Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение процессов деконтаминации пищевых продуктов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение процессов деконтаминации пищевых продуктов"



На правах рукописи □□3448361

Попова Елена Юрьевна

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ДЕКОНТАМИНАЦИИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Специальности 03 00 23 - "Биотехнология"

05 18 07 - "Биотехнология пищевых продуктов"

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

О 2 0HT 2008

Москва 2008

003448361

Работа выполнена в Московском государственном университете инженерной экологии (МГУИЭ) на кафедре «Экологическая и промышленная биотехнология»

Научный руководитель - Минаева Людмила Павловна,

кандидат технических наук

Официальные оппоненты - Туликова Татьяна Владимировна,

доктор технических наук - Юсупова Галина Георгиевна,

кандидат биологических наук

Ведущая организация Московский государственный университет прикладной биотехнологии

Защита состоится 21 октября 2008 г в 1230 на заседании диссертационного совета ДМ 212 204 13 в Российском химико-технологическом университете им Д И Менделеева по адресу 125047, Москва, Миусская пл, д 9, ауд 443

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУим Д И Менделеева

Автореферат разослан «/^»¿^^¿^£^2008 г

Ученый секретарь

диссертационного совета ДМ 212 204 13, кандидат технических наук И В Шакир

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Процессы порчи пищевых продуктов во многом обусловлены наличием общего типа контаминантов - присутствием спор бактерий

Молоко, поступающее на завод, изначально заражено вегетативными клетками и спорами Инактивация спор происходит при температуре свыше 120°С, но обработка при повышенной температуре негативно сказывается на технологических свойствах молока и качестве получаемых из него продуктов. Альтернативой жестким режимам тепловой обработки может быть обработка в более мягких условиях (пастеризация), но она не обеспечиваег необходимой защиты.

Следующая проблема - проблема безопасности хлебобулочных изделии, связанная с повышенной зараженностью муки спорами бактерий рода Bacillus, вызывающих картофельную болезнь хлеба (КБХ) Известно, что бактерии рода Bacillus могут вызывать у ослабленных людей заболевания желчного пузыря, менингиты, артриты, перитониты, эндокардиты

Проблема качества муки является актуальной, с одной стороны, для производства здорового хлеба потребителю, с другой стороны Россия после вступления в Б1Ü становится потенциальным экспортером муки Товары, представляемые с граной-экспортером, должны соответствовать международным стандартам по показателям безопасности.

Несмотря на множество разработанных методик оценки зараженности муки бактериями-возбудителями КБХ, до сих пор единственным способом проверки муки является метод пробной лабораторной выпечки

В связи с этим разработка методики по оценке качества муки в отношении возбудителей КБХ является актуальной

Цель работы - изучение контаминантов и разработка методов деконта-минации продуктов повседневного потребления - молока и хлеба

Основные задачи: провес га экспериментальное изучение влияния низина на кинетику гибели споровых микроорганизмов в диапазоне температур пастеризации на примере контаминаптов из молока,

- разработать математическое описание кинетики гибели споровых контаминаптов в присутствии низина,

- исследовать влияние низина на газообразующие контаминанты кисломолочных продуктов,

- исследовать развитие споровых контаминантов в опытных образцах хлеба в процессе хранения,

- исследовать динамику развития спор бактерий-возбудителей картофельной болезни хлеба в модельной среде,

- исследовать амилолитическую и протеолитическую активности бактс-рий-возбудителеи картофельной болезни хлеба,

- исследовать термоустойчивость спор бактерий-возбудителей картофельной болезни хлеба,

- разработать методы оценки картофельной болезни в муке и хлебе

Научная иовизпа: изучено влияние добавок низина на кинетику термической деконтаминации споровых контаминантов, вызывающих порчу молочных продуктов, и установлены значения стерического коэффициента А и энергии активации Е,

- предложен способ расчета режимов тепловой обработки, обеспечивающий сохранность продуктов в условиях жаркого климата,

- установлено ингибирующее действие низина на неспоровые газообразующие кошаминанты Lactobacillus fermentum, выделенные из молочнокислых десертов,

- изучена динамика развития споровых бактерий-возбудителей картофельной болезни хлеба в опытных образцах хлеба и на модельной среде,

- разработаны экспресс-методы сравнительной оценки протеолитической и амилолитической активностей бактерий-возбудителей картофельной болезни

хлеба в образцах муки и показана корреляция этих параметров с заболеваемостью хлеба

Практическая яичимость: исследована чувствительность газообразующих контаминантов к низину и молочной кислоте, определена доза низина -40 мг/кг, обеспечивающая деконтаминацию творожных десертов,

- установлена рациональная доза внесения препарата низина в молоко - 10 мг/л для снижения уровня теплового воздействия на компоненты молока, обеспечивающая микробиологическую безопасность готовых продуктов в сезон повышенного микробного фона молока,

-изучено влияние остаточного низина на развитие заквасочной микрофлоры молочных продуктов и установлено, что низин не влияет на общее время сквашивания молока с массовой долей жира 0,5 % и 3,5 %,

- разработаны методики оценки микробиологического качества муки и хлеба по содержанию споровых бактерий-возбудителей КБХ,

- предложены показатели сравнительной оценки протсолитической и амилолитической активности бактерий-возбудителей КБХ

Апробаиия работы Результаты диссертационной работы докладывались на 2-й Международной конференции Наука-Бизнес-Образование Биотехнология-Бизнес-Окружающая среда в Пущино, ИБФМ, 2005 г, на 10-й и 11-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых в Пущино, ИБФМ, 2006, 2007 п , на Научной конференции студентов и молодых ученых МГУИЭ, 2008 г, на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ, Москва, 2008 г

Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 работ

Структура и объем работы Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты экспериментов и их обсуждение, выводы, список литературы

Диссертация изложена па 139 страницах, содержит 31 таблицу и 28 рисунков, список литературы включает 110 наименований

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Обоснована актуальность темы, сформулированы положения, выносимые на защиту, научная новизна, сведения о личном вкладе соискателя Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Рассмотрены причины и источники микробиологической порчи пищевых продуктов, контаминанты молока и хлеба Изложены методы предотвращения порчи пищевых продуктов, особенно термические, а также имеющиеся в настоящее время данные о кинетике термической деконтаминации продуктов Представлена сравнительная характеристика методов борьбы и определения зараженности муки и хлеба возбудителями КБХ Проанализированы работы Барановой И П, Мазохиной-Поршняковой Н Н, Матвеева В Е , Богатыревой Т Г, Поландовой Р Д, Поляковой С П , Delves-Broughton J , J С , Hurst А , Mansour М, Peskera ТI и др Анализ литературы позволил сформулировать цель и задачи исследования.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работу проводили на кафедре «Экологическая и промышленная биотехнология» МГУИЭ, исследование молока и молочных продуктов на базе ОАО Лианозовский молочный комбинат и на кафедре «Стандартизация, сертификация и управление качеством пищевых продуктов» МГУПБ, исследования муки и хлеба совместно с ГНУ ГОСНИИХП Россельхозакадемией Объекты исследований - молоко, молочные продукты и пшеничная мука

Исследования проводили по двум основным направлениям

- изучение кинетики деконтаминации молочных продуктов с низином,

- диагностика возбудителей КБХ в муке и хлебе

По первому направлению использовали методы выделения термостойких споровых контаминантов из молока и неспоровых контаминантов из молочных продуктов, методы идентификации споровых контаминантов с использованием определителя Берги и неспоровых с помощью системы API® произ-

водства «ВюМепеих», метод определения термоустойчивое ги контамиканюв, оригинальный метод определения чувствительности лактобацилл к низину, метод определения КМАФАнМ по ГОСТ 9225-84, определение низина в пробах молочных продуктов методом диффузии в ai ар с тест-культурой Bacillus coaqu-lans ВСЕ15-204 В молоко и молочные продукты вносит российский препарат низина «БИЗИН 1000» В качестве стандарта использовали импортные препараты «Низаплин» и «Кризин»

По второму направлению - метод определения общего количества бактерий КБХ в хлебе, метод определения амилолитической активности согласно ГОСТ 20264 4-89, методы определения протеолитической активности согласно ГОСТ 20264 2-89 и оригинальный метод, основанный на гидролизе казеината натрия, методы определения желатиназной активности бактерий КБХ в пробирках и тонком слое, метод определения кинематической вязкости с помощью вискозиметра

Все экспериментальные исследования проведены не менее чем в трех по-вторностях Для сташстической оценки результатов использовали расчет дисперсии воспроизводимости относительного отклонения величины, усредненный по большому массиву экспериментов, расчет доверительных интервалов средних значений и разницы двух значений

Глава 3. ВЛИЯНИЕ НИЗИНА IIA КИНЕТИКУ ИНАКТИВАЦИИ СПОРОВЫХ КОНТАМИНАНТОВ ПРИ ТЕПЛОВОЙ ОБРАБОТКЕ

Изучали действие низина на споровые формы в условиях пастеризации Споровый контаминант выделяли из сырого молока, полученного с приемного пункта Лианозовского молочного комбината В результате идентификации установлено, что культура относится к р Bacillus подвид lentus Была принята исходная концентрация споровою контаминанта не менее 107спор/мл Прогрев проводили в фосфатном буфере с рП~6,8 при температурах 75±0,5, 85±0,5, 97+0,5 °С в термостатированной водяной бане Время выдержки проб составля-

ло 5, 7, 10, 20, 30, 45 и 60 мин В работе исследовали концентрации низина 25, 50,75, 100 и 125 МЕ/мл

Данные по кинегике гибели клеток контаминанта представлены на рисунках 1, 2, 3, соответственно

О 10 21} 30 40 50 60 70 время, мин

- Без низина

- 50 МЕ/мл -100 МЕ/чз

25 МЕ/Ч1 | 75 МЕ/мл ^ 125 ИЕ/М

Рис 1 Кривые гибели спорового контаминанта с разными концентрациями низина при 75 °С с начальной концентрацией спор 4*107 КОЕ/мл

10 20 30 40 50 60 время, МИН

- Вез низина -50 МЕ/мл -100 МЕ/мз

24 МЕ/мл -74 МЕ/мл

-125 МЕ/мл;

Рис 2 Кривые гибели спорового контаминанта с разными концентрациями низина при 85 °С с начальной концентрацией спор 4*107 КОЕ/мл

0 10 20 30 40 50 60 70 время, мин >—Безниэнва —в—25МЬ/ил к— 50 МЕ/мл Ж 75 М£/мл 1-100 МЕ/мл -»—125 МЕ/мл

Рис 3 Кривые гибели спорового контаминанта с разными концентрациями низина при 97 °С с начальной концентрацией спор 4x107 КОЕ/мл_

Для описания гибели микроорганизмов при нагревании использовали принягую в биотехнологии модель, в которой исходное уравнение

с!Шт = -КхЫ, (1)

где К - удельная скорость гибели микроорганизмов, т - время температурной обработки, N - количество жизнеспособных микроорганизмов

В соответствии с уравнением (1) ожидаемой является линейная зависимость от времени Однако при всех концентрациях низина можно выделить

участок от 0 до 10 минут с высокой скоростью гибели контаминанта. Это связано с наличием нескольких форм контаминанта, из которых одна более лабильная. Поэтому в дальнейшем при обработке результатов учитывали участок кривой от 10 минут и более, что позволяет оценить условия выживаемости наиболее термоустойчивых контаминантов.

По экспериментальным данным рассчитаны значения удельной скорости гибели контаминантов К. Для определения кинетических характеристик контаминантов А и Е (табл. !) использовали уравнение Лррепиуса:

К=А*е"Е'(КТ) или 1пК=1пА-Е/(11Т). (2)

Таблица 1

Значения кинетических характеристик А, 1пА и Е при разных ____концентрациях низина_______

Концентрация низина. МЕ/мл А. мин" Ь А Е, кДж/моль

0 4,2*10" 41 134

25 1,4*10" 35 116

50 2,6*10" 26 90

75 7,6*10" 20 72

100 3,0*10' 17 62

125 3,4*106 15 55

0 25 50 75 100 125 концентрация пизина, МЕ/мл

— ~ Экспоненциальный (1пА) -Линейный (1пА)

— — Экспоненциальный ( Е) -Линейный ( Е)

Рис.4 Зависимость энергии активации Е и 1п А от концентрации низина

На рисунке 4 представлены зависимости кинетических параметров А и Е от концентрации низина, которые можно описать уравнениями в экспоненциальной форме:

1пА=40.9е

-0.0085С

Е=133.6<?"а0075С

(3)

(4)

Более простое описание получается, при аппроксимации зависимости линейными уравнениями (рис.4): 1пА=39.2-0.22С (5)

F~129.2-0.66C (6)

С - концентрация низина, МЕ/мл.

При аппроксимации экспериментальных данных экспоненциальной зависимостью величина достоверности составляет 0,98, а линейной зависимостью -0,95 Так как эти величины имеют высокие значения, то целесообразней принять для расчетов более простые - линейные уравнения (5) и (6) Преобразовывая уравнение (2) с учетом уравнений (5) и (6), получили уравнение зависимости удельной скорости гибели от концентрации низина

Задавая критерий стерилизации V для конкретного случая по уравнению (9) с учетом уравнения (8) можно подобрать разные режимы тепловой обработки пищевых продуктов в зависимости от концентрации низина

где N0 и NK - количество контаминантов до и после прогрева Принятый ранее подход расчета тепловых режимов по наиболее термостойкому контаминанту В stearothermophilus 1518 дает жесткую обработку, позволяющий получить стерильный продукт, но его качество не удовлетворяет покупателей Введение низина снижает температуру и время обработки продукта, приближая его по качеству к натуральным

Были проведены исследования условий применения низина с целью снижения режимов тепловой обработки молока, так как сезонные изменения микробного фона молока, особенно в весенне-летний период, приводят к необходимости ужесточения режимов обработки

Изучали влияние низина на сохранность молока при различной температурной обработке В термизированное молоко вносили 10 ME/мл (мг/л) низина, молоко пастеризовали Полученные образцы хранили при температурах, представляющих интерес в производственных условиях, 10±2°С и 24±2°С в течение 24 ч Общее количество микроорганизмов в образцах с низином на порядок меньше, чем в образцах без низина Применение низина позволяет снизить

1пК = 39 2-0 22С - (129 2-0 66С) /(RT)

J£_g(39 2-0.22С - (129 2-0 66С) /(RT))

(7)

(8)

V = In N0/NK = x x К,

(9)

температуру пастеризации с 95±2 °С до 84+2 °С (табл. 2).

Таблица 2

Общее количество микроорганизмов (КМЛФАнМ) и концентрация низина в молоке после термической обработки и в процессе хранения__

Время хранения молока при температуре 10"С, ч

О

18

24

Время хранения молока при ___температуре 24°€, ч

'О Т 18 Г 24"

5,5х103 I 2.0x10

После термюации при 68°С в течение 15 минут без низина:

4.0x10-

После термизации при 68°С в течение 15 минут с низииом 10 МЕ/мл:

5.5x10"' Т 2,0x10'

4,0x10

После пастеризации при 84°С в течение 5 минут без низина:

I

2,6x10

3,2x104

4,9x10

После пастеризации при 84°С в течение 5 минут с низином 10 МЕ/мл:

2,6x10

1,0x10"

6,0x10

После пастеризации при 95°С в течение 5 минут без низина:

1,6x10"

3,0x10"

2,0x104

Влияние остаточного низина на развитие заквасок. Изучали влияние остаточного количества низина на развитие микрофлоры заквасок, используемых при производстве творога (Х./ас/м, Ь.сгетопь) (рис.5). Температура пастеризации молока для контрольных образцов 95±2°С. В пастеризованное молоко с массовой долей жира 0,5 и 3,5% вносили закваску из мезо-фильных культур. В процессе сквашивания определяли активную кислотность. В молоке с 0,5% жира скорость нарастания кислотности

0 1 2 3 4 5 6 7 Время, ч

- о - 30С,ж =0,5% (контроль)

-30С, ж- 0,5% с низином происходит быстрее в низинсодержащем об-—€3— ЗОС ж =3,5% с низииом * г

А ЗОС, ж = 3,5% (контроль

Рис.5.Влияние низина на скорость сквашивания молока с различной массовой долей жира творожной закваской - 30+1 °С

разце в сравнении с контролем, а при 3,5% жирности скорости в образце с низином и в контрольном практически одинаковы.

Таким образом, предварительная пастеризация молока с низином не ухудшает качества кисломолочных продуктов.

Экономическая оценка: при применении низина стоимостью 7000 руб./кг в рекомендованных дозах 10 мг/л затраты для молока составят 70 руб./т молока.

Глава 4. ПРОВЕРКА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ГАЗООБРАЗУЮЩИХ КОИТАМИНАНТОВ К НИЗИНУ, МОЛОЧНОЙ КИСЛО ГЕ И ЛАКТАТУ КАЛЬЦИЯ

Очевидно, что при производстве молочных продуктов из пастеризованного молока, даже подвергшихся термизированию, существует опасность попадания в готовый продукт остаточной микрофлоры

Были выделены контаминанты, вызывающие порчу герметически упакованных молочных продуктов, и идентифицированы как Lactobacillus fermentum Для исследований выбраны три штамма, распределившиеся по степени газообразования в следующем порядке Lfermentum 2 (Lb2) (наибольшая) -L fermentum 1 (Lbl) - L fermentum 8 (Lb8) (наименьшая)

Наиболее газообразующий штамм Lb 2, был проверен на термоустойчивость Культура выдерживала прогрев при 80 °С в течение 9 минут и только при 90 °С - 7 минут рост культуры не наблюдался Результаты подтверждают возможность контаминирования кисломолочных продуктов лактобациллами, выжившими после пастеризации молока

Проверка чувствительности L. fermentum к молочной кислоте и лактату кальция

Была изучена чувствительность выделенных контаминантов к молочной кислоте на модельных средах в опыте m vitro Молочная кислота в испытанном диапазоне концентраций при рН 4,00±0,02 подавляла развитие лактобацилл (табл 3) Штамм Lb2 полностью подавлялся при стартовых нагрузках 102 и 105 КОЕ/мл, а штамм Lbl и Lb8 только при 102 КОЕ/мл

Содержание молочной кислоты, образуемой естественным путем в твороге 9 г/кг, а концентрация 11 г/кг может придавать кислый вкус продукту Была изучена возможность замены молочной кислоты лактатом кальция Суммарная концентрация лактат-иона в опыте составляла 11-12,6 г/л Значение рН на уровне 4,84±0,02

Таблица 3

Интенсивность роста штаммов L fermentum in vitro в зависимости от

Штамм Стартовая на- Концентрация чочочной кислоты, г/кг

грузка, КОЕ/мт контроль, 0 11 11,8 12,2 12,6

Lbl 1,5х102 +• + - - - -

1,5x10s + + + +

Lb2 1,5х102 + + + - - - -

1,5х105 -1 + + - - - -

Lb8 1,5x102 + + + - - - -

1,5х105 + + + + + + + + + + +

<d Ь> - слабый рост,

«4 + +» - хорошо выраженный рост

Примечание «-» — нет роста, «+» - едва заметный рост,

Среду Рогоза инокулировали штаммами Lbl, Lb2 и Lb8 так, что концентрация в среде составляла 102 и 105 КОЕ/мл Подавления роста не наблюдалось ни в одном из вариантов

Проверка чувствительности коптаммнантоп L.fermentum к шин ну

Следующим этапом было определение чувствительности ллкюбацилл к низину в опыте in vitro на модельной среде (табл 4)

Таблица 4

Чувствительность газообразующих штаммов L fermentum к низину при начальной концентрации лактобацилл 10 КОЕ/мл и 10б КОЕ/мл

Низин, МЕ/мл Lbl Lb2 Lb 8

104 10" 104 106 104 10"

0 +-Н- +++ +++ +++

20 + + - + +++

40 - - - - ++ +-H-

60 - - - - +++

80 - - - - ++ +-H-

100 - - - - + +++

140 - - - - - +

Примечание (ОП-оптическая плотность)

«+++» максимум по ОП на 20 ч <<+» максимум по ОП на 40 ч

«++» максимум по ОП на 30 ч «-» роста нет

Среду МЯЕ-бульон инокулировали штаммами ЬЫ, ЬЬ2, ЬЬ8 так, чтобы стартовая нагрузка составляла 104 и 10б КОЕ/мл Чувствительность проверяли в присутствии низина 20,40, 60, 80, 100 и 140 МЕ/мл, пробы термостатировали

при 30±0,5 °С Контролем служила среда без низина

Развитие ЬЫ и ЬЬ2 полностью подавлялось при концентрации низина 40 МЕ/мл, а штамм ЬЬ 8 оказался устойчивым к действию низина и выдерживал концентрацию 100 МЕ/мл без задержки роста при 10б КОЕ/мл

Проверка чувствительности Ь./егтеШит к низину и молочной кислоте в творожных десертах

Были приготовлены опытные образцы («Чудо-творог» с черносливом -175 г, жирность 4 %), в которые вносили низин и контаминировали штаммами ЬЬ2 и ЬЬ8 Образцы инкубировали при температурах 25±1°С и определяли в них концентрацию тестовых штаммов (табл 5)

Таблица 5

Прирост численности1 (Д^КОЕ/г) лактобацилл в творожных десертах

Lb2 Lb8

Вариант стартовая нагрузка, lgKOE/i

mm Мах | mm max

Хранение при 25 °С 5 суток

Стартовая нагрузка 2А 5^4 2Л ¿0

Прирост AlgKOE/r

Контроль 6,0 3,0 5,8 3,5

+ 2,0 г/кг лактата (из молочной кислоты) 1,4 1,5 1,5 1,6

-Г 2,0 г/ы JiaKTdld (из JldKldld К<И1ЬЦИЯ) 5,4 2,8 6,3 3,6

-1- 40 мг/кг низина нет 0,4 6,3 3,7

+ 60 мг/кг низина нет 0,1 5,6 3,8

Примечание Стартовая нагрузка (подчеркнуто') это абсолютная численность, а прирост - увеличение относительно стартовой нагрузки, т е численность к концу инкубирования равна стартовая нагрузка плюс прирост и составляет около 8,0-9,0

Закономерности поведения штаммов, отмеченные в опытах m vitro, справедливы и для экспериментов с десертами Низин в концентрациях 40 и 60 мг/кг задерживал развитие Lb2 с эффективностью даже большей, чем молочная кислота, и не задерживал рост Lb8 по сравнению с контролем

Действие лактата из молочной кислоты, вводимого в продукт в количестве 2,0 г/кг, подавляло развитие обоих штаммов лактобацилл Lb2 и Lb8 Однако,

при введении такого количества молочной кислоты изменяется активная кислотность продукта до рН 3,99+0,01.

В образцах измеряли концентрацию низина в начале эксперимента, а также на 1-е и 5-е сутки (рис. 6). На 5-е сутки в пробах творога с контаминан-том Lb 2 количество низина в продукте не уменьшалось ни в одном варианте.

-a-Lb 2,11-40,10(2) -A-Lb 2, Н-60,10(2)

■Lb 2, Н-40,10(5) -Lb 2, Н-60,10(5)

-s-Lb 8, Н-40.10(2) -A-Lb 8. Н-60,10(2)

■Lb 8, Н-40,10(5) ■ Lb J, Н-60,10(5)

Рис. 6. Содержание низина в процессе хра- Рис. 7. Содержание низина в процессе нения в образцах «Чудо-творога», контами- хранения в образцах «Чудо-творога», нированных Ь. ГегтепШт 2 контаминированных Ь,. ГегтепШт 8

При контаминировании Ы>8 концентрация низина в пробах падала с большой скоростью в образцах со стартовой нагрузкой 105 КОЕ/г (рис.7), что обусловлено разрушением низина культурой Ь./егтепШт.8.

Была выработана опытная партия творожных изделий с низином в количестве 40 мг/кг, хранение десерта при температуре 6±0,5 °С в течение 21 дня не выявило никаких отклонений в органолептических показателях.

Таким образом, применение низина позволит получать безопасные молочные продукты с сохранением большей пищевой ценности.

При применении низина стоимостью 7000 руб/кг в рекомендованных дозах 40 мг/кг затраты для творожных десертов составят 280 руб/т продукции.

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ КОНТАМИНАН ГОВ МУКИ -ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КАРТОФЕЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ХЛЕБА (КБХ)

Исследование динамики развития картофельной болезни в опытных образцах хлеба в процессе хранения

Из исследуемых образцов муки выпекали хлеб по методу пробной лабораторной выпечки, образцы помещали в провоцирующие условия. В образцах в процессе хранения на 18, 24, 40 и 48 ч определяли наступление КБХ по органо-лептическим и микробиологическим показателям (рис. 8).

Рис.8 Динамика развития КБХ по микробиологическому показателю Вид столбцов соответствует степени нарастания заболевания, сверху над столбцами указаны номера образцов муки.

Первые признаки заболевания появлялись при содержании бактерий 106 КОЕ/г - легкий фруктовый запах, при увеличении их до 107 КОЕ/г - добавлялся слабый запах КБХ, свыше 107 КОЕ/г - сильный запах КБХ.

Таким образом, показано, что хлеб по органолептическим признакам может не вызывать опасности, а содержание бактерий в нем превышает нормы, допустимые для пищевых продуктов, то есть больше 103 КОЕ/г по показателю КМАФАнМ согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 (п. 1.4.7.1-1.4.7.4).

Был проведен сравнительный анализ по оценке количества бактерий выросших на агаризованной среде при глубинном и поверхностном способах посева При глубинном способе количество бактерии занижено более чем в 10 раз Для дальнейших исследований был выбран способ поверхностного посева для количественной оценки бактерий КБХ в муке и хлебе

Содержание бактерий в хлебе определяли следующим образом 10±0 1 i исследуемого образца измельчали и суспендировали Из надосадочнон жидкости делали высевы на идентификационную среду

Для определения в муке количества бактерии-возбуди гелей КБХ разработана идентификационная агаризованная среда, позволяющая определять визуально амилолитически активные колонии по реакции с йодом После засева и термостатирования чашек Петри на поверхность агара наносили раствор йода, происходило окрашивание среды в синии цвет, а зоны гидролиза крахмала вокруг амилолитически активных колоний не окрашивались, что является характерным признаком бактерий КБХ

В результате разработана методика оценки микробиологического качества хлеба по содержанию споровых бактерии-возбудителей КБХ

Исследование развития бактерий-возбудителей КБХ в муке Для выделения споровых бактерий образцы муки обычно ресуспендиру-ют, прогревают и затем делают высевы на питательные среды

В литературе описаны различные режимы прогрева для получения спор возбудителей КБХ 70-75°С - 5 мин, ВОТ - 30 мин, 90-95°С - 10 мин Споры Bacillus могут выживать в процессе выпечки хлеба в центре мякиша, где температура 9б-100°С Для уточнения условий термической обработки суспензии муки проведена оптимизация по четырем параметрам концентрация муки в суспензии, температура, время, состав жидкой среды для прорастания спор

Подбор кониеитраиии суспензии по сухим веществам В вышеуказанных режимах предлагается 10%-ная суспензия муки, при заваривании которой получается сгусток, что приводит к увеличению ошибки опыта Были исследова-

иы концентрации муки - 1% и 5% Содержание спор в муке около 100 КОЕ/г невозможно определить в 1%-ной суспензии Для работы была выбрана 5%-ная концентрация суспензии муки

Подбор режима прогрева суспензии муки Исследовали три режима прогрева суспензии муки, указанные выше В результате высевов наблюдали неоднородность культуры и не все колонии обладали амилолитической активностью Однако, при анализе заболевшего хлеба, выпеченного из этих образцов муки, все колонии были амилолитически активны Это наблюдение заставило более детально исследовать условия прогрева муки

Исследование динамики нагрева 5%-ной суспензии муки в количестве 100 мл в водяной бане показало, что нагрев до 96° С продолжался в течение 23±1 минут, далее рост температуры не происходил После прогрева и охлаждения пробу термостатировали при 37±1°С в течение 18±1 ч Высевы показали, что все колонии были амилолитически активны

Подбор жидкой питательной среды дчя прорастания спор бактерий КБХ Муку суспендировали в МПБ и 2,5% растворе КаС1 в воде (такое соотношение соли и муки в тесте), прогревали, термостатировали и высевали на идентификационную среду Развитие спор в мучной суспензии с МПБ происходило быстрее, чем в мучной суспензии с 2,5% соли Оишчие в качеслвенных показателях разных образцов муки на среде МПБ была менее заметна, поэтому для дальнейшей работы была выбрана мучная суспензия с солью

Были определены следующие условия обработки муки 5%-ная суспензия муки в воде с добавлением 2,5% 1ЧаС1, объем суспензии 100 мл, прогрев при 96±1°С в течение 10 минут

В итоге разработана методика оценки микробиологического качества муки по содержанию споровых бактерий-возбудителей КБХ

Исследование протеолитической активности бактерий КБХ в муке Характерные признаки бактерий КБХ - протеолитическая и, в частности, желатиназная активности Был проведен сравнительный анализ методов опре-

деления протеолитической активности но ГОСТ 20264.2-89, определения жела-тиназной активности в тонком слое желатина и в пробирках с желатиновой средой. Однако, эти методы не позволили получить четких значений протеолитической активности по ряду причин: низкая чувствительность, нет количественной оценки.

Учитывая небольшой уровень протеолитической активности в муке исследовали метод, основанный на гидролизе казеината Иа.

Провели подбор условий, при которых протеолитическая активность бактерий КБХ проявляется наиболее отчетливо. Активность определяли в суспензии муки после прогрева и термостатирования.

Подбор времени гидролиза. Показания фиксировали через 3 и 5 часов. Величина зон при гидролизе 5 ч значительно больше, чем при 3 ч гидролиза (рис. 9).

20 18 -16 -14 -12 10

35

40 45

рН, темпера тура, С

—I

50

-•—№3 - рН=5,85

- -и- №3 - рН=6,5 —А— №3 - рН=6,8

Рис.9 Зависимость диаметра зон преципитации Рис.10 Зависимость диаметра зон преципи-от времени гидролиза на казеинатной среде тации от температуры и рН среды для различных образцов муки при гидролизе 5 ч

Подбор рН казеинатной среды. Исследовали рН 6,8; 6,5; и 5,85, последнее значение соответствует кислотности теста после выбраживания. Для всех образцов муки при рН = 5,85 зоны преципитации наибольшие (рис. 10).

Подбор температуры. Рассматривали температуру 37, 45 и 50 °С. Установлено, что протеолитическая активность возрастает с увеличением температуры и достигает наибольшего уровня при 50 °С (рис. 10).

Подбор концентрации казеината натрия Исследовали влияние концентрации казеината 'Ма 0,5% и 1% на величину зон преципитации Уменьшение концентрации казеината Кта приводит к увеличению зон В варианте с 0,5% картина более четкая

Подбор толщины агарового слоя Толщина агарового слоя влияет на размер зон и на погрешность Так как при толщине 2 мм в лунку необходимо вносить 50 мг пробы, а при 4 мм - 100 мг, в последнем случае воспроизводимость результатов увеличивается

Таким образом, были выбраны условия • время гидролиза -5 ч, рН среды-5,85, температура - 50°С, концентрация казеината На - 0,5%, толщина агарового слоя - 4 мм, проба - 0,1 г

В результате проведенных исследований была разработана методика сравнительной оценки протеолитической активности бактерий КБХ в образцах суспензии муки

Изучение амилолигической активности бактерий КБХ в муке

При прогреве муки суспензия становится вязкой, но по мере нарастания амилолитической активности бактерий КБХ при термостатировании происходит снижение вязкости Изменение ее качества можно оценить вискозиметром

Подбор вискозиметра Оценивали кинематическую вязкость до и после термостатирования вискозиметрами ВПЖ-2 с диаметром капилляра 0,56, 1,31 и 1,77 Готовили 5%-ую суспензию, прогревали и через 18 часов термостатирования определяли вязкость Для работы выбран вискозиметр ВПЖ-2 с диаметром капилляра 1,31 мм, который позволяет определить вязкость суспензии до и после прогрева

Изучение доступности кислорода Возбудители КБХ - факультативные анаэробы и кислород оказывает влияние на их развитие Исследовали вязкость в зависимости от площади поверхности суспензии, контактирующей с воздухом Суспензию по 50 мл вносили в колбы вместимостью 250, 100 и 50 мл Поверхность контакта с воздухом составила при этом 55,9, 28,3 и 12,9 см2 Были

рассчитаны соотношения поверхность контакта к объему суспензии - S/V. Из рисунка 11 видно, что вязкость значительно зависит от площади контакта с

воздухом, то есть доступность кислорода является определяющей.

Изучение условий термостатирования. Учитывая влияние кислорода на контаминанты, был поставлен опыт в стационарных условиях и при перемешивании. В колбы вместимостью 250 мл вносили по 100 мл и по 50 мл прогретой суспензии и культивировали в стационарном термостате и в термостатированной качалке со скоростью перемешивания 180 об/мин. В эксперименте контролировали количество бактерий КБХ, протеолитическую активность и вязкость на 18 часов роста (рис. 12, 13, 14).

12

10

S 8

л 2 6

г

« 4 2 0

Рис. 12 Зависимость количества бактерий Рис. 13 Зависимость протеолитической ак-от условий роста тивности бактерий от условий роста

Большая доступность кислорода стимулирует прирост бактерий, протеолитиче-

ская активность достигает наибольшего значения при перемешивании на качалке с объемом суспензии 50 мл. В наибольшей степени аэрация оказывает влияние на амилолитическую активность, что видно по низкому уровню вязкости в пробах при перемешивании. При объеме суспензии 50 ми при хтеремеши-

0.0 0.5 1.0 Соотношение S/V

Рис. 11 Зависимость вязкости от условий рос та споровых конта-минантов в стационарных условиях на 18 часов

100 90

0 80 1

<| 70 * 60 & 50

1 40

I 30 20

10

0

1

■ ;

- ] ....." "

------- :

й

В

т __|_»Д»--1-шЁЁ_|

вании наблюдали самые низкие значения вязкости, которые для разных образцов муки были примерно одинаковы. Таким образом, чтобы зафиксировать

отличия в образцах с большей точностью были выбраны условия: перемешивание суспензии с объемом ) 00 мл.

Для проверки зависимостей выявленных на одном образце исследовали 5 различных образцов муки. Количество бактерий КБХ в этих суспензиях муки находились

50 мл 100 мл 50 мл 100мл стац стаи иерем перем

в пределах одного порядка и не давали чет-Рис. 14 Зависимость вязкости от

условий роста споровых бактерий кой картины о степени заражения муки. Уровень протеолитической активности бактерий в этих образцах показывал

значения, которые согласовывались со степенью заболевания хлебцев выпеченных из той же муки, но различия находились в низких пределах определения. В наибольшей степени отличия были выявлены в уровнях амилолитической активности, которые и отражали заболеваемость хлебных образцов. Таким образом, было показано, что заболеваемость хлеба в большей степени определяется

амилолитической активностью споровых контаминантов муки. Образцы № 1, 3, 7 относятся к слабозараженной муке по результатам выпечки (рис.8) и вязкость у этих образцов имеет наибольшие значения (рис. 15). Хлеб из образцов муки № 8, 14 заболел на 24 часа хранения и суспензии муки показали

наименьшую вязкость. Рис.15 Вязкость для разных образцов муки при перемеишвании

В результате проведенных исследований была разработана методика

сравнительной оценки амилолитической активности бактерий КБХ в образцах

суспензии муки.

ОСНОВНЫЕ РЕ1УЛ1.ТАТЫ И ВЫВОДЫ

1 Изучено влияние низина на кинетические характеристики гибели клеток контаминанта Показано, что в присутствии низина увеличивается удельная скорость инактивации К, но снижается стернческий коэффициент Л и энергия активации Е С помощью математического анализа получено описание кинетики гибели клеток контаминанта с учетом концентрации низина в среде

2 Изучено действие низина на штаммы газообразующих лактобацилл Показано, что добавление низина в творожные изделия в концентрации 40 мг/кг практически полностью подавляет активность наиболее газообразующего штамма Lactobacillus fermentum 2, что позволяет использовать низин для предотвращения вздутия творожных изделий

3 Установлено, что рациональной дозой низина для сырого мопока является 10 мг/л, при этом режим пастеризации 95±1°С может быть заменен более мягким режимом - 83±2°С без увеличения микробного заражения, что актуально при сезонном повышенном микробном фоне

4 Показано, что использование предварительной пастеризации молока с низином не оказывает существенного влияния на скорость сквашивания обезжиренного молока и молока с массовой долей жира 3,5%, что позволяет использовать низин в молоке при производстве кисломолочных продуктов

5 Проведено изучение влияния протеолитической и амилолитической активностей бактерий-возбудителей на развитие картофельной болезни хлеба Установлено преимущественное влияние на этот процесс амилолитической активности бактерий-возбудителей

6 Разработаны методика оценки качества муки по содержанию спор бактерии-возбудителей картофельной болезни хлеба и предложены экспресс-методы сравнительной оценки протеолитической и амилолитической активности споровых контаминантов муки

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Нгуен, Вьет Ань Влияние низина на кинетику гибели споровых конта-минантов/ Вьет Ань Нгуен, JIП Минаева, Е Ю Попова, Н И Дунченко, В В Бирюков // Наука-Бизнес-Образование Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда тез докл 2-й Международ конф - 2005 - С 35

2 Попова, Е Ю Исследование термоустойчивости газообразующих кон-таминантов Lactobacillus fermentum! Е Ю Попова, Е А Гула, JIП Минаева, Н И Дунченко, И Н Мозговая, Т Ф Вустина, В.В. Бирюков // Биология - наука XXI века сб тезисов 10-й Международ Пущинской школы-конф молодых ученых - 2006 - С 390

3 Попова, Е Ю Изучение кинетики гибели споровых контаминантов, выделенных из молока/ Е Ю Попова, JIП Минаева, В В Бирюков // Сб научн тр МГУИЭ Вып 3 - 2006 - С 237-243

4 Попова, Е Ю Повышение срока хранения мясных и молочных продуктов с применением низина/ Е Ю Попова, JIП Минаева, В В Бирюков // Биология - наука XXI века сб тезисов 11-й Международ Пущинской школы-конф молодых ученых -2007 -С 214-215

5 Попова, Е Ю Влияние низина на кинетику термической инактивации споровых микроорганизмов/ Е 10 Попова, JIП Минаева, В В Бирюков // Биотехнология -2008 -№2.-С 69-73

6 Попова, Е Ю Разработка методики определения протеолитической активности споровых бактерий в муке/ Е Ю Попова, JIП Минаева // Доклады молодых ученых и студентов МГУИЭ - 2008. - С 28-29

7 Попова, Е Ю Интенсификация технологии производства отечественного препарата "БИЗИН 1000" - консерванта из молочнокислых бактерий/ Е Ю. Попова, В В Бирюков // Всероссийская выставка научно-технического творчества молодежи НТТМ. сборник научных докладов -2008 -С 260-261

Попова Елена Юрьевна

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Подписано в печать 17 09 2008 г Формат 60x90, 1/16 Объем 1,5 п л Тираж 130 экз Заказ №629

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г Москва, ул Краснопрудная, вл 13 т. (8-499) 264-30-73 www blokOlcentre.narod ru Изготовление брошюр, авторефератов, печать и переплет диссертаций