Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мембраны и их роль в процессах компартментализации и ассоциации рибосом у бактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Мембраны и их роль в процессах компартментализации и ассоциации рибосом у бактерий"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ Ц РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ОРЛОВ Вячеслав Георгиевич

МЕМБРАНЫ И ИХ РОЛЬ

В ПРОЦЕССАХ КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИИ И АССОЦИАЦИИ РИБОСОМ У БАКТЕРИЙ

03. 00. 07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ростов-на-Дону — 1992

Работа выполнена и Кубанском медицинском институте имени Красной Лрм1

Научный консультант — доктор биологических наук, профессор Шакулов Р. С.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Гамлешко X. П. доктор биологических наук, профессор Островский Д. Н. доктор биологических наук, профессор Рукавцов Б. И.

Ведущая организация — Ростовский научно-исследовательский протш'очум

институт

) г '

Защита состоится « ЛУ » 1992 г. в ■/О ,

сов па заседании специализированного совета Д084.53.01. при Ростовском орде Дружбы народов медицинском институте (344700, Ростов-на-Дону, Нахичева ский пер., 29.)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского медицинскс института /. . , _ , , г , у

Автореферат разослан * У и » С-1- /-////Лг.

Ученый секретарь специализированного совета доцент

Н. Я. Корганов

Р0ССИЙС1ГЛГ ГОСУДАРС ; .. f'!!. БИБЛИОТЕК*.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Биологические мембраны отделяют клетку от окружающей ее среды, следовательно, целостность их структурной организации является основным условием существования клетки как единого целого. Поэтому они являются исключительно полифункциональными структурами и сопричастны почти ко всем процессам, происходящим в клетке (Солтон, 1977).

Основными компонентами клеточных мембран являются белки и фосфолипнды, которые образуют сложные структуры, в основе строения которых лежит жидкостно-мозаичная модель их организации. Фосфолипнды образуют бислой, который является основной структурной единицей в организации биомембран. Белки, входящие в состав цитоплазматической мембраны бактериальной клетки, выполняют разнообразные функции, которые включают: транспорт веществ (Gronan, 1987), синтез ДНК (Чернова, Гази-ева, 1979; Firshein, 1989), РНК (Winsten, Huang, 1972), белка (Allen, Scott, 1979), липидов (Островский, Шакулов, 1973), ли-пополисахаридов (Kanegasaki, 1974), циклического АМФ (Poll, 1977). Кроме того, в мембранах осуществляются процессы, обеспечивающие клетку энергией (Скулачев, 1989).

Одной из фундаментальных проблем мембранологни является проблема участия мембран в биосинтезе и секреции экзобелков. Эти процессы осуществляются в основном на мембраносвязанных рибосомах.

Совершенно очевидно, что выяснение ассоциации рибосом с мембранными структурами бактерий позволит более глубоко понять особенности биосинтеза секретируемых белков, а также ряд ключевых вопросов участия биологических мембран в остальных процессах клеточной биологии.

Изучение этих вопросов будет способствовать решению целого ряда практических задач современной биологии, связанных с расшифровкой механизмов: канцерогенеза, анабиоза, радиационного поражения клеток, регуляции активности работы мембранных

ферментов, механизма действия мембраноактивных антибиотиков и многих други^ не менее актуальных проблем.

Таким образом, все рассмотренные выше аспекты мембрано-логии определяют актуальность исследований в этом направлении.

Цель исследования. Целью настоящего исследования было выявление роли мембранных структур в процессах компартмента-лизации и ассоциации рибосом у различных видов бактерий и связанных с этими процессами биосинтеза и секреции белков.

Основные задачи исследования

Работа была направлена на решение следующих задач:

1. Изучение внутриклеточного размещения рибосом у различных штаммов кишечной палочки по основным субклеточным фракциям: гиалоплазменной, нуклеоидной и мембранной.

2. Сравнительное изучение стабильности рибосом к диссоциации при понижающихся концентрациях ионов магния как в отдельных субклеточных фракциях, так и тотальных рибосом из клеток, находящихся в различных физиологических состояниях.

3. Выявлена роль мембранных компонентов в ассоциации рибосом с мембранами.

4. Установление роли прокариотических рибосом и их компонентов в процессе секреции белков.

5. Изучению молекулярных механизмов участия мембран, лежащих в основе процессов компартментализации и ассоциации с ними рибосом, а также возможной роли этих процессов в секреции белков.

Новизна исследования

Впервые нами детально изучено распределение рибосом у кишечной палочки между основными субклеточными фракциями (гиалоплазменной, нуклеоидной и мембранной). В результате проведенных исследований мы показали, что остановка роста культуры кишечной палочки сопровождается перераспределением рибосом между указанными фракциями клеток: относительное содержание рибосом в гиалоплазме возрастает, а в мембранной фракции уменьшается. Такое перераспределение рибосом можно рассматривать как один из механизмов регулирования уровня биосинтеза цитоплазматических и секретируемых белков в клетке адекватно условиям окружающей среды.

Используя сшивающие агенты и антитела к мембранным белкам, нам удалось показать, что связывание с мембранными структурами 70S рибосом, траспортирующих секреторные белки, осуществляется 50S-pii6odoMHoi"i субьединицей за счет белок-белковых взаимодействий определенных белков 50Б-рибосомной субъединицы с мембранными белками. При исследовании белкового состава 508-рибосомных субъединиц, выделенных из грамот-рицательных бактерий, нам впервые удалось обнаружить два ассоциированных белка в структуре 508-рибосомных субъединиц гиалоплазменной фракции. На основании полученных экспериментальных данных о корреляции АТФазной активности 50S субъединиц с уровнем содержания в структуре субъединиц белка с молекулярной массой 102 кД, а также четко выраженной реакции преципитации этого белка с антисывороткой, полученной против мембранных антигенов, мы предположили, что он является продуктом гена Sec А.

Кроме того, в структуре 505-рибосомных субъединиц мембранной фракции обнаружен ассоциированный рибосомный белок, образующий интенсивную полосу. Молекулярная масса этого белка 52 кД, почти соответствует расчетной молекулярной массе интегрального мембранного белка Sec Y. Этот белок играет важную роль в процессе секреции белков.

Научно-практическое значение работы Выявление роли мембранных структур в процессе компартмен-тализации и ассоциации рибосом с мембранными структурами позволит более глубоко понять особенности биосинтеза и механизмы секреции белков, синтез которых осуществляется мембра-носвязанными рибосомами. Эти данные могут быть использованы в качестве теоретических основ при разработке методов получения различных экзобелков бактериальных клеток и их промышленного производства, в том числе белков эукариотических клеток, гены которых клонированы в прокариотические клетки.

Сформулировано новое представление о возможном механизме участия белков Sec А, триггерного фактора и белка Sec Y в процессах, лежащих в основе секреции белков.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на 2-ом Всесоюзном совещании «Структурно-функциональная организация микробной клетки» — (Пущино, 28-30 декабря 1987 г.), на Всесоюзном

семинаре «Современные проблемы антнбиотикорезистентности» — (Москва, 23-24 марта 1988г.), на 3-м рабочем совещании «Секреция белков у микроорганизмов» — (Пущино, 19-21 апреля 1988 г.), на Всесоюзной конференции «Регуляция микробного метаболизма» — (Пущино, 12-14 июня 1989 г.), на Всесоюзной конференции «Физиология пищеварения и всасывания» — (Краснодар, 27-29 сентября 1990г.), на II Международном симпозиуме «Реабилитация иммунной системы» — (Дагомыс, 9-11 октября 1990).

Структура работы Диссертация изложена на 331 странице, состоит из введения, 2 глав литературного обзора, 4 глав собственных исследований с описанием методов, результатов исследований, заключения, выводов и библиографии. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 63 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования Использованные в работе штаммы бактерий приведены в таблице 1.

Среды и условия роста Бактерии выращивали на жидкой среде М9 (Миллер, 1976). Необходимые аминокислоты добавляли в среду из расчета 20 мкг/мл относительно Ь-форм, тиамин — в концентрации 2 мкг/мл. Для выделения из клеток рибосом и мембранных структур их выращивали на среде М9 с добавлением МПБ при интенсивной аэрации в режиме рН-стата до середины экспоненциальной фазы роста. Выращенные клетки собирали центрифугированием и промывали буфером № 1, а затем буфером № 3.

Основные буферные растворы, использованные в работе В работе использованы буферные растворы следующего состава: № 1 — 20 мМ трис НС1, рН 7,5,1 М ЫН4С1, 20 мМ ацетата магния, 100 мкг/мл хлорамфеникола; № 2 — тот же, что и № 1, но без хлорамфеникола; № 3 — 10 мМ трис — НС1 рН 7,5, 100 мМ КС1, 10 мМ ацетата магния, 100 мкг/мл хлорамфеникола; N9 4 — тот же, что и № 3, но без хлорамфеникола; № 5 — тот же, что и № 4, но с 1 мМ ацетата магния; № 6 — тот же, что и № 5, с добавлением

Таблица 1

Характеристика и происхождение штаммов бактерий, использованных о работе

Штамм Генотип Происхождение

Е. coli MRE600 Дикий Получен от Р. С. Шакулова ВНИИ генетика

Е. coli CP78 Tlir leu his argil thiA relA

Е. coli MM52 Гага Dl 39 lac 11169 thi relA rspL mol (SecA) SI ts Получен от М. А. Несмеяновой ИБФМ Пущино на Оке

Е. coli Kl 2 S Музей ВНИИ генетика

Е. coli ро1Л Kl 2 S pol A- Получен из ГИСК им. Л. А. Тарасевича

P. Viilraris Дикий

Р. aeruginosa

S. aureus 209Р

Б. siibtilis1 i

1 M. Intens

E. coli M Выделен и нашей лаборатории

E. coli 34 Выделен от больного

E. coli 629

E. coli 630 E. coli 358 E. coli 381 E. coli 018 E. coli 0151 P. Vulgaris 1010 E. coli J53 Получен из музей ВНИИ генетики

200 мкг/мл пуромицина; № 7 — 10 мМ трис-НС1 рН 7,5, 100 мМ КС1, 1мМ ацетата магния, 2-мкг/мл пуромицина, ДНКаза 1 мкг/мл, РНКаза 1 мкг/мл; № 8 — 1 мМ — трис-НС1 рН 7,5, 100 мМ КС1, 1 мМ ацетата магния, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид; № 9 — стандартный буферный раствор (10 мМ трис-НС1 рН 7,5, 10 мМ КС1, 10 мМ ацетата магния); № 10 — 10 мМ трис-НС1 рН 7,5, 100 мМ КС1, ацетата магния 0,5 мМ — 1,0 мМ — 5 мМ6 0,5% сахарозы.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР

Методы разрушения клеток Ферментативное разрушение клеток проводили с помощью ли-зоцима (Со51ег1оп еЬ а!., 1967). Баллистическую дезинтеграцию осуществляли в планетарной мельнице, установленной в рефрижераторной центрифуге ЦЛР-1 при 1500 об/мин.

Экструзионную дезинтеграцию проводили из замороженного состояния (Ратнер и др., 1972). Для этих целей был использован Х-пресс фирмы ЛКБ (Швеция).

Разделение наружной и цитоплазматической мембраны проводили в ступенчатом градиенте концентрации сахарозы по Осборн (ОзЬогп е1. а1., 1972).

Во всех случаях выделения мембранных структур буферные растворы содержали ингибитор протеаз фенилметилсульфонилфторид.

Определение транслирующей активности рибосом Транслирующая активность рибосом была проверена в бесклеточной белоксинтезирующей системе стандартного состава.

Все компоненты бесклеточной белоксинтезирующей системы смешивали на ледяной бане, а затем пробы инкубировали 20 мин. при 37 град. С (рН 7,5). Реакцию останавливали добавлением холодной 5%-ной трихлоруксусной кислоты. Пробы нагревали при 90 град. С в течение 15 минут, охлаждали и фильтровали через ультрафильтры № 4. Каждый осадок на фильтре промывали 50 мл 5%-ной трихлоруксусной кислоты, высушивали и определяли радиоактивность синтезированного пол-нпептида на сцинтилляционном счетчике с использованием стандартного толуольного сцинтиллятора с тритоном Х-100.

Аналитический электрофорез белков в ПААГ проводили в пластинах градиентного ПААГ (7 — 15%) в присутствии доде-цилсульфата в системе Лэмли (Laemli, 1970).

Определение белка в препаратах мембран и рибосом проводили по методу Лоури (Lowry, 1951).

Получение мембранных антигенов

Препараты цитоплазматических и наружных мембран ресус-пендировали в буфере № 7 и озвучивали на высокочастотном ультразвуковом генераторе. После озвучивания препараты наружных и внутренних мембран разводили буфером № 5 и осаждали в роторе SW — 55 Ti при 40000 об/мин. центрифуги L8-70. Осадки последовательно промывали буфером № 5 и дистиллированной водой. Осаждение препаратов после промывки осуществляли в указанном выше режиме. Осадки мембран лио-фильно высушивали и использовали для иммунизации кроликов.

Получение антисыворотки проводили как описано в руководстве «Иммунологические мотоды» (Фримель, 1987).

Двухмерный перекрестный иммуноэлектрофорез проводили как описано в работе (Adler, Arvidson, 1984).

Аналитические методы

Постановка реакции связывания мембранными структурами рибосом

Для постановки этой реакции использованы рибосомы, меченые (14 С) урацилом.

Для присоединения рибосом к мембранам, с которых рибосомы были предварительно удалены обработкой буфером № 6, суспензию мембран в 0,5 мл буфера № 10 соединяли с 0, 5 мл суспензии рибосом в том же буфере и инкубировали 30 мин. при 37 град. С. После инкубации материал охлаждали на ледяной бане и наслаивали на линейный градиент концентрации сахарозы 5-20% с подслойкой 50% сахарозы и центрифугировали 30 мин. при 25000 об/мин. при изучении связывания наружными мембранами рибосом и 60 мин. при изучении связывания внутренними мембранами рибосом при том же режиме центрифугирования.

Полосу мембранных структур, видимую в проходящем свете в зоне подслойки 50% сахарозы, отбирали перистальтическим

насосом. Затем разводили буфером № 4 и осаждали на дно пробирки в роторе SW-55Ti ультрацентрифуги L8-70. После центрифугирования осадок споласкивали холодной дистиллированной водой и ресуспендировали его в 200 мкл дистиллированной воды. В 100 мл определяли радиоактивность, обусловленную присоединившимися к мембранам рибосомами, а 50 мл пробы использовали для определения количества белка в ней. По удельной радиоактивности рибосом, использованных в данном опыте, высчитывали количество рибосом, связавшихся с мембранными структурами в данной пробе. Из величины белка в пробе вычитали количество белка, приходящегося на долю рибосом, связавшихся с мембранными структурами в данном опыте, а оставшееся количество белка принимали за мембранный белок. На количество этого белка и определяли долю связавшихся с мембранными структурами рибосом из расчета на 1 мг мембранного белка.

Определение количества РНК в рибосомах Количество РНК в рибосомах рассчитывали как разницу содержания РНК во фракциях экстракта до и после осаждения рибосом. Эту величину использовали при анализе распределения рибосом по фракциям. Для определения РНК материал фракционировали по методу Шмидта и Таннгаузера (Schmidt, Thannhausen 1945). Содержание РНК в пробах определяли спек-трофотометрически по Спирину (Спирин, 1958).

Определение АТФазной активности Активность АТФазы определяли по скорости гидролиза АТФ до ортофосфата и АДФ. Для определения количества образовавшегося ортофосфата использовали стандартный набор реактивов, поставляемых фирмой «Хемапол».

Электронномикроскопическое исследование мембранных структур Для электронномикроскопических исследований препарат мембранных структур промывали в 10 мл аммонийно-фосфатном буфере pH 6,0. Осадок мембранных структур ресуспендировали в том же буфере и наносили на сетки с формваровой подложкой. Сетки высушивали при комнатной температуре, а затем конрастировали фосфорно-вольфрамовой кислотой. Образцы исследовали в электронном микроскопе УЗМВ-ЮОВ при увеличении 45000.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ РАЗМЕЩЕНИЕ РИБОСОМ И ИХ НЕКОТОРЫЕ" ХАРАКТЕРИСТИКИ

1.1. Локализация рибосом в субклеточных фракциях Относительное распределение рибосомного материала, найденное в результате фракционирования протопластов различных штаммов кишечной палочки, приведено в табл. 2. Как видно из данных, приведенных в табл. 2, остановка роста культуры кишечной палочки сопровождается перераспределением рибосом между указанными фракциями клеток: относительное содержание рибосом в гиалоплазменной фракции возрастает, а в мембранной фракции — уменьшается. Такое перераспределение рибосом является одним из механизмов регуляции уровня биосинтеза ци-топлазматических и секретируемых белков в клетках адекватно условиям окружающей среды.

1. 2. Сравнительное изучение стабильности рибосом кишечной палочки на различных этапах ее роста

Как видно из данных, приведенных в табл. 3, содержание активных, то есть непосредственно занятых в трансляции, рибосом в бактериальной клетке в значительной мере зависит от стадии роста культуры. Клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста, содержат значительно большее количество активных рибосом, чем клетки, находящиеся в стационарной фазе роста. В стационарной фазе роста культуры или в условиях дефицита в среде необходимых аминокислот в гиалоплазменной, нуклеоид-ной и мембранной фракциях уменьшается доля рибосом, не диссоциирующих на субъединицы, при понижении концентрации ионов магния в буферном растворе. Остановка роста культуры добавлением в среду хлорамфеннкола приводит к увеличению доли стабильных рибосом по сравнению с экспоненциально растущей культурой.

Полученные результаты подтверждают данные о том, что между скоростью биосинтеза рнбосомной РНК и содержанием активных рибосом в бактериальной клетке существует определенная корреляция.

Изучение распределения рибосом между тремя субклеточными фракциями — гиалоплазменной, нуклеоидной и мембранной и изменение характера диссоциации рибосом при понижении концентрации ионов магния в окружающей среде следует признать наиболее важными критериями изменения их состояния in vitro.

Содержание рРНК в различных субклеточных фракциях Е. coli процент от суммы в трех фракциях

Культура, фаза роста. среда

Е. coli MRE600 Е. coli М Е. coli СР78

Фракция экспо- стацио- экспо- экспо- стацио- экспо- стацио- экспоненциальная

ненциальная нарная ненциальная ненциальная нарная ненциальная нарная М-9+ глюкоза М-9+ глюкоза M-9+ глюкоза

МПБ МПБ МПБ +ХФ МПБ МПБ М-9+ глюкоза М-9+ глюкоза +АК+В -АК+В -АК+В +ХФ

Гиалоплаз- 16 50 39 27 41 17 44 24 42 46

менная

- Нуклеоид- 37 30 30 32 23 20 14 27 12 10 пая

Мембранная 47 20 31 41 36 63 42 49 46 44

Сумма 84 50 61 73 59 83 56 76 58 54

нуклеоид-ной и мембранной

Примечание: АК — аминокислоты, ХФ — хлорамфеникол, В — тиамин, (+) — присутствие аминокислот и тиамина, (-) — отсутствие аминоксилот.

7025 Таблица 3

Диссоциация рибосом Е. coli MRE600 ?QS -f3osxl00^°

Состояние культуры Фракция Концентрация Mg++ в мМ

1 0,5

Экспоненциальная Гиалоплазма 37 16

фаза Нуклеоид 38 22

Мембраны 46 29

Среднее значение 40 22

Стационарная Гиалоплазма 36 14

фаза (5 часов) Нуклеоид 31 14

Мембраны 28 9

Среднее значение 32 12

Стационарная Гиалоплазма 27 0

фаза (22 часа) Нуклеоид 19 0

Мембраны 24 0

Среднее значение 23 0

Экспоненциальная Гиалоплазма 52 39

фаза + 100 Нуклеоид 58 44

мкг/мл хлорамфе- Мембраны 52 41

пнкола Среднее значение 54 41

2. РОЛЬ МЕМБРАННЫХ КОМПОНЕНТОВ В АССОЦИАЦИИ РИБОСОМ С МЕМБРАНАМИ

2.1. Прочность связывания 70S рибосом с бактериальными мембранами

Рибосомы в прокариотических клетках достаточно прочно связаны с мембранами. При обработке мембранного материала про-теолнтическими ферментами, сульфгидрильными реагентами и РНКазой не удается полностью отделить рибосомный материал от мембранных структур, что наиболее вероятно может быть объяснено тем, что рибосомы не просто ассоциированы с мембранами, а часть их заключена в мембранные пузырьки, обна-руженньш нами на электронограммах.

2.2. Связывание мембранами 70S рибосом in vitro

Мембраны, рибосомы с которых предварительно удалены пу-

ромицином и KCl в высокой концентрации, вновь связывают рибосомы in vitro. Связывание мембранами рибосом стимулируется ионами магния и угнетается KCl.

Эффективность связывания мембранами рибосом in vitro зависит от степени вывернутости внутренних мембранных везикул, поэтому можно полагать, что места связывания рибосом на мембранах локализуются на внутренней стороне цитоплазматиче-ской мембраны бактериальной клетки. Подтверждением этому служит тот факт, что наружные мембраны грамотрицательных бактерий практически не связывают рибосом (табл. 4).

На основании полученных нами данных о том, что связывание 50S-pn6ocoMHbix субъединиц с мембранными стуктурами эффективно подавляется антителами к мембранным антигенам, а эффективность связывания ЗОБ-рибосомных субъединиц мало чувствительна к такой обработке, можно сказать, что связывание ЗОБ-рибосомных субъединиц с мембранными структурами носит неспецифический характер.

Связывание с мембранными структурами 70S рибосом, транслирующих секреторные белки, осуществляется, очевидно, 50S субъединицсй за счет белок-белковых взаимодействий строго определенных белков 50S субъединицы с мембранным белком Sec Y, а возможно, и с другими интегральными мембранными белками, являющимися продуктами генов Sec D и Sec E(Rigs et. al., 1988).

2.3. Перекрестное связывание in vitro 70S рибосом, выделенных из грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов с мембранами грамотрицательных и грамположительных бактерий

Как видно из результатов, приведенных в табл. 5, мембрань из М. luteus связывают 70S рибосомы из Е. coli MRE600 с такой же эффективностью, как и рибосомы, выделенные и: собственного штамма. Внутренние мембраны из Е. coli MRE60( связывают рибосомы, выделенные из М. luteus, как и в случа< перекрестного связывания рибосом мембранами М. luteus, прак тически с одинаковой эффективностью.

На основании того, что мембранные структуры грамотрица тельных и грамположительных бактерий одинаково эффективн« связывают гомологичные и гетерологичные рибосомы, можн< предположить, что аппарат секреции грамотрицательных и грам положительных бактерий, видимо, имеет общий принцип органи зации.

Эффективность связывания 70S рибосом из Е. coli MRE600 внутренними и наружными мембранами, выделенными из различных штаммов бактерий, в мкг рРНК/мг мембранного белка

Эффективность связыва- Е. coli Е. coli

ния 70S рибосом мемб- Е. coli 629 630 Е. coli Е. coli Е. coli Е. coli Р. vul- Р. vul-

ранными структурами 34 358 018 0151 J53 garis* garis

в мкг рРНК/мг мемб- 1010**

ранного белка

Внутренние 249 266 260 257 243 253 257 278 255

±3,7 ±4,1 ±3,9 ±3,5 ±3,7 ±4.5 ±3,8 ±4,3 ±3,6

Наружные 23 19 27 17 21 18 22 29 25

±4,9 ±3,8 ±5,2 ±4,1 ±3.1 ±4,5 ±3,5 ±4,3 ±5,1

Примечание: данные представляют среднее из трех определений и среднеквлдратические ошибки.

* Стандартный штамм вульгарного протея, полученный из Всесоюзного института стандартизации и контроля биологических и медицинских препаратов им. Л. Л. Тарасевича.

** Дикий штамм вульгарного протея, 1010 — номер в журнале регистрации поступления патогенных штаммов бактерий на кафедру микробиологии Кубанского медицинского института.

Таблица 5

Перекрестное связывание 70S рибосом, выделенных из грамотрицатсльных и грамположительных микроорганизмов, с мембранами грамотрицатсльных

и грамположительных бактерий в присутствии 5 мМ ацетата магния и 50 мМ KCl в буферном растворе в мкг рРНК/мг мембранного белка

Мембраны Эффективность связыва- Эффективность связыва-

ний 70S рибосом из ния 70S рибосом из

Е. coli MRE600 М. luteus

Е. coli MRE600 257 277

±3.0 ±3,5

М. luteus 264 265

±3,2 ±3,7

Примечание: данные представляют среднее из трех определений и средне-квадратические ошибки.

3. РОЛЬ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ РИБОСОМ И ИХ КОМПОНЕНТОВ В ПРОЦЕССЕ СЕКРЕЦИИ БЕЛКОВ

Какую роль играют основные рибосомные белки и рРНК в процессах секреции неизвестно. Однако в последние годы рядом авторов, в том числе и исследованиями, проведенными в нашей лаборатории, в структуре рибосом, кроме основных структурных белков, обнаружены белки, ассоциированные и рибосомами, молекулярная масса которых значительно больше основных рибо-сомных белков. Прочность связывания белков, ассоциированных с рибосомами, и выполняемые ими функции во многом остаются неясными.

Процесс секреции белков и эукариотических клеток изучен более детально, чем у прокариотических. Рибосомы, синтезирующие секреторные белки в эукариотических клетках, направляются в систему эндоплазматического ретикулума с помощью специального класса рибонуклеопротеидных частиц, получивших название сигнальных узнающих частиц (SRP-частиц), которые в клетке проделывают для этих целей специальный цикл (Walter et. al., 1984). Структур, аналогичных SPR-частицам, в прокариотических клетках не обнаружено.

Универсальной моделью для изучения секреции белков у прокариот является кишечная палочка. У нее к настоящему времени картировано более 20 генов, мутации в которых приводят к частичной или полной остановке процесса секреции.

Рис. 1. Схема взаимодействия белковых компонентов секреторного аппарата у кишечной палочки на примере секреции Ошр А белка (Yill et al., 1989)i. Т. •Ф. — триггерный фактор, Sec A, Sec Y — белковые факторы секреции, pOmp А — предшественник Ошр А.

Некоторые продукты этих генов в настоящее время выделены в чистом виде и в большей или меньшей степени изучены их свойства. Так, одним из продуктов генов, которые контролируют процесс секреции у прокариот, является белок с молекулярной массой около 70 кД, обнаруженный в составе 505-рибосомных субъединиц (Crooke et al., 1988, а, в; Yill et al., 1988). Два других белка являются продуктами генов Sec А и Sec Y. Белок Sec А — поверхностный мембранный белок с молекулярной массой 101, 9 кД, обладающий АТФазной активностью (Schmidt et al.1988; Kawasaki et al., 1989). Белок Sec Y является интегральным мембранным белком с сильно выраженными гидрофобными свойствами и молекулярной массой 49 кД (Cerrectti et al., 1983). Выделены продукты и некоторых других генов, контролирующих процессы секреции, однако их свойства и выполняемые ими функции изучены еще не в полной мере.

Предложена схема взаимодействия описанных выше компонентов в процессе транслокации белка через фосфолипидный бислой in vitro на примере белка наружной мембраны кишечной палочки Omp А (рис. 1). Согласно этой модели, на рибосоме образуется комплекс синтезирующегося пре Omp А белка с триггерным фактором. После завершения синтеза пре Omp А этот комплекс покидает рибосому, после чего он связывается с белками Sec А и Sec Y на мембране. Это в свою очередь приводит к стимуляции гидролиза АТФ белков Sec А, и сек-ретируемый белок транслоцируется через мембрану. После этого триггерный фактор освобождается из комплекса, попадает в цитоплазму и может вновь связываться с рибосомами, которые синтезируют секреторный белок.

При исследовании белкового состава 50S субъединиц Е. coli MRE600 трех субклеточных фракций: гиалоплазменной, нуклео-идной и мембранной — нами обнаружено в структуре 50S субъединиц гиалоплазменной фракции два дополнительных белка с молекулярной массой 102 кД и 72 кД. В нуклеоидной и мембранной фракциях эти белки представлены минорными полосами. Молекулярные массы обнаруженных нами белков очень близки молекулярным массам белка Sec А и триггерного фактора. Учитывая, что белок Sec А обладает АТФазной активностью н почти полное совпадение молекулярной массы обнаруженного нами белка с молекулярной массой белка Sec А, представляло интерес определить АТФазную активность 50S-pn6ocoM-ных субъединиц всех субклеточных фракций.

Фосфогидролазная активность* 505-рибосомных субъединиц различных субклеточных фракций

Фосфогидролазная активность 505-рибосомных субъединиц

Фракция 505-рибосо.ч-ных субъединиц Нативные Обработанные ДЦКД Обработанные ази-

50 мкМ/мл 100 мкМ/мл дом натрия 2 мМ/мл

А" р+#* А Г А Г А Г

Гиалоплазменные 37,2 ±1.2 6,4 ±0,6 35,4 ±1,1 5,9 ±0.5 38,2 ±1,3 6,2 ±0,6 36,6 ±1,2 5,3 ±0,7

Нуклеоидные 11.9 ±1.1 2.0 ±0,3 10,6 ±0,9 1.8 ±0,2 11,2 ±0.9 1.9 ±0,2 11,8 ±0,8 2,1 ±0,2

Мембранные 12,3 ±1,2 2,1 ±0,2 11,8 ±1,1 1.9 ±0,2 12,2 ±0,9 2,0 ±0,9 12,2 ±0,8 2,0 ±0,2

Примечание:* — фосфогидролазная активность выражена в нМ Р1/мин. на мг белка; А** — АТФазная активность; Г*** — ГТФазная активность.

Данные представляют среднее из трех определений и среднеквадратичные ошибки

Как видно из табл. 6, АТФазная активность 50S субъединиц гиалоплазмы составляет 37 нМ Pi/мин. на мг белка, a 50S субъединиц нуклеоидной и мембранной фракций 1169 и 12,3 нМ Pi/мин. белка соответственно.

Как видно, АТФазная активность коррелирует с уровнем содержания в 50S-pn6ocoMHbix субъединиц белка с молекулярной массой 102 кД.

При фракционировании рибосом на субклеточные фракции не исключена возможность загрязнения их Н+ — АТФазным комплексом или растворимой АТФазой (комплекс Fi). Для исключения этой возможности АТФазная активность 50S субъединиц была изучена в присутствии N, N1 — дициклогексилкарбомида (ДЦКД), который блокирует активность протонной АТФазы и в присутствии азида натрия, который является известным ингибитором фактора Fi. Ни ДЦКД, ни азид натрия не блокировали АТФазной активности 505-рибосомных субъединиц. Трехкратное промывание 505-рибосомных субъединиц буферным раствором, содержащим 1 М хлорида аммония, приводит к полному удалению дополнительных белков из рибосомных субьединиц. Рибо-сомные субъединицы, лишенные дополнительных белков, полностью теряют АТФазную активность. Таким образом, АТФазная активность 505-субъединиц обусловлена наличием в их структуре дополнительных белков.

Использовав метод перекрестного иммуноэлектрофореза, нам удалось показать, что белок с молекулярной массой 102 кД образует выраженный пик преципитации с антисывороткой, полученной против антигенов внутренних мембран Е. coli MRE600. Этот факт свидетельствует о том, что этот белок присутствует как в структуре 505-рибосомных субъединиц, так и в структуре внутренних мембран Е. coli MRE600.

На основании этих данных можно предположить, что после программирования рибосомы мРНК, кодирующей синтез секреторного белка, синтез его начинается в цитоплазме. Появление за пределами рибосомы последовательности из 15-30 аминокислотных остатков служит сигналом для распознавания такой рибосомы белков Sec А и триггерным фактором. Это приводит к замедлению или остановке процесса трансляции. Следующим этапом является распознавание таким комплексом интегрального мембранного белка Sec Y, а возможно, и других интегральных белков мембраны, таких, как Sec D и Sec Е с переходом

белка Sec А из структуры рибосомы в состояние поверхностного мембранного белка. Его АТФазная активность может быть использована для поддержания в активном состоянии трансляцион-но-транслокационного комплекса, а таже триггерного фактора и белков Sec В и Gro El, обладающих анфолдазной активностью.

Мы предлагаем следующую схему, отражающую последовательность описанных выше событий, происходящих в процессе взаимодействия компонентов аппарата секреции у кишечной палочки (рис. 2).

Таким образом, из приведенных данных очевидно, что дополнительные рибосомные белки играют важную роль в процессах секреции у прокариот.

Как уже говорилось выше, в структуре рибосом грамотрица-тельных и грамположительных бактерий, выделенных без использования в буферном растворе хлорида аммония, обнаружены ассоциированные с ними белки. Используя антисыворотку, полученную к препаратам бактериальных мембран с помощью метода перекрестного иммунофореза и двойной радиальной имму-нодиффузии по Ухтерлони, обнаружено иммунологическое родство рибосомных белков с белками мембранных структур бактерий. Дополнительные белки рибосом удаляются из них трехкратным промыванием рибосом буфером, содержащим 1М хлорида аммония. Удаление дополнительных рибосомных белков буфером, содержащим 1М хлорида амония, приводит к утрате иммунологического родства таких рибосом к антисыворотке, полученной против препарата бактериальных мембран. Отделенные хлоридом аммония дополнительные рибосомные белки, после удаления их путем диализа против буфера, не содержащего хлорида аммония, вновь встраиваются в структуру рибосом. Реконструированные таким образом рибосомы восстанавливают иммунологическое родство к антисыворотке против препарата бактериальных мембран.

^Полученные результаты свидетельствуют о том, что именно ассоциированные с рибосомами белки определяют иммунологическое родство рибосом с мембранными белками.

Полученные данные необходимо учитывать при разработке высокоэффективных рибосомных вакцин против различных возбудителей инфекционных заболеваний. Разработкой таких вакцин в настоящее время занимается ряд исследователей в США, СССР, Канаде, Японии, Франции и ряде других стран.

Рис. 2. Схема взаимодействия белковых компонентов секреторного аппарата у кишечной палочки Т. Ф. — триггерный фактор, Sec A, Sec Y — белковые факторы секреции, KJ1 — кардиолипин, ФГ — фосфатидилглицер-ни, ФК — фосфатидная кислота, LP — лидерная пептндаза.

Иммуногенность бактериальных рибосом была описана в 1965 г. (Youmans A., Youmans J,. 1965). Исследовались иммуногенные свойства рибосом сальмонелл, кишечной палочки различных ши-гелл, клебсибелл, синегнойной палочки, менингококков, гонококков, стрептококков, включая стрептококки пневмонии, стафилококков, гемофильной палочки, возбудителей туляремии, бруцеллеза, чумы, коклюша, холерного вибриона, лептоспир, простейших грибов (Левинсон и др., 1978; Левинсон, Субботина, 19781 Субботина и др., 1979; Angerman, Eisensten, 1980; Джикидзе и др., 1981; Thomas, Weiss, 1981; Левинсон и др., 1984).

Особенности механизма защитного действия рибосомных вакцин нельзя считать окончательно выясненными.

По мнению одних авторов, рРНК попадает в клетки и репродуцируется в них с помощью обратной транскриптазы. Таким образом, по их мнению, возникает резистентность к бактериям, независимо от антител и факторов клеточного иммунитета (Youmans A., Youmans J., 1965).

При изучении ряда других экспериментальных инфекций защитный эффект рибосомных препаратов имеет иммунологическую природу с участием как гуморальных, так и клеточных факторов иммунитета. Вторая гипотеза о механизме действия рибосомных вакцин была предложена при разработке вакцины 'из S. tuphimurium. Авторы считают, что главным иммуногенным фактором являются рибосомные белки (Angerman, Eisensten,

1980).

Высказывается и третье предположение, которое основывается на данных о том, что препараты рибосом содержат то или иное количество антигенов клеточной оболочки, капсульные полисахариды, белки клеточной стенки и др. Авторы предполагают, что «контраминирующие» антигены как раз и обуславливают иммуногенное действие рибосомных вакцин (Thomas, Weiss,

1981).

На основании данных, полученных нами и рядом других авторов, о наличии дополнительных белков в структуре бактериальных рибосом, иммунологнчески родственных мембранным белкам, можно полагать, что эти белки играют существенную роль в иммуногенности рибосом.

Таким образом, вопрос о протективном факторе рибосомных вакцин весьма противоречив и далек от разрешения.

Можно полагать, что одним из этапов исследований в этом направлении будет изучение иммуногенности и протективной ак-

тивности рибосом прокариотических и эукариотнческих клеток, находящихся на тех или иных этапах их экспериментальной разборки с различным количеством белков в их структуре. Препараты таких рибосом, возможно, могут быть использованы для реабилитации иммунной системы как при инфекционных заболеваниях, так и при иммунодефицитах различного характера.

ВЫВОДЫ

В работе изучена роль мембранных структур в процессах компартментализации и ассоциации рибосом у бактерий, в результате чего выявлен ряд новых закономерностей этого явления.

1. Установлено, что рибосомы не только ассоциированы с мембранами, но и заключены в мембранные пузырьки, обнаруживаемые на элекронограммах. Практически полное отделение рибосом от мембран происходит в результате обработки их ультразвуком в буферном растворе, содержащем ДНКазу, РНКазу и пуромицин.

2. Показано, что наибольшее количество рибосом на всех стадиях роста обнаруживается в нуклеоидной и мембранной фракциях. Остановка роста бактерий сопровождается перераспределением рибосом между фракциями клеток — относительное содержание рибосом в гиалоплазме возрастает, а в мембранной фракции уменьшается.

Такое перераспределение рибосом говорит о том, что в экспоненциально растущих клетках синтез секретируемых белков осуществляется более интенсивно, чем в клетках, находящихся в стационарной фазе роста.

3. Содержание активных, т. е. непосредственно занятых в трансляции рибосом в бактериальной клетке в значительной мере зависит от стадии роста культуры. Клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста, содержат значительно большее количество активных рибосом (60-70%) по сравнению с клетками, находящимися в стационарной фазе роста (40-50%).

4. Установлено, что наружные мембраны кишечной палочки in vitro в 10 раз хуже связывают 50S субъединицы, чем внутренние. Это свидетельствует о наличии в структуре внутренних мембран бактериальной клетки участков, расположенных

с внутренней стороны, с которыми связываются 50S субъединицы рибосом.

5. Обработка внутренних мембран антителами, полученными против мембранных белков, почти в 4 раза снижает эффективность связывания 50S субъединиц, поэтому можно полагать, что эти участки представлены белками или белком.

6. В структуре рибосомных субъединиц 70S рибосом обнаружены ассоциированные с ними белки. Эти белки обнаруживают иммунологическое родство с определенными мембранными белками.

Поэтому они, выполняя свои функции в процессе секреции белка, могут находиться определенное время в структуре рибосом, и на последующих этапах транслокации белка через фос-фолипиднып бислой становиться поверхностными белками мембран.

7. Ассоциированные с рибосомами белки могут быть удалены из их структуры промыванием препарата буферным раствором, содержащим 1М хлорида аммония. Эта процедура приводит более чем к трехкратному снижению эффективности связывания 505-рибосомных субъединиц с мембранными структурами. Следовательно, белкам, ассоциированным с рибосомами, принадлежит существенная роль в удержании их на поверхности мембраны в процессе секреции белков.

8. Предложена модель секреции белка, предусматривающая участие в этом процессе ассоциированных с рибосомами белков, мембранных белков, а также фосфолипидов. Она построена с учетом моделей, предложенных другими авторами.

9. Установленный нами факт наличия в структуре рибосом эактерин ассоциированных с ними белков необходимо учитывать при получении препаратов рибосомных вакцин, производство которых в последние годы разрабатывается как в СССР, так и за рубежом. При детальном изучении иммуногенных свойств эибосом они могут быть использованы как препараты для им-^унореабилитации больных, у которых заболевания сопровождается развитием иммунодефицитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Эффективность биосинтеза рибосомами белка у Е. coli (Коротяев А. И.). — //Микробиология. 1969. Т. 37, № 2, с.205-210.

2. Кинетика основных биосинтетических процессов у реком-бинантов Е. coli и Sh. sonnei, содержащих различные типы R-факторов (Коротяев А. И., Астапов А. А.). — //Всесоюзное совещание «Внехромосомные факторы наследственности у бактерий», — М., 1969, с.39.

3. Необычный характер изменения массы ДНК у некоторых штаммов Е. coli. (Коротяев А. И., Максимов В. Ф., Ширяева М. Н. и др.). — //Докл. АНСССР, 1970, т.7 194, № 6, с.1433-1436.

4. Влияние антибиотиков на биосинтез белка и нуклеиновых кислот в антактных клетках кишечной палочки, несущих R-факторы (Коротяев А. И., Астапов А. А.). //Антибиотики, 1971, № 9, с.797-801.

5. Активность белоксинтезирующей системы и характер выражения генома у Е. coli (Коротяев А. И., Карасева Э. В.). //Биолог, науки, 1971, № 5, с.86-90.

6. Универсальная постоянная белоксинтезирующей системы Е. coli (Коротяев А. И., Фукшанский Л. Я., Положенцев Б. И., Карасева Э. В.). //Микробиология, 1972, т.11, № 4, с.607-612.

7. Некоторые характеристики рибосом Е. coli после прекращения роста культуры (Клячко Е. В., Шакулов Р. С.). //Биохимия, 1974, т. 39, № 2, с.426-431.

8. Рнбосомальный аппарат бактерий. Активная регуляция содержания рибосом (Коротяев А. И., Лищенко Н. Н.). //V съезд Всесоюзного, микробиологического общества. Тез. докл., Ереван, 1975, с. 15-16.

9. Скорость синтеза полипептидной цепи и механизм функционирования рибосом у бактерий (Коротяев А. И.). //V съезд

Всесоюзного микробиологического общества. Тез. докл., Ереван, 1975, с.29-30/

10. Внутриклеточное размещение рибосом у Е. coli. (Коротяев А. И, Лищенко Н. Н., Журавлев Ю. Н.). //Молекулярная биология и медицинская генетика. Симферополь, 1975, т. 66, вып. 1, с.15-19.

11. Сравнительное изучение стабильности рибосом кишечной палочки на различных этапах ее роста (Зенцова О. А.). // Молекулярная биология бактерий. Краснодар, 1977, с.57-64.

12. Регуляция содержания рибосом у бактерий в зависимости от условий их культивирования (Князев А. И., Лищенко Н. Н., Наумов Г. Н.). //Вопросы биохимии и физиологии микроорганизмов. Саратов, 1977, с. 91-102.

13. О природе щелочелабильности ДНК (Коротяев А. И., Кроличенко Т. П.). //Биохимия и биофизика микрорганизмов. Горький, 1978, с.15-18.

14. РНК-фрагменты в ДНК бактерий (Коротяев А. И., Кроличенко Т. П.). //VI съезд Всесоюзного микробиологического общества. Метаболизм микроорганизмов и его регуляция. Тез. докл. Рига, 1980, Т. 3, с.47.

15. Итоги 10-летних исследований бактериальной ДНК (Коротяев А. И., Кроличенко Т. П.). //Тез. докл. к науч. конф. ин-та. Краснодар, 1980. с. 236-238.

16. Присоединение 70S рибосом к мембранным структурам Е. coli (Коротяев А. И., Кроличенко Т. П.). Биохимия, 1980, т. 3, вып. 8, с.1481-1487.

17. О присутствии в составе бактериальной ДНК ковалентно связанных с ней фрагментов РНК (Коротяев А. И., Кроличенко Т. П.). //Бнол. науки, 1983, № 12, с. 27-31.

18. Связывание 30S- и 505-рибосомных субъединиц с мембранами Е. coli in vitro. //VII Сев.-Кав. конф. по иммунол. и молекул, биол. Тез. докл. Краснодар, 1983. с. 240-241.

19. Роль белок-белковых взаимодействий в связывании 30S-и 50S-pn6ocoMHbix субъединиц с внутренними мембранами кишечной палочки. //Функция иммунной системы в инфекционном и неинфекционном процессе. Молекулярная биология бактерий. Краснодар, 1984. С. 134-138.

20. Хромосомы, рибосомы и клеточный цикл у бактерий (Кроличенко Т. П., Лищенко Н. Н.). //Достижения микробиологии на практике: Тез. VII Всесоюзн. микробиол. об-ва. Генетика и генная инженерия. Алма-Ата, 1985, т. 3, с.40.

21. Характеристика штаммов кишечной палочки, резистентных к полимексину (Сидоров И. А., Дорохина О. В., Караева JI. Д,). //Всесоюзный семинар «Современные проблемы антибиоти-корезистентности». М., 1988, с. 37.

22. Связывание 505-рибосомных субъединиц с внутренними мембранами кишечной палочки. //Актуальные вопросы иммунологии и иммунопатологии. Изд-во Ростовского университета, 1988. с. 35-36.

23. Специфичность связывания 505-рибосомных субъединиц с плазматическими мембранами кишечной палочки. //Регуляция микробного метаболизма. Всесоюзн. конф. Пущино, 1988. с.80.

24. Особенности механизма секреции белков эукариотическими и прокариотическими клетками. //Физиология пищеварения и всасывания. Тез. докл. XV Всесоюзн. конф. Краснодар, 1990, с. 208-209.

25. Иммунологическая специфичность рибосом бактерий, содержащих дополнительные белки. //Реабилитация иммунной системы. Тез. II Международного симпозиума. Дагомыс, 9-11 октября 1990 г., с.362.

26. Белки, ассоциированные с 508-рибосомными субъединицами Е. coli MRE600 (Наумов Г. Н.). //Мол. генетика, 1992. № 1, с.3-7.

«

КЧПО 357100, г. Черкесск, ул. Первомайская, 47. Заказ № 2869.