Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение некоторых структурно-функцилнальных характеристик митохондриального генома инфицированного Verticillium dahliae klebahn хлопчатника

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение некоторых структурно-функцилнальных характеристик митохондриального генома инфицированного Verticillium dahliae klebahn хлопчатника"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

НАУЧ МО-ПРОИЗВОДСТВЕН МОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ «БИОЛОГ» ИРС[Т^УТ(Ь5СПЕРИМЕНТАЛЬН0Й БИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ

3 1 -ПОП Ш

На правах рукописи

МАМДУХ АХМЕД МОХАМЕД АХМЕД

УДК 577.113:576.31.347:633.51

ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА ИНФИЦИРОВАННОГО УЕ1ШС1Ш1т ВАНЫАЕ КЬЕВАНЫ ХЛОПЧАТНИКА

(03.00.04 —Биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТАШКЕНТ — 1995

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики хлопчатника Института экспериментальной биологии растений АН РУз.

Научные руководители-. Член-корреспондент АН РУз,

Заслуженный деятель науки РУз, доктор биологических наук, профессор ИБРАГИМОВ А. П.,

Лауреат Гос. премии им. А. Беру-ни, доктор биологических наук, профессор ХАЛ И КО В С. К.

Официальные оппоненты: Член-корреспондент УзАСХН

РАХМАНКУЛОВ С.,

Кандидат биологических наук НУРИТДИНОВА X.

Ведущее учреждение: Институт защиты растений УзАСХН.

Защита состоится ¿¿Ь&НЬ- • '^95 г- в ^^ часов па

заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени доктора биологических наук в Институте экспериментальной биологии растений АН РУз (Д.015.19.21) по адресу: 700143, г. Ташкент, ул. Ф. Ходжаева, 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНЭБР НПО «Биолог» АН РУз.

Автореферат разослан «/^ » .■Ц.НУ 1~Из ■ 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Ф. Р. НУРИТДИНОВА

ОНДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: Заболевание хлопчатника вертициллеэ-ным вилтом широко распространено в хлопкосеющих странах в том числе в республике Узбекистан, Ущерб, вносимый хлопководству вилтом, огромен. Поиск радикальных средств борьбы с вилтом хлопчатника затруднен тем, что до настоящего времени неясны те основные биохимические и молекулярные изменения клеток растений, которые приводят к развитию патологического состояния организма. Одним из возможных способов борьбы с вертициллезным вилтом хлопчатника является разработка современных биохимических и молекулярно-генетических методов создания устойчивых генотипов. В этом направлении широко используются межвидовые гибридизации культивируемых сортов хлопчатника'с дикими вилтоустойчивы-ми генотипами. Выявление у гибридов генов вилтоустойчивости при помощи молйкулярно-генетического анализа ДНК с целью диагностики имеет определенное значение в сельскохозяйственной практике.

Известно, что клетка высших растений содержит три генетические системы. Зто геном ядер» хлоропластов и митохондрий. Каждая из этих генетических систем играет основную роль в устойчивости растений к различным экстремальным факторам. Данная проблема освещена в работах ряда авторов и при этом установлено, что нито-хондриальный геном несет с собой гены устойчивости к различным антибиотикам, фитопатогенам и неблагоприятным условиям внешней среды (засуха, засоление) (Негрукс,19В7; ЮсуповД9Э4).

В настоящее время геном хлопчатника и возбудителя вилта детально изучается рядом узбекских ученых (А'бдукарго,!бв'^ 1994;Ибрагимов, 1992-1994; Авазходжаев,1990-1992).

Таким образом, исследования в этой области приобретают не только теоретическое, ко и прикладное значение.

В связи с этим, особый интерес представляет изучение в сравнительном аспекте некоторых структурно-функциональных характеристик ыитохондриального генома инфицированных грибом У^аЫ 1ае

хлопчатника, чем и посвящается данная исследовательская работа. Аналогичные работы по этим проблемам в литературе практически отсутствуют.

Цель и задача исследования. Целью данного исследования явилось изучение в сравнительном аспекте структурно-функциональных

характеристик митохондриального генома и основных компонентов его белоксинтезирующей системы инфицированных грибомV.,Ла'пПае двух сортов хлопчатника ( МгвШио 1, , Ю8-Ф; Ташкент-б),

Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1.Сравнительное изучение содержания и биосинтеза нуклеиновых кислот в митохондриях инфицированных грибом 'ЫчЬИае растений двух сортов хлопчатника.

2,Изучение изменения Д1К- и РНК-полимеразной активности митохондрий, инфицированных грибом растений хлопчатника.

3.Определение нуклеотидного состава митохондриальной ДОК иРНК.

4.Изучение характера распределения в линейном градиенте плотности хлористого цезия и кинетики реассоциации митохондриальной да.

5.Изучение гомологических последовательностей нуклеотидов в митохондриальной ДНК и РНК хлопчатника. .

Научная новизна работы. Впервые нами проведено анализ структуры митохондриального генома и некоторых компонентов его бе-локсинтезирувдих системы инфицированных грибом 'МаМие хлопчатника. Показано, что наибольшее изменение суммы нуклеиновых кислот и уровень их биосинтеза происходит в митохондриях восприимчивого к йилту сорта 108-Ф, а наименьшее - у более устойчивого сорта Ташкент-б, Установлено, что в митохондриях зараженных проростков хлопчатника кроме основной фракции миторибо-сом наличие дополнительной фракции с коэффициентом седиментации близким по значению к субъединицам миторибосом, Обнаружено, что подавление активности ДНИ- И РНК-полимеразной системы митохондрий зараженных грибом проростков хлопчатника в раннем онтогенезе у восприимчивых сортов (108-$) идет более интенсивно, чем у устойчивых сорто® (Ташкент-б). У больных вилтом проростков хлопчатника наблюдается увеличение ГЦ пар оснований. Особенно это изменение связано было снижением содержания вденина и увеличением количества гуанина. '

При сопоставлении кинетических кривых митохондриальной ДНК изученных нами сортов хлопчатника обнаружено, что ДНК зараженных грибом проростков хлопчатника по своей структурной органи-

эаций имеют как сходные, так и несколько различающиеся нуклео-тидные группировки по сравнению с контролем. Методом молекулярной гибридизации установлено нарушение комплементарности гомологичных последовательностей митохондриальной ДНК больных вил-том проростков хлопчатника.

Научно-практическая значимость работы. Выявленные структурные и функциональные особенности митохоццриального генома зараженных грибом 7НаМ1а'! проростков хлопчатника позволят проводить в дальнейшем более глубокие исследования, которые помогут глубже понять молекулярные механизмы'взаимодействия гриба-патогена с растением хлопчатника.

Проведенные опыты по молекулярной гибридизации ДНК-ДНК можно использовать для диагностики частоты семенного материала хлопчатника.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были доложены на ХХХХУ и ХХХХУ1 конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов ТашГУ 1994 и 1995 гг., конференции Института экспериментальной биологии растений НПО "Биолог",1995 г..Объединенном заседании кафедр агрохимии, физиологии растений и биохимии ТашГАУ и лаборатории молекулярной генетики.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения» обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и список литературы.

Работа изложена на 103 страницах, иллюстрирована 20 рисунками и таблицами.

Список литературы насчитывает 154 наименований« в том числе 128 иностранных. .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ■

Растительный материал. Объектом исследований служили семена двух сортов хлопчатника МгзиЬит !,,Ю8-Ф; Ташкент-6). Материалы исследования получены из коллекций НПО "Биолог" Института экспериментальной биологии растений АН РУз и УзНИИ селекции и семеноводства хлопчатника им.Г.С.Зайцева УзАСХН.

Выделение митохондриальных ДНК и РНК из проростков хлопчатника осуществляли согласно методике, описанной в работе Одинцовой и др.(1970) с модификациями Юсупова Т.Ю. (1982,1992).

Выделение рибосом из митохондрий хлопчатника и анализ их физико-химических свойств проводили согласно методики, использованной в работе Хазратова П.Р.(1990).

Определение содержания и включения меченных предшественников в нуклеиновые кислоты митохондрий проводили согласно рекомендаций Нечаевой Е,П.(1966).

Определение ДНК- и РНК полимеразной активности митохондрий осуществляй методикой, использованной в работе Юсупова Т.О. (1994).

Определение нуклеотидного состава ДНК II РНК проводили по прописи Ьаношика Б.Ф.(1964), Х . ..

Определение плавучих плотностей.проводили' по методу, описанному Шилдкрайтом и др.(1962Ь 1 ' .....■•.•.'-'"'""'

Термическая денатурация и реассоциация ДН^рдуйгеСтЬлялась по метода, описанному в работе,Юсупова''Т,Й,'(1994).

Электрофорез ДНКДй,е,чение нуклеиновых кислот и молекулярную гибридизацию ДНК-ДНК^пр'с^водили по методу, описанному в руководстве Маниатиса и др.ШВД).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Сравнительное изучение содержания й биосинтеза нуклеиновых кислот а митохондриях инфицированных грибом 7,.1аМ1ле растений двух сортов хлопчатника

Работами последних лет достигнут большие успехи в определении содержания суммарной ДНК высших растений*

* Данных по содержанию ДНК в цитоплазматическик органоидах -хлоропласта* и митохондриях в литература значительно меньше. В частности, на хлопчатнике такИе работы т проводились»

В данной работе а сравнительном аспекте нами было Изучено содержание и биосинтез нуклеиновых кислот в миеоховдриях здоровых и зараженных Грибом растений хлопчатника.

Результаты определения количественного содержания нуклеиновых кислот в митохондриях исследованных форм хлопчатника представлены в ?абл,1»

Анализ содержания нуклеиновых кислот в семенах больных растений показал возрастание количества как ДНК, так и №К. Увеличений содержания нуклеиновых кислот а митохондриях семян, еаракенных грибом растений хлопчатника, зависит от вилтоустой-

Содержание нуклеиновых кислот (мг на сухую массу митохондрий) в митохондриях нормальных и зараженных грибом \fjdahl 1ае растений хлопчатника

Сорта хлопчатника;Содержание нуклеиновых кислот ¡Соотношение

| рнк Г | гак+дак \ ик/док

ТТов^Ф)

Контроль 2817,2+6,4 227,0т0,3 3044,20 12,41

Зараженные • 3103,6+7,4 228,5^3,5 3337,10 13,60 {Таикент-6)

Контроль 288753x6,8 227,5+0,5 3114,80 12,69

Зараяонные 3098,478,2 227,4+0,4 3325,80 13,62

чивости сортов и степени поражения растений вилтом. Подобная закономерность была обнаруяена Ибрагимовым И др. - при изучении ядерной ДОК и РНК хлопчатника»

Наибольшее изменение суммы доклеиновых кислот (по отношению к контролю) наблюдалось р митохондриях восприимчивого к вилту сорта 108-©, а наименьшее - У сорта Таэкект-б'» Та.ким образом, проникновение гриба '^ДаЬПае в .растение вызывает одинаковую реакцию - увеличений содержания нуклеиновых кислот. Но степень з?ил изменений завися? от вилтоустойчирости сорта,

Болзо глубокуа икформацию об изменениях геиетичеезеого аппарата митохондрий -при заражени|1 растений хлопчатника грибом У^аЬЦае можно получить исследованием скорости биосинтеза ДНЯ и РНК» '

Из таблицы 2 видно, у изученных нами .зараженных грибом растений хлопчатника показатели скорости биосинтеза ДН1С и РНК п митохондриях был и вышз, йен у контрольных растений, Наибо-леэ высокий показатель скорости биосинтеза нуклеиновых кислот ■ выявлен у ¡зараженных растений хлопчатника сорта 108-3? вида <

Это указывает на то, что У восприимчивого сорта хлопчатника ответная оадатная реакция начинаемся раньш, чем у устойчивых сортов.

Таким образом, характер протекания синтеза штохондриальных ДНК и РНК зависит от сортовых особенностей, а такав'о* отепени поражаемости растения хлопчатника грибом УЛаШае

- б -

Таблица 2

Включение меченых нуклеотидав (имп/мин,на I мкг ДНК или РНК) в митохондриях нормальных и зараженных грибом у^алЬПае растений хлопчатника

Сорта хлопчатника 1 Включение меченых нуклеотидов

I* ДНК | рРНК ¡иРНК+тРНК ______ { (^-тимидин)} (3Н-уридин) |(3Н-уридин)

(108-Ф)

Контроль 1476 3557 7460

Зараженные 1660 3780 10771 (Ташкент-б)

Контроль 1534 3684 8320

Зараженные .1605 3740 ' 9630

Помимо того нами интересно было рассмотреть образование активных рибосом под влиянием токсина гриба 'МаЬПав V Митори-босомы Мы изучали методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы.

Как ридно й'з рис, 1,2 в митохондриях зараженных растений кроме основной фракции имеющей 77,4$ константу седиментации наблюдается дополнительные фракции. Эти фракции имеют' константы седиментации близкие по значению к субъединицам мйторибосом. Образована таких химерных субъёдиниц мйторибосом,по-видимому, связано, либо нарушением синтеза рРНК, либо с подавлением синтеза риборомных белков, В связи о этим не могут образоваться активные циторибооомьи Количественное содержание не связанных субъединиц рибосом в митохондриях у восприимчивых к вилту сортов хлопчатника 108-$ намного больше по сравнению с. более устойчивым сортом Ташкенттб.

Сравнительные Характеристики рибосом митохондрий нами изученных контрольна и ааражеНных грибом 1/^аЫ»ае растений хлопчатника представлены в таблице 3.

Как видно из табличных данных, у миторибосом зараженных растений соотношение РНК/белок немного повышается по сравнению о контролем# Этот показатель у восприимчивого сорта 1б8-Ф составляет 0*86, а у более устойчивого сорта Тащкенттб - 0,84. При атом процентное содержание рРНК существенно не отличается от контрольных растений.

805 77,45 705

10 20 . 30, ,40 ■ ЙЙЛЬ , -

80

Рис Л. Распределение миторибоеом хлопчатника вида ^ МгзШШп (сор« 108-5) в градиенте плотности Ьахарозы {5-20!>}. -♦-Контроль 'Зараженные

-Маркеры рибосом <ло{к>йАастов|70$)й цм*о«язми(805)

%0

0,6

М о,а

а» щука.

10 20 30 40 80 номер дииаи

Рйс»2. Распределённие ми*ор*бобои хлопчатника бйДа С„Мгаи1ш) (сорт ?аикен*«6). »Градиенте ,плотнос<и са*арози(5-20?5). Контроль —о—Зарахеннне

*—: Маркеря рибосом хлоропласт (Ш)« цйтопла8мн(805)

Характеристика препаратов миторибосом, вццеленных из контрольных и зараженных грибом "ЫаМие растений хлопчатника

Сорта хлопчатника ; РННД > Белок,%

;Соотношение ( РНК/белок

(108-®) Контроль

45,2 44,4

54,8 51,6

0,82 0,86

Зараженные

(Ташкент-б)

Контроль

45,2 54,8 0,82

! 44,7 53,3 0,84

2.Изменение ДОК и ШК-полимеразной активности митохондрий в инфицированных грибом

Зараженные

растений^хяопчатника

Известно, что синтез Д1К и РНК связан с изменениями активности генетического аппарата клетки - структурного состояния ДОК и функциональной целостности ДО{- и ГОК-полимеразной системы* Результаты ряда исследований свидетельствуй об изменении матричной активности ДИК в клетках, инфицированных грибами растений.

В связи с тем нами была изучена ДНК- и РНК-полимеразная активность изолированных митохондрий в норме и инфицированных грибом \'„апЫ1ае растений хлопчатника. Полученные результаты приведены в таблице 4. Опыты проводили на 2-х дневных корешках в различные промежутки времени в течение суток. Установлено,что усиление активности РНК-полимеразы происходит в проыекутке от 50 до 64 часов после начала прорастания у сорта 108-Ф, от 58 до 66 часов у сорта Ташхент-6 и от 54 до 64 часов у проростков, выращенных из семян от инфицированных грибом рас-

тений хлопчатника. В дальнейшем наблюдалось падение интенсивности включения. По включению меченых предшественников обнаружено, »гго усиление биосинтеза РНК в митохондриях на ранней стадии онтогенеза у поражаемых вилтом видов хлопчатника начинается раньше, чем у устойчивых форм. У зараженных грибом V^ й аЪ11 ае хлопчатника сорта 108-Ф подавление активности РНК-полимерааы начинается раньше, чем у сорта Ташкент-6.

Изменение РНК-полимеразной активности в изолированных митохондриях инфицированных грибом У/йяМ 1ае растений хлопчатника (имп/мин,на мкг РНК)

Время,чао,{ Контроль ! Зараженные _[ 108-ф ' )Ташкен?-б ] 108-ф |Ташкент-б

2 307 . 280 361 230

4 1370 601 1670 667

8 1340 804 1760 829

12 1280 973 1792 1238

16 1107 1032 1076 1245

20 653 742 462 734

24 605 704 418 657

В настоящее время известно, что. в гцюцессе развития верти-циллезного вилта в клетках происходят структурные изменения хроматина и, естественно, функциональной активности ДОС-поли-меразной системы,

В связи с этим, нами было изучено изменение ДНК-полимераз-ной активности изолированных митохондрий в норме и инфицированных грибом У„с1аЬИае растений хлопчатник» Полученные данные представлены в таблице 5,

Как видно из табличных данных, усиление активности ДНК-по-лимеразы в контрольных вариантах нами изученных сортов происходит В промежутке от 50 до 64 часов, В периоде от 64 до 72 часов проращивания уровень ДДК-полимеразной активности существенно не изменяется,- а у зараженных проростков в этой периоде наблюдается падение активности. Однако следует отметить, что снижение активности ДНК-йолимераац у поражаемых вилтом сортов хлопчатника (Ю8-Ф) идет более интенсивно, чем у устойчивых форм (Ташкент-6).

За оснований полученных данных можно предполагать, что изменение ДОК-* и ШК-полимеразной активности митохондриальной генетической системы при вертициллезном увядании хлопчатника связано с его сортовыми особенностями, а также о устойчивостью рамений я вилту.

Изменение ДЩ-полимеразной активности изолированных митохондрии инфицированных грибом Vj dah 11 ав растений хлопчатника (имр/мин,на мкг ДНК)

■ У"| .......... « ................................

' KnumwAitL *

:ые_

Ташкент-б

Время, час»! Контроль ; Зараженн!

}' 106-$ j Ташконт-6 ( 108-Ф |'

2 24Í 251 V 252 . 263

4 247 259 259 271

8 293 .314 310 321

12 310 322 324 . 334

16 340 349 316 331

20 345 357 221 342

24 347 Зб| ' 214 : 345

З.Нуклеофидный состав Ьттохондриальной ДНК гШ; :•'.;' " Изучение первичной структуры ДНК в сравнительном аспекте необходимо как для выяснения специфичности различных ДНК, так и для решения вопросов, касающихся их функционирования, происхождения ИЭВОЛЙЦИИ,'

Однин р дегродоо^гт*«; подходов й исследованию рерричной структуры ДО дйляеточ ойрвдалеше ер доклеотидноро состава,, Сравнительна анализ ОРдержаВД Щ-пар нУКлеотидов показал, что митохондриа^йная $$ иоолодопаннмх нами сортов хлопчатника ртноои?ся á h^mm (47,1-47,9 Щ) (табл,6). Показатель рдерфичрос?«' e'ocfi^e-^ojtoipp^bH0® /PK хлопчатника, т.е. отноюедае T+U/A+T íapítHpy^? Ь незначительном ин?ерва~ де от 0,82 до 0,87 |!ол,%» |1нало^едые'дашаде получены рядои исследователей rjpn Ш5УЧ0НИ!<1 'jfáf'oxó^ii^bH^ Щ других разительных объектов ifópfti^fif íeiúe fc* ¡ 1984). ; ^ ■ . ' '

Если орй)эни?{» нуклеотадный состав ыитохондриальной ДНК контрольных И ИнфИОДрорацных НрйбоМ Itdahílae растений хлопчатника, то ваблрдаетвя ц^бопщов увеличение'содержания Щ-пар оснований митохондримьнРй ДНК у больны* эдлтом р&стений.Оообенно ato Изменение связано с нё6о4|>шии снижением содержания ад»нина в увеличением количества гуанина. Полученные данные можно интерпретировать слёдующим образам. Известно, что ДНИ гриба более

Таблица б

Нуклеотидный состав митоховдриальной ДНЯ в инфицированных грибом уЛаИПав Растений хлопчатника

Сорта } Содержание азотистых оснований, хлопчатника • • молД (М+,м)

--,-_ | „-г

} Т I Г | Ц ¡Г+Ц

(108"$) , 1

Контроль 26,5+0,6 26,0^,3 23,7+0,4 23,8+0,5 47,5

Зараженные 25,9+0,3 26,3+0,4 24,5+0,4 23,3+0,3 47,8 (Ташкент-6) . ,

Контроль 26,2+0,5 26,7+0,3 23,4^0,3 23,7+0,7 47,1

Зараженные 26,1+0,3 26,1+0,5 24,1^0,5 23,7+0,7 ' 47,5

выраженного Ш,-тип^ {Щ-54,9 мол.%), чем ¿Щ митохондрий хлопчатника ГЦ - (47,1-47,5), Поэтому поглощение ДНК гриба или ее фракций растением может привестик увеличению Щ-пар а семенах больных растений, В результате взаимодействия растения-хозяина о грибом-патогеном, возможно, изменяются метаболические процессы растений и в результате депрессии отдельных участков генома растений'синтезируются определенные фракции нуклеиновых кисло?. При этом возможно нарушение процесса синтеза отдельных нуклео-тидов ДНК. ■*'■;■■" ■ '

Аналогичные выводы можно сделать при сравнении куклеотидно-го состава митохондр^альной РНК контрольных и инфицированных грнбо?,? УЛаЬПае растений хлопчатника (табл.7).

Таким образом, в инфицированных Грибов УЛаЬНао растений хлопчатника увеличивается содержание Щчщр оснований митохонд-риальной ДНК и РНК, наиболее ярко это проявляется на примере гуаниновых азотистых оснований<

4.Изучение характера распределения в линейном .. . ' градиенте дат^Оо?» хлорного цзаия И'

кинетики реассоциации мйтохоедриальной ДНК

Препараты митохондриальнод ДНК здоровых и зараженных грибом 'МаЬПае растений хлопчатника характеризуется распределен в линейном градиенте плотности Ец соИ в виде симметричного пика с плотностью 1,105-1,Ш г.ем"э (рйв.З^ что со-

Таблица 7

Нуклеотидный состав митохондриальной РНК в инфицированных грибом у4<ЗаЫ)ае растений хлопчатника

Сорта

хлопчатника{ t

Содержание нуелеотидов,мол,% (М+м)

?

Ц

~\т

(108-$)

контроль 25,3+0,4 22,2±0,3 28,3+0,7 24,2+0,3 62,5

Зараженные 24,7*0,3 ZI,9+0,4 29,1+0,6 24,3+0,4 53,4

(Ташкент-б)

Контроль 26,4$,5 21,4+0,6 28,4*0,4 23,8+0,5 51,9

Зараженные 25,9+0,3 21,7*0,5 29,I+P,5 23,3.0,6 52,4

ответствует 45 4§ молД ГЦ-цар. Анализ характера распределения в ррадиентр плотности CsCl препаратов митохондрИальной ДНК контрольных и зараженных растений показывает отсутствие в ее составе щщарных компонентов, Аналогичная картина наблюдается в ряде рабо? при исследования митохондриалыюй дак других растр ельных объектов ( Dale Н^М^И^ ,1983} Ward ВД^ 1981).

Дця исследования структурной организации ДНК больных ад-том растений успешно применен метод кинетики, реао-

социации, дно1! МЭТОД бр использован нами для сравнительного изучения организации нуклеотидных последовательностей ми?с-хондриальцой ДО контрольных и инфицированных грибом растений ялорчатиивя 1ри.о.4»&)»- '..-..

Сопоставление диетических ррйрих цитохондриальной ДНК изу/ чендах нади сортов »лошшка показало, что да в инфицированных грЦбоМ V4'iahHae растениях .хлопчатника щз своей структурной организации щегэт как Сходадо, так й Несколько различающиеся нуклеотидные группировки по сравнении о контрольной формами, Особенно ати различия наблюдается в интервале со ена-чением Cot о? 0,5#|£Г* до 10 , Размер генома митохондриальной да варьировал в оч^нь узком интервале! от 2,07x10 п.н, до 2,071x10® п.н» Аналогичные результаты были получены Рсуповым и др.(1994) при Изучении кинетики реасеоциации ыитохондриаль-ной ДНК ряд других видов хлопчатника.

J

Ii

Iii

dt

Рис.3, Распределений митохондряальяой ДНК хлопчатника в градиенте плотности хлористого цезия*

1- Контроль (108-5)

2- Зараженные (I08-S)

3- Контроль (Тавкент-б)

4- Зараженнне (Таакент-S)

Й- "аркер ДНК s„ "lutea If-t.m г/см1 ).

• Ряс.4. Кривая кинетики реассоциации митохондриальной ДНК хлопчатника вида G.. hlrsutua Ь< (сорт 108-Ф).

1- Маркер ДНК Е.' coll (раямер генома 5.Í0* тпн)

2- Зараженные

3- Контроль .

Рис.5. Кривая кинетики реассоцивции митцхондриальноП ДНК хлопчатника вмда'С* hirsutuai t.jtсорт Тапкент-6).

1- Маркер ДИ1 В* col 1(размер генома 5.10'тпн)

2- Эаражеинне

■ 3- Контроль , '

5.Изучение гомологичных последовательностей нуклеотидов в митохондриальной ДНК хлопчатника •

Б последнее время твердо установлено, цто метод молекулярной гибридизации является одним из удобных способов для обнаружения изменений в структуре ДНК при воздействии различных экстремальных факторов на растения, а также для решения ряда современных проблем молекулярной биологии, особенно проблемы таксономии и эволюции.

Для количественной оценки изменений в структуре митохондриальной ДНК в инфицированных грибом 'Мчи 11 ас растениях хлопчатника была проведена молекулярная гибридизация ДНК-ДНК.

Результаты экспериментов представлены а табл.8.

Таблица 8

Гомология нуклеотидных последовательностей мито-

х и инфицирова! хлопчатника

*имилигил пуплеигпдпыл нииледис

хондриальной ДНК контрольных и инфицированных грибом V^ д аЬ11 ае растений хлсг

Иитохондриальная ; Относительная гомология.% ДНК на фильтре мт дакх. _"мт шкх

; (108-Ф) ) (Ташкент-бТ

(108-Ф)

Контроль 100+0,5 96,5+р,7

Зараженные 97,4^0,4 95,2+0,4 (Ташкент-б)

Контроль 95,6+0,6 100^0,7

Зараженные 94,5+0,6 98,2+0,5

х - удельная радиоактивность препаратов мт ДНЯ хлопчатника 0,2-0,5°108 имп/мин.На мкр ДНК»

В качестве реперкого образца ДНК мы использовали митохонд-риальную ДНК контрольных растений хлопчатника сорта 108-Ф и Ташнент-6.

Как показывают данные молекулярной гибридизации, у зараженных грибом растений относительный процент гибридизации ДНК с гомологичной ДНК уменьшался на 1,8 (Ташкент-б) и 2,6% (108-4). Также обнаружено уменьшение степени гомологии ДНК в гвтерологичной ДНК. Оно составляет у сортй 108-Ф 1,155, а у сорта Ташйент-6 - 1,3$.

Для обнаружения нуклеотидных последовательностей в ДНК инфицированных грибом ЧЛаШае растений хлопчатника, гомологичных ДНК гриба нами проведена молекулярная гибридизация ми-тохондриальной ДНК (сорта 108-Ф и Ташкент-6) с ДОК

гриба. При атом гомологии нуклеотидных последовательностей между митохондриальной ДгШ зараженных растений и ДНК гриба во всех случаях выше ро сравнению с контролем (табл.9).

Таблица 9

Гомология нуклеотщшы* последовательностей ыитохоедриальной ДНК контрольных и инфицированных Грибом растений хлопчатника с ДОК гриба \vlahliae

Митохондриальная ДНК ТОтносительная гомология,% ____

на фильтре Г ( ^Тд^ГдЩ^гриба

(108-Ш)

Контроль Зараженные (Таакент-6) Контроль Заракенкнв

х- - удельная ртдаодитирлосгь 8рецарз?0р ДНК гриба УййаЬПае ■ 6,1-0,3-Ю8 »кг ДНК,

- В вчоц процессе нр?;ачовг."нув роль» ^орогдно, играют ^кле-пноаш кислот« гриба У-йаШбв , Яо-рэдпмозгу, с скибио'тос-цоы ^азшив О Граиом .нас^ь хро.часоы«ой или плаз-

ыидной ДНК {¡мпсрткруется о клетки здоачадгшка и участвует и ре{!Омб|П!ациоц?(Н:: «роцесоан, происходя®!* р елктке' яс-адия. Л|1бо уе^аболнгц гряба* роококно, кода»? репрессия я пндуцируют синтез определи» фракций нуклещгорцх рисло? имеющих бслырое взсодсцзо с {гуклоотндяой последовательностью ДНК гриба-патогена,

6«В0ДЫ

¡.Сравнительное изучение содержания и биосинтеза нуклеиновых кислот о ыитохондриях двух сортов Ц08-Ф, Ташкент-6 >5 контрольных и зараженных грибом проростков хлопчатника показало,

ко, о+о, 4 104,1+0,5

|С0,0+0,6 103.3+0,3

что наибольшее изменение суммы нуклеиновых кисло? и уровень их биосинтеза наблюдалось з митохондриях восприимчивого к вил-ту сорта 108-Ф, а наименьшее - у более устойчивого сорта Тап-кент-6.

2.Изучены некоторые физико-химические характеристики мито-рибосом контрольных И зараженных грибом проростков хлопчатника. При этом установлено, что в митохондриях зараженных проростков хлопчатника кроме основной фракция, имеющей константу седиментации 77,49, наблюдаются дополнительные фракции с коэффициентом седиментации близким по значению к субъединицам мн-торибосом.

3.По включении (3Н):- тимидина и (3Ш - уридина обнаружено, - что подавление активности ДНК- И PHK-полимеразНоЙ системы митохондрий зараженных грибом проростков хлопчатника в раннем онтогенезе у восприимчивых сортов (108-Ф) идет более интенсивно, чем у устойчивых сортов (ТашкеНт-б)«

4.При определении нуклеотйдного состава Митохондриальной ДНК и РНК контрольных и зарайенных грибом проростков хлопчатника установлено0 что у больных вилтом проростков хлопчатника наблюдается увеличение Щ-пар оснований» Особенно это изменение связано было снижением содержания аденина и увеличением количества гуанина.

5.Сопоставление кинетический кривых митохондриальной ДНК изученных нами сортов хлопчатника показало, что ДНК зарааен-ных грибом проросткоз хлопчатника по своей структурной организации имею? как сходные, так и несколько различающиеся иуклео-тидкые группировки по сразнениа с контролем, Особенно эти различия наблюдаются в интервале со значением Cat от 10"^ до 10^. При этом размер геноМа существенно не отличается.-

5.Методом молекулярной гибридизации установлено, что относительная гибридизация митохондриальной ДНК ИЗ заражении* Грибом проростков хлопчатника с гомологичной ДОК уменьшается ка 1,8 (108-Ф) и 2,6% (Ташкент-б), а о гетерологичной ДНК 1,1 и 1,3% соответственно. Это указывает на нарушение комплементарное«!» в митохондриальной ДО больных вилтом проростков хлопчатника. Возможно это связано с тем, что метаболнтц гриба снимают репрессий и индуцируют синтез определенных фракций имеалт большое сходство с нуклеотидной последовательность» ДНК грйба--патогена.

7.Выявленные структурные и функциональные особенности мито-хондриального генома зараженных грибом УЛаЬИае проростков хлопчатника позволят проводить в дальнейшем более глубокие исследования, которые помогут глубже понять молекулярные механизмы взаимодействия гриба-патогена с растением хлопчатника.

СПИСОК РАШТ .ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I.Мамдух А.Мохамед,Гамаль 1.1.Эль Метабтеб. Сравнительное исследование биосинтеза митохондриальных РНК хлопчатника ■

• С.- Мгзиип в норме и инфицированных грибом

V, // Ташкент Давлат аграр университетининг "Туп-

рок унумдорлигини оаиримнинг допзарб масалалари" илмий асар-лар пувлами, Тошкент,1995. Й.Гамаль М.Эль Метабтеб, Мамдух А.Мохамед. Физико-химические свойства митохондриальной ДНК радиомутантов хлопчатника и их исходных форм. Там же.

3.Маодух А.Мохамед, Гамаль 1.1.Эль Метабтеб. Изучение содержания нуклеиновых кислот в митохондриях инфицированных грибом

V* йаЬПаедвух сортов хлопчатника // Хлопководство,)? 4,1995.

4.Мамдух А.Мохамед, А.П.Ибрагимов. Молекулярные механизмы взаимодействия гриба Л', йаМие 0 растением хозяином // Хлопководство, ,¥ 4, 1995.

VrtHell]lim dahliae Klebahn эамбруги билан зарарланган ryaa ыито-хендриал геномининг айрш структуравий ва функционал характерио-тикаоини урганиш.

Мазкур илмий ипща v, cb.hluc замбруги билан аарарлан-ган гуза ыитоховдриал геномининг айрим функционал ва отрук-туравий характериоткаси киёоий даражада урганилган, Биринчи булиб . Vj dahliae замбруги билан зарарланган гуза ыито-. хондриал гономи отруктурааи анализ цилинди ва он; сил синтез адшпа сиотемаоининг айрим бир компонентлари урганилди. Нуклеин киолоталаршинг микдори ва синтез даражаоининг узгариши, тлт каоаллигига ннобатан чвдаыоиэ 108 ~ ¿D наввда - купро^, аилт каоаллигига чидамли Т~6 навида камрон уэгариш анакландн.

V. dahliae замбруги билан зарарланган гуза уоимтаои аоосий шторибоосма фракцияоидан тапщари, миторибооома оубье-диницаои седиментация коэфицентига якин булган кушимча фрак-циядар толилди. ДНК - ва ГНК'~ полимераза .системасш активли-гининг узгариши, ентогенезнинг даотлабки боокичларвда вилтга ниобатан чадам сиз /IOB-ЙУ навларда теэрон;, вилтга чидамли навларда /1-6/ оекинроч утиши кузапилди. Вилт касаллиги билан зарарланган чигит уешыталарида ГЦ - ¡куфт нуклеотидларининг куяайши агащлавди. Ejy узгаришня Дценин нуклеотвдлари ышс-дорининг камайиши ва Гуанин йукявотидяари шодорининг купайи-шига богликлиги куроатллди. Митохондрия ДНКсининг кинетика эгри чизигини эдёсий урганишлар натижаезда, замбруг билан зарарланган гуза митохондриясининг ДНКси узининг отруктура-вий тузилиши буйдча замбруг билан каоаллвнмаган гуза мито-ноздриясига нисбатан ухшаш ва бир ыунча фарц цилувчи нуклео-тидлар мажцуаси борлиги аншелацци. Молкуляр гибридизация уо-уяи ёрдамида вият билан касалланган гува усимтаяари митоховд-риал ДНКшшинр цуклеотйдлар гомология кетманкетлияларининг кошлементарлигини узгариши кайд циливди.

А 5 S 1 S А С T STUDY ОГ "0'!Г, r>7"UCT'ir.AL А ИЗ F(Ji;C7Tf>r,t. СНА Р.ЛСТ"?Л 3TICF! 0:

•!!?0С110"!;л!д', w.v* i:iFi:c?n" г-y угглсгллт:

"i'T7\" '" "3F CO""')"

in тег*: "1th ''.iiTrirliloii of aspects of so-'o structural

am". f'.mr 11 anril с •, ч г л с: с r 1 s i I r. of -л tochondr Inl oenone Infected by fun1)»!.* V. da'illae in cotton are studied j

First takes place conduction of analysis of structures of nltochondrlal genoae nй Ген conponcnts In syston of synlhesls of' protein И :oUon infected by fungus dahllae found that greater change In suae of ,indole ¿eld level of hi ojynlbesls takes plase In •)l tochondrla of variety receptive to vtlth IOG-F and lesser In more гея 1s tance variety ^

Asser tal nnienl of fact that In Mitochondrial of Infections sprouts of cotton except l;.!-jcrtant fraction of nt tor 1 bosones in presence of additional fraction '.nth coefficient of sedlrimtatlon nearer for the Inportantance of subunlt of nltorlfcosones^

''.ereabient of supresslon of activity of ЕПA - 1411Л polymerase systen о f ,nl to chondra In sprouts Infected by fungus In earlier ontogenesis In receptlval v-irlety takes place .'lore Intensively, than in resistant varl'.y(?ashkent-*)L In sprouts diseased by with observed increase In C.C Talr base.-

Particularly that change is connected and <.;I th decrease In contents of adenine and increase In guanine,, In eoripar 1 tlon г/1th к kinetic curve:; of mitochondrial N!A studied In varieties of cotton reveals that П1Ц of Infected sprouts by fumjus by its structural organisation has both the similarities and Jlfferenclated.micletlde groups -¡hen compared ulth control«

Method of nolecular hyburldlnation shova the ulst;-rbance In eonplftnentar 1 ty of hono I og 1 с.'Д succcssl c.is mitochondrial of ulth infected cotton sprouts..

Подписано в печать — 7. 06. 95. Формат бумаги 60X84716- Бумага типографская № 1. Печать «РОТАПРИНТ». Объем 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 740.

Типография издательства «Фан» АН РУз. 700170, Ташкент, акад. X. Абдуллаева, 79.