Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение ранних этапов взаимодействия вирусов с клетками

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение ранних этапов взаимодействия вирусов с клетками"

ГЛАВНОЕ КАУЧНО-1¡РСйЗВСЩРТВЕННОЕ УПРАВЛЕНИЕ

е<юлоп:ческой прощдашости

Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт •

На правах рукописи УДК 576.858:639.96

НОВСКЯЯОВА Евгения Васильевна

ИЗУЧЕНИЕ ЕА11ЧЙХ ЭТАПОВ ВЗАШОДЕГЙТВЩ ВИРУСОВ С КЛЕТКАМИ

03.00.06 "Вирусология"

Автореферат'

диссертации на соискание ученой стзпэня кандидата биологически наук

Владимир - 1991

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследова-тельскои ящурном институте. .

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: кандидат ветеринарных наук

старший научный сотрудник ШЦЕИКО В.А.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

- ЧЕШЯЕВ ЮлиП Александрович, доктор веторлнзрных наук, профессор (ВИИгдурныи институт, г.Владимир);

- Ш1К0ВА Ли/для Алексеевна, кандидат биологических наук, стерший научный сотрудник (ВИЭВ, г.москвя).

ВЬ'ДУШДй ОРГАНИЗАЦИЯ - Иаучно-иослвдовательскиь ветеринарный институт, г.Казань.

Защита состоится " fC" года d 10^ час.

на заседании специализированного совета К 120.60.01 по защите диссертации на соискание учрноП степени кандидата наук при Всесоюзном научно-исследовательском «¡дурном ииетда-уте по адресу:'600900, г.Владишр, п/о Юрьевец, ВКИЯИ. ;

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоазпрго' йаучно-исследовательского хгдурного института.

Автореферат разослан января 1992г.

Гчоный секретарь саоциализирояанного совета

- Соко'лов Д.Н.

- г -

Актуальность темы.

. Диагностика играет решающую роль в системе меро- • приятия по борьбе с болезнями животных вирусной этиологии.

В настоящее время в лабораторной диагностике многих вирусных болезней наиболее широко применяется юшукофер-ыентные тесты в различных модификациях (ИгА)', метод флуоресцирующих антител и радиоиммунный анализ (РИА), что позволяет обнаруживать вирусы за 4-6 часов при концентрации возбудителей не менее 1-5 кг вирусспецифичаско-го белка.

Однако практическое применение РИА ограничено тагозш факторами, как нестабильность маркера и дороговизна необходимого оборудования,

Вышеперечисленные иммунахимичвские методы позволяв? определять только те возбудители, на которые ямзвтся диагностику»» или которые по антигенной структуре соответствует производственному итаацу.

Гмстахзшгчвскве варианты КФА явзяэтся трудевнзопя и требуют значительного времени на «следования»

Другие методы лабораторной диагностики вирусных болезней (биопроба, реакция нейтрализация) беэкруптсл на конечных этапах взаимодействия воэбудвтелая в югетгаш--шшеняш, выражавщввря в вшяяекна цхтоватогфнного >аффекта в клеточных культурах в точена® 72-240 часов.

В то аз время известно, что начальной стесняй яз-бого вярусного внфекционного цикла являйся адсорбция возбудителя на клет^-кивань, протвкезщ&я в точек:* з короткого, времена Сне богеэ 60 йщут) а приводящая к взш-Н2НИЯИ (качественным а количественны**) г составе клеточных гдамбран (йармшезя З.Н. ,1931, ,1990).

Тагсш сбрззон, анализ структурно-^унщионазьксй срганязацпн вдазао^ег® приобретает везкоэ значение з д^агкосгйатз я прогноза инфекционной оатологав гярусиого зрозехо^-дааз. . - ' ^

- 3 -

Следовательно, имеются предпосылки для разработки экспрессного метода выявления и определения вирусов, основанного на обнаружении изменений функционального состояния мембран клеток-мишеней.

Для изучения процессов, протекающих в структурах плазмолемм, используют спектроскопические методы с применением флуоресцентных, спиновых (¿ПР-) или а№-зондов.

Однако методы <ШР- и ЖР-спектроскопии требуют сложного и дорогостоящего оборудования, специальной подготовки исследователей при множестве артефактов из-за неоднозначности интерпретации получаемых данных.

Поэтому в наших исследованиях мы использовали метод флуоресцентных зондов, обладающий следующими преимуществами: информативность», простотой, дешевизной, высокой чувствительностью и универсальностью.

В целом зондом монет быть любое флуоресцирующее вещество, которое прикрепляется к клетке за счет нековале-нтной связи, а из параметров его флуоресценции можно извлечь информацию об изменениях свойств исследуемых объектов (липопротеинов, мембран, клеток) (Добрецов Г.Е., 1989).

Цели и .задачи исследования.- Исходя из вышеизложенноп целью данной работы явилось изучение возможности применения метода флуоресцентных зондов (03) для индикации и дифференциации вирусов на стадии адсорбции на клетку-ми-пень,

В ходе работы решались следующее задачи:

- выбор ®3, оптимальных параметров методики постановки опытов и учета результатов,

- разработка экспрессного способа определения вирусов и антител к ним, основанного на изучении с помощью

$3 ранних этапов взаимодействия вирусов с клетками.

Так как плазмолеымы лимфоцитов содержат иммуноглобулины в качестве рецепторов, а сами нммунокомпэтеитшэ клетки претерпевают значительные изменения под действие»

антигенов или митогенов, то последующими задачами данной работы являлись:

- изучение возможности определения феномена активации иммуноцитов под воздействием вирусов методом ФЗ на ранних стадиях,

- оценка возможности применения денного фенокена для определения иммунного статуса животных,

- разработка на этой основе способа определения воз-0удителей вирусных болезней с везикулярным синдр'Шси с применением лимфоцитов периферической крози.

¡кучная новизна.

Показано, что адсорбция вирусов на чувствительные клетки приводит к изменениям в микроструктуре их уемб-ран, которые выявляются по увеличении интенсивности флуоресценции зонда ДСК (ДСЛ-6) в 1,5+5 раз по сравнен™ с интактнык контролем.

Разработан способ определения вирусов и антител к ним, осноэ&нкый на изучении "с пскощьв флуоресцентных зондоз ДСМ и ДСП-0 ранних этапов взаимодействия вирусов с клетка«,« и позволяющий проводить идентификации возбудителя в течение 35-60 кинут.

Получил оксперикентаяьное обоснование новый способ определения аозбудителей болезней с везикулярный синдромом, основанный на установлении феномена активации жш$о-цитов с приискание и адаэуказакнызс зондов. . . •

Практическое значение,работц.

- Разработана методика определения вирусов а гятг-. тел к ни« с применением флуоресцентных зондоз.•

- Прадлежена методика экспрессного подбора ¿истеа репродукцт? вирусов.

- Разработана методика определения возбудителей болезней с везикулярный синдромом с использезениен лимфоцитов. • -

-5-

ПуСликации. По материалам диссертации опуоликовано 2 работы» получено положительное решение ВНИИГ1Ш от 30 октября 1991 года на изобретение "Способ.определения вирусов и антител к ним" по заявке $ 4843386/14.

Апробация ра_бо_т_ы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на научной конференции "Актуальные проблемы ветеринарной вирусологии" Ст.Владимир, 1988г.), заседаниях ученого совета ВШдИ (гуЬд-Ь.Ъ'Огг.), объединенном семинаре о и 'У лабораторий БШШ ЦУЬуг.) и кеядународоой конференции "К новой стратегии борьбы с ящуром (г.Суздаль,19у1г.).

-Структура и объем работы. Диссертация содержит еле дующие разделы: введение, обзор литературы, заключение, описание материалов и методов,' собственные исследования, обсуздение результатов, выводы, практические предложения библиография, включающая 14В ссылок иа источники литературы. Работа изложена на 1Ы,странице машинописного текста, иллюстрирована 32 таблицами, 6 рисунками и 2 схемами.

Положения выносите на защиту.

I. Адсорбция, вирусов на чувствительную клетку приводит к изменению состояния ее мембраны, которое выявляется по увеличению интенсивности флуоресценции зонда ДС1>! СДС11-6) в Г,5-6 раз по сравнению с интактными.клетками.

¿.^Резрасотка способа определения вирусов и антител к ним, позволяющего проводить идентификации возбудителя в течение ЗЬ-60 минут.

3. 1'ет одические подходы к экспрессному подбору систе репродуидо* вирусов с использованием флуоресцентного зонда ДСМ.

4. Изучение возможности определения возбудителей

осдасне" с зозикуляртедо синдромом с применением лимфо-

цкмв иерк^еригеской крови. \ '

С0БС1ВЕШ1£ ШСЛЕДОВШЙ Материалы и метода исследований

Флуоресцентные зонды.

Использовали следующие зонды:

а) I-V фенилыгино)-8-суль$онафталин САНС-8) 4ир*-ы

С) 4-(п-^кетилакиносткрил)-1-»«тилаири,ццни:1 п-толу-олсульдонат (ДО.!), синтезированный Р.Р.Дубуре (Институт органического синтеза АН Латвии, г.Рига),

в) 4-(п-Дикетиламиностирил)-1-гексилпиридиний л-то-луодсульфонат (ДС11-6), синтезированный Р.Р.Дубуре (там »в),

г) 3-1'етоксибекзантрон (Ш1), синтезированный Б.Н. Красовицкиы (НПО "Конокристаллреактив", г.Харьков).

Культуры клеток.

Использовали как монослойныэ первичко-трипсинязиро-ванные, так и перевиваемые культуры клеток санного происхождения :

ШК-66 (культура перевиваемой данни клеток почек поросят),

У& -АЗ-2 (культура перевиваемой лгшин клеток почек свгшзй), -

СШВ (культура перевиваемой линял клеток почек риока свиней),

' Ш (первкчно-трилсиннэированная культура клеток почки свиней),

а также ПСГК-30 (культура перевиваемой дшнки клеток почки сибирского горного козерога), ВНК-21 (культура перевиваемой линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка).

Вирусы.

Использовали следуизие штакет:

- вирус яцура - 0 л' 194, Ор А^ 1' ЬсО, А 71?, Азая-1 № 48, Сат-1.

В зависимости от цели опытов применяли вирусы, адап тированные к различным биологическим системам: к организ му крупного рогатого скота, свиней, морских свинок или клеточным культурам (СП, ВШ-21, ПСГхС-ЗО и т.п.),

- вируса везикулярной экзантемы свиней (ВХ) - А-4а

С-71,

- вируса везикулярной болезни свиней (ВьС) - 0-72, Т-75 в виде афтозного эпителия или вируссодержаще'*1 суспензии клетоу СП, ШГК-30, У&-Яй -2,

- вируса болезни Ауески-18 "в" ^ЛШЭВ, г.Харьков),

- вируса болезни Гамборо (ВНШИП, г.С-11етербург),

- вируса синдрома снижения яйценоскости (ССН-76) (ВНИЗИП, г.С-Иетербург),

. - вируса классической чумы свиней - АСВ-л (г.Сумь$1

- вируса диареи лРС - вакцинный для РН (ТУ 46-21-• -259-79),

- аттенуированного энтеровируса свиней Ь, 7,.а серо групп из набора диагностикумов энтеровирусных гастроэнте ритов свиней для РН (УкрНШИ, г.Киев),

коронаэируса свиней (УкрНЛВИ),

- коронавируса телят (УкрНйЗИ),

- вируса болезни Ньюкасла (ВНИЗИП), .

- вируса инфекционного ринзтрахеита - ТК,

- вируса парагриппа-3 КРС-вакцинный "Паравак", •

- вирура лейкоза КРС (УкрНИВИ).

_одтаочнърс „клеток.

К клеточной суспензии добавляли водные растворы зондов до различных конечных концентраций. Интенсивность флуоресценции зонда ДСП (ДСП-6) измеряли с помощью кикр< флуориметра ЛШАЫ И-1 (ЛЖО.СССР) и фотоприетавки на участках препарата ¿¿=8,3 ыкы,--включающих в себя по одной клетке.

За единицу измерения флуоресценции, принимали средне значение интенсивности флуоресценции 20-30 клеток.

- 8 -

Определение_типа вируса ящура с помодьр флуоресцентного .зонда. СДСО-6)

К 0,3 ил разведения испытуемой пробы добавляли 0,3 мл соответствующего разведения ящурной диагностической сыворотки. Затем в 0,Ь мл суспензии клеток ВНК-21 вносили 0,1 мл полученной смеси "вирус-сыворотка" и инкубировали 20 минут при 37°С. Затем в нее добавляли зонд

до конечной концентрации 1 мк& и выдеркивалн 15 »нут, после чего проводили учет результатов реакции.

При значении показателя интенсивности флуоресценции К равной 1,5 и выше, определяют наличие инфекционного агента. Время анализа пробы - 40 мшут. Вирус ящура относят к тому типу, какими антителаии он нейтрализован (в этом случае КС 1,5).

Определение других вирусов проводили аналогично.

Опреде лениег антител к вирусу ящура с применением^.флуоресцентного .зонда ДСМ (ДСН-6)

К 0,3 мл разведений вируса пщра тшзоэ А, 0 я С добавляли но 0,3 юг соответствуем« развздений используемой сыворотки крупного рогатого скота, параболезлего ящуром о Затем в 0,5 мл суспензии клеток ВШ-21 еноскля , 0,1 мл полученной смеси "вирус-сыворотка" я' инкубировали при 37° 15 ткут. Посла этого в смзсь добавляет ,-зонд ДШ до конечной концентрации 5 ыкК и выдерживали с зондом 15 мин. Додготовленныэ образцы флуоркметряровали так,как описано вше.

За подсггителънув константу (К) взяли величину, равную или Сольш 1,Ь.

Эта величина характерна для проб, содержащих культуру клеток, вирус ящура я зонд. В случае нейтрализации вируса гомологичными антителами атот показатель мгньш 1,5.

Определение антител и вирусу ящура осущестаяяля э •гэчэнкэ 60 икнут.

- 9 -

Исследование проб на содержание антител к другим вирусам проводили аналогичны!! образом.

Катематическая обработка .данных

Результаты представлены как среднее зничение + ошибка среднего.

Для удобства учета ввели показатель интенсивности флуоресценции К, где

К Р опыта/ Р контроля

(Р- средняя интенсивность Флуоресценции ¿0-30 клеток). Другие вычисления проводили на 13К-АТ с ислользовани-" ем программ, разработанных в вычислительном центре ьН-Ьй (Базарова С.К.

Типизация Вирусу с .использованием

КНМ;ЩдДКТОВ

Лимфоциты из крови подозреваемого в заболевании животного получали в градиенте фикоял-пакз (" Швеция) по стандартной методике. •

Готовили несколько проб суспензий лимфоцитов, добавляли к квндоЯ пробе по 0,1 мл вируса ящура различных ткпоз, адаптированных к культуре клеток Ш и инкубировали при 37°0 в течение 60 мин. Смесь центрифугировали и надосадок ино^улировали в культуру клеток СП. йнкубиро-вили 72, чоса'при 37°С. Учет результатов проводили по цитспатическому действ*® вируса ("Щй^о/мл).

Способ определения возбудителей болезней

с вез'луудяпнь^,синдромом ^использованием лимфоцитов -

В пробу суспензии лимфоцитов добавляли: к одной части крссщ шгрус яцура, к другой - вирус вези^лярной бо-хззкк свшэ*, к гротьеГ; - е:грус везикулярной экзантемы сви-П;?:';. С;.;ссь пнкубкроЕала, центрифугировали и надосадок..

- ю -

■ инокулировали в культуру клеток Cil.

.После экспозиции во флаконы с культурой клеток вно-. сили агаровую смесь, и флаконы инкубировали при 37°С в течение 72 часов. Учет результатов проводили по количеству бляшек. Тип вируса, вызвавшего заболевание, соответствовал типу возбудителя, размножение которого ивгкоирозе-лось лимфоцитами больного животного.

В выполнении отдельных этапов работы щптптж участие Толокнов A.C., лостюченко Ь'.Г., Ь'етяикина H.A.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОьСТВЕННЫХ ¡ШИДСШИ.;

Выбор оптимальных параметров методики постановки и учета результатов

Для решения поставленных целей наш из ряда химических соединений были выбраны два гомологичных флуоресцентных зонда, специфичных к яипидаы: ДХ к ДД1-6.

На основании многочисленного экспериментального материала (более £00 проб) было установлено, что прикрепление вируса к клеточной поверхности приводимо е кзмаке-î'jtQ состояния ее пдазиояеммы, которое выявлялось по уве-лйченив интенсивности флуоресценции зонда а 1,5-5 ргц по сравнению с интактными, а также обработанными балластныкя белка!,« клетками.

Выявлено также, что в диагностическое значений данного критерия (К » 1,5) изначально заложена априорная вероятность Р<0,05, то есть достоверное различие vs,:-s?.y кнтакткыми и инфицированными клетками по степени их флуоресценции будет наблюдаться ке менее, чей yö,5p сду-^еэ, что было показано яри изучении 200 клеток культуры cs'.îhc" почки в контроле и опыте.

С цельо обоснования временного интервала кнкуСпц^ системы "вирус-клетка" проведено исследование д^иа;;::;^; . сорбция вируса ящура А^ & 550 на моносдоГ; ' иультури ток евккой почка (СО) с последуетеü его рвпрод^кц;:сг,:

-12-

А - по содержанки вируса в надосадке (БСЕ/мл), ь - с по-кощью флуоресцентного зонда (рис.1).

Из графика на рис.! следует, что максимум флуоресце* ции наблюдался через 15-30 минут экспозиции клеток СП с вируссодержащей суспензией, а минимум приходился на времз экспрессии вирусного генома и высвобождения вирионов потомства. Причем интенсификация флуоресценции совпадала с максимумом сорбции вируса на клетку (то есть соответствовала минимуму присутствия возбудителя в супернатанте).

На отом основании были сделаны выводы, что

а) изменение состояния клеточной мембраны, связанное с вирусном инфекцией, может быть выявлено методом флуоресцентных зондов на ранних стадиях, предшествующих вирусной репродукции,

б) наиболее целесообразным является время инкубации системы "вирус-клетка" в пределах 15-30 минут. Это обеспечивало специфическую сорбцию"вируса на рецепторы клеток-мишеней и являлось необходимым и достаточным условием для получения достоверна результатов.

Для равновесного распределения зонда в системе "среда-клетка" экспозицию проб с зондом проводили в течение 12-15 минут» что было найдено экспериментально.

Наконец, с помощью флуоресцентных зондов был подтверди также- феномен торможения адсорбции возбудителе? ¿нтителсми на клеточной мембране, о чем судили по одинаковой флуоресценции проб, содержащих комплекс "клетки-t-вирус+гоыологичная сыворотка" с интактнык контролем: "кдетки+зонд".

Оптимизация способа определения вирусов и антител к ним

- Выаеиэложенное послужило основой для разработки , "Способе определения вирусов и антител к ним".

Сут'Д его заключалась в том, что при образбвании ' укмукного комплекса "вирус-антитело" возбудитель теряет епоесснссть связываться со специфическими рецепторами

-¿гА

515,30 _ЕД 123 №0 240 360 430 880 .......¡е.

Тис.I.Исследование динамики сорогии вируса яцура 550 на монослойной культуре клеток СП с последующей его репродукцией..

По оси абсцисс: время.экспозиции |клеток ..СП-с вйруссодержащей суспензией, мин. По .осям ординат: А-.% рабочей дозы ■ вируса*

Б- показатель интенсивности флуоресценции зонда

К. "Рог/? контр.

шшзколемыы. В этом случае состояние .мембраны клеток--ыкаэней не изменяется.

•Если же нейтрализации вируса из-за отсутствия в сыворотке специфических антител к нему не происходит, "свободный" вирус адсорбируется на плазмолеыме клеток, Что ыокет быть выявлено ь;.етодоы «3, как показано ранее.

Таким образомs инкубацию снеси вируса с сывороткой в системе репродукции вируса ведут в течение. Ib-20 мину прк 37%р затеи в нее добавляют флуоресцентный зонд и через I2-X5 шнут осуществляет учет результатов реакции по отнощешш интенсивности флуорзсценции смеси в опыте и контрога я при значении ее показателя К, равном а вше, определяют наличие инфекционного агента, а при значении этого показателя менее I,b в случае образовани еовцяфического комплекса "вирус-антитело" определяют на asme антител к нему.

Этот способ признан изобретением { положительное реиение ВНШЗГДЭ от 30 октября 1у91г. по заявке & 484338 /14).

Дредевагаеыый способ апробирован как в "прямой?,так п "ттдосп^тшыШ," диагностике.

Пгцуч@нные данные овкрвтехьствую? о том, что нейт-¡/лпхаа&я жвруса мажет происходить только при наличия s OKScpото® гокояогичных к нему вярусспецкфиче сккх ант ■sea. сто согласуется как с вазшейшм принципом реакции нейтрализации: потеря ssipycoM инфекционности после обрг Сотен его специфической сывороткой, так и с предлонен-íasai рддсы авторов механизмами данного процесса, один : которых основан на пояишриэации вирионов. с образован:« крупных агрегатов , второй - на конформ;

цгюкшдс изменениях С Зс£лс-у& é. a., 1^83) и третий - на соединения пентаыеров в вирцоне ( /Ьиоел. г. а.) ШЗЗ)..

С цельв сравнения разработанного способа ©пределе вирусов Е антител к ннм с общепринятыми методиками ясс. довали* Г: сшороткк крозк от вакцинированные и napeOi

% Работа проведена совместно с Костэченко 1!.Г.,

- 14 - .

звших ящуром типа А.^ А? Ь50 аивотных в динамике с пер-зго по пятнадцатый день после начала исследований.

Показано, что предлагаемый способ презосходкт по (вствительности классическую реакцию вируснейтрализации 5Н) на культуре клеток свиной почки и сопоставим по ?ому критерию с показателями им&уноферментного метода.

Вычисление коэффициент парной корреляции между корками из данных по РН и предлагаемого способа позволю подтвердить этот вывод, так как а '70% случаев кор-;ляцж? являлась значимой.

Б целом спссоо определения вирусов и антител к ним применением *3 испытан с положительными результатами i моделях возбудителе« хс болезней сельскохозяйственных ibothkx и птиц. Эти вирусы относятся к АО различным действам и являются как РНл-, так и ДНК-содераащими; такке вызывающими как цитоцидике инфекции (вирусы \ура, везикулярной болезни свиней, везикулярной экзанте-i свиней и т.д.), так инфекции, протекающие без. цитопати-;ских изменений (вирусы лейкоза КгС, классической чуш »иней и т.п.).

Таким образом, разработан способ определения,вирусов. антител в ним, основанный на изучении с помощьз ФЗ ран-гх этапов взаимодействия вирусов с клетками и позволяющий доводить идентификацию возбудителя в течение 35-60 мину?.

Известно таюке, что плазмолеммы лимфоцитов содержат шуноглобулины (антитела) в-,качестве рецепторов.

Поэтому следующим этапом нашей работы явилось ис-¡едоаение влияния вирусов на имыунокомгетеитные клетки юзи на ранних стадиях. • '

Изучение возможности опрсделения'4;2>;о^ена активации лимфоцитов методом флуоресцентных 'зондов (&3)

Для изучения возмояяости определения феномена акти-¡ции ш/муноцитов использовали суспензию лимфоцитов,

гщаеденных из крови доноров« подозреваемых в заболевании, Путей центрифугирования в градиенте фиколл-пака Vфирмы ." ЙЬа-'ика.ЫсГ» Швеция) по общепринятой методике.

В качестве доноров использовали 21 голову крупного рогатого скота, 25 - свиней, 6 - зеоовидного скота, 6 -овец, Животных разделили на 3 группы.

Первую группу .заражали вирусом, вторую - вакциниро-. вам, а третью, составляли кктактные животные.

■ Для заражения крупного рогатого скоте использовали вирус яцура типов А, 0; свиней - вирус Я1цурь типа ь., везикулярной экзантемы и везикулярной болезни свиней; зеоовидного скота - вирус яцура типе "Азия-1", овец -вирус ящура типов А, 0.

Вакцинацнс крупного рогатого скота проводили вакциной против вируса ящура типа 0 серии 73, изготовленной гаводоу "Юрьевецветбиопреларьт", свиней - эмульсионной вакциной против вируса ящура типа серии 77, изготовленной заводом "йрьевецветбиопрепарат".

Вцаеленнке пробы лимфоцитов от животных всех трех групп вначале смеаивали с указанными вирусами и затем обрабатывали флуоресцентным зондом ДСЫ с последуще$1 . экспозицией в течение 15 минут. Учет результатов проводила с аомоаЕЫ} кикрофлуориметра ДШШ И-2 ^ЛО&О) с фото-лристевкой 4ШИ по отноиенкю интенсивности флуоресценции сг*эск в опыта я контроле. Пробы крови отбирали через . сутки досхе начала исследований в течение 30 дней.

Нсзя; установлено, что инкубация комплекса "лимфоциты ккфяцкрованного животнбго + гомологичный вирус" и.последующая обработка его зондом ДСМ приводила, к увеличению интенсивности флуоресценции в 1,5-2,5 раза по сравнении . е штактным контролем "лиыфоциты+зонд" и комплексом "лимфоциты вакцинированного животного + виру о".- Различие в интенсивности флуоресценции зонда отмечено ухе через -24" часа после шхфицирования доноров и сохранялось на про-лшеник всего периода исследований. Возможным объяснением

\

- 16 -

наолюдаЕщегося феномена является изменение рецептсрного аппарата vuнoщклеарньк клеток под воздействием натизных вирусов.

Приведенные результаты исследований могут служить осново!1 для ранне;! и экспресс-ддагностики инфекционной патологии вирусного происхождения« а также использоваться при изучении -инфекционного процесса и оценке иммунного статуса животных.

¿нелогичные данные были порчены при сравнительном изучении шеношна активации лимфоцитов от инфицированных •.и иммунизированных введением вакцины доноров реакцией нейтрализации по редукции бляшек (БСЙ/мл) и с помощью Флуоресцентного зонда ДИз. Доказано, что титр вируса 'ягцура после инкуоации с лимфоцитами, полученными от животные на 4-5 дни после заражения этим возбудителем, уменьшался в 2-3 раза по сравнению с контролем рабочей дозы вируса.

Такиы образом, вирусные частицы подвергались либо воздействию цитотоксических лимфоцитов и нормальных киллеров, лиоо фагоцитозу со стороны мононуклеаркых клеток, либо били централизованы антителами, либо испытывали сухарное доРстзие отих факторов.

Следовательно, мононуклеврнце клетки (лимфоциты) периферической крови больных или подозреваемых в 'заболевании животных можно использовать в качестве антитело-, содержащей жидкости в реакции вируснейтрализации, что дало бы возможность сократить время идентификации•возбудителя на 4-П дней.

Оптимизация способа определения воз'будителай

вирусных болезне* с везикулярным синдромом

Полученные результаты легли в. основу "Способа определения возбудителей вирусных болезней с везикулярным синдромом" с использованием феномена активации иммуно-цитов. * .

- 17 -

Суть .способа заключается в том,-ото при смешивании лимфоцитов, содержащих внтигенсвязыващие участки антител, "с вирулентным возбудителем происходило образование комплексов, которые осаждали центрифугированием, а надо-, садочную жидкость отбирали и вносили в чувствительною культуру клеток. Дри этом размножения вируса в клетках но происходило.

Кепи комплексы "антитело-лимфоциты-виру с'' не образовывалась, то после внесения в культуру надиоадка, содержащего вирулентный возбудитель, происходила адсорбция вирусе на мембранах клеток-мишекей и в.последующем егс репродукция.

Таксой вируса, вызвавшего заболевание, соответствовал таксону возбудителя, размножение которого иигиС-иро-валось лимфоцитами больного животного.

Таким образом удалось провести типирование вируса щура, а ?акже идентифицировать его от возбудителей других болезней с везикулярным синдромом.

Аналогичным образом определяли также вирус везикулярной экзантемы свиней.

Предлагаемый способ дает возможность сократить время спределзнгя возбудителя в реакции нейтрализации не 4-11. раея* «к как для ее постановки в классическом варианте используют сывороткя, полученные от животных не ранее, ты чероз 7-14 дней после заболевания.

Ускорание идентификации возбудителей инфекционных 6ойэ§кзй имеет большое значение для своевременного купирования очага, е в последующем его ликвидации.

Изучение возможности экспрессного подбора сисгеы репродукции вирусов

Резвктие современных методов культивирования клеток кыедо реващее значение для экспериментальной и диагностической вирусологии. Но так как не всякая клетка-чувствительна к лабоку вирусу, то для получения ЕИруссодержащего

материала необходимо провести подбор культур клеток в целях адаптации и размножения исследуемых возбудителей*

Нам/ изучалась возможность экспрессного подбора систем репродукции вирусов с применением флуоресцентного зонда ДСМ на моделях возбудителя болезни Гаыборо (реови-русы) и вируса ССЯ-76 (синдром снижения яйценоскости, аденовирусы птиц). •

Обследованы перевиваемые культуры клеток: ПЗК (почек зеленой мартшки); ПСГК-30 (почек сибирского горного козерога), ППК-66 (почек поросят); ВНК-21 (почек новороаденно-

го сирийского хоиячка 2 (почек свиней) с целью

^ . -

роаения следующих задач:

- экспериментальной инфекции вирусами болезни Гаыборо и ССЯ-76 вышеуказанных перевиваемых культур клеток,

- выяснение перияиссивности отобранных культур клеток для изучаемых возбудителей болезней птиц.

Установлено, что из вышеуказанных культур клеток тря (ПСГК-30, ШК421, ППК-66) имели рецепторы для прикрепления вируса ССЯ-76 к клетке-мшени, о чем са дили по изменению состояния ее плазыолешы (К >1,5) по сравнению с интахтика контролем.

Вирус ССЯ-76 пассировали: до 3 пассажа на культуре клеток ППК-66 (титр 3,5 ПЩ^/мл и 4,0 во 03) я до 10 пассажа на культуре клеток ПСГК-30 (титр ф. 7,5 ■Щ^д/мл и ■ф- 8,5 со ФЗ). Продуктивность инфекцин.дяя ■ данных культур клеток подтверждена злектронно-микроскопн-^ ческиии исследованиями (совместно с Еыкозой Т.Н., НШЯИ).

Аналогично судили о сорбции вируса болезни Гамборо,, которая происходила на клетки культуры ПСГК-30 и ШК-21 (К >1,5).

Таким образом, игюльзуя флуоресцентный зонд ДСМ, -можно -з течение 30-60 минут подобрать систецу репродукции вируса, что является необходимым условием для его культивирования.

- 19 -- 1У. Выводы

1. Показано увеличение интенсивности флуоресценции аовдй (ДСМ иян ДСП-б) в I«545 раз при адсорбции вирусов ' на мембрану чувствительной клетки, что свидетельствует об Езкененин состояния плазмолемуы после прикрепления к ней возбудителя.

2. Разработан способ определения вирусов и антител к шы, основанный на изучении с поыощыо флуоресцентных зондов ДСМ и ДСП-б ранних этапов взаимодействия вирусов с Елегхами (адсорбции)и позволяющий проводить кдентифика-ЦВ8 возбудителя в течение 35-60 юту?.

3. Установлено, что для выявления изменения состояния шибраны кпотки-яиазенк, происходящее при адсорбции вируса на нее, целесообразно использование литщспецифнческих даисюшзчеиых палихромныг зондов: 4-(п-Диметиламиности-ркл)-1 изтшширвдииий п-толуолсульфонат (ДСМ) и 4-(п-Ди-К0тшвдшност1грил)-Х гексклпиридиний п-толуолсульфонат (ДСП-б).

4. Разработан способ определения возбудителей болез-шй с Еезядудярныы синдромом, основанный на установлении §£жтет аетизации лкыфоцктов с помодьг шззуказанных г.оцдсв. •

, 5о Вояааака возможность экспрессного подбора и оценки саетагл репродукция кжрусов с использованием фкуоресцент-вого ьоцде. ДСМ. >.'.■' -

6. Шзучщт дчшгносткческая ценность катода флуоргс-зоцдов, позволяющего проводить обнаружение вирусов 112, стадии:прикрепления к поверхности клетки-мюлеии. ^встватсяьность катода сходна с чувствительностью .бао-пробы па культуре клеток.

7. Вазншша идентификация зозбудетелей болезней с'. гсэЕкуллрныы спвдроиом в реакция вируекейтр&лигацш! прзз ЕСЕольй-ойадаа лжфзцктов рерифертееской щ>ах,"г отобранной о? гуво'лг-з ш ргшжх этглаг багезкг. . -

практические: пщдохеыия

1. Разработана методика определения вирусов и антител к ним с применением флуоресцентных зоадов ДСП я ДСП-б.

2. Предложена методика экспрессного подбора систем репродукции гирусов.

3. Разработана методика определения возбудителей бдлезней с везикулярным синдромом с использованием жшфо-цитоа.

СПИСОК ОПУЕШОВАШШХ РАБОТ

1. Миденко В.А., Новожилова К.В. Использование метода флуоресцентных зондов для изучения взаимодействия вируса ящура с клетками. Тез.докл. науч. кокф. ,посвяч. 30-летию ШИШ, г.Владимир, 1988, с.59-60.

2. Мщзнко В.А., Новожилова Е.В. йлуорвсцекткые зонды при изучении вирусов. Тез.дозд.меедунар.коиф. "К новой стратегии борьбы с ящуром", Владимир,1991, с.171-172.

3. Получено положительное решение ВНИИГПЭ от

30 октября 1991г. на изобретение "Способ опредеяаняа вирусов и антител к ним" по заявке 9.4843386/14.

Отпечагйно на ротапринте в Областной типографии . Заказ № УР^ Тираж -100 экз.