Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение распределения эукариотического фактора элонгации 2 в фибробластах

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение распределения эукариотического фактора элонгации 2 в фибробластах"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕЗОЛЮЦИИ Я ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.З. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИ* «АКУЛЬТЕГ

На правах рукошси УДК 576.3:577.217

ЭЕСГАКОВА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКОГО ФАКТОРА ЭЛОЕГАШ 2 В ФИБРОБЛАСТАХ

(ОЗ.ОО.25 - Клеточная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1993 г.

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук Л.П.Гаврилова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Г.Е.Онищенко

кандидат биологических наук А.С.Степанов

Ведущая организация: ШШ Канцерогенеза ВОНЦ РАМН

Защита состоится: 993 г.

в ас. на заседании ^Специализированного совета

Д 053.05.68 в Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119399, г. I Биологический факультет МГУ, аудитория

М.В.Ломоносова по адресу: II9899, г. Москва. Ленинские горы,

M-d.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан. Ученый секретарь Совета

кандидат биологических наук / Е.Н.Калистратова

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Идея о возможном участии цитоскелэта в организации белок-синтезирующего аппарата в эукариотической клетке возникла болев, чем 10 лет тону назад. С помощью высоковольтной электронной микроскопии было обнаружено, что цитоплазма клетки содержит филаменты, и что часть рибосом и полирибосом расположены Вблизи НИХ (Wolosewick and Porter, 1979).

Многочисленные биохимические данные показали. что полирибосомы, мРНК и некоторые факторы интдеяции удерживаются в клетках после экстракции их неионным детергентом в условиях, когда все типы цитоскелетных структур сохраняются (см. обзор

Hesketh and Pryme, 1991). НаЛИЧИе рИбОСОМ В КЛеТКЭХ,

экстрагированных неионным детергентом, было показано также с ПОМОЩЬЮ метода электронной микроскопии (Lenk et al., 1977; Ramaekera et al., 1983) И ОКраШВЭНИеМ акрИДИНОВЫМ ОрЭНЖеВШ (Fulton et al, 1980; Gavrilova et al., 1987),

Данные электронной и иммунофяуоресцентной микроскопии показали, что в фиксированных клетках некоторые компоненты белок-синтезирувдей системы распределены вдоль филаментных структур. С помощью электронной микроскопии, объединенной с гибридизацией in situ, было показано, что мРНК (актино_ая, тубулиновая и виментиновая) распределены в клетках здоль актиновых филаментов (singer et ai., 1989). Цумбе с сотрудниками (zumbe et ai., 1982) было заявлено, что антитела

к 50 кДа мРНК-кэп-связывазощему белку окрашивали промежуточные филаменты в енк клетках. С помощью аутоиммунной сыворотки больных красной волчанкой, содержащей антитела, к рибосомам, было обнаружено, что рибосомы в фибробластах крысы распре делеш в вида пунктирных линий, по расположения напоминающих распределение актинових филаментов в этих клетках (Тоь а1., 1980). Используя метод ишунофлуоресцентной микроскопии, было обнаружено, ЧТО часть рибосом (Gavrilova ег а1. , 1987; НезкеЪЬ еЪ а1., 1991), а ТЭКЖе ЭуКЭрИОТИЧеСКОГС фа!£ТОра ИНЩИЭЦИИ 2 (ваугПоУа еЪ а1. , 1987) К эукариотического фактора элонгации 2 (Оауг11о\'а еЬ а!., 1987) ко-локализозаш с пучками актиновых филаментов.

Все. эти данные позволили предположить, что в эукариотической клетке разные типы цитоскелета могут каким-то образом участвовать в организации белок-синтезирувдего аппарата.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей . работы было изучение распределения эукариотического фактора элонгации 2 (еКЕ-г) в пролиферирущих и покоящихся фибробластах с помощь» метода непрямой иммунофлуоресценткой микроскопии. ен^-г рассматривался как маркер для выявления возможных мест локализации бедок-синтезиругацего аппарата в исследуемых клетках. • Экспериментальные задачи исследования состояли в слздумцем:

1) Изучить специфичность окрашивания актиновых филаментов антителами к сер-2.

2) Исследовать влияние ингкбирозакия синтеза белка посредством

инактивацяи сер-2 днфгерийным токсином или путем инактивации рибосом рицином на распределение екр-2 в фибробластах.

3) Выяснить, как влияет разборка актинового цитоскелета на локализацию еЕР-2 в фибробластах.

4) Изучить распределение еьт-г в покоящихся, то есть находящихся в во фазе клеточного числа, фибробластах.

Научная новизна работы

В результате настоящей работы получена картина распределения eEF-2, а также рибосом в фибробластах. Обнаружено, что в этих клетках, находящихся в пролиферирунцем состоянии или в о, фазе клеточного цикла, небольшая часть eEF-2 распределена вдоль пучков актиновых филаментов. Такая организация eEF-2 в "видимые" тяжи не существует per se, а зависит от наличия актинового цитоскелета. Обнаружено, что в фибробластах, находящихся в о» фазе клеточного цикла, основная часть eEF-2 и рибосом распределена вдоль промежуточных филаментов и/или микротрубочек. Высказано предположение, что разные цитоскэлетные структуры могут быть вовлечены в процесс организации аппарата трансляции в клетках зукариот.

Научно-практическая ценность работы

Результаты работы сведетельствуют в пользу того, что в клетках зукариот белок-синтезируодий аппарат может быть ко-локализозан вдоль разных типов цитоскелета. Это открывает перспективу создания модельных систем для изучения возможной

роли различных цитоскелетных структур в организации многочисленных компонентов белок-синтезирукщей системы в аппарат трансляции.-

Методические подходы, использованные в данной работе, могут быть применены для исследования распределения других компонентов белок-синтезирувдего аппарата в эукариотической клетке.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на Заседании Секции биологических макромолекул Московского отделения Всесоюзного Биохимического Общества РАН (Москва, 1989 и 1991), на Международной школе "Метода клеточной биологии" (Орхус, Дания, 1991), на Международной Конференции "Биосинтез белка" (Пущино, 1991), на Второй Международной конференции молодых ученых "Проблемы и методы молекулярной и клеточной биологии" (Каварна,-Болгария, 1991),' на Конференции Института белка РАН, посвященной 25-летию создания Института (Пущино, 1992), на 5-ом Международном Конгрессе по клеточной биологии (Мадрид, Испания, 1992). Материалы диссертации были апробированы на заседании комиссии по переаттестации аспирантов и сотрудников Института белка РАК 22 октября 1991 года.

Публикации

По теме диссертации имеется 7 публикаций.

ЭКСПЕРНМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и метода

Материалы. Среда lis, MEM и эмбриональная сыворотка теленка для культивирования фибробластов были получены от

фирмы Flow Laboratories (АНГЛИЯ), Среда ИГЛЭ - ИЗ ИНСТИТуТЭ

полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР, постнатальная сыворотка теленка - из Пылваского центра прикладной биотехнологии АПК ЭССР. Цитохалазин в, вторые антивидовые антитела, коныогированные с фдуоресцеин-изотиоцианатом, тетраметилродаминилизотиоцианатом и пероксидазой хрена - от фирмы sigma (США). £14сj лейцин был получен из Чехословакии, [3н] тимндин - ОТ фирмы Amereham (англия), эмульсия типэ "М" -

из НИИХимфотопроект, Москва, СССР. Очищенный препарат eEF-2 печени крысы и аффинно-очищенные антитела к eEF-2, полученные в козе, были зпобезно предоставлены JI.H. Мотуз (Институт белка РАН, Пущино), антитела к екк-2, полученные в кролике, - A.A. Мининым (Институт белка РАН, Пущино), антитела к белку st малой субчастицы рибосом, полученные в кролике, - доктором Шгалем (Центр Молекулярной Медицины им. Макса Дельбрюка, Берлнн-Бух, ФРГ), антитела к тубулину, полученные в кролике, -Ф.К.Гиоевой (Институт белка, РАН), монокпональные антитела к виментину, клон nt зо - профессором Ю.М.Васильевым (НИИ Канцерогенеза ВОНЦ РАМН, Москва), тетраметлл-родаминилизотиоцианат-фаллоидин - профессором Виландом (Институт медицинских исследований имени Макса Планка, Гейдельберг, ФРГ), дифтерийный токсин и рицин - А. Г.

Тоневицким (Кардиологический центр РАМН), культуры клеток диплоидных фибробластов кожи человека - М.Г. Фрид и И.В. Фуки (Кардиологический центр РАМН).

Методы. I. Культивирование клеток. В работе использованы диплоидные фибробласты кожи человека, культивировавшиеся в среде Игла с 10% эмбриональной сыворотки теленка и антибиотиками, и ' фибробласты эмбрионов мыши, культивировавшиеся в среде lis с 10% постнатальной сыворотки теленка и антибиотиками.

2. Обработка клеток дифтерийным токсином и рицином. Диплоидные фибробласты кожи человека, росшие на покровных стеклах 24 ч, инкубировали с ГО-9-Ю-8 М дифтерийного токсина или I0"I0-I0~9 М рицина в среде Игла в течение 6-23 ч при 37°С, Для контроля внутриклеточного синтеза белка покровные стекла с клетками инкубировали с [14с]лейцином (I мкКи/мл) 20 ч при 37 °С.

Обработка клеток цитохалазином d. Эмбриональные фибробласты мыши, росшие на покровных стеклах в течение 48 ч, инкубировали с 0,2 мкг/мл цитохалазина d 15-180 мин при 37 °С. Для изучения эффекта удаления цитохалазина d на распределение eEF-2, клетки на покровных стеклах сначала обрабатывали цитохалазином d в течение I ч, а затем промывали и инкубировали в среде без лекарства в течение I-I7 ч.

4. Перевод диплоидных фибробластов кожи человека из пролиферируицего состояния в о® фазу клеточного щг:яа осуществляли путем снижения концентрации эмбриональной телячьей сыворотки в среде Игла с 10% до 0,2 % с последующей инкубацией клеток в такой среде в течение 120 ч. Для

возвращения клеток, находящихся в о» фазе, в пролиферируицее состояние, к клеткам добавляли на 24 ч свежую среду Игла с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Состояние клеток (пролиферация или покой) выявляли через наличие или отсутствие в них синтеза ДНК, для чего клетки на покровных стеклах инкубировали с [3н)тимиданом (2 мкКи/мл) 24 ч при 37°С. Клетки рассматривали как пролиферирувдие, если в ядрах клеток обнаруживали [°нI-метку. Клетки считали покоящимися, если их ядра не содержали [эн]-метки после 24-часовой инкубации фибробластов с [3н]тимидином.

5. Электрофорез белков в денатурирующих условиях проводили в системе буферных растворов, описанной в работе Яэтт

(ЬаеттИ, 1970).

6. Характеристика антител к екг-г методом иммуноблоттинга. Для переноса белков из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозу использовали систему "полусухого" электрофоретического переноса (куЬзв-Апаегаеп, 1984). Для выявления связывания первых антител (антител к еЕР-2) использовали вторые антивидовые антитела, коньюгированные с пероксидазой.

7. • Иммунофлуоресиентное окрашивание клеток и их микроскопия. Клетки, росшие на покровных стеклах, промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), фиксировали 1% формальдегидом в ФСБ в течение 10-15 мин при комнатной температуре, промывали ФСБ, затем обрабатывали 1% Тритоном Х-100 в ФСБ в течение 30 мин. Такие клетки инкубировали с первыми антителами к еЕР-2, к рибосомному белку Б7, к виментину и тубулину (50-60 мин при комнатной температуре), а затем со вторыми антивидовыми

антителами, коньюгированныни с флуоре сцеинизотиоцианатом или тетраметилродамщшл-изотиоцианатом (50-60 мин при комнатной температуре). В случае выявления, актиновых филаментов ко вторым антителам добавляли тетраметил-родаминилфаллоидин (0,03-0,1 мкг/мл). Окрашенные клетки наблюдали с помощью Фотомикроскопа III (Оптон, ФРГ), снабженного набором светофильтров для родамина (tritc) (487714) и для фяуоресцеина (fitc) (487710) (селективный).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение распределения eEF-2 в пролиферирукщих фибробластах методом непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии

а) Распределение антител к еЕи-г в пролиферирупцих фибробластах

В пролиферирупцих фибробластах антитела к еЕР-2 интенсивно окрашивали околоядерную зону. Яркость, окраски в этой зоне очень высока, поэтому методом иммуиофлуоресцентной микроскопии невозможно проследить какие-либо особенности, характерные для локализации молекул еЕР-2 в этой области клетки.

Помимо околоядерной зоны антитела к еЕР-2 окрашивали Тяжи, по виду и распределению наломинащие пучки актиновых филаментов в фибробластах. Поэтому одну и ту же клетку окрашивали антителами к еЕР-2 и фаллоидином, выявляющим полимеризованный актин. Оказалось, что тяжи, окрашиваемые антителами к еЕК-2 (рис. 1А), совпадают с пучками актиновых

Рис. I. Распределение еЕК-2 в пролиферирувдих фиброблэстах эмбрионов мьшш. (А,Б)- исходные клетки; (В,Г) клетки после инкубации с цитохалазином о (0,2 мкг/мл) 3 ч, 37 °С . Двойное окрашивание клеток: ■ (А,В) антитела™ к еЕ¥-2, цолученными в кролике;(Б,Г) тетраметилродаминилфаллоидином. Масштаб: 20 мхм.

филаментов (рис. 1Б). Но не все пучки актиновых филаментов окрашиваются антителами к eEF-2. Например, часто краевые пучки актиновых филаментов, а также некоторые скопления актиновых филаментов в центральных областях клетки не окрашивались антителами к eEF-2 (рисЛА.Б). Окрашивание пучков актиновых филаментов антителами к eEF-2 наблюдали в двух исследованных видах фибробластов: фибробластах эмбрионов мыши и диплоидных фибробластах кожи человека.

б) Доказательства специфичности окрашивания пучков

актиновых филаментов в фибробластах антителами к eEF-2

Был получен ряд доказательств того, что окрашивание пучков актиновых филаментов антителами к eEF-г не является результатом неспецифической сорбции этих антител на указанных' пучках. Во-первых, антитела к eEF-г выявляют в .гомогенатах фибробластов преимущественно одну полосу, по электрофорегаческой подвижности совпадающую с eEF-2 (рис. ZAJ, Б1, BI). Во-вторых, антитела к eEF-2, полученные в козе и кролике, распределяются в клетке аналогичным образом. В-третьих, после предъинкубации антител к eEF-2 с 10-кратным молярным избытком антигена эти антитела переставали окрашивать клетки. Это говорит о том, что используемые антитела к eEF-2 взаимодействуют с компонентами клетки антиген-связЫвакщшш участками. В-четвертых, если вместо первых антител использовали преиммунные иммуноглобулины класса g, окрашивания не наблюдалось при концентрациях преиммунных иммуноглобулинов по крайней . мера в два раза выше, чем

требовалось для получения яркой флуоресценции с антителами к еЕР-2. В-пятых, не все пучки актиновых фшгаментов окрашивались антителами к еЕР-2, что тоже может говорить в пользу специфического окрашивания этих пучков. Наконец, экстракция клеток Тритоном Х-100 приводила к практически полному исчезновению окрашивания их антителами к еЕР-2. При этом такая обработка клеток сохраняла актин-содержаадае структуры. Эти результаты были подтверждены данными иммуноблотткнга, показавшими, что обработка нативных клеток Тритоном удаляла из

■V23

1 2 3

1 г з

Рис. 2. Состав белков фибробластов эмбрионов мыши, выявляемый электрофорезом и иммуноблоттингом. <А) Гель, окрашенный Кумасси. (Б) Иммуноблоттинг белков, выявляемых антителами к еЕР-2, полученными в кролике. (В) Иммуноблоттинг белко&, выявляемых антителами к еЕР-2, полученными в козе. Дорожка Т -целые фибробдасты, дорожка 2 - фибробласты после экстракции Тритоном Х-100, дорожка 3 - очищенный препарат еЕР-2 из печени крысы, дорожка ми - молекулярные массы маркеров (в кДа).

них практически весь eEF-2 (рис. 2 AZ, Б2, В2).Перзчисленные вше данные свидетельствуют в пользу того, что использованные в работе препараты антител действительно выявляют распределение eEF-2 в фибробластах.

Таким образом, можно считать доказанным, что в цитоплазме фибробластов eEF-2, помимо околоядерной области, может быть локализован на нитях, по местоположению совпадающих с актин-содержащими филаментами.

По литературным данным другие факторы трансляции также могут локализоваться вдоль актиновых филаментов и, возг.ожно, даже взаимодействовать с ними. Так, была обнаружена локализация фактора инициации 2 вдоль пучков актиновых филаментов в фибробластах (Gavriiova et ai., iü87). 50 кДа актин-связываиций белок ИЗ Dictyostelium discoideum ОКаЗЭЛСЯ фактором элонгации 1а ЭТОГО организма (Yang et ai., 1990).

Изучение распределения рибосом в фибробластах с помощью антител к белку S7 малой рибосомной субчастицы

Выяснилось, что рибосомы распределены в фибробластах сходным с еЕк-2 образом. Так, антитела к белку Б7 малой рибосомной субчастицы окрашивают околоядерную зону, а также тяжи, совпадающие с пучками актиновых филаментов, выявляемых родаминил-фаллоидином. Специфичность окрашивания фибробластов антителами к рибосомному белку б7 установлена в работе (ОаугИоуа еЬ аХ. , 1987), ЭТИ результаты СОГЛЭСуЮТСЯ С литературными данными о локализации рибосом вдоль актиновых филаментов (ТоЬ et а!., 1980; СаугИоУо et а!., 1987; Неэке^Ь

et al. , 19 Ь1)

Влияние дифтерийного токсина и рицина на локализацию eEF-2 вдоль пучков актиновых фильментов в фибробластах

Для того, чтобы выяснить, да может ли остановка синтеза белка привести к удалению eEF-2 с актиновых филаментов, были поставлены эксперименты по кнгиблрованип синтеза белка путем

ШШСТИВаЦИИ eEF-2 ДИфтерИЙПЫМ ТОКСИНОМ (Pappenheimer, 1977) ИЛИ инактивации рибосом рицином (Endo et а]., 1987). Оказалось, что сама по себе остановка синтеза белка обоими способами не запрещает локализацию eEF-2 вдоль актиновых филаментов в фибробластах. После подавления синтеза белка каждым из обозначенных ингибиторов при концентрациях

Таблица I. Влияние дифтерийного токсина и рицина на включение [14С] лейцина , в диплоидные фибробласты кожи человека

Время Включение [Г4С] лейцина в Ю4 клеток (гот/мин)

инкубации контроль +дафтерийшй токсин +рицин

(часы) Ю_9М 10""% ю'Щл Г0_9М

0 449 - - -

3 10263 1370 331 1479 313

20 72799 I7S8 404 2239 712

дифтерийного токсина и рицина, указанных в Таблице I, eEF-2 продолжал распределяться вдоль пучков актшювнх филаментов в диплоидных фибробластах кожи человека.

Влияние цитохалазина о на организацию в виде "вгдимых" тяжей в фиОроОластах

Одной из экспериментальных задач было выяснить, зависит ли организация еЕК-2 в "видимые" тяжи от наличия актинового цитоскелета, шш енг-2 организован в виде тяжей независимо от

ч

актинового цитоскелета. Поэтому мы решили разобрать актиновые филаменты и посмотреть, сохранится ли организация еЕк-2 в виде тяжей. Оказалось, что разборка актиновых филаментов 1п VI.уо цитохалазином О (СБ) (ВегвЪаавку апа УазШеу, 1988) сопровождается разборкой еЕР-2-тяжей. Обработка клеток со (0,2 мкг/мл) в течение 3 часов приводит к разрушению пучков актиновых филаментов и образованию агрегатов остатков актиновых филаментов (рис. 1Г). При •этом антитела к еЕР-2 окрашивают агрегаты, совпадающие с агрегатами остатков актиновых филаментов, и не окрашивают тяжей (рис. 1В). Этот процесс обратим: вслед за удалением со из среды, еЕР-2-тяжи вновь организуются вдоль реконструирующихся пучков актиновых филаментов. Таким образом, еЕЕ-2-тяжи разбираются и собираются одновременно с разборкой и сборкой актиновых филаментов. Все это говорит о том, что еЕР-2-тяжи не существуют сами по себе, а организация еЕк-2 в "видимые" тяжи зависит от наличия актинового цитоскелета.

Возможно,что организация других компонентов аппарата трансляции В фибробластах (рибосом (ТоЬ еЬ а1., 1980; СаугИоуа et а1., 1987; НезкегЬ ег а1., 1991), фЭКТОра инициации 2 (йаугИоуа а1., 1987)) в виде тяжей также не существует сама по себе, а зависит от актинового цитоскелета.

По данным литературы обработка клеток цитохалазинами, разрушающими актиновыс филзменты, приводила к тому,что факторы инициации eIF-2o, eIF-2ß, eIF-2f, eIF-4B, eIF-3 (Howe and Hershey, 1984), ПОЛИрИбОСОМЫ (Lenk et al., 1977; Ilamaekers et al,, 1983; Howe and Hershey, 1984 ; Ornelles et al., 19B6; Vedeler et al., 1991), а ТЭКЖе МРНК (Lenk et al., 1977; Howe and Hershey, 1904; Bird and Seils, 1986; Ornelles et al.,

1986) переходили вместе с актином в детергент-растворимую фракцию.

Влияние экстракции фибробластов Тритоном Х-100 на окргливание их антителами к eEF-2

Для того, чтобы оценить, насколько прочно удерживается eEF-2 вдоль пучков актиновых филамеитов, фибробласты экстрагировали неионным детергентом и окраяквали антителами к eEF-2. Оказалось, что если фибробласты до их фиксации обработать I% Тритоном Х-100 в условиях, когда сохраняются все цитоскелетные структуры, антитела к cef-з вообще пе^стают окрашивать клетку. Другие компоненты аппарата трансляции могут сохранять распределение вдоль актиновых филаментов в клетках, экстрагированных Тритоном Х-100. Tait с помощью метода непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии было показано, что рибосомы

(Gavrilova et al., 1987; Hesketh et al., 1991) И фЭКТОр инициации 2 (Gavrilova ot al,, 1987) удерЖИВаЛИСЬ ВДОЛЬ акгиновнх филаментов после обработки клеток Тритоном. Также с помощью биохимических методов было показано, что рибосомы и !й>НК могут сохраняться в Тритон-нерастворимой фракции клеток

(СН. обзор Hesketh and Pryme,' 1991). ЭТИ ДЭННЫ8 ПОЗВОЛЯЮТ

предположить, что в кеэкстрагированных клетках липиды могут принимать участие в удержании eEF-2 около рибосом, которые в

свою очередь локализованы вдоль актиновых филаментов. Таким

>

образом, обнаружено, что ассоциация eEF-2 с актиновыми филаментами не такая прочная, как может"быть в случае рибосом и мРНК.

Распределение eEF-2 и рибосом в фибробластах, находящихся в Go фазе клеточного цикла

Диплоидные фибробласты кожи человека переводили в покоящееся состояние (о» фазу клеточного цикла) путем понижения концентрации сыворотки в среде культивирования с 10% до 0,2%. Переход клеток в состояние покоя контролировали по отсутствию в них синтеза ДНК. Было обнаружено, что в фибробластах, находящихся в с» фазе клеточного цикла, основная .часть молекул еЕР-2 распределена вдоль изогнутых филаментов, напоминающих промежуточные филаменты или микротрубочки. В связи с этим клетки, находящиеся в а«, стадии клеточного цикла, были одновременно окрашены антителами к еЕР-2 и антителами к 'виментину, белку промежуточных филаментов в фибробластах. Оказалось, что изогнутые филаменты, окрашиваемые антителами к еЕР-2 (рис. ЗА), окрашиваются также и антителами к виментину (рис. ЗБ). Двойное окрашивание фибробластов в фазе а0 антителами к виментину и тубулину обнаружило совпадение распределения основной части промежуточных филаментов и микротрубочек. Отсюда следует, что в фибробластах,

Рис, 3. Распределение евг-г в фибробластах, находящихся в оо фазе клеточного цикла. Двойное окрашивание диплоидных фибробластов кола человека, находящихся в о» фазе клеточного цикла, антителами к еЕР-2, полученными в кролике, (А) и антителами к вименгину (Б). Масятаб: 20 мкм.

переведенных в а» стадию, большая часть еЕ?-2 может быть ко-локализована вдоль промежуточных филаментов и/или микротрубочек. На рис. ЗА видно также, что в фибробластах,

находящихся в о« фаза клеточного цикла. . как и в

)

пролиферирупцих клетках (рис. 1А). небольшая часть молекул еЕК-2 может расцределяться вдоль пучков актиновых филаментов.

Изучение распределения рибосом в фибробластах, находящихся в во фазе клеточного цикла,показало, что в таких клетках рибосомы, как и еЕР-2, также локализованы вдоль промежуточных филаментов и/или микротрубочек: рисунок окрашивания изогнутых филаментов антителами к белку Б7 малой субчастицы рибосом совпадал с рисунком окрашивания промежуточных филаментов антителами к влментину.

Распределение еЕР-2 в стимулированных к пролиферации фибробластах

Клетки, находящиеся в во стадии, можно вернуть обратно в клеточный цикл, повысив концентрацию сыворотки в среде культивирования. Картина распределения екк-2 в фибробластах, находящихся на пути из во стадии к в фазе клеточного цикла, но еще не вошедших в б фазу, отличается от картины распределения еЕк-2 как в с», так и в пролиферирупцих клетках. В процессе перехода клеток из в« фазы в клеточный пикл антитела к еъ?-2 перестают окрашивать в этих клетках изогнутые филаменты, а окрашивают по преимуществу прямые короткие пучки актиновых филаментов. По виду такие пучки актиновых филаментов нетипичны как для пролиферирупцих, так и для покоящихся фибробластов.

Это указывает на то, что в процессе выхода клеток из о» фазы и вхождения их в шел происходит заметная реорганизация актинового цитоскелета, сопровождающаяся также и заметными изменениями в распределении молекул eEF-2.

Таким образом, полученные в работе результаты позволяют высказать предположение о том, что в зукариотичеекой клетке не только актиновый цитоскелет, но и другие типы цитоскелетных структур (промежуточные филаменты и/или микротрубочки) могут быть вовлечены в организацию белок-синтезирущего аппарата.

вывода

1. В пролиферируппих и покоящихся фибробластах небольшая часть eEF-2 распределена вдоль сучков актиновых филаментов.

2. Ингибироваше синтеза белка посредством инактивации eEF-2 дифтерийным токсином или путем инактивации рибосом рицином не запрещает распределения eEF-2 вдоль пучков актиновых филаментов в фибробластах.

3. Разборка актиновых микрофиламентов как следствие обработки фибробластов цитохалазиноы d сопровождается разборкой "видимых" eEF-2-тяжей. Это означает, что eEF-2-фИЛаМеНТЫ не существуют В клетке per se-, и что организация eEF-2 в "видимые" тяжи зависит от наличия актинового цитоскелета. . . -

4. В покоящихся фибробластах основная часть eEF-2 и рибосом оказывается распределенной вдоль промежуточных

филаыентов и/или микротрубочрк.

5 Результаты работы дают основание предположить, что в клетках эукариот разные типы щЛоскелетных структур могут быть вовлечены в процесс организации аппарата синтеза белка.

■у

Основные результаты, диссертации отражены в следующих публикациях:

1. Шестакова Е.А., Гаврилова Л.П. Влияние цитохалазина о, дифтерийного токсина и рицина на локализацию эукариотического фактора элонгации 2 вдоль пучков актиновых филаментов в фибробластах. //ДАН - 1992 - т.324 - стр. 196-199.

2. Gavrilova L.P. and Shestakova Е.А. Eukaryotic elongation factor 2 is distributed along aotin microfilament bundles in mouse embryo fibroblasts. //J.Cell Biol., -1990-v.lll, p.160a. Abstr. The American Society for Cell Biol. Thirtieth Annual Meeting, 9-13 December 1990, San Diego, California;

3. Shestakova E.A., Motuz L.P., Hinin A.A., Qelfand V.I, and Qavrilova L.P. Sone of eukaryotic elongation factor 2 is colocalized with actin microfilament bundles in mouse embryo fibroblasts. //Cell Biol. Int. Rep. -1991 - v.15 - pp.75-84.

4. Shestakova E.A., Hinin A.A., Motuz L.P. and Qavrilova L.P. Effect of cytochalasin D, diphtheria toxin and ricin on co-localization of eukaryotic elongation factor 2 (EF-2) along actin microfllament bundles in fibroblasts. //International Conference "Protein Biosynthesis", Pushchino, USSR, August 26-September 3, 1991, Abstr. - p. 86.

5. Shestakova E.A. and Gavrilova L.P. Eukaryotic

elongation factor 2 (EF-2) distribution in_ cycling and Go fibroblasts. //5th International Congress on Ceil Diology, Madrid (Spain), 26th-31st July, 1992, Abstr. - p.46.

6. Shestakova E.A., Hotuz L.P., Hinin A.A. and Gavrilo^a L.P. Study of localization of the protein-synthesizing machinery along actin filament bundles. //Cell Biol. Int. Hep.

1993 - в печати.

7. Shestakova E.A., Hotuz L.P. and Gavrilova L.P. Co-localization of components of the .protein-synthesizing machinery with cytoskeleton in <3o-arrested cells. //Cell Biol.

int. Rep. -1S93- в печати.