Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение биологических параметров и молекулярно-биологических свойств вирусов гриппа А и В при отборе и подготовке диагностических штаммов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение биологических параметров и молекулярно-биологических свойств вирусов гриппа А и В при отборе и подготовке диагностических штаммов"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГРИППА

На правах рукописи УДК:616.988.75.078.735

КУЗНЕЦОВА Елена Владиславовна

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВИРУСОВ ГРИППА А и В ПРИ ОТБОРЕ И ПОДГОТОВКЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ШТАММОВ

(03.00.06 — вирусология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ленинград 1990

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте гриппа Минздрава СССР.

Научные руководители:

доктор медицинских наук А. А. Соминина, кандидат биологических наук А. 3. Плюснин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор О. К. Кузнецов; доктор медицинских наук, профессор Ф. С. Носков

Ведущее учреждение: Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л. А. Тарасевича.

Защита диссертации состоится « ». 1990 г. в . ч. на заседании специализированного совета (Д 074.48.01) при Всесоюзном научно-исследовательском институте гриппа Минздрава СССР (197022, Ленинград, ул. проф. Попова, 15/17).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института гриппа Минздрава СССР.

Автореферат разослан « » . . /^Г 1990 г

Ученый секретарь специализированного совета

И. Н. Жилинская

- Актуальность проблема. Современный этап исследований в области сероэпидемиологии гриппа характеризуется расширением сферы применения диагностических препаратов, включая изучение роли вирусов гриппа в структуре ОРЗ, определение уровня коллективного гуморального иммунитета к современным и реликтовом вирусам гриппа, оценку иммуногенности новых гриппозных вакцин а вакцинных штаммов. Исследования!® последних лет доказано, что результаты серодиагностики гриппа в РТГА в значительной мера зависят от ряда биологических свойств избранного диагностического штамма. Поэтому всесторонний анализ современных -антигешю актуачышх и реликтовых вирусов, выделенных от больных гриппом, имеет вагшое научно-практическое значение применительно к первичному скринингу и последующей специальной подготовке диагностических штаммов. До настоящего времени для отих целей практически не использовались современные методы молекулярной биологии, позволяющие, например, анализировать ползпэптютшй состав вирусов. Установлено, что анализ отличий в скорости миграции полипептвдов и фрагментов РНК вирусов гриппа методом электрофореза (ЭФ) в полиакрилам^дном геле (ПМГ) даёт ценную информацию в исследованиях по генетике вирусов, а сам метод ЭФ является чувствительным тестом при скри-!шнге выделенных вирусов и анализе рекомбинантов ( HugentobLer, 1981; Oxlord . Schild , 1979; Oxford, 1985).

Известно, что диагностические штаммы должны отвечать оп-• ределашшм требованиям, предъявляемым в первую очередь й таким биологически свойствам как широта антигенного спектра (ШАС) и оеядность к антителам человеческих сывороток. Учитывая, что эти признаки, так же как и свойство резистентности к иеспеци-фхтческЕг.! ингибиторам снворотой, связаны скорее всего с особенностям структуры поверхностных гликопротеидов вируса, сопоставление указанных биологических свойств с электрофоретичес-кой подвиялостью полшпептддов в гэле представляет теоретический и практический интерес. Кроме этого, метод ЭФ в ПМГ, необходимый з обязательный при этиологическом надзоре за гриппом, может прздостяЕпть дополнительную информацию по сравнительной характеристике алтигенно актуальных вирусов и отобранных из их числа кандидатов в диагностические штаммы.

Весьма актуален и вопрос влияния системы хозяина на биологические свойства вирусов гриппа и их структурные особенное-

та в связи с принципиальной возможностью использования клеточных культур для производства гриппозных диагностикумов. При &том, важным свойством, определяющим рентабельность производства как вакцинных, так и диагностических штаммов, является высокая репродукционная активность вирусов в избранной системе накопления. Такая активность может быть достигнута за счёт использования метода генетической рекомбинации или специальных приёмов выделения из популяции высокорепродуктивных клонов (Корчанова и др., 1982). Исследования по генетической детерминации этого признака ( Palese е.а. 1976; Ghendoa е.a. . 1979; Paleso,Youns , 1982; Baez e.a., 1980; Фураева В.A., 1983) не дали однозначного ответа на поставленный вопрос. Сложность проблемы выяснения взаимосвязи биологических свойств со структурой вируса, обусловленная поллгенным характером большинства "жизненно" важных для вируса гриппа признаков (веап, Webster . 1978; Oxford е.а. . 1978; Rott е.а. » 1978; Scholtissek е.а. » 1979; Florent , 1980; sugaura, ueda . 1980), требует изыскания новых подходов к решению этих задач. Важное значение при этом приобретает анализ экспрессии различных вирусных генов в инфицированных клетках и зависимости от неё уровня репродукционной активности вируса. Для этих целей может быть применён метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (МГНК) с мечеными ДНК-зондами, содержащими различные вирусные гены.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение некоторых биологических параметров и молекулярно-биологи-ческих свойств ряда штаммов вирусов гриппа А и В при отборе и получении диагностических штаммов, а также при культивировании вирусов в различных системах хозяина, для чего предполагалось решить следующие основные задачи:

1. Сопоставить полипептидный состав и биологические свойства вирусов гриппа при первичном скрининге и отборе кандидатов в диагностические штаммы.

2. Изучить электрофоретическую подвижность полипепткдов субпопуляций вирусов гриппа, полученных в лабораторных условиях и отличающихся по чувствительности к неспецифичесюи сывороточным ингибиторам.

3. Оценить влияние системы хозяина на структуру и антигенные особенности вирусов гриппа А.

4. Изучить экспрессии генов, особенности структуры п анти-

генных свойств высокорепродуктивных субпопуляцнй вирусов гриппа, полученных раэделешем исходной популяции по скоростям репродукции.

Научная новизна. -• I. Впервые выявлены корреляции между электрофоретической подвижностью тяжёлой цепи гемагглютинина (HAI) вирусов гриппа В и такиш биологическими свойствами как широта антигенного спектра и авидность к антителам.

2. Впервые показано, что ингибиторорезистентныв (ИР) варианты вирусов гриппа А, полученные в лабораторных условиях, могут отличаться по подвижности полипептида HAI от исходного вируса, причём выраженность этих отличий, определяемых методом ЭФ в ПААГ, зависит от системы хозяина.

3. С помощью метода МГНК впервые изучена кинетика экспрессии отдельных генов у вариантов вируса гриппа А(НЗц 2), различающихся по уровню репродукционной активности в клеточных культурах.

Практическая значимость работы. Приготовлены новые диагностические шташы А/Ленинград/289/83 и А/Киев/3304/84, которые отконтролированы в ГЙСК им.Л.А.Тарасевича и рекомендованы Комиссией по вакцинным штаммам Минздрава СССР дая внедрения в производство.

Штамм А/Ленинград/289/83 внедрён в производство диагности-' чееких препаратов в Лен.НШВС и на Одесском предприятии'по производству бакпрепаратов с 1986 г. Диагностикумы из указанного штамма широко применяются в практике работы вирусологических лабораторий на Союзном уровне (более чем в 60 городах страны). Использование вируса А/Ленинград/289/83 по сравнению с вирусом А/Бангкок/1/79 (рекомендованным ВОЗ для целей диагностики) позволило повысить частоту диагностирования гриппа в среднем на 6%. Широкий антигенный спектр вируса А/Ленинград/289/83 позволил с успехом использовать его для диагностики гриппа в течение трёх последовательных эпидемий (1983, 1985 и 1987 гг.), а также применять для оценки пммуногенностп живых и инактивпро-ванных гркгатозшх вакщш.

Штамм А/Киев/3304/84 (HON I) используется в производстве диагностикумов в отделе диагностических препаратов ВНИИ гриппа Минздрава СССР в течение последних 4-х лет и с 1990 г. - на Одесском предприятии по производству бакпрепаратов. Диагноста-

кум из указанного штамма характеризуется высокой активностью и специфичностью, что позволяет контролировать коллективный иммунитет и следить, таким образом, за уровнем циркуляции вирусов указанной антигенной структуры в различных возрастных группах населения. Диагностикумы внедрены в практику работы вирусологических лабораторий - опорных баз Всесоюзного Центра по гриппу и ОРЗ.

Разработанные диагностические штаг-ялы защищены авторскими свидетельствами на изобретение (АС № 1277607 и АС Л 1463758) и экспонировались на международной выставке Восток-Запад-89 (г.Турку, Финляндия).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. На основании сравнения вирусов гриппа В одного периода циркуляции показано, что способность антигенно родственных штаммов реагировать со специфическими антителами зависит от структурных особенностей полипептида HAI. Установлены прямые корреляции мезду молекулярной массой тяжёлой цепи гемагглютн-нина и способностью штаммов к взаимодействию с антителами к дрейф-вариантам соответствупдего периода циркуляции как в сыворотках людей, так и иммунизированных лабораторных животных.

2. Формирование in Yitro ингибиторорезистентннх, а также хозяин-зависимых вариантов вирусов гриппа A(H3li 2) может приводить к изменению скорости миграции полипептида HAI при электрофорезе в полиакриламидном геле.

3. Методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот показано, что одним из механизмов становления высокорепродуктивных для клеточных культур вариантов вируса гриппа А(НЗК 2) может быть формирование субпопуляций, характеризующихся повышенным уровнем экспрессии НА, NA, KP, М, РА и NS генов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференциях молодых учёных во ВНИИ гриппа Минздрава СССР (1979, 1989 гг.), в Институте микробиологии и эпидемиологии им.И.И. Мечникова г.Одессы (1979 г.), в Институте микробиологии им. А.Кирхенштейна АН Латв.ССР г.Риги (1980 г.), а также на заседании вирусологической секции Общества микробиологов п эпидемиологов (1989 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, получено 2 авторских свидетельства.

- Объём и структура работы. Диссертация изложена на 188 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов. Текст иллюстрирован22 таблицами, 25 рисунками. Список литературы содержит 242 названия работ отечественных и зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работа использовали вирусы гриппа типа А с антигенной формулой НОЫ" I и НЗ К2 и типа В из музейной коллекции ВНИИ гриппа Минздрава СССР (19 штаммов), в том числе эталонные штаммы, полученные из ВОЗ (8 штаммов), а также рекомбинантные вакцинные штаммы, полученные Н.Е.Горевым в лаборатории генетики и вакцинных штаммов ВНИИ гриппа (2 штамма).

• Накопление вируссодержащего материала проводили путём заражения 11-дневных куриных эмбрионов (КЗ) в дозе Ю2 - Ю3 ЭИДсф/О 2 мл* перевиваемой клеточной культуры ?ЛСК ш пер-вично-трипсинизированной культуры клеток почек телят (ТП) в дозе 10-100 ЭИД50/клетку.

Реакцию гемагглютинации (РГА) и торможения гемагглютина-■ ции (РТГА) выполняли в соответствии с Методическими указаниями по работе опорных баз ВЦГ (Ленинград, 1986).

Инфегашонную активность вирусов определяли титрованием на куриных эмбряонах.

. Концентрирование вирусов гриппа проводили с помощью высокоскоростного центрифугирования (40 тыс^ , I час), очистку концентрата - центрифугированием в градиентах плотности сахарозы (10-40$ и 30-60%) по методу ТоЪ^а, КПЬоигпе (1975). Концентрацию белка в пробах определяли по методу Ьочгту (1951). Электрофорез вирусных полипептидов в 7,5 пли полн-акриламццном геле проводили по методу ЬаедапИ (1970) в присутствии додецклсульфата натрия и мочевины с последующей окраской Кумасси и-250. При анализе вирусиндуцировагашх полипеп-тадов в клетках ВДСК электрофорезу подвергали лизаты инфицированных клеток, при культивировании которых через 4 часа после инфекции в поддерживающую среду вносшш смесь меченых аминокислот (14С-ала, 14С-лей, ^С-вал) из расчёта I мБк/млн.кле-

ток. После ЭФ гели высушивали и экспонировали с рентгеновской плёнкой РМ-В.

Меченые вирусные РНК получали путём введения в куриные эмбрионы через 4часа после заражения 3Н-урвдина (80-100 мБк/ /эмбрион).

Выделение РНК из аллантоисной жидкости и лизатов клеток проводит фенол-хлороформным методом с предварительной обработкой активированной проназой Р или протеиназой К и последующим переосазденпем этанолом. РНК, выделенные из лизатов клеток, иммобилизовали на полиамидных фильтрах и анализировали в реакции молекулярной гибридизации.

Электрофорез одноцепочечных РНК из аллантоисного материала проводили в пластине 2,8$ ПААГ в системе трис-фосфатного буфера (Palese, Schulman , 1976).

Для молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот использовали плазмиды рВ£ 322 с встроенными ДНК-копиями генов вируса гриппа А/Ленинград/385/80 Р-НА, NA, M.HS и РА из коллекции НИИЭМ им.Пастера, а также плазмиду pBR 327 с встроен-, ной ДНК-копией KP-гена вируса гриппа A/PR/8/34, любезно предоставленную I .А.Петровым (ВНИИ молекулярной биологии, Новосибирская обл.). Введение метки (^Р) проводили в реакции ник-трансляции (Маниатис, 1984). Предгибркдизацию и гибридизацию иммобилизованных на фильтрах РНК с мечеными зондами проводили в 50^-ном формамиде при 40-42°С в течение 2 суток, после чего фильтры отмывали от избытка метки и авторадиографи-ровали. Полученный принт сканировали с одновременны?.! интегрированием пиков на денситометре " Bio Had По площади пика, выраженной в единицах оптической плотности (Б/мм), оценивали относительное содержание РНК в данной пробе.

Расчёт средних геометрических титров (СГГ) антител проводили по методу Ворошиловой и соавт. (1964). Достоверность различий рассчитывали с помощью критерия Стьздента (Ашмарин и др., 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительное изучение полипептвдного состава и биологических свойств вирусов гриппа В

Метод одномерного электрофореза широко использовался в исследованиях по этиологии гриппа для выяснения отличий в скорости миграции вирусных полипептодов (ПП) при первичном скрининге новых язолятов вируса в целях определения молекулярных механизмов изменчивости вирусов и их модификации (Oxford е. а. , IS83; 1984). Приемлемость теста к анализу диагностических потенций штаммов практически не изучалась. В этой связи была поставлена задача сравнительного изучения электро-форетической подвижности полипептидов вирусов гриппа В разных лет выделения наряду с основными биологическими признаками, существенно важными для кандидатов в диагностические штаммы.

В работе бшш использованы антигенно родственные штаммы вирусов гриппа В: В/Гонконг/5/72, В/Ленинград/232/74, В/Ле-нинград/369/75, В/Ленинград/14/76, ВДабаровск/46/76, ВД!ур-манск/2/76, В/Свердловск/1/76. Дополнительно исследовали антигенно отличные штаммы В/Ли/40, ВД1осква/95/59, ВДабаровск/ /85/79.

Указанные вирусы были исследованы по следующим признакам: репродукционная активность, чувствительность к ингибиторам, широта антигенного спектра в отношении антител к вирусам соответствующего периода циркуляции (с использованием моноспецифических гипериммунных сывороток крыс), а также авид-пость к антителам человеческих сывороток.

Сравнение подвижности отдельных Ш (в одной пластине геля) показало, что все исследуемые вирусы гриппа В не отличались друг от друга по подвижности ППмР, RA2 и М. Молекулярная масса {ММ) ПП WP составляла 62, НА2 - 28 и М - 24 кД (полипептид НА, как правило, экранировался НА). Чёткие различия наблюдались, однако, в подвижности ПП HAI, W которого составляла у вируса В/Ли/40 56,0; В/Москва/95/59 - 57,5; В/Гон-конг/5/72 - 52,5; В/Ленинград/232/74 - 53,5; В/Ленинград/369/ /75 - 55,5; В/Ленинград/14/76 - 58,0; ВД!ур?ланск/2/76 - 53,5; ВДабаровск/46/76 - 53,5; В/Свердловск/1/76 - 53,0; ВДаба-ровск/85/79 - 53,0 кД.

Анализ диагностической активности вирусов по их способ-

ности выявлять антитела в человеческих сыворотках в РТГА показал, что у антигеннородственных вирусов гриппа В с увеличением Ш полппептида HAI как правило повышалась способность выявлять антитела в человеческих сыворотках (табл.1). Методом корреляционного анализа установлено наличие прямой взаимосвязи этих величин (при Р = 0,05). Аналогичные корреляции (Р « = 0,05) отмечены при сравнении Ш полипептида HAI с широтой антигенного спектра вирусов гриппа В IS72-I976 гг. выделения при чётко выраженной тенденции у штаммов с наибольшей ММ ука-зашюго полипептида лучше выявлять антитела к дрейф-вариантам вирусов гриппа В одного периода циркуляции.

Таблица I.

Сопоставление ММ ПП HAI со способностью вирусов гриппа В к взаимодействию со специфическими ан- . тителами

Найме- Антигенно - родственные Антигенно-отличные

ко- СО Ю ■Г

ва- < < ш

ние см «3 N \ N ю

штам- с-\ ^ X э 5 £.. S

ма LO о к р. л р.

m о « ЬЮ Lj о

й о о и о Н £> Нс- И из О • я

§ а ¡8 Н 4 В е*г го н!> §<

£ р. са а ^ М Ф о Ч OJ шч са

о ^ т РЧ га га

рр РЭ га со

ММ ПП

52,5 53,0 53,5 53,5 53,5 55,5 58,0 56,0 53,0

ш

СГТ"1

анти-

тел в

чело- 12,5 30,0 47,0 15,0 100,0 122,0 33,5 33,0

вечес-

ких

сыво- *

ротках

СГТ-1

анти-

тел в

крыси- 28,0 28,0 45,0 42,0 52,0 60,0 64,0 - -

ных

сыво-

ротках ШС) . ...

" Изучение биологических свойстз и полппептидного состава вирусов гриппа А(Н0 N1)

Актуальность работ по подготовке диагностических штаммов вирусов гриппа А с антигенной формулой HON I (по классификации ВОЗ 1971 г.) определяется реальной возможностью появления в циркуляции "старых" эпидемических вирусов согласно гипотезе Френсиса-Смородинцева (Hope-Siтрвоп, Golubev , 1987). Известно, что вирусы этой антигенной разновидности выделяются и в настоящее время (Дегтярёв и др., 1987; Фурсова и др., 1988), однако об интенсивности их циркуляции можно судить лишь по результатам коллективного иммунитета, сопоставляя его динамику в группах здоровых лкщейвозрастных категорий (инфицированной и контрольной групп).

Следует отметить,- что использование слабо аввдного производственного .штамма А/Шклявер/48, в отличие от вируса A/PR/8/ /34, не позволяло выявлять антитела ни в одной из групп, однако последний в поствакцинальный период (ноябрь-декабрь) нередко выявлял у взрослых гетеротишгческие приросты антител.

В связи с задачей подготовки соответствующего диагностического штамма, было проведено изучение вирусов гриппа А(НОя I), тлевшихся в коллекции ВНИИ гриппа: A/PR/8/34, А/ меГЬигп /35, А/Во1Ьапу /42. A/weis /43, А/Шклявер/48 и А/Киев/3304/84, современный вирус, близкий по антигенной структуре вирусу A/PR/ . /8/34. , -

Указ шише вирусы мало отличались друг от друга по показателям репродукционной активности и чувствительности к неспеци-фичвскам ингибиторам сывороток лошади и морской свинки, однако наибольшей шпротой антигенного спектра, определяемой по результатам перекрёстной РТГА с гипериммунными крысиными сыворотками ко всем указанным вирусам, обладал вирус А/Киев/3304/84. Штамм А/Киэз/3304/84 также характеризовался наибольшей авидностью и к антителам человеческих сывороток (от лиц старше 40-летнего возраста). Использование штамма А/Киев/3304/84 при изучении коллективного иммунитета показало, что в группе "инфицированных", т.е. лиц, имевших реальную возможность контакта с вирусами гриппа А(Н0н I), антитела в титре 1:20 и выше определялись чаще со .штаммом А/Киев/3304/84, чем с вирусом А/Р1/8/34 (в 23,7 и 17,1$ ■ случаев соответственно), тогда как у детей и лиц контрольной (неинфицированной) группы в возрасте до 40 лет, напротив, чаде

выявлялись антигемагглютишпш к вирусу A/PR/8/34, что не позволяет исключить возможность выявления реакций неспецифического характера.

Электрофоретический анализ полипептидного состава вирусов гриппа А(Н0W I) показал, что основные различия ыеэду штаммами наблюдались по подвижности полипептида тяжёлой цепи гамагглю-тинина (HAI).

При сравнении Ш ПП HAI вирусов гриппа A(H0N I) с показателями их 1ИАС и авидности к AT человеческих сывороток можно, было проследить тенденцию к обратной зависимости, а именно: с увеличением ММ полипептида HAI показатели 111АС и авидности у соответствующего штамма снижались.

По результатам проведённых исследований штамм А/Киев/3304/ /84, как в наибольшей стерени отвечающий требованиям, предъявляемым к диагностическим, был представлен в ГИСК нм.Л.А.Тара-севича, где был отконтролирован по всем параметрам, после чего решением Комиссии по вакцинным штаммам Минздрава СССР от 28.10.86 рекомендован для внедрения в производств.

Ксслед вание лабораторных параметров и подготовка нового диагностического штамма вируса гриппа A(H3N 2)

Как было показано ранее (Соминина, 1983), выбор авялиого штамма с широким антигенным спектром является важным условием правильной подготовки диагностических штаммов, от чего в конечном счёте, зависит как частота диагностирования гриппозной инфекции, так и определяемые показатели пммуногенности новых гриппозных вакцин. В зарубежной практике, где для целей профилактики используются преимущественно высокояимуногеннне препараты инактивировашшх гриппозных вакцин, этот вопрос не привлекает столь пристального внимания. Он возникает, однако, при оценке иммуногенности живых гриппозных вакцин, при использовании которых интенсивность гуморального ответа выражена несравненно слабее, и показатель частоты выявляемых сероконверскй нередко является лимитирующим фактором.

Для уточнения вопроса о стабильности признака ШАС и возможности его сохранения при подготовке ИР штаммов в условиях сильного селективного подавления основной массы содержащихся в популяции ингибиторочувствительных частиц, были использованы резко отличные по признаку ШАС (п исходном состоянии) антигенно

родственные вирусы А/Филгогпикы/2/82 и А/Ленинград/289/83. Показатель ШАС у штамма А/Ленинград/289/83 был в 3 раза вине, чем у вируса А/Филишшны/2/82. Методика получения К? субпопуляций была аналогичной и заключалась в последующем пассировании предельными разведениями в присутствии нативных сывороток лошади и морских свинок.

Диагностическую активность полученных инглбиторорезистент-пых субпопулягсий обоих вирусов оценивали в сравнении с диагностическими штаммами предшествующего периода (А/Гехас/1/77 и А/Балгкок/1/79).

На материалах обследования парных сывороток от 142 детей с ОРЗ в возрасте от 7 до 14 лет при -параллельном использовании трёх диагностических штаммов было установлено, что вирус А/Ленинград/289/83 по диагностической активности намного опережал штамм А/Филшшшш/2/82 (разница в частоте выявляемых серокон-версий составляла 12%, средние геометрические титры вируса в сыворотках переболевших были выше со штаммом А/Ленииград/289/ /83 в 2,8 раза, а кратность прироста титров антител при использовании указанных выше штаммов составила 9,8 и 6,5 соответственно). При сравнении с более ранними диагностическими штамм — . № (А/Гехас/1/77, А/Бангкок/1/79) на материалах сывороток от 556 детей и 125 взрослых с ОРЗ такяо документирована наиболее высокая диагностическая способность у штамма А/Легагаград/28Э/ /83.

Полученные результаты подтвердили существование корреляции медцу ШАС исходных популяций вирусов гриппа и их реальной диагностической активностью.

Полипептидный анализ эталонных и диагностических штаммов вирусов гриппа А(НЗы 2) - А/Гехас/1/77, А/Бангкок/1/79, А/Фи-лишшны/2/82 а А/Ленинград/289/83 - показал, что, в отличие от вирусов гряппа В, молекулярная масса полипептида НА1 была наименьшей у штамма А/Яенинград/289/83, обладающего наибольшей диагностической активностью. . ■

Подготовка и сравнительное изучение вирусов гриппа

А(НЗК 2). различающихся по чувствительности к неспецифическим ингибиторам сывороток животных и , .ловека

Многолетний опыт использования в диагностике ИР-штаммов вирусов гриппа показал существенное преимущество такой практи-

ки, при которой устраняется необходимость дополнительных операций по обработке сывороток, повышается стандартизация результатов, описается стоимость анализов. Вместе с тем, остаётся мало изученным вопрос о том, какие изменения происходят в составе вирусной популяции в процессе становления ИР-вариантов.

Как показал опыт получения üP-вариантов из вирусов гриппа А(НЗЯ 2), в том числе из штаммов А/ЕехасЛ/77, А/Лекинград/7/78, А/Пенинград/289/83, А/Москва/2851/86, А/Сичуань/2/87, кинетика становления ИР-субпопуляций в каздом случае достаточно своеобразна и зависит, по-видимому, не только от соотношения ИР- и ИЧ-частиц в популяции, но и от структурных особенностей гемаг-глюткшша конкретного штамма, определяющих или оказывающих влияние на признак отношения к иеспецифическим сывороточным ингибиторам (НСИ).

Способность икгкбЕторорезистентвого (ИР) варианта к взаимодействию со специфическими антителами в сравнении с исходной ингибиторочувствительной (ИЧ) популяцией такие изучена недостаточно. В этой связи ИЧ- и ИР-варианты вирусов А/Ленинград/ /289/83 и А/БангкокД/79 исследовали с панелью доноютанальишс антител к НА шта-лма А/!Бангкок/1/79, любезно предоставленных д-ром Вебстером ( Webster R.G. Department of Virology ana Molecular Biology, St. Jude Children.'p Research Hospital, Memphis, Teimesss, USA ).

Полученные результаты продемонстрировали незначительные изменения в реактивности отдельных антигенных детерминант, которые практически не влияли на суммарную степень взаимодействия вариантов с МКА, оцениваемую по величине СГТ.

Молекулярно-биологичаские исследования ИР- и ИЧ-вариантов вирусов гриппа, направленные на изучение природы признака отношения к НСИ, судя по доступной литературе, весьма ограничены. При сравнении ИЧ- и ИР-рекомбшантных вирусов гриппа А методом ЭФ РНК (Hay , 1974) были обнаружены мутации только в гене НА, что позволило связать способность взаимодействия с НСИ со структурой соответствующего белка (Dötmer «?. о. , 1983). В другом случае, признак устойчивости к ^-ингибиторам неиммунной сыворотки лошади использовался как инструмент отбора вариантов вирусов гриппа А(НЗн 2) с заданной рецепторной специфичностью: свойство чувствительности (или резистентности) к НСИ лошади соответствовало сродству НА к связи СКс<2 - 6 Гал (или СКо(2 - 3 Гал) на рецепторе (СК-сиаловая кислота, Гал - галактоза). ИЧ -

и ИР-свойства, как и сцепленные с ними свойства рецепторной •специфичности, определялись- наличием остатка глиинна или глу-тамина в положении 226 тяжёлой цепи НА (Rogers е.а. , 1983). В нашей работе исследовались пары ИЧ- и ИР-вариаитов вирусов гриппа А(НЗМ 2). Анализ ПП состава обоих вариантов вируса А/Ле-шшград/289/83, выращенных в куриных эмбрионах, показал, что скорость миграции Ш HAI у ИР при Эф в ПААГ заметно выше, чем у ИЧ. Подобные результаты были получены при изучении культу-ралышх ИР и ИЧ вирусов гриппа А/Летшград/7/78: HAI у ИР двигался быстрее. Таким образом, данные подтверждают связь природа признака отношения к НСИ со структурой гемагглютинина. В то жэ время очевидна разобщённость центров взаимодействия с НСИ п со специфическими антителами.

Влггяние клетки-хозяина' на структуру и свойства вирусов гриппа

Изучение вирусов, выращенных в различных клеточных культурах или куриных эмбрионах показало, что система хозяина влияет на состав гликопротеидов вируса (Вихрев и др., 1987). Также показано, что культуралыше вирусы по сравнению с аллантоисными обладают повышенной диагностической активностью (Schild а.а. » 1983; Schild o.a. ,1984; Oxford е.а. , 1987; Katz е.а. , 1987). Это преимущество, однако, проявляется обычно в случае изоляции вирусов в клеточных культурах, как отражение тропизма определённых антигенных вариантов к данной системе хозяина (Schild е.а., 1983; Robertson, е.а., 1985). В отдельных случаях, например, при серодиагностике вирусов гриппа В, преимущество культурального вируса проявлялось я в случае первоначального пассирования в куриных эмбрионах (Соминина п др., 1982; bathey е.а. , 1986), что свидетельствует, по-видимому, о зависимости диагностических свойств от особенностей гликозилировашш и других структурных характеристик вирусов гриппа.

- Выполненный нами седиментанионный анализ вирусов гриппа АДехас/1/77 п А/Лешшград/385/80 Р, выращенных в куриных эмбрионах и клеточных культурах MUCK и ТП, позволил сравнить диапазон распределения вирионов в 10-60$ градиенте плотности сахарозы. Было отмечено, что культуралыше вирусы, в сравнении с ат-лантоиснкми, тлеют тенденцию распределяться в болР" широкой зоне градиента, что, как и электронно-микроскопический анализ,

свидетельствует о более выраженном полиморфизме популяций вирусов гриппа культурального происхождения.

Электрофоретичес:<ий анализ вирусов гриппа АДехас/1/77, выращенных в КЭ, клетках ТП и МДСК,выявил различия в подвижности полипептидов гемагглютинина. Так, в невоостанавливающих условиях ПП НАО аллантоисного варианта мигрировал быстрее, а НАО вируса, выращенного в клетках ТП,- медленнее остальных. При анализе в восстанавливающих условиях ещё чётче проявлялась разница в подвижности полипептидов HAI, а у аллантоисного ви-' руса и ПП НА2 заметно "опережал" аналогичные полипептиды куль-туральных вариантов. Другие различия, наблюдаемые при данном анализе, относились к разной степени расщепления ПП НАО у аллантоисного и культурального вирусов. У последних часть гемагглютинина оставалась в ''неразрезанной" форме, о чём свидетельствовало наличие ПП НАО и при восстанавливающих условиях электрофореза. Аналогичные различия в подвижности и степени расщепления гемагглютинина показаны и между аллантоисными и культу-ральншли (ТП и МДСК) вариантами вируса А/Ленинград/385/80 Р.

Изучение высокотзептюдуктивных для клеточных культур клонов вируса гриппа А(НЗК2)

Ограничение в практическом использовании гриппозных куль-туралышх диагностикумов связана с низким уровнем репродукции вирусов гриппа в клеточных культурах. Использование в качестве инфекционного материала высокорепродуктивных клонов (HPK), выделенных из исходной популяции с помощью приёма разделения её по скоростям репродукции в клеточных культурах (Корчанова и др., 1982), позволяет увеличивать урожай культуралышх вирусов. Тем самым возможность применения культуралышх препаратов в целях диагностики могла бы быть расширена при условии сохранения активности их взаимодействия со специфическими антителами. В этой связи особый интерес представляло изучение ВРК в сравнении с исходной популяцией как по характеру взаимодействия с антителами, так и по молекулярно-биологическим параметрам.

В работе использовали вирус гриппа А/Ленинград/385/80 Р -- исходный вариант (ИВ), а также высокорепродуктивные клоны ' (ВРК), полученные из него путём разделения в культурах клеток почек телят (ЕРКДП/6, ВРКДП/4а, ВРК/1П/46), почек поросят (ЕРК/КФ/8), перевиваемой линии клеток ВДСК (ЕРК/ВДСК/6, ВРК/

/ЦЕСК/8, Ы>МГСК/9).

Для сравнения 11В и ВРК в РТГА использовали 28 типов ЫКА к гемагглготинину вируса гриппа А/Вангкок/1/79 (МеЪцЬег п.й.)•

Отличия ВРК от 11В по активпости взаимодействия с отдельными МКА свидетельствовали о репрезентативности использованного набора МКА для оценки антигенных свойств гемагглютинина, и в то же время о сходстве антигенной структуры гемагглютинина ВРК и ИВ.

Различия в степени взаимодействия по отдельным антигенным сайтам были не более чем 2-4-краткыг.п( рис.1). ВРК/ГП/6 не отличался от ИВ и по реактивности с антителами человеческих сывороток (табл.2).

Таблица 2.

Сравнение диагностической способности в РТГА двух вариантов вируса гриппа А/Ленинград/385/80 Р

Вирусный материал Система накопления CTTj) СТТ^ Кратность прироста титров Частота серокон-версий (абс-ч..^

Исходный Клетки ТП 32 74 2,3 8

КЭ 49 104 2,1 8

НРК/ТП/ /6 Клетки ТП 34 79 2,3 8

КЭ 34 79 2,3 8

' CTTj - в первых сыворотках.

СГТ2 - во вторых сыворотках.

Электрофоретический анализ вирусных полипептидов, синтезируемых в клетках МЦСК, инфицированных ИВ и ВРК/ГП/6 не выявил разницы в подвижности ПП НА, N Р, M и us (N'A эмигрировала при данных условиях ЗФ с НА). Не обнаружено различий между исследуемыми вариантами вируса и по подвижности одной очечных РНК при электрофоретическом анализе.

ДОХ* ъиж

ыф№

ш-тг*<т И К Л

Рис.1. Спектр взаимодействия исходного вируса А/Ленин-град/385/80 Р и полученных из него ВРК с набором ША к гемагглютинину вируса гриппа А/Бангкок/ /1/79 (НЗК2) в РТГА.

Результаты определения инфекционного вируса в культураль-ной среде на разных сроках после заражения показали, что ВРК/Ш/6 значительно опережал исходный вариант по скорости формирования инфекционного потомства: первичный цикл репродукции у ВРК завершался через 6 часов, тогда как у исходной популяции - лишь через 12 часов после инфицирования (рис.2).

Для выяснения вопроса о механизме повышения репродукции ЕРК было проведено изучение уровней и скорости экспрессии генов, кодирующих структурные (гемагглютинин - НА и нейраминида-зу - NA), структурно-регуляторные (нуклеопротеид - кР и мембранный - М) и регуляторные (неструктурные - Nsl и N82, и кислый белок транскриптазного комплекса - РА) белки у ИВ л ВРК в клеточной культуре почек телят (ТП). Для этой цели использовали метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, успешно применяемый при решении задач по специфическому выявлению генетического материала вируса гриппа (Плюснин и др., 1987).

Относительные количества всРНК в клетках ТП оценивали по результатам денситометрирования авторадиограмм, полученных после молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Анализ содержания всРНК - продуктов отдельных вирусных генов - в клетках ТП, инфицированных одним из вариантов вируса А/Ленинград/385/ /80 Р, выявил опережение в скорости накопления всРНК у ЕРК/ТП/6 по сравнению с исходным вирусом (рис.2). Расположение кривых, отображающих изменение содержания в клетках всРНК, позволяет судить также и о превышении уровня экспрессии генов ЕРК/ТП/6 с 6 до 24 часов после инфицирования. Таким образом, впервые удалось продемонстрировать повышенную и ускоренную экспрессию генов у ЕРК/ТП/6, причём особенно Еыраженную у генов РА, нР и ns, принимающих участие в регуляции процессов транскрипции и репликации. Динамика накопления инфекционного вируса в куль тур алыгой среде и всРНК в клетках отражает, по-видимому, ускорение процессов сборки и (шга) почкования вирионов у EPK/îïï/6 по сравнению с исходным вирусом.

ЙА

час после заражения

Рис.2. Кииетика инфекционной активности(ИА) и содержания в-ирусспецифических РНК(!1Л,ИА,М,Н5,НР,РА) в культуре клеток, почек телят у исходного вируса (•-*)

и ВРК/ТП/6(-------

ВЫВОДЫ

1. Изоляты вирусов гритаа А и В, отличающиеся по широте антигенного спектра и способности реагировать с антителами человеческих сывороток, могут не различаться по электрофорети-ческой подвижности полипептида нуклеопротеина (кР), М-балка и лёгкой цепи гемагглютинина (НА2).

2. Способность вирусов гриппа А и В реагировать со специфическими антителами зависит от структурных особенностей тяжёлой цепи гемагглютинина (HAI), отражающихся на её электрофоре-тической подвижности.

3. Получаемые в лабораторных условиях для диагностических целей ингибиторорезистентные клоны вирусов гриппа А, судя по результатам их взаимодействия с панелью монокяопальных антител, не меняют своей антигенной структуры (но могут приобретать минорные отличия в подвижности полипептида HAI при ЭФ в ПААГ), что свидетельствует о разобщённости сайтов на молекуле гемагглютинина, ответственных за взаимодействие со специфическими антителами и но специфически?.® ингибиторами.

4. При подготовке новых диагностических штаммов вируса гриппа с антигенной формулой A(H0n I) и A(H3n 2) показано существование прямой зависимости между широтой антигенного спектра и реальной диагностической активностью штаммов.

5. Повышение репродукционной активности у клона вируса гриппа А/Ленинград/385/80 Р, полученного разделением популяции по скорости формирования инфекционного потомства в культуре клеток почек телят, коррелирует с увеличением уровня экспрессии генов НА, ПА, BP, М, РА и N8 , а также ускореннымjiaKomie-нпем в клетках всРНК, которое наиболее выражено для KP-, раи ns-phx.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

I. Соминина A.A., Корчанова Н.Л., Лисок Т.П., Симановсйая В.К., Кузнецова Е.В., Сухубаевская Л.П. Новая технология производства и характеристика антигенных и молекулярно-биологических параметров тканевых гриппозных диагностикумов// Актуальные вопросы иммунопрофилактики вирусных и бактериальных пн-• фекций.-- Томск. 1981. - С.87-68.

2. Кузнецова E.B. Мслекулярно-биологическая характеристика вирусов гриппа А, отличающихся по признаку чувствительности к не специфически!/ ингибиторам// Вирусы человека и животных. -

- Рта, Зинатне, 1981. - С.50-51.

3. Корчанова Н.Л., Соминша A.A., Лисок Т.П., Сухубаевская Л.П., Кузнецова Е.Б. Гетерогенность популяций современных вирусов гриппа А и В по признакам репродукционной активности, чувствительности к ингибиторам и авидности к антителам// Этиология и диагностика гриппа и других ОРЗ. - Л., 1982. -

' - С.124-132.

4. Корчанова Н.Л., Сомишша A.A., Симановская В.К., Гордон М.А., Головешкина Т.Н., Кузнецова Е.В. Сравнительная характеристика вирусов гриппа В. I. Биологические свойства и полипептпд-ный состав вирусов разных лет выделения// Акта вирологика.

- 1983. - У. 27. - Р.37-384.

5. Корчанова Н.Л., Соминнва A.A., Симановская В.К., Кузнецова Е.В. То де П. Влигниз системы клетка-хозяин на биологические свойства и полипептвдный состав вирусов гриппа В// Акта вирологика. - 1903. - У. 27. - Р.385-392.

6. Сухубаввская Л.П., Кузнецова Е.В., СомининаА.А.. Характеристика высокорепродуктивных для клеточных культур клонов вируса гриппа А(НЗи2), полученных разделением вирусной популяции по скорости репродукции// Этиология и диагностика грип- . па и других ОРЗ. - Л., 1986. - С.128-133.

7. Авторское свидетельство й 1277607 (СССР). Штамм А/Ленинград/ /289/83 (НЗы 2) вируса гриппа, используемый для приготовления гриппозного диагностикума/ Сомишша A.A., Лузянина Т.Н., Гринбаум Е.Б., Коваль С.Г., Кузнецова Е.В. и др.

0. Авмрское свидетельство & 1463758 (СССР). Штамм вируса гриппа А/Киев/3304/84, используемый для приготовления гриппозного диагностикума/ Кузнецова Е.В., Соминпна A.A., Найхин А.Н., Литвинова О.М. и др.

9. Кузнецова Е.В., Плюснин А.З., Нолавдт О.В., Сухубаевская Л.П., Союшина А.А;Киселёв О.И. Изучение кинетики накопления вирусспецифических РНК в клетках почек телят, заражённых высокорепродуктивными клонами вируса гргапа А, методом точечной гибридизации нуклеиновых кислот// Генетическая инженерия имму-номодуляторов и вакцинных препаратов. - Л., 1989. -

- С.140-146.

Bl/fbjfb iQ< Ш Гир./СС. Л t/sSO/ ¿e('ts.r>>'S-.