Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение диморфизма этнологически значимых видов грибов рода Candida

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Изучение диморфизма этнологически значимых видов грибов рода Candida"

РГ6 од

МИНИСТЕРСТВО РФ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДШЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

На правах рукописи

ДАНИЛОВА Ольга Павловна

ИЗУЧЕНИЕ ДИМОРФИЗМА ЭТИОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧНЫЫХ ВИДОВ ГРИБОВ РОДА САШОА

03.00.24-ынкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученое степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 19ЭЗ

Работа выполнена в Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования.

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор

В.Г.Кубась

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук, профессор

В.Л.Быков

- доктор биологических наук, профессор Н.А.Эаикина

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский санитарно-гигиени

ческий медицинский институт

Защита диссертации состоится * !$' ИОХ^эА 1993г. в 13 часов «а заседании специализированного ученого совета Д 074.16.04 по защите докторских диссертаций при Санкт-Петербургской академии последипломного образования по адресу: 193015, Санкт-Петербург, ул. Салтыкова-Щедрина, 41

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотек! института,

Автореферат разослан " ¡Я" ОХТЯорЯ' 1993г.

Учений секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

Л.В.Соболев

.ктуальность проблемы.

Согласно данным ВОЗ (1987), микотические инфекции занимает [ервое место в структуре инфекционной патологии. Дрожжеподобные рибы p.Candida в качестве этиологического агента внутрибольнич-:ых инфекций вышли на четвертое место.

Ряд форм кандидоза характеризуются крайним полиморфизмом линики и тяжестью прогноза. Лабораторная диагностика в значи-ельной степени осложнена широко развитым иосительством грибов .Candida, обнаруживающим тенденцию роста.

Если в 20-е годы на слизистой роговой полости носительство оставляло 107. (Tonner F. et.al., 1927), то в последующие периоды но составило 46-527. { Кубась В.Г., 1968, Реброва Р.Н.,1979, Di !enna H.,1952). В 70-е года частота иосительства на слизистой рта ;остигла 40-50/5 (Farman A., Nutt G.,1976).

A.Stenderup (1980) сообщает о 86% случаев иосительства andida на слизистой влагалища беременных женщин, что повышает иск инфицирования в родовых путях (Мороз Е.Я.,1960, Scog-ins R.,1979).

о данным Центра контроля заболеваемости (США), с мая 1983 года о июнь 1984 года было зарегистрировано 3170 больных СПИДом, сре-,и которых у 41,8% выявлен кандидоз слизистой ротовой полости и лотки, а в 9,4% - кандидозныЯ эзофагит (Chandler F.,1985). андидоз ротовой полости, пищевода и влагалища может развиваться ак,в продроме, так и манифестной стадии СПИДа, и как показало сследование C.Pedersen с соавт. (1987), его появление иногда редшествует серопозитивной стадии инфекции.

У ВИЧ-серопозитивных лиц увеличена частота иосительства andida на слизистой ротовой полости до 77,8%, при этом почти у оловины носителей (49,Ш в смывах выявлена мицелиальная форма риба без клинических проявлений кандидоза (Torssander S.et.al., 987).

Биология Candida такова, что они могут быть представлены вумя фазами роста: дрожжевой и нитчатой. При носительстве грибы andida размножаются на слизистых почкованием и обнаруживаются в иде дрожжевых клеток. Нитчатая фаза превалирует при развитии па-ологического процесса, поэтому выявление данной морфологической ормы гриба является важным диагностическим признаком.

Ведущее значение С.albicans при кандидозе стимулировало по-

вшенный интерес исследователей к грибам этого вида, между тем, по данным J.Perry с соавт.(1990), за последние годи возросла этиологическая значимость С.tropicalis.

За период с 1980 по 1983 г. À.Miche 11-Ngugen с соавт.(1986) в университетской медицинской центре Иарселя получили 4200 изолятов дрожжеподобных грибов, из которых С.albicans составили 66,4%, С.tropical is - 13%.

Р.Muñoz с соавт.(1990) в течение четырех лет получили 552 гемокультуры дрожжеподобных грибов, из них 192 были идентифицированы как C.alblcMis, 20 - С.tropicalis.

В 70-е годы появились сообщения о выделении сахарозонегатив-них штаммов С.tropical is (Ahearn D. et.al.,197?), что значительно затрудняет применение автоматизированных систем идентификаций VI ТЕК, API-20C, V ACUTA I HER, ВАСТЕК ), основу которых составляет определение биохимических свойств изолятов.

J.Bille с соавт.(1982) сообщили о выделении из крови 100 типичных культур С.tropicalis or 36 больных и 59 сахарозонегативных штаммов этого вида от 20 больных.

До настоящего момента не потерял актуальности поиск факторов, стимулирующих переход одной фазы гриба в другую. N.Dabroea с соавт.,1976, Т.Odds,1979, U.Hubbard с соавт.,1985 изучали процессы, происходящие при трансформации дрожжевых клеток С.albicans в мицелий.

Инициация же нитчатой фазы грибов С.tropicalis практически не изучена, такхе как степень антигенной гомологии дрожжевой и нитчатой фаз указанного вида.

Неоднозначна оценка роли различий белкового спектра двух фаз гриба для диагностики кандидоза (Manning H., Mitchell T.,1980; Ponton S. et.al., 1986).

Остается дискуссионным вопрос об объединении вида C.stellatoidea с С.albicans (Barnett S. et.al.,1983, Kwon-Chung К. et.al,1990).

Анализ приведенных выше положений определяет направленность данной работы.

Цель исследования.

На основании изучения антигенного состава двух фаз роста С.tropical Is и их сравнения с антигенным набором дрожжевой и ми-целиальной фаз С.albicans представить рекомендации о целесообраз-

иости использования в диагностике кандидоэа антигенных препаратов тканевое фазы возбудителя, а также оценить роль активации с«степи комплемента в гибели условно-патогенимх (С.albicans, С.tropicalis) м сапрофитных грибов (Sacch.cerevlslao).

Задачи исследования.

1. Сравнительное изучение процессов трансформации дрожжевых клеток С.albicans. C.stellatoldea м С.tropicalis в нитчатую фазу.

2. Установление морфологических особенностев клеток С.albicans, C.stellatoidea, С.tropicalis ори вегетированни в организме экспериментального животного.

3. Определение экспрессии антигенных детерминант наружных слоев клеточкой стенки при переходе дрожжевой фазы С.tropica!Is в нитчатую.

4. Изучение белковых слектров имтоплазматического содержимого дрожжевое и нитчатое фаз С.albicans, C.stellatoidea в С.tropica!is.

5. Определение влияния активации системы комплемента на характер воспаления, визцваемого диморфнши грибами С.albicans,

С.tropicalis и истинными дрожжами Saccharomyces cerevisiae.

Научная новизна работы.

Впервые показано различие характера трансформации дрожжевых клеток C.albicans и С.tropicalis в иитчатуо фазу. В то время как у C.albicans нитчатая фаза была представлена истинным ыицелиеи с редко встречавшимися элементами псевдомицелия, у С.tropicalis преобладали псевдоиицелиалькие формы. Установлены структурные отличия клеточных стенок дрожжевых клеток указанных видов: в отличие от C.albicans, клеточная стенка С.tropicalis структурирована менее четко и характеризуется меньшее толщиной при выраженной аморфности средних слоев.

При трансформации дрожжевых клеток С.tropicalis утрачивался один слой клеточное стенки, причем не обнаружено отличий в поверхностных структурах клеток истинного мицехия и псевдомицелия. При трансформации дрожжевых клеток С.tropicalis ранние этапы <3 -- 4 часа) сопровождает формирование особых морфологических форм,

отличных от обычных почек и "ростковых трубок". Показано, что переход дроыових клеток п ммцелиальные как ] С.albicans, так н С. tropical Is ведет к обеднение цитоплазмати-ческого содержимого нитчатой фазы белками с изоэлектрическиш точками, принадлежали«« области pH 6-9, причем у С.tropicalis i меньшей степени.

Установлен активируюоий эффект растворимых лолисахаридо! маточных стенок дрожжевой к нитчатой фаз С.tropical Is, степень влияния которых иа систему комплемента, в отличие от С.albicans, била одинаковой.

Выявлено, что степень активации системы комплемента компонентами грибов С.albicans, С.tropicalis и Sacch.cerevlslae не определяет судьбу возбудителя в макроорганизме.

Теоретическое и практическое значение работы.

Установленные структурные отличия в строении клеточной стеи-ки С.albicans я С.tropical is указывает на вариабельность организации клеток в продолах одного рода.

Электронно-микроскопическое изучение позволило выявить значительную степень тождества структуры клеточных стенок нитчатой фазы С.tropicalis, индуцированной in vitro и in vivo и показать идентичность этой структуры у истинного мицелия и псевдомицелия.

Данные относительно высокой степени гомологии клеточных стенок С.albicans я С.stellatoldea, процессов трансформации одной фазы гриба, в другую, а также высокая степень тождества белковых спектров свидетельствует в пользу правомерности включения C.stellatoldea в вид С.albicans иа правах биохимического варианта

Выявленные отличия антигенного состава нитчатой и дрожжевой фаз С.tropical is расширяют представления об особенностях перехода гриба из одного морфологического состояния в другое.

Учитывая возросшую роль С.tropicalis в этиологии кандидоза, выявленные различия белкового содержимого цитоплазмы идентичных фаз С.albicans и С.tropicalis диктуют необходимость использования цитоплазматических антигенных препаратов гомологичного вида.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Дрожжевые клетки С.tropical Is в состоянии In vitro и In vivo

- ? -

трансформируются в нитчатую фазу, структурные особенности которое отличны от С.albicans,

2. Переход дрожжевой фазы С.tropicalis в нитчатую сопровождается уменьшением количества слоев клеточное стенки, снижением плотности общих антигенных детерминант наружных слоев, нэыененнйм белковых профилей цигоплазиатнческого содержимого.

3. Спектры белков цмтоллазматичаского содержимого клеток гомологичных фаз C.stollatoldea и С.albicans идентичны н отличны от С.tropicalis.

4. Равнозначность антикомпяемеитарной активности компонентов клеточных стенок С.albicans, С.tropicalis и Sacch.cerevislae не определяет выживаемость этих грибов в иакроорганизме.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 1S9 страницах машинописи,из которых текстуальная часть составляет 122 страницы и состоит из введения,' 9 глав, выводов, списка литературы, включающего 163 работы, в том «нежа 22 отечественных и 161 иностранную.

Текст иллюстрирован 6 таблицами и 32 рисунками.

Внедрение результатов работы.

Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры микробиологии и микологии СПб ГИД/Ва, кафедр микробиологии СПб санитарно-гигиенического медицинского института и Военно-медицинской ккадемии ни.С.U.Кирова.

Апробация работы. -

По теме диссертации опубликовано 7 сообщений. Материалы дассертации доложены на Международном симпозиуме "Актуальные ьоп-юсы медицинской микологии"(СПб,1987) и Международном симпозиуме Микозы и иммунодефициты" (СПб,1991).

, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы штаммы дрожжеподобных грибов Candida

- в -

albicans (C.albicans ■T.624).C,stellatoidea(arr.372),С. tropicalis (шт.72) и ястмнних дрожжеЯ-Saccharomyces cerevlsiae (Sacch.cerevlsiae шт.500/404),полученные из Всесоюзной коллекции патогенных грибов НИО глубоких микозов.

Для получения дрожжевой фазы использовали плотную питательную среду Сабуро с 4Х глюкозы,а для нитчатой-жидкую среду 199 с 25% нормальной лошадиной сыворотки.

Имиунолюымнесцентиое исследование!метод непрямой иммунофлюо-ресценция) проводили с использованием сывороток.полученных путем иммунизации кроликов введением препаратов клеточных стенок дрожже вой и нитчатой фаз C.troplcalis в подколенные лимфоузлы.Иммунные глобулины подвергали высаливанию по обычной схеме. Клеточные стенки и цитоплаэиатическое содержимое получали дезинтегрированием клеток, для чего использовали дезинтегратор клеток, разработанный Н.П.Блиновым и В.Г.Калошиным (1978).При получении шпоплазматического содержимого клеток перед разрушением добавляли 0,1 И спиртовый раствор ингибитора протеиназ (фенилме-тилсудьфонилфлюорнд)до конечной концентрации 0.001 Ы.Стенки отделяли центрифугированием при 18000g в течение 30 минут.Супериа-таят подвергали ультрацентрифугированию при 105000g в течение 90 минут с целью получения цитопАазматического содержимого. Изоэлектрофокусироваиие белков цитоплаэматического содержимого клеток вели в горизонтальных пластинах плоского тонкого геля иа аппарате Multlfor 112117 (LKB). Пробы наносили на полоски фильтровальной бумаги Vhatman толщиной 3 мм в объеме 25мкм. В качеств тестовой смеси была использована коммерческая смесь белков (фирм Reanal) с известными язоэлектрическими точками. Кислотораствори-мые амфолины удаляли отмыванием в смеси уксусной кислоты (10%) и этанола (353).Гели охраоивали 0,5% раствором кумасси-R 250. При окраске азотнокислым серебром гели предварительно вымачивали в 20% растворе атанолового спирта и промывали дистиллированной водой. Окрашивание проводили 0,1% раствором азотнокислого серебра. Проявление изоэлектрофореграмм вели смесью ЗХ карбоната натрия и 0,2% формалина.

Для электронно-микроскопического исследования отмытые клетки грибов фиксировали глютаральдегидом,обрабатывали \% таннином на растворе Хэнкса и раствором четырехокиси осмия,выдерживали в 2% растворе уранилацетата иа ацетатном буфере (pH 5,2) и обезвожива-

ли в растворах этилового спирта в возрастала«» концентрациях, заливали в смолу Cnyppa (Spurг А..19€8).Окраска проводилась урани-лацетатом и цитратом свинца (ЯеупоЫз Е., 1963). Электронно-микроскопическое изучение препаратов води с помоиаи микроскопа JEM-100C (Япония).

Для сканирующей микроскопии отмитие клетки грибов помещали в SX раствор акролеина на растворе Хэмкса (Black J.,1974), выдерживали в IX растворе четирехокыси осмия,проводили обеэвоживиние в растворах атиловога спирта в возраставши концентрациях, помещали на фильтровальную бумагу ,висувивали при комнатное температуре и покрывали золотом в напилителъной установке JEC-1100 (Япония). Изучение препаратов проводили при панаши микроскопа JSU-35C (Япония).

Гемолитическую активность коиплеиента сыворотки мышей определяли методом B.Clnader с соавт.(1964).Полисахаридные препараты получены по методу Н.П.Блинова (1964).

Воспалительные процесс моделировали внутрибрюшинным введением клеток грибов нишам-самцам линии BALB/C.Характер воспалительное реакции оценивали экспресс-методом, разработанным в лаборатории экспериментально)! микологии Н1ШИАФ (Аравийский P.A., 1978). Микрофотосъемку вели при помощи микроскопа ИБИ-15 иа черпо-Оелус пленку (фирма Свена)и микрат-300 (фирма Свема),микроскопа МЛ-2 с микрофотонасадкой 1Ш-10 иа пленку РФ-3.

Статистическая обработка результатов исследования проведена с применением коэффициента Стьодента при использовании компьютерной программы Statgraph.

В экспериментах использовано 10 кроликов,160 мышей-самцов линии BALB/c.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУ1ДЕНИЕ

Диморфизм грибов p.Candida привлекает большое внимание вследствие того, что нитчатая фаза роста гриба (инвазивная фаза), имеет диагностическое значение (Хмельницкий O.K. с соавт.,1984; Cassone A. et.al.,1987).

Исследования последних лет направлены, в основном, на изучение двух фаз роста грибов С.albicans, оставляя без должного внимания вид С.tropical is, который no степени этиологической значи-

мости, «вряд; с С.albicans, занимает ведупев значение при кпнди-дозе.

Для изучения индукция нитчатой фазы С.tropicalis и сравнения Процессов трансформации с С.albicans был осуществлен подбор условия культивирования. При выборе среди учитывали доступность ингредиентов, поскольку большинство рекомендуемых способов получения мицелия С.albicans предусматривает использование коммерческих срод зарубежных фирм (Hönning N.. Mitchell Т.,1980; Нагеп К., Hazen В. .1987).

Из шести изученных сред максимальная степень трансформации дрожхевоп фазы как С.albicans, так и С.tropicalis получена на среде Хэхкса с 25% лошадиной сыворотки и среде 199 с сывороткой в той же концентрация. Последней было отдано предпочтение, поскольку входящий в ее состав индикатор позволяет контролировать стерильность засева я степень трансформации.

При равных условиях культивирования, нитчатая фаза С.tropica!is, в отличие от С.albicans,содержала значительное количество псевдомицелия и бластоспор.

По имеющимся в литературе сведениям, для получения нитчатой фазы предпочтительно инкубирование при град.(Shepherd М.,1988) Исходя иэ полученных нами данных следует уточнить, что выбор температуры 37 град, яеобходим для количественного накопления нитчатой фазы, поскольку понижение температуры выращивания не угнетало процессов перехода дроххей в мицелий, но снижало интенсивность трансформации.

Мицелиальные клетки С.albicans и С.tropicalis при помещении на плотную среду я внесении в жидкую среду претерпевали морфологические изменения, интенсивность которых была выше у С.tropicalis.Изменение морфологии исходной нити С.albicans при помещения на плотную среду при 37 град, не было связано с ее фрагментированием, в отличие от C.troplcalis. В том и другом случае на поздних сроках (24 часа) наблюдали образование иэ исходной нити микроколоний, прорастающих в агар.

Нить мицелия С.tropicalis, внесенная в жидкую среду для накопления нитчатой Фазы при 37 град., формировала бластоспоры через 2 часа от момента инкубирования, С.albicans - 4 часа. В дальнейшем (через 6 часов) отмечено появление цепочек бластоспор, удлинение составляющих их клеток и образование верти-

- и -

цилл, а в конечном итоге, через 18 часов - войлокообразиого мицелия у С.albicans и хлопьевидного - C.troplcalls. Снижение температуры до 25 град, изменяло характер морфогенеза нитей, что выражалось в более обильном, чем при 37 град, образовании дрожжевых клеток, появление которых предшествовало интенсивному формированию псевдомицелия как у С.tropicalls. так и С.albicans.

Вышеприведенные данные свидетельствуют, что нитчатая и дрожжевая фазы изученных грибов являются фенотипами конкретного вида, способными к взаимной трансформации.

Модификация схемы введения грибов белым мышам (2-х кратное заражение) позволила получить из очагов пиелонефроза нитчатую фазу этих грибов в достаточном количестве. Степень трансформации дрожжевых клеток С.albicans в организме экспериментального животного была столь же высока, что и при получении In vitro. Мицелий С.albicans и С.tropicalis полученный указанными двумя способами, не отличался по структуре, отмечено лишь незначительное увеличение количества бластоспор на нитях мицелия, что обьяснимо, если принять во внимание результаты изучения обратной трансформации.

Для определения характера антигенных связей дрожжевой и нитчатой фаз С.albicans и С. tropical ls било применено иммунолюми-несиентное исследование, для чего были использованы неадсорбиро-ванные и адсорбированные иммуноглобулины против клеточных стенок дрожжевой и нитчатой фаз С.tropicalis в реакции непрямой иммуноф-люоресценции.

Данное исследование подтвердило тесное серологическое родство дрожжевых фаз указанных грибов, а также поверхностных антигенов нитчатой фазы и показало, что переход дрожжевых клеток в нитчатую фазу сопровождается изменением экспрессии общих антигенных детерминант.

Антидрожжевой глобулин при рабочем титре 1/320 окрашивал нитчатую фазу С. tropicalis в разведении 1/40, C.alblcans - 1/20. Красящий титр глобулина против нитчатой фазы в отношении дрожжевых клеток составлял 1/160, что превышало рабочее разведение (1/40) для гомологичной фазы.

Адсорбция иммуноглобулина против дрожжевой фазы мицелием приводила к четырехкратному снижению рабочего титра при окрашивании дрожжевых клеток, адсорбция иммуноглобулина против мицелиаль-ной фазы дрожжевыми клетками С.tropicalis значительно снижала

красящий титр, который падал с 1/40 до 1/2, а в отношении дрожжевых клеток с 1/160 до 1/40.

Результаты, подобные вышеизложенным, выли получены при аналогичных исследованиях С.albicans, но в отличие от С.tropicalis адсорбция антидроххевого глобулина мицелием практически не снижала красящего титра как в отношении С.albicans, так и С.tropical is. Снижение красящего титра иммуноглобулина против дрожжевой фазы С.tropical Is при адсорбции его нитчатой формой, объясняется высоким содержанием псевдомицелия в нитчатой фазе С.tropical is. Следует отметить, что при окрашивании адсорбированным антидрожжевым глобулином дрожжевых клеток и псевдомицелиальных форм, последние воспринимали специфическое окрашивание в более низких титрах (1/16J, чем дрожжевые клетки (1/40).

Таким образом, использование неадсорбированных и адсорбированных иммуноглобулинов против клеточных стенок дрожжевой и нитчатой фаз, позволило продемонстрировать превышение плотности обоих антигенных детерминант дрожжевых форм в сравнении с нитчатыми,в том числе и меньшую плотность общих антигенных детерминант в поверхностных структурах псевдомицелия по сравнению с дрожжевыми клетками, что может зависать от эффекта элонгации клеточных элементов при формировании псевдомицелия.

Несмотря на то, что в данных экспериментах не представилось возможным выявить фазоспецнфичные антигены., в литературе встречаются немногочисленные упоминания о их существовании. Е.Small и J.Jones (1934) сообщили о специфическом антигене в составе "ростковых трубок" и мицелия С.albicans,Р.Sundstrom и С.Kenny (1984) указывают на различие в составе поверхностных антигенов двух фаз С.albicans.

К сожалению, авторы вышеприведенных публикаций не сообщают сведений относительно плотности этих антигенов, из-за чего невозможно решить вопрос о их значимости для диагностических целей.

Методом изоэлектрофокусирования белков цитоплазматического содержимого дрожжевых н мицелнальных клеток была продемонстрирована видоспецифичность их спектров.

M.Suzuki и T.Nakase (1986) отмечают, что даже сахарозонегативные штаммы С.tropicalis отличает высокое сходство спектров. Сравнение белковых профилей грибов С.albicans и С.stellatoidea выявило их высокую гомологию. Незначительные отличия отмечены в областях pH

- 13 -

4.4-6.9; 6.9-8.35; 8,35-10,65.

При численном равенстве белковин спектров (45 линий), цитоплазма дрожжевой фазы С.albicans была беднее белками, изоэлектри-ческие точки которых принадлежат области pH 5,34-6,9 и богаче белками с изоэлектрическими точками диапазона pH 7,3-8,3. В отношении белковых профилей нитчатой фазы С.albicans и C.stellatoidea прослеживалась значительная гомология.

Изучение спектров белков цитоплазмы двух фаз роста C.alblcans и С.tropical is показало существование фазоспецифичних белков дрожжевой фазы, причем выявить эти отличия в отношении С.tropicalis представилось возможным только прв изоэлектрофокусироваиии в узких диапазонах pH.

Анализ белковых спектров изоэлектрофореграмм цитоплазмати-ческого содержимого двух фаз роста C.alblcans и С.tropicalis показал. что переход дрожжевой фазы в нитчатую ведет к обеднению клеточного содержимого последней белками, что особенно было выражено в зонах pH 6,9-7,3; 7,3-8,0; 7,0-9,0. Отмечено расхождение распределения 50% белковых фракций у C.alblcans и 21% С.tropicalis, более низкий процент расхождения у последнего вида связан с высоким содержанием псевдомицелия в нитчатой фазе. 1 обоях указанных видов прослеживалась высокая степень гомология, белков тетерологичных фаз с изоэлектрическими точками зоны pR 5.34-6,9. Выявленные отличия белковых спектров нитчатой я дрожжевой фаз C.alblcans ш С.tropicalis не зависели от температуры культивирования, поскольку я та и другая были получены при 37 град.

Методом изоэлектрофокусирования белков цитоплазматического содержимого нитчатой и дрожжевой фаз C.alblcans и С.tropical Is, к сожалению, не удалось определить фазоспецкфических белков цитоплазмы мицелия, возможно содержание их весьма мало и даже данный метод, считающийся одним из наиболее чувствительных, не обладал разрешающей способностью для их выявления. В имеющейся в нашем распоряжении литературе нам не встретилось сведений, касающихся сходства или различия белковых фракций составляющих цитоплазмы по изоэлектрическим точкам. Более того, сравнение белков по молекулярной массе имеется только относительно дрожжевой фазы, что касается нитчатой, то данные ограничены сопоставлением тождества антигенных свойств белков C.alblcans в иммунологических реакциях.

Полученные нами результаты изоэлектрофокусирования белков

цитоплазмы двух фаз C.albicans, С.stellatoidea и С. tropica)ls позволили придти к выводу об отсутствии фазоспецифическнх балков нитчатой формы, что делает нецелесообразным использование цитоп-лазматических белков тканевое фазы в целях иммунодиагностики кан-дидоза.

Изучение ультратокких срезав дрожжевых клеток С.albicans и С.tropicalis выявило различие в организации их клеточных стенок, которые имели многослойную структуру. В отношении C.stellatotdea прослохивалась полна» аналогия с C.albicans, более того, в некоторых препаратах C.stellatotdea определялся дополнительный слов, при этом число слоев увеличивалось до семи.

Клеточная стенка дроххевой фазы С.tropicalis была менее массивной в сравнении с C.albicans (0,095 t 0,006 шш; 0,196 ± 0,012*мкм соответственно), имела более аморфный электронно-плотный слой, граничащий с фибриллярным

В литературе упоминаний о подобном структурном отличии организации клеточной стенки C.albicans и С.tropicalis нам не встречалось, однако, В.И.Голубев с соавт.(1960) допускает существование различных вариантов структуры клеточной стенки в пределах од' ного рода грибов, в частности среди сапрофитных видов p.Candlda.

Изучение процессов, сопровождающих почкование и прорастание у грибов C.albicans и С.tropicalis, позволило уточнить их характер и продемонстрировать их отличия. При почковании происходит разрыв клеточной стенки материнской клетки, поверхностные структуры почки на ранних этапах соответствуют внутренним слоям дроххевой клетки. Формирование "ростковых трубок" C.albicans и C.stellatoidea не сопровождалось разрывом клеточной стенки материнской клетки. С самых ранних этапов сохранялся наружный фибриллярный слов и электронно-плотный, прилежащий к последнему, но утрачивался внутренний электронно-прозрачный рыхлый слой, а также происходило слияние двух электронно-плотных слоев дрожжевой клетки в .единую структуру в составе " ростковой трубки." По мнению некоторых авторов, отличие почкования и прорастания сводиться лишь к наличию сужения и перетяжки в месте отхождення дочерней клетюиот материнской (JosM К. et.al., 1973).

При культивировании дрожжевых клеток С.tropicalis в условиях, соответствующих получению нитчатой фазы, на ранних этапах трансформации дрожжей (3-4 часа) были выявлены особые морфологи-

ческие формы, формирование которых сопровождали процессы аналогичные прорастанию, тоесть отсутствовал разрыв нарудннх слоев клеточной стенки материнской клетки. При этом архитектоника клеточной стенки материнской и дочерней клеток била идентичной. Между этими клетками отсутствовала сплошная перегородка и сохранялось общая иитоплазматическая мембрана. Такая репродукция отличалась от механизмов как прорастания, так и почкования. В некоторых случаях на границе указанных выше клеток выявляли извитые перегородки с клапанообразными ограсгками.

Кок особый вариант почкования С.tropicalis следует отметить образование вытянутых почек, напоминающих при светлопольной микроскопии "ростковые трубки".

Как нами ранее било показано, эти структуры окрашиваются специфически при иммунолюминесцентном исследовании в тех же титрах, что и материнские клетки, что позволило дифференцировать их от "ростковых трубок" С.! Ibicans и C.stellatoldea (Кубась В.Г., Данилова О.П.,1987). Подобные почки в сывороточных средах встречаются примерно у 30% дрожжевых клеток С.troplcal]s, что затрудняет ускоренную идентификацию С.albicans, C.stellatoldea и С.tropicalis по тесту "ростковых трубок".

Методом сканирующей микроскопии било показано структурное отличие нитчатой фазы C.alblcans и C.stellatoldea от С.troplcalis, в составе которой преобладал псевдомицелий. Превышение содержания в составе нитчатой фазы С.tropicalis псевдомицелия было подтверждено исследованием ультратонких срезов клеток указанного вида. Клеточная стенка мицелиальных клеток трех изученных видов грибов имела меньшее число слоев в сравнении с дрожжевыми (4 и 5-7 соответственно). Особенностью нитчатой фазы С.tropicalis било отсутствие различий в структуре клеточной стенки истинного мицелия и псевдомицелия.

Цитоплазма мицелиальных клеток обладала развитой сетью эн-доплазматического ретикулюма, небольшим числом липидных включений и значительным - митохондрий. В структуре мицелиальных клеток выявлены характерные инвагинаты мембраны. Компоненты клетки - рибосомы, цитоплазматические включения - идентичны у обеих фаз изученных грибов. Морфология внутреннего содержимого клеток, описанная выше, соответствует данным литературы (Shepherd М.,1988).

Ультраструктурное изучение нитчатой фазы, полученной из ор-

гвнмэма экспериментального животного, выявило ее некоторые особенности и позволило показать отличие структуры нитчатой фазы In vivo гриОов С.tropicalis от аналогичной фазы С.albicans и C.stellatoidea. В ряде случаев нитчатая фаза С.tropica!ls, сформированная In vivo имела выраженный наружный сдой, фибриллы которого у отдельных нитей имели значительную длину, образуя сплетения.

Подобные структуры были не характерны для нитчатой фазы, полученной в пробирочных условиях и для тканевой нитчатой фазы С.albicans и С.stellatoidea, более того, данный фибриллярный слой у части клеток этих грибов практически отсутствовал.

Клеточные стенки гиф, указанных трех видов грибов имели одинаковое число слоев при индукции нитчатой фазы In vivo и in vitrot Нитчатая фаза С.tropicalis состояла преимущественно иэ псевдомицелия как при получении in vivo, так и in vitro. В составе тканевой нитчатой фазы С.albicans, С.stellatoidea и С.tropicalis выявлялись клетки в деструктивном состоянии. Эти клетки характеризовались обилием вакуолей и включений,отслоением цитоплазматической мембраны с образованием полостей и формированием многочисленных внутриклеточных ламеллярных структур. У отдельных клеток были изменены поверхностные структуры, что выражалось в нарушении слоистости и в увеличении электронно-прозрачно« массы, носившей аморфный характер. Утолщение клеточной стеики. не сопровождалось при этом нарушением ее целостности. Не представляется возможным соотнести полученные нами данные с имеющимися в литературе, поскольку изучение тканевой фазы указанных выше грибов, касалось, в основном, лшвь патоморфологических исследований (Хмельницкий O.K. и др.,1985; Быков В.Л.,1989).

В результате проведеннмх нами исследований была показана высокая степень тождества С.stellatoidea и С.albicans. Данное заключение основывается на результатах изучения структурных особенностей нитчатой фазы в состоянии in vivo, морфогенеза клеточной стенки при почковании и прорастании к характера белковых профилей цитоплазматического содержимого клеток двух фаз, архитектоники клеточной поверхности.

Электронно-микроскопическое изучение поверхностных структур дрожжевых форм С.albicans и С.tropicalis выявило их отличия, однако, препараты маннанов и клеточных стенок указанных форм эб-

ладали тождественной антикоыплементарной активностью. Впервые Сил показан дозозависииыЯ эффект снижения мананнами клеточных стенок С.tropicalis гемолитической активности сыворотки мышей н проведено сопоставление антмкоиплементарной активности ианнанов н лио-фильно высушенных клеточных стенок двух фаз С.albicans и С.tropicalis мехду собой и аналогичными препаратами истинных сапрофитных дроххей Sacch.cerevisiae.

Активацию комплемента вызывали маннаны клеточных стенок дроххей в дозах 100,0 н 10,0 икг/мл н маннани клеточных стенок мицелия C.alblcans и С.tropicalis в дозе 100,0 мкг/мл. Представляется интересным факт, что инактивируюцее действие маннанов нитчатой фазы C.alblcans, в которой преобладает истинный мицелий, было нихе, чем аналогичного препарата С.tropicalis, характерной особенностью нитчатой фазы которого является доминирование псевдоыицелня.

При патоморфологическом изучении препаратов большого сальника в динамике инфекции, обусловленной грибами C.alblcans, С.tropicalis н Sacch.cerevisiae, нами была отмечена наибольшая реактивность нейтрофилов спустя весть часов от инъекций клеток гриба. Внутриб-рюшинное введение дрожжевых клеток C.alblcans, С.tropicalis н Sacch.cerevisiae приводило к однотипным гнстопатологическим изменениям тканей большого сальника. Острая воспалительная реакция сменялась ярко выраженной макрофагальной инфильтрацией и формированием эпителиондноклеточных гранулем, что согласуется с данными литературы (Higaji Ii., Nlshimura К.,1986; Sohnle Р..Wilson В., 1986). Вплоть до 10 суток внутри гранулем определялись грибы C.alblcans и С.tropicalis, клетки Sacch.cerevisiae к этому сроку полностью исчезали из очага воспаления, причем,клетки инертные к окрашиванию PAS-ыетодои, появлялись уже через 30 минут от момента заражения, что свидетельствует о химических изменениях структуры клеточных стенок. Все три вышеуказанных вида грибов подвергались активному фагоцитозу, в том числе почкурщиеся формы С.tropicalis а Sacch.cerevisiae.

'пособность видоизменяться была характерна только для С.albicans, а С.tropicalis,но не для Sacch. cerevisiae.К шести часам вегети-эования в организме экспериментального животного 43,2+3.3% клеток '.albicans формировали "ростковые трубки",а к 24 часам 8,33+0,67/2 слеток С.tropicalis-вытянутые почки и короткие фрагменты мицелия.

Вышеприведенные денные свидетельствуют о том, что компоненты клеток С.albicans, С.tropicalis и Sacch.cerevisiae (маннаны, клеточные стенки) в одинаковой степени способны активировать систему комплемента, при втом сроки гибели этих микроорганизмов различны. Идентичность клеточной реакции на ранних стадиях воспаления, примерно равные фагоцитарные числа и фагоцитарные индексы позволяет объяснить различную чувствительность этих грибов к внутриклеточному киллингу их биологическими особенностями.

ВЫВОДЫ

1.Клеточные стенки дрожжевой фазы С.albicans и C.stellatoldea имеют аналогичную структуру,характеризующуюся наличием 5-7 слоев с преобладанием в ее составе электронно - прозрачных.

У С.tropicalis, по сравнению с указанными видами,толщина клеточной стенки меньше (0.095*0.006мкм;0.196*0.012мкм соответсвенно).

2.Процессы трансформации дроххевых клеток С.albicans и C.stellatoldea в нитчатую фазу сопровождаются уменьшением числа, слоев клеточной стенки,что ведет к уменьшению ее толщины.

Утрата одного слоя клеточной стенки при трансформации дроххевых клеток С.tropicalis в нитчатую фазу не изменяет ее толщины. В нитчатой фазе С.albicans и C.stellatoldea преобладает истинный мицелий, а у С.troplcalis-псевдомицелий.

3. Начальные этапы перехода дроххевой фазы в нитчатую у С.albicans и C.stellatoldea сопровождаются локальным истончением клеточной стенки материнской клетки,выпячиванием цитоплазмати-ческой мембраны и формированием "ростковых трубок".

У С.tropicalis выявлен механизм репродукции,не соответствующий ни почкованию, ни прорастанию. Начальные стадии сопровождаются истончением клеточной стенки материнской клетки, формированием дочерней клетки,имеющей общую цитоплазматическую мембрану с материнской клеткой, без разрыва клеточной стенки последней.

4. Дрожжевая и нитчатая фазы роста изученных грибов p.Candida представляют собой фенотипические формы, способные к взаимному переходу. Обратная трансформация нитчатой фазы сопровождается формированием дрожжевых клеток и их скоплений на нити без распада последней.Особенностью трансформации С.tropicalis являлось §олее

интенсивное формирование дрожжевых клеток по сравнению с С.albicans.

5. Наружные слои клеточной стенки дрожжевой и нитчатой фаа C.albicans и С.tropicalis имеют общие антигенные детерминанты,плотность которых вше у дрожжевых клеток.

6. Белковые профили цитоплаэматического содержимого дрожжевых клеток C.albicans и С.stellatoidea являются гомологичными; не выявлено существенных различий в спектрах белков нитчатой фазы данных видов.

7. Трансформация дрожжевых клеток в нитчатую форму сопровождается уменьшением количества фракций в цитоплазме последней,при этом не установлено появления фазоспоцифических белков нитчатой фазы.

8. Трансформация дрожжевых клеток С.tropicalis в нитчатую форму также приводит к уменьшению количества фракций, но степень гомологии белковых профилей обеих фаз составляла 70%, тогда как у C.albicans и C.stellatoidea - 50%. Основная масса белков цитоплазмы дрожжевой и нитчатой фаз изученных грибов p.Candida фокусируется в зоне pH 5-8.

9. Клеточные стенки дрожжевой и нитчатой фаз C.albicans и С.tropicalis и их маннаны активируют систему комплемента, большую активность прявляют маннаны дроххевых клеток.

101Компоненты клеточных стенок С.albicans,С.tropical is и Sacch.cerevislae обладаит одинаковым активирующим эффектом в отношении системы комплемента, но подобная активация не влияет на судьбу фагоцитированных клеток указанных грибов.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Количественная характеристика редукции нитросииего тетразо-лия нейтрофилами при экспериментальном кандидозе.//Журнал микроб. ,эпид. и иммуи. -1987. -с. 58-59 (соавт.Кубась В.Г..Никифорова H.A.).

2.Способ исключения ложнопаложительных результатов идентификации C.albicans при использований/теста "ростковых трубок". //Микология и фитопатология.-198?!-том21.-с.546-550 (соавт. Кубась В.Г.).

3.Сравнительное изучение антигенного состава дрожжевой и нитчатой фаз С.albicans.//Тезисы Ывжд.снмп.Актуальные вопросы медицинской микологии:заболевания вызванные условно-патогенными грибами.-СПб,1987.-с.29-00 (соавт.Кубась В.Г.,Никифорова H.A.).

4.Влияние компонентов С.albicans на систему комплемента ми-вой. //Материалы Иежд.сямп.Микозы и иммунодефициту.-СПб,1991 (соавт.Кубась В.Г.)

5.Электронно-микроскопическое изучение дрожжевых и мицели-адьных клеток С.albicans к С.tropical is,полученных In vitro и In vIуо//Матер.Иежд.симп.Микозы и иммунодефицит.-СПб,1991 (соавт. Рыбальченко О.В.).

6.Изучение спектров белков цитоплазмы дрожжевых и мицелиаль-ных клеток//Мат.кояф.Актуальные вопросы медицины и биологии. -Днепропетровск, 1992. -с. 40 (соавт.Кубась В.Г.).

7.Способ идентификации С.albicans.-Авт. св.И 1303615.-1986. (соавт.Кубась В.Г.).

Автор приносит благодарность к.б.н. О.В. ч Рыбальченко, ст.я.сотр. Н.Г.Кручининой , д.м.н. А.А.Аравийскому и м.н.сотр. Л.А.Семеновой за оказанную методическую помощь в исполнении данного исследования.