Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кальций- и актинзависимое ингибирование синтеза белка в культуре клеток

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шаров, Вадим Иванович, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ФИЛИАЛ ИНСТИТУТА БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи УДК 576.362

ШАРОВ Вадим Иванович

КАЛЬЦИЙ- И АКТИНЗАВИСИМОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ СИНТЕЗА БЕЛКА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК

03.00.04 — Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических^аук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Ю.Б. Алахов

Пущино - 1998

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АДФ аденозиндифосфат

АТФ аденозинтрифосфат

БСА бычий сывороточный альбумин

ДМСО диметилсульфоксид

ДСН (SDS) додецил сульфата натрия

ДТТ дитиотреитол

JIC лошадиная сыворотка

мРНК матричная рибонуклеиновая кислота

мРНП рибонуклеопротеидные частицы мРНК

ПААГ полиакриламидный гель

протеинкиназа А цАМФ-зависимой протеинкиназа

протеинкиназа С кальций/фосфолипид-зависимая протеинкиназа

ТХУ трихлоруксусная кислота

ТСБ трис солевой буфер

ФДЭ фосфодиэстераза

ФКС эмбриональная (фетальная) сыворотка крупного

рогатого скота

ФСБ (PBS) фосфатный солевой буфер

цАМФ циклоаденозинмонофосфат

ЭГТА (EGTA) этиленгликольтетрауксусная кислота

ЭДТА (EDTA) этилендиаминтетрауксусная кислота

СаМ кальмодулин

HEPES ]Ч-2-гидроксиэтилпиперазин-]Ч'-2-этансульфоновая кислота (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-etane sulfonic acid)

[Ca2+]in внутриклеточная концентрация свободного кальция

[Ca2+]out внеклеточная концентрация свободного кальция

Оглавление.

Список сокращений 1

I. Введение 4

И. Обзор литературы 6

1. Клеточный синтез белка. 6

1.1. Изменения в синтезе белка по циклу и при дифференцировке. 6

1.2. Регуляция трансляции мРНК. 8

1.3. Регуляция синтеза прото-онкогенов и цитокинов. 11

1.4. Гормон-зависимая регуляция синтеза белка и регуляция синтеза 17 белка во время оогенеза.

2. Роль кальция в проведении сигнала. 22

2.1. Рост внутриклеточной концентрации кальция при разных стимулах. 23

2.2. Регуляция кальциевого сигнала. 23

2.3. Влияние кальция на синтез белка. 25

3. Цитоскелет. 27

3.1. Структуры цитоскелета. 28

3.2. Связь элементов белок-синтезирующей системы с цитоскелетом. 32

3.3. Кальций-зависимые изменения цитоскелета. 36

3.4. Изменения цитоскелета в клеточном цикле. 39 Заключение 41

III. Материалы и методы 44

1. Клеточные методы. 40

2. Мечение клеточных белков. 47

3. Электрофоретические методы. 43

4. Иммуноблоттинг. 49

5. Иммунофлюоресцентная микроскопия. 50

6. Измерение уровня внутриклеточного кальция. 53

7. Получение С2 токсина. 54

IV. Результаты и их обсуждение 58 1. Разработка метода, позволяющего обнаружить кратковременные 58

изменения в синтезе белка

2. Повышение уровня внутриклеточного кальция после добавления 62 иономицина.

3. Иономицин вызывает кратковременное ингибирование синтеза 63 белка в покоящихся клетках РС 12.

4. Действие кальциевого антагониста - кобальта на синтез белка в 72 покоящихся клетках

5. Влияние ингибитора кальмодулина W7 на синтез белка. 74

6. Влияние лития, ингибитора инозитольного обмена, на 78 ингибирующий эффект кальциевого ионофора

7. Зависимость синтеза белка от состояния актинового цитоскелета. 80

7.1. G2 токсин. 80

7.2. Обработка С2-токсином вызывает разборку актиновых 84 филаментов в эукариотических клетках

7.3. ADP-рибозилирование актина увеличивает пул его мономеров 86

8. Деполимеризация микрофиламентов приводит к ингибированию 87 синтеза актина

8.1. С2-токсин влияет на синтез небольшой группы белков в клетках 90

А31

9. Изменения в общем синтезе белка, индуцированные С2 токсином 91 9.1. Посттранскрипционная регуляция экспрессии актина в клетках, 93

обработанных С2-токсином

10. Разрушение цитоскелетных структур при тепловом шоке. 95

V. Заключение 100

VI. Выводы 103

VII. Список литературы 104 Благодарности 130

I. Введение.

Регуляция пролиферативного ответа - одна из важнейших проблем современной биологии. Современные физико-химические методы позволили изучить многие аспекты перехода клетки к делению. Первым этапом запуска пролиферации является присоединение к рецептору покоящейся клетки белкового фактора роста.

Взаимодействие фактора роста с рецептором ведет к запуску внутриклеточного каскадного механизма, что приводит к образованию внутриклеточного регулятора в цитозоле клетки. В этой схеме белковый фактор называют внеклеточным или первичным посредником, а молекулу (или комплекс молекул) внутриклеточного регулятора - вторичным посредником (мессенджером). Число известных гормонов и вызываемых ими эффектов довольно значительно. Вторичных посредников не много. Ион кальция является одним из них. Хотя общее содержание кальция в большинстве клеток не так уж и мало (порядка 1мМ), концентрация свободного, ионизированного кальция в цитозоле поддерживается на чрезвычайно низком уровне (обычно ниже 100 нМ). Внеклеточная концентрация ионов кальция обычно около 1 мМ (см. напр. Бипкап, 1976; СагайэН & Реппн^оп, 1985). Преимущество поддержания столь малой концентрации Са2+ в клетке по сравнению с внеклеточной средой очевидно: при таком исходном уровне даже ничтожное увеличение абсолютного количества свободных ионов кальция приведет к большому увеличению его

концентрации, что в свою очередь, вызывает каскад фосфорилирования/дефосфорилирования многих белков.

Одной из возможных мишеней митоген-зависимого фосфорилирования и дефосфорилирования может являтся белок-синтезирующая система клетки. Действительно, при переходе к делению необходимо быстрое переключение "программы" клеточного белкового синтеза. В связи с этим актуальным является получение информации о специфичности действия кальциевого сигнала на синтез белка при вхождении клетки в пролиферативный цикл.

Имеется большое количество данных относительно вовлечения актинового скелета в пространственную и временную организацию белкового синтеза в живой клетке (Sheterline et al., 1986; Rijken et al., 1991). В настоящее время существует мнение, что вызываемые гормонами изменения внутриклеточного распределения ионов кальция могут быть связаны с динамикой цитоскелета (Farmer, 1986; Hartwig, 1992). В частности, предполагается участие в передаче сигнала от мембраны на цитоскелет G белков, фосфолипазы С и инозитолфосфатного цикла (Forscher, 1989; Ridley and Hall, 1992). При различных стрессовых воздействиях происходят почти синхронные изменения в перестройках цитоскелета и синтезе белка. Одним из клеточный ответов на стресс является повышение внутриклеточной концентрации кальция.

Таким образом, изучение цитоскелет-зависимых изменений синтеза белка может объяснить процессы кальциевой регуляции белкового синтеза.

II. Обзор литературы.

1. Клеточный синтез белка.

Изменения клеточных программ невозможны без точной регуляции биосинтеза белка.

Матричные РНК в клетках эукариот всегда связаны с белками и образуют рибонуклеопротеидные частицы (мРНП или информосомы). Белки, ассоциированные с мРНК, контролируют ее активность в белковом синтезе, время жизни в клетке и внутриклеточное распределение (Эртп, 1978).

Гормоны и другие внеклеточные сигналы влияют как на общий синтез белка клетки, так и на биосинтез определенных клеточных белков. Это влияние может быть как непосредственное, так и через активацию системы вторичных посредников (Вегпс^е, 1985). Регуляция общего синтеза белка идет и на транскрипционном уровне, и посттранскрипционно, и на уровне трансляции (НегзЬеу, 1991). Рассмотрим некоторые общие вопросы регуляции синтеза белка в эукариотической клетке, в том числе на разных стадиях клеточного цикла.

1.1. Изменения в синтезе белка по циклу и при дифференцировке.

Спектр синтезируемых на разных стадиях клеточного цикла белков различен. Так гистоны синтезируются во время 8 фазы клеточного цикла (Акегшап ег а1, 1984). Накопление гистонов в цитоплазме в конце 8 фазы приводит к ингибированию их синтеза (ВаишЬасЬ ег а!., 1987). Показано, что регуляция экспрессии гистоновых генов идет как на уровне транскрипции

(Capasso & Heintz, 1985), так и на уровне трансляции (Borun et al., 1975). При переходе через Gi происходит активация транскрипции онкогенов с-fos, с-jun, с-тус и др. (Pardee А.В., 1989).

Одним из механизмов регуляции клеточного цикла является дестабилизация "отслуживших мРНК" (Decker & Parker, 1993; 1994). Распад мРНК играет важную роль в определении уровня мРНК во время развития специализированных клеток. Например, во время развития клеток хрусталика, мРНК, кодирующие а и (5 кристаллины, стабилизируются (Yoshida & Katoh, 1972). Большинство же других мРНК при развитии клеток хрусталика деградируют, вследствие этого мРНК кристаллинов накапливаются в большом количестве в дифференцированной клетке (Yoshida & Katoh, 1972). Схожий механизм в полностью дифференцированном эритроците обеспечивает то, что 90-95% внутриклеточного белка составляет гемоглобин. Глобиновая мРНК стабильна на всех стадиях созревания клетки. Однако другие мРНК дестабилизируются во время развития красных кровяных клеток (Aviv et al., 1976). Было подсчитано, что концентрация гемоглобина в эритроците была бы значительно меньше, если бы другие мРНК не были бы дестабилизованы (Avi wet al., 1976).

Размеры и времена полужизни нескольких, не охарактеризованных мРНК, были проанализированы во время дифференцировки эритроидных MEL клеток (Volloch et al., 1987). Как и ожидалось, их времена полужизни изменяются во время дифференцировки. Изменения в стабильности мРНК, по-видимому, связаны с изменением размеров (укорочением поли(А) последовательности). Более того, время полужизни мРНК различно, в

зависимости от того, была ли она синтезирована до или после того, как началась дифференцировка (Volloch et al., 1987). Регуляция синтеза белков в процессе клеточного цикла через накопление продукта гена per (period-gene, Drosofyla melanogaster) вызывает ускорение деградации собственной мРНК (Hardin et al., 1990).

Из этих данных следует, что транскрипция и сплайсинг, так же, как и трансляция, влияют на время полужизни мРНК при клеточной дифференцировке и на разных стадиях клеточного цикла.

Гормон-зависимая регуляция на уровне мРНК и регуляция синтеза протоонкогенов будет рассмотрена ниже.

1.2. Регуляция трансляции мРНК.

Внеклеточный сигнал непосредственно (например, через рецептор-зависимую тирозинкиназу или/и активацию вторичных мессенджеров) запускает каскад фосфорилирований и дефосфорилирований белков (Cohen, 1982; Berridge, 1985; 1987). Зачастую конечным этапом каскадов являются белки белоксинтезирующей системы: факторы инициации, элонгации, белки мРНП. Большинство факторов инициации и элонгации трансляции подвергается фосфорилированию. В некоторых случаях фосфорилирование стимулирует трансляцию (фосфорилирование eIF-4E, elF-2В и eEF-1), в других оказывает ингибирующее действие (фосфорилирование eIF-2, eIF-2B, eEF-2A и eEF-2B) (см. напр. Tuazon et al., 1989; Chang & Traugh, 1996). Во многих случаях влияние фосфорилирования факторов трансляции на биосинтез белка прямо пока не установлено (eIF-3, eIF-4A, eIF-4B, eIF-4G)

(Morley & Traugh, 1990; Chang & Traugh, 1996). Остановимся на некоторых примерах.

Инсулин подавляет фосфорилирование фактора eIF-2B в фибробластах или клетках яичника китайского хомячка и стимулирует активность фактора по обмену GDP на GTP, активируя синтез белка (Welsh & Proud, 1993). С другой стороны, инсулин стимулирует фосфорилирование eEF-lA, аир субъединиц eEF-lB в культуре клеток 3T3-L1. При инкубации клеток 3T3-L1 в среде без сыворотки активность eEF-lA и eEF-lB уменьшалась на 50%. После добавления сыворотки активность восстанавливалась одновременно с увеличением фосфорилирования eEF-lA, аир субъединиц EF-1B. Предполагается, что фосфорилирует эти факторы элонгации инсулин-зависимая S6 протеинкиназа. (Tuazon et al., 1989; Chang & Traugh, 1996). Для этой протеинкиназы также характерно фосфорилирование белка S6 малой субъединицы рибосомы.

Существует прямая корреляция между пролиферативным статусом клетки и степенью фосфорилирования фактора eIF-4B (Hershey, 1991). При инкубации клеточных культур в бессывороточной среде, а также при тепловом шоке (42-45 °С) наблюдается дефосфорилирование eIF-4B. Если после этих экстремальных условий клетки поместить в среду с сывороткой или культивировать их при +37°С, наблюдается фосфорилирование eIF-4B и активация белкового синтеза (Hershey, 1991). Эпидермальный фактор роста и инсулин могут стимулировать фосфорилирование eIF-4B в 2-4 раза (Chang & Traugh, 1996). Инсулин также вызывает фосфорилирование eIF-3 (Morley & Traugh, 1990).

Одним из примеров положительного влияния фосфорилирования на биосинтез белка является фосфорилирование кэп-связывающего фактора инициации eIF-4E (Duncan et al, 1987; Chang & Traugh, 1996). eIF-4E непосредственно взаимодействует с кэп структурой на мРНК. Взаимодействие eIF-4E с кэпом является скорость-лимитирующим фактором в процессе инициации трансляции. Относительное содержание eIF-4E значительно меньше содержания всех остальных факторов трансляции и составляет около 1 молекулы на 4 рибосомы (Duncan et al, 1987). Скорее всего, в клетке функционально активный eIF-4E представляет собой фосфорилированный белок. Так eIF-4E, находящийся в 48S преинициаторном комплексе, фосфорилирован на 80-85%. в то время как свободный eIF-4E фосфорилирован только на 50% (Lamphear & Panniers, 1990).

Степень фосфорилирования eIF-4E прямо коррелирует со скоростью белкового синтеза в клетке. Например, усиление фосфорилирования eIF-4E, сопровождающееся активацией белкового синтеза, наблюдалось в В-лимфоцитах после обработки клеток митогенами: форболовыми эфирами (Frederickson et al, 1991; Morley & Traugh, 1989; Rychlik et al, 1990), форболовыми эфирами с иономицином или липополисахаридами (Rychlik et al, 1990). 2,5-5 кратное усиление фосфорилирования eIF-4E и стимуляция белкового синтеза в фибробластах наблюдались под действием инсулина (Morley & Traugh, 1990), эпидермального фактора роста (Donaldson et al, 1991), фактора некроза опухолей (Marino et al, 1991), фактора роста тромбоцитов (Frederickson et al, 1991), а также при инкубации с сывороткой (Kaspar et al, 1990).

Фосфорилирование фактора eIF-4E в клетках феохромоцитомы (PC 12) наблюдалось под действием фактора роста нервных клеток, вызывающего

дифференцировку этих клеток (Frederickson et al, 1991; Morley & Traugh, 1989). Ингибироваиие одного из генов раннего ответа, RAS, в клетках PC 12 с доминантными супрессорными мутациями приводило к подавлению дифференцировки под действием фактора роста нервных клеток. В таких клетках фактор роста нервных клеток вызывал существенно меньшее фосфорилирование eIF-4E по сравнению с контрольными клетками. (Frederickson et al, 1992). Усиление фосфорилирования eIF-4E также наблюдалось в клетках эмбриональной карциномы PI9 при их индукции к дифференцировке эпидермальным фактором роста (Kleijn et al, 1995). Скорость белкового синтеза при этом увеличивалась (Kleijn et al, 1995).

Таким образом, фосфорилирование eIF-4E необходимо для ранних стадий дифференцировки.

Одним из следствий ингибирования синтеза белка может быть, как не парадоксально, стабилизация мРНК. Ингибирование синтеза белка пуромицином и эметином приводит к стабилизации гистоновых мРНК и к их накоплению (Sittman et al., 1983). Ингибирование трансляции циклогексимидом стабилизирует почти все мРНК млекопитающих, Dictyostelium и дрожжей (Herrick et al., 1990; Brown, 1993). Аналогичные результаты получены при использовании искусственной мРНК (Aharon & Schneider, 1993). Это также характерно для мРНК тубулина, связанной с полисомами (Pachter et al., 1987).

Не будет большой натяжкой предположить, что ингибирование синтеза белка может играть активную роль в регуляции стабильности мРНК.

1.3.

Регуляция синтеза прото-онкогенов и цитокинов.

Клеточные протоонкогены, или с-опс гены, гомологичны генам, найденым в трансформирующих вирусах. Они важны для регуляции клеточного роста и дифференцировки, и их экспрессия коррелирует с началом и прогрессией карциногенеза в различных клетках. Например, введение дополнительных копий с-тус протоонкогена в MEL клетки блокирует их дифференцировку в ответ на химическую обработку (Coppola & Morgan, 1986). Вирус птичьего лейкоза (ALV) индуцирует лейкемию, когда интегрируется возле 5' конца с-тус гена, и таким образом активирует экспрессию с-тус (Hayward et al., 1981).

Уровни различных протоонкогенных белков и их мРНК, включая c-fos, с-тус, и c-myb регулируются в процессах пролиферациии и дифференцировки фибробластов и некоторых гематопоэтических клеток. Эти мРНК малочисленны в покоящихся (Go) клетках, но быстро аккумулируются в клетках, стимулированных к пролиферации сывороткой или ростовыми факторами (Campisi et al, 1984). После первоначального всплеска синтеза мРНК, концентрации мРНК с-тус и c-myb падают до уровня, наблюдаемого в экспотенциально растущих клетках (Blanchard et al., 1985; Dani et al., 1985). Увеличение концентрации мРНК протоонкогенов может происходить за счет: увеличения уровня транскрипции мРНК; посредством изменения стабильности мРНК; совокупности этих механизмов (Cole, 1986). Например, инкубация с сывороткой вызывает быструю, но временную аккумуляцию мРНК c-fos за счет ускорения транскрипции гена c-fos (Greenberg & Ziff, 1984). Напротив, обработка митогеном некоторых эндотелиальных или лимфоидных клеток вызывает временную стабилизацию и аккумуляцию мРНК с-тус (Cole, 1986). Когда покоящиеся первичные гладкомышечные

клетки из аорты быка переносят из среды с низкой концентрацией сыворотки в ср