолвд-. тельная очистка препарата ВС дала возможность свести до-.; . ^минимума примесь в нем Ш (рис' 12 ж,з). ■ .

V-V Определение констант седиментации изадироваяшх субъе- \ датщ вутбм ■ аналитического уяьтрацентрифугнрованйя с использованием УФ-оптики дало.величины 39,7 я-58,9 ед. Свед-берга'ддя МС и; ЕС соответственно. Эти значедаяочень близки к результатам определения констант седиментации субъе-г' диниц,' образувдсхся цри диссоциации рибосом в солевом бу- г

1 ■ ' " ' Л V '

^ ■■'У

-f

- s.-

'г '" ' >'■' 1

фере с U^"

: Изучении________________—, _ _

дачным"" содержанием К*.'и Ц^*" потачало, что обе-субьеяигпщи

Изучение поведения каждой из субъединиц в буферах с ■ рэз—1 ;...

'..< . • - одинаково устойчивы.в солевом буфере с М§+(рис.12 иК.В - . ^ ^■Лг!.;.', - ; среде с шзкем содержанием К* и м£+ (0,02бм KCl и. 0,0001м • • ; ' ' ; ' ..'. .м|+) субъедиимда неустойчивы. БС обнаруживает при этом тен- V -

• денвдю к образованию медленно седиментируппей форм*,- оче^ : • : ^ : : ' видно, за счет нарушения компактной структуры» приводящего . '

-VoV^'i • к разрыхлению, а MC - к агрегации - (рис 12 к). Повышение : /^V ; . *содержания :до 0,005-0,01м стабилизирует• БС,' но способ-^ \ . ' ' ствует дальнейшей агрегации;Ш (рис 12 л).'Таким образом,: 7;.. У • • ясно, что использование буферных систем с.низким содержа-. ,,'... ••'.•'j' 'нлем К*" мало пригодно для шделения- и анализа индавидуаль-г';.'• • ■* , :' ных субъедашиц, так как в результате изменения седимента- . - • {•'"'. . * ■-*'.' • ' - ционных свойств может происходить коседиментацлякомпонеи- ' V.;'.

' . тов различного проаохождешя.. Далее, подтвердилось преддо-'., '-■v^'i.. - ложенае о том, что сложная картина диссоциации рибосом го-^л• . ( ' роха,- наблюдавшаяся вами в условиях низкой ионной .сшн бу-» -•"• фера, обусловлена нестабильностью субъединиц в данных ус-'-. • . ; . . •, ; ' •■ ловлях я изменением их седаментациоышх свойств. V vV "■'*', Т.

i':. . Изолированные субъединицы,: взятые в отношении 2:1, в ус- i ; ловаях стандартного буфера образуют один.кга^нёнт'о'коэф^-i^'V;;^;: » фяцяентом седаментоцхи 7S-77S - к, величиной, плавучей плот-' •• ■ ■ 'V: ' ^ ности равной 1,545 г/см^ (рис 12м, рис 10). Сходство,ха- '' ' ';'■•■<:'•'>'7' рактеристик данного компонента с характеристиками исход-V

ных paöocou дает ос1»вагеав*счатать ето продуктом спедафи- .

•Д.,';:'• : ческой ассоциации. БС и MC. " ' ■

':''■> ■ Из кришх поглощения в 79. (рис 6) видно; что" каждая из • V .:. субъеданиц имеет характердай дня. ИШ-частац' спектр. Срав-^ j ; vviyvO.v нешв этих спектров показало, что одна из,характеристик; • v 4 ' ('.Eggo/ £235 ) у них различна. Это давало основание пред-; Ч. • i;^;'1";." ^ полагать различный уропспь относительного'содержания белка.: '. > ; в 2 субъеданкцах. Действительно„проведенный намя'плотност- '' •' . ной анализ показал, что изолированные субъедашоз!; разлцча- ■'■

втся между собой по величине плавучей плотности~.(р:тс. 10) и, :.', .• . . ';/ следователь^)» по" соотношеша) в них белка и РИК^. Содержа- '.. ,. v .'

■. вие белка в ВС а MC равно 46^ и S4£ соответствегаю, чтог .•'■'; •у'.'; ' :' составляет 1,2 х106 а 0,8 х I06 дальтон. Сходство харавте-.v Д

У /'У—у'*.

пслученныхдля изолированна субъединиц и - для, с<>-У ■■ '-/у. у У? у',

У ответстяупцйзссубъедаи^; образрвда^

\ ходных рабосом в голевом буфере с М§+означает,'.что про-; г гпесс;шдел'ения • не вызывает варушгная ах структурной цело- •; У'^" : "сткоста.'••••• .' • .■ //л,Ууу-\■■■,; ■ ': ,,<<•' •;. ':•* > ''у^'

.. Плавучая плотность в СаС1 в содержание белка в рибосомах у' и их 'субьедяницах; выделенных из разных источников .. ¿у-Угч^ ¿^''¿^Ьу;-;

1 . 1

--V Источник рибосом ^ : ^ |^ '"• -.У-: "V- ''''ч'У

ВеХа (Белицина и др. ". -;;у.'у ■..■.■.. уУ У-.У"-.^У-УУ'-.-- - •• ■УгУЛ-" ,,' 'V ' \У"-

:: гИйн^^'Т^п1"6 В0""' ' 1'55~1»56 49-50 2,45 : 2,45 /Л. ->у ; у ;УУ'И»;\'

. :.19Ь9)Гпечеяь крыс' 60 1,60-1,61 40-41 1,75 . 1,20 '.-■■(X; .V у.\ у^/

;.- (015пез, 1970);а0- ' 40 . 1,52-1,53 54-55 0,70 0,85. ....-'С'' . улУ^ У-Ушиная карцинома -л-у.-, = .-■:■«■■ -уу .'■■■-■■ у... ■. ■' Уу■'■ : ' < --У

': Семена гороха '', -' 80 - У 1,545 > 50-51 ! 2;00 . 2,00 уУ^у^'.-./

V-'-" УууУ'-''.* " '60 : • 1,560-': 48' -!...1,30^ 1,20 У ч' V . 'Л у.'чД;^' 40"- у 1,522 54 0,70 . 0,62.. ' ''У''-у ^''У-У

ГЧ УЕ.;1со11::(Оза<га,'' : - . А70 1,63 -.37 .1,66 , 0,90 ^Л ' ■"':■ у'^

1968, Тогшв, На1»- >50 : . 1.64 ; . ' 35 ' 1,10 ; 0,60 : , ; , у. л

1970) ..у, : ,,у'зо ..:;•. 1.62 ,> 38. -уо.бб • :о,34- .у, -. ^ ; \

• • П р и ы ечанне.-Приведенные 'значения молекулярных весов РНК взяты из работы Ленинта (1леп1п«, 19685$ содержа- : V■-..ние белка в процентах рассчитано из велиадны j'- по формуле ' ■ ^ - у.^ " -'■' '~ ■■'

■ '■'.'I у Вели, сравнить .полученные нами данные по субъединицам У у' . г.'/':"'.-;' растительных рибосом с .смеющимися в' литературе сведения-..• • ; . Уу :ми о субьедакицах про- и вукараотов (табл.! 2),' то можно /У' ' у' 'Гзамет1т." следующее; I) все 80б ¿¿босо»«'сходны ме*ду со^.

деления суммарного белка между 2 субъединицама:' каждая из ; -.Л субьединиц 70s рибосом напоминает в этом"отношении исходные рибоссш; каждая из субъеданип 80s рибосом отличается. , от исходных рибоссм го. отюсительному ; содержанию в нкх бел-'Ч ка;,2) внутри класса 80s рибосом наблюдается большое сход-: ство в характеристиках малых субъеданиа:" 40s субьеди'ннцн '_.. .": растительных и животных рибосом обладают равным количест-Ч' О вом HS н' одинаковнм - абсолютным и относительным содержави- ; ем белка;: 3) в характеристиках 60S субъединиц цитоплазма- у-ч тических рибосом эукараотеш имеются существенные различия: при одинаковом абсолютном содержании белка' 60S. субъедяни-цы растительных рибосом относительно больше насыщены бел- .•••• .ком, иэ-за более шзкото ыалекулярного,веса ее. РНК, чемБС';\: животных рибосом. Это свидетельствует о существенной/гете-; рогеяности класса 80S рибосом, которая выражается не толь- : ко в размере моле^л рШ^ в ссютаве бОз; с^едшяда. во и л-в степени насященности ее белкш. Таким образом, если первт ход от прокариотов к эукариотам сопровождается изменениям в параметрах обеих'субгРл*нид рибосш,.то дальне2тая, зволю- ; . цияэукарлотов.пс всей видимости, сопровождается,разшта-;;.-ем только 60s • субъеделацы» ■; ^

Изучение белкопой чаоттг щбосом и рябосокнях / 1 субгелиниц :

Для выяснения, структуры -и. фунявди ркбосошГболысое .зла— чение имеет.дегахьное исследование ее белкового кокпопента. В последнее года' значительный ■ успех достигнут, в изучегЙ!. -белков рибосом прокариотов- Показала вякиая. функциональная -роль многих рибосомных белков, Осме структурные.и функци-; овальные характерно 1-акИ щиоплатг'атических рибосом эукари—- ; отов сходны с характеристиками: бактериальных рибосом. Од— С; ^нако рибосом* аое класса отличаются от: бактериальных ри— ^ босом более высоким абсолютным и относительный содержание* . белка (2.00 х Ю6 - 2,45 х Ю6 место 0,9 х 106 дальтонов),.-Белковая; часть этих рг"5осо^ предст^аляет собой более слож—!

У'.7."* У У, У- :.. У. ■ - ■' У ."•*■',/.'У^Ь^'л-^

. .1. ную систему к изучена в значительно меньшей.степени. .4.'

■V-'* "л}'-:'. Анализ'аминокислотного состава:показал. что стадааоний' ,; -' ' ' белок рибосом семян гороха полноценен и характеризуется У , ^ ■ ; : У ^ ."типичным длявсех рибосом чертами: высоким содержанием оо- у

• вовшх и.кислых аминокислот, пошоешшм содержанием гдици- ч г\ ;

• : на, алаяйна, валяна и лейцина и нвзкзд - остадьшх'вмино- . •• /.■ ^...

• г кислот.'. Отношение основных и кислых аминокислот, без учета • / ; " : У ; амидов, превышает единицу,'. Значительных различий в амияо- " .' * - у)

У кислотном составе бедка рибосом н'рибосомшх субъедищц не У У"- ■У-.^у./- обнаружено. V' . 1 .У;"' ■ ■'.V'- '.."■'" . 'у..:' У'У-'УУ?

' ■ Элентрофоретическая гетерогенность. Белок в дссдедте- ; .'"-^-У мых рибосомах составляет около 2 х 10® дальтон. При элект- : : ; ,•'••. рофоретяческом анализе суммарного бодка рибосом семян го- ; * : I"-'г'У"У1у

; рота в полиакрлламидном геле (рисЛЗГусловиях кислой сре- .'■■'.■ У ¿¿у;'' . • • * да вам удалось наблюдать 41 компонент. Это указывает на .,'■-. ■ ; . уу-;

;,- л; высокую степень гетерогенности рибооомадго бедка, что во- '-' „ • ' ... обще свойственно всем 80зрибосомам. При электрофорезе в ;

трис-глицвновом буфере, рН-9,2, нам не удалось обнаружить ; ' ' ^

• какого-либо материала, соответствующего кислым белкам. Та-- ,\А -'¡"У-

кин образом, в растительных рибосомах, в отличие от риб»-" ;Л

"•'1' • сом прокариотов,• кислые белки либо совсем отсутствуют, 'ли- -■ : . бо присутствуют в трудно определяемых количествах. Иите- -'". }пссво отметить, что обработка клеточного экстракта ДОХ, не ' ^■> ■ >• , • -вдяяилая на общее содержание бедка в рибосомах, приводит • . * : "¡У'У.'у " некоторым качественным изменениям в их белковой части, '.■.'<-._' V :'•'•• глубина, которых,зависит от концентрации детергента '{рис ■ ..';;>■ : ■ 13). Тритон подобного действия не оказывает. .';' /У. П У,'*:

ч: .• ' Тдлее, выше уже Сворилось о тек, что при прорастании - .. ;

.-.'• не происходит каких-либо количественных изменений в белко- ';■'-уУ, ■' , ^ У • вой. части рибосш. Однако это не исключает возможности по- "" г- '; IV > 7явления каких-либо качественных изменений в белковом соста- ;' ""'У ' У У ве рибосом, которые не отражаются на общем содержании бел- '■ -1' ^ У-";'' • . у ка и не улавливаются при анализе плавучей плотноста. Лей- : " У

' ^ • ствательно, при сравнительном электрофоретическсм анализе ' ¡. .^ у'/

суымрного белка рибосом покоящихся и прорастапцкх сеисн " Г наблюдаются определенные различия. Но более детальному ио- ".' . ^ л • - • следованию.этот.вопрос'в данной работе не подвергался."""'.', .*' , ^' /У'-;:*' '. > . : •. • Картина , распределения "белка каждой из субъединиц отли- ; '. ',,

- . M Л л '-;'■< ■ ' V.-, V ' V V - ■* "( :V■;:■■:>, ■ '*, У : í,--; V- ■■■ У di;,; .!чЛ v -' У ¡

'f- '-VУ ■■■■ -.' ■■—. '■ '-y <..■'. i. ■ . lyrt "■ ■.."■■ -.-- ■-■■i"1'; t ■■ '■■■ У-

■ ■■■■V ■ í -i : -■ " '< ' . ^ ■ ■:,'•--'■>■ :.-. ~ . y; . •... . . • ; уу^/уу* i --''УУ '--Л"

60 s

.•/ .¡.-.»чг-г—,.- jj.

r Ij t c^ , " - L 4

; ......

. . -iw,--^V •

Ч-4.' Mi" /.. •• : ■'■/.-:

ЧЧу'Ч>Чх—

• ;/«i--4 ^ - ^ .: ■_ aoS-eos^

■(■;! 1 ■

*..;. r* ■, - tu--V---

--M В 71-----"TT

-----СШЙ——^"Г --«

- - Ч; ч в»-—-- —

-JS . ••. . ' • ; • ..;í.¡:: — -Mí

—- »ss y " • ■■.>,: ;

' У • У У

''v. y; '

'V ' 4'. •íy--« . 1... - - •: 4

У. ■ . y.

• «« — Л/ ; . : ' '\\V-H

. ti--" ' . . • 4

^ •'/; y. V-

'-■n^a-л'Si : : • ,

i-л

} ?ист4 V у

-Hii Распредедегсго <íe,i-v ; ■ ■ ■ ^ . ков субъвданиц рл-^ . . • • ^ —гь босой сетяа гороха ' . • ' ■ >. ^x^^-íz V пря электрофорезе • " • • /.: ;.

fe^ уУ-Д ;

г Чл. уу.. V ■■: .':-у;."У.Уг/ ■ v Í4

Л\ --ми - . .■ i "■: ■ >"- ■: г; ;■■:.■ : < : и-- >'

"-j- •• ' • ' ' ' ' • ^..¿ff .. " '

\ -:. • -. ••• - • . ' . r f. * : ► ^ ■■ . ч - ■ yy-

..•г.Д/ y/-

" • .'/.Д ^ - 28 , < ;ЛД/Д -уДД^ДД^Д

• чается от картава. распределения Дедка1 исходных .■ рибосом у у ■ Д',

у (рис 14). В каждой субьедашце было обнаружено значительно : .

- - меньше белкошх компонентов.чш в ВОз" рибосоыах; Белка 'Д\Д

• ЕС при электрофорезе в САГ разделяются на 26 компонентов, •.'у' бедки МС - на 21* Все белковые.компонента»; обнаруживаете "; , в рибосомах, присутствуют и в рибосомных субъединицах, ис—Д *ДД'

, ключение составляет полоса'2, которой вет ни в сщцой из ' ... субъеданиц. ч: ■■ * у: Д Д- ' , -Дл-Дл ^ Л.-.-.,*" Д ./у, ДДД Д При исследовании электрофоретической гетерогенности бе>- . -у1; карибосш семян горот основное впаиание было уделено на- 'ДуД ми вопросу о степени специфичности белкового набора ЕС к ДдД • . .' Ш.' Дда бактериальных рибосом, а в последнее' время и'для ,' "Д ■ животных рибосом, установлена строгая и солпая спецяфич- ,' ;Д• ■ ' вость белков двух субъедишщ. Вопрос о характере и степени ЗД. специфичности белкового набора 2 субъединиц датоплазыати-- ' ческих рибосом высших, растений оставался открытгаиСравни-у 'Ду тельный алектрофоретачсский анализ белков 2 субъеданиц Д {■■ '-ДД-, (рте 14) позволяет сказать, что большинство компонентов ЕС , " ,'И'ЫС не совпадают по подвижности.1 При данных условиях фрак-:: . . ционирования только 6 компонентов в белках ВС имеют одана—Д ;ковде или близкие подвижиостк.с^6 соответствушеши^'ксмпо-,\-:Д:;■': ненташ в белках ВАС. Еще меньшая степень гомология мезду - V ..* ' - - белками дауж.субъединиц обнаружена при анализе юс молеку- Д-:;ДД лярно-весовой гетерогенности. Таким образом, полученные '.';'••' .-•• 1данные позволяют сказать,что основная: масса белков вхо-,\ \'Д

- 'двдихв состав 2 субъедипиц ясслсдуетх рибосом шепмх рас- : • ':

• тений, строго специфична. По всей вероятности'; • спецкфкчес- • • Д ; ■ кий характер распре деления белков между други: субъеда ¡ища--■."у ми свойственен всей классам рибосом и не зависит от абсо-жниото содержания в них белка. . Д. у .- Д

Ыолекулярно-весоаая гетёрогешость.линейная зависимость.''.'Д подвижности ЛШ-белкоиога комплекса от логарифма молекуляр-'. Д -

• него веса белка (рис 15) дает возможность оценить тлекулнр^- /' нис веса различшх белков, находящихся, в: смеси, не прибегая 1 .

. кшдедешш индивидуальных компонентов.: .Д---Д 1 Д\ Д" ■ ^ ДД; Изучение колекулярно-весоБой гетерогенности суммарного ' белка рабоссы и рдбосомшсс субъеданиц' сейш ! гороха а' .ШГ,: :::Д-Т содержащей додецллсульфа* натрия»- показало, что суммарный -Ду^

ш

■■■а»

Ш

.:■: * 1

i

'г

■"■'■■ i

Рве 15. Калибровочная'*" |фивая для определения молекулярных весов бея- ; - ков по их влектрофоре- / тпчесной подвижности в ..* ДАТ,. содержащем доделил- ; сухьфат Ra ^v I— бычий сывороточный . . альбумин (68000); S- яичный альбумин - ■ * {43000); Э-пепсин (Э5000) 4— химотршгсикогев ■ (25700); 5- лизсады (14300); 6- РНК-аза шш-

__- ■ - хреатическан

• «««.«НИМ u tt tf 7-штохром с

хреатическан (13700);

СИ700}; .

белок 803 , рибосом разделается на ряд фракций с молекуляр-Сными весами от 10 ООО до 64 ООО. Это указывает на то» что . Жданный белок сильно гетерогенен по моле^лярноцу весу со- v Вставляющих его белтошх; компонентов. Обработка рибоссы тра-. тонем.или Ш ве изменяет общей картины ыолеагтлярнот-весо-{ вого распределения рибоссмнаго бедка, В 60s субъединице (рис. 16)обнаружено 19 белковых зон (14 главных к 5 минорных),' молекулярные веса которых варьируют от 10 ООО до 54 ООО,- . Отчетливые, полосы, соответствующие молекулярным весам от . ' 14 ООО до 32 ООО, представляют собой основную массу белков ' HJ.-Kpowé того,'ЕС содержит еще 3 интенсивные полосы в области от 40 ООО до: 54 ООО. Все белки с молекулярным весом ; ниже 14 000 имели слабую окраскуи были отнесены к . "минорным";: Молекулярные веса:17'белковых зон КС (7 главных.и 10 минорных) варьируют от 10 ООО до 64 ООО. Болыкинство бед-( Ков UC, как и BS,' располагается в'области моле^ляршх в©; сов от 14 ООО, до 32 ООО. Все белки с молекулярным весом выше 32 ООО и нихе 14 ООО представляют собой "минорные*; На : -одна из двух суб%едопвэд, как и■ мсследуеше 80S рибосомы, не содержит оелков с относительно шеоким или относительно низком молекулярным весом, качения молекулярных весов - ■:, ■ ¿всех зов/ на которые разделяется белок ЕС, за исключением, , возможно,' 3*»' отличаются от значений молекулярных весов4 . ' белковых зон НС. .Этот факт свидетельствует о специфическом.

^ y,*-

VX и 0 IB К у ХЯ р К НЕ : •: в в с а ;

: КШЯ - СУБЪЕЛЯНЙЦА' ' - БОЛЫНАЯ СГЕЬЕДИЕИЩ':4 "

главные ' компоненты минорные:.--компоненты; ^ • минорные : компонентна главные компоненты

A

V»

s

M£

ЙШ

i • V'v. i-:-

Ы.ООО—

L'* - -:.r. ■■ . , .

. ; , . .

1

30 500-

í'i ' . i*ooo-

57000-----

V5*»00--—'—J-^z:'

. klÜQO-----' , ■ '

39ÍOO--— 33000----->...

— - ^cfflw -TiW

_3li00JJ

■32«oo í

-33 500 .

-—-37до» ■ .y-y-v-y^r ■—Лее*' ''-.¡л

—MilMl.V. .

Л 300-

¡tsooe-

,177011-16 000-USOff-

—ftooo ■**" ".:'>' ■■

*L ana . ■■! . ^^ '--.■:.

<10000----™

soc >---- •-/ - ——\V\__

míoo' y-— , "Шшо:

«300 . , ■ ■■:.■' -UlTOi л";

'í. ■■■

. ... i ■У'" : - VW 700 ... " . ■ -.'■• ¡ ' <0000 л.у

■■'.- Рис i6 . Электрофореграмш белков рабосомных субмдкшщ' '\ ' • в'ПАГ, содержащем додецялсуяьфат натрия ■>'■■:';' ~ > ^ .

характере молекулярно-весоваго распределения белков 2 субът \ ";'/'• : единиц и дополняет подучепные нами результата.о спецафич--. -.. ности белкового набора субьедаяид 80в рибосом секян ropo- - у

7 *

..-у. • у -'.

, и Траут показали .(В1сЫ.в, Тг«ш*, -1970), что хотя .: '•- .'• ^ рибосош эукариотов ииепт в своем составе такие же низко-'л.-молекулнрыые белка» как и рибоссьм прака^гатов, но, в от-дичие.от1 последних, садержат 'бодъшую долв балков с щцеду- *;.' «"ч ■лярным весом-15 000-32 000, то есть более тажелкх,; час оо-новная масса белков баетериад^ныт гу^м

даянм» распространяется ли уяазаишй характер молекулярао- -весо^^^раифедалета на белкж рибоссм всех вувщшиов. то у ; " есть и на 80 & рибоссш высших растений^ ■ У

^Лнг;:..^ . ----í

" '-'" -'у ' " ' "

г

- V; .

■■■.-Л'.-^Ч'-:;

У ' { Обнаруженный вами характер молекулярш-весового распре-1 . / • . ; -. I;'-,- \ деления. белкового компонента рибосом семян' гороха близок к, ~ ^характеру мавекулярно-весового. распределения цитоплазмати—' \ "!,'■:■. у -Д^-Чвсшх рибосси'жввотннх и,,очевидно, является типичным для . '. }всего.класса.80е >.'рибосом. Это ггпдчтчаряг^риау пр^р^р'дгдряи^ <Е1ск1в, ¡ьлв*, 1970 ), о том.что. высокое абсоовтное содер^ ( , ., , у >жаше бедка как в животных, так и в растительных 80б ри~ 'V'* "'•.,':;, ' V -.боосмах, по сравнении с бактериальными'7СВ рибосомами, • '„"л'' < обусловлено не только увеличением числа белковых комаонен- -:■'"

• » ,' тов, но и увеличением молекулярного веса основной массы • ' ' • ' '.белков^ и что характер молекуднрно-ьесовито распределения • •;

- является таким же типичным признаком, как константа седа- ■■■ ;■. Д М/'*

.. V ; ментацяи, разяер рибоссшшй РНК и чувствительность к анти- .• Д

•. V биотикам:'•'.' . .' . ДД^ь'^г,'

•• выводы- ' .• • . .тДу -л'

Шпфосомная фракция клеточного вкстракта семян гороха •'в дориод покоя состоит из свободшх' ЮТ-частиц и гладких .1' >■;; мембран1 ретикудума. Гранулярный ретикулум на данной стадии \ ' . ' развития семян отсутствует. \ '-V- : '■'.< ■■ у--"' У- "У'-' - ■•;^'.'У'-^-.""---.1

РНП-частида .в'клетках запасашей паренхим» семядолей^.^ДУу/;^К-;•:, - гороха в период метаболического покоя представленц структур- • . ■ ,; -; но - полноценными, .веимеющсми шраженшх дефектов цитоплазма-: Л ■ V - тическима растительными 80Э рибосомами. Д ■ У У-■-У>У УУУУ

УУ\У У 3*-; В0В? рибосомы покоящихся' семян гороха представляют со^ .'-..• .бой легко диссоциирушие (в солевом буфере сзакончив^;.-;.' * шие"- трансляцию и свободные от мЕШ и пептидил-тР11К'803рибосомы.

У

■ . * ~ ■

л'1, т ■

. г /.' 4. Рибосомы семян гороха чувствительны к обработке и \ - 5 ... • .' :• не чувствительны к обработке тритоном х 100. Влияние ДОХ вы- . ;

'ражено в ослаблении взаимодействия; субъединиц в рибосоме,'' в''..'. ' ■; > ,, ■ . : - > удалении отдельных белковых компонентов и изменений алектро-:.' О Ч.

^,, форетческих свойств некоторых белков.■ ; ■ Д; * ' .)} ' Лг ;'- 5. • Структурно неповрежденный субьединицы' исследуешх. рибо^' Й

^сом_растекяй могут быть'шаделены в услоетях солевого буфера -, • ^ '.л^Г нг:;(о,еы К

: I . '.' 6. 608' и 408 субъедвнидн 'рибоош семян гороха различают-' . ' {Ч: '-,'''ся. между собой 'по р^ддр^риш в них белка и9 по ; • V1

стабильности в буфера! с различный содержание* К*:и-

' Различая в характеристиках.6Св субъеданиц растительным и жи-л вотных рибосом позволяет сделать закдзтчение отетерогеннос- ' ти класса 8Ш рибосом в отношении большой субъединашы. >.'■■,'■':

7. Основная касса белков 2 оубъединиа'исследутшх рибосом ~ рт^тегг растений строго специфична» Очевидно*" специфический ^ характер распределения белков между двумя субьединицада свойственен рибосомам как прокариотов, так и эукариотов. -

8. Характер молекулярно-весового распределения белка рибосом семян гороха близок к характеру' иолекуянрно-весоваго распределения бедвов цитовлазматических рибосом животных'и,' очв-

"' видго>» является типичным для всего класса 80S рибосом. \

9. Процесс обезвоживания цитоплазмы клеток семядолей го- / роха в период их полного созревания не сопровождается дегра-г

. дацией рдбосомного аппарата; Рибосомы, синтезированные при-созревании семян, по всей видимости, способны обеспечить ■ синтез бедка при прорастании. , -

Ci i с о i работ, опубликованных по материалам диссертации

- I. Гумилевская H.A., Куваева Б.Б., Чумиккна Л.В., Крето-вич B.2L 1971. Рйбосош сухих семян гороха.. Ьюхимия, 36 , 277. . " , .-;';:

2. Гумилевская H.A., Куваева Е.Б., Чумикина JLB., Крето- -вич В Л. 1972. Плавучая плотность рибосом и их субъеда-шщ, тделенных из покоящихся и прораставдкх семан го- -■ ■■' роха. шахимия, 77, 629. ■■;'■'■... ■ V • :

3. Güín 11 атаку а H.A., Emraeva Б.В*,'сЬиаШл* L.7.', Xreto-vicb V.L. 1972. Rlboaomaa of pea se#<la. Syro. BloX. Hyag. TJ, 229*...

4. Гумилевская H.A., Куваева Е.Б., Чумикина JLB.-1969. . -

' Синтез белка в прорастающих семенах. II Всесоюзный биохимический съезд* Тез. докл., Ташкент, стр; 180.

5. 1^милевская Ни., Чумикина . Д.В., КуваеваЕ.Б., Крето- Л вич В.Л. 1974. Выделение и некоторые характеристик -субъедишщ 80S рибосом сухих семян гороха: Биохимия, '

3 ПбЧ^ТИ« . • . :

6. Чумикина Д.В., Гумилевская. H.A., Кротович ВJL. 1974. -

- Изучение белков рибосом и сибосомшх субьедаииц,- внде- ," ленных из семян гороха, методом эдекгрофореза в-шиш- 4-акрилямидяом геле* Биохимия, 39, в печати. . '.

7^ Чумикина Х.В,,'Гумилевская HJU, Ирвтович B.JL. 1974.

. Изучение молекудярно-весоэой гетерогенности белков ра. . босом и рибосоыных субъединиц, вмделеншх из сухих се-мяв гороха. Биохимия, 39, в печати, j ■ -

8. Чумикина JLB.,; Кретович BJL 1974. Рибосомы семядолей гороха. "Растительные_болки и их бжосянтвз", "НаухаС М.