Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение АТР-связывающего участка активного центра ацетил-СоА-карбоксилазы из печени крысы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение АТР-связывающего участка активного центра ацетил-СоА-карбоксилазы из печени крысы"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

ИЗУЧЕНИЕ АТР-СВЯЗЫВАЮШЕГО УЧАСТКА АКТИВНОГО ЦЕНТРА АЦЕТИЛ-СоА-КАРБОКСИЛАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ.

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

АМОНТОВ Сергей Всеволодович

УДК.577.152.3

Москва - 1990

Работа . выполнена в Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта АН СССР

Научные руководители: доктор биологических наук,

Е.В.ГОРЯЧЕНКОВА

, I

кандидат биологических наук, А.Г.Рабинков Официальные оппоненты: доктор химических наук

С.Н.Кочетков

кандидат химических наук, В.И.Тишков

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина АН СССР

Защита состоится /УД.'-гХ^.'З- 1990 г. в часов

на заседании Специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта АН СССР по адресу: 117984, Москва, ул.Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта АН СССР

Автореферат разослан ШСШ--Яг 1

990 года

Ученый секретарь Специализированного /' /)/ С ¿/V _

у/7 - •/"

совета кандидат химических наук '/ -- у А.М.Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время хорошо известно, что биотикзависимые процессы играет существенную роль в метаболизме любой живой клетки. Достигнуты значительные успехи в изучении роли биотинзависимых ферментов в липогенезе, глюконеогенезе, в синтезе пиримидиновых нуклеотидов, аминокислот и мочевины, а также в ряде катаболических процессов.

В основе процессов, протекающих при участии биотина, лежит реакция карбоксилирования. При этом большинство биотинзависимых ферментов в процессе карбоксилирования используют энергию АТР. АТР-зависимый синтез карбоксибиотина (первая1 полуреакция ферментативного процесса):

HCOj + биотинилгЕ + ATP * СО^-Окотинил-Е + ADP + Pj является общим для ферментов, относящихся к группе биотинзависимых карбоксилаз и имеет принципиальное значение в живой природе как процесс, обеспечивавший перенос и включение в молекулу одноуглеродного фрагмента. Это относится и к ацетил-СоА-карбоксилазе, биотинзависиыои карбоксилазе, ферменту, имеющему универсальное распространение в живой природе, что свидетельствует о принципиальной роли в метаболизме процесса, катализируемого этим ферментом. (Ацетил-СоА-карбоксилаза ключевой фермент в цепи биосинтеза лирных кислот.) Ацетил-СоА-карбоксилаза из печени крысы и явилась ■ объектом данного исследования;

АТР-зависимый синтез карбоксибиотина - фундаментальная проблема для биотинового катализа. Однако, со времени доказательства Линеном образования в процессе реакции карбоксибиотина механизм этого процесса остается невыясненным.

Цель работы. Основной задачей данного исследования была попытка приблизиться к пониманию событий, происходящих при АТР-зависимом карбоксилировании биотиновой простетической группы в АТР-связывающем центре ацетил-СоА-карбоксилаэы. С этой целью было предпринято изучение функциональных групп и топографии активного центра фермента методами ингибиторного анализа и, в частности, аффинной модификации, с использованием аналогов АТР, субстрата первой полуреакции, протекающая в АТР-связывающеи участке активного центра фермента, и влияние бикарбонат-иона на процессы инактивации фермента.

Научная новизна и практическая ценность работы. Показано, что о-АТР (высокоспецифический модификатор аминогрупп осуществляет аффинную модификацию АТР-связывающего участкг активного центра ацетил-СоА-карбоксилазы. Установлено, чтс алкилирующие амиды АТР и ADP обратимо взаимодействуя с АТР-связывающим участком активного центра модифицируют группу находящуюся в ацетил-СоА-сяэывающэм участке активного центра Показано , что в результате взаимодействия косубстрата перво: полуреакций - бикарбонат-иона, с активным центром фермента увеличивается реакционная способность групп активного центра являющихся объектом модификации.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи

Объем работы. Диссертационная состоит из введения, обзор литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения выводов, списка цитированной литературы. Диссертация изложена н 60 страницах машинописного текста и содержит 4 таблицы 16 рисунков и список цитированной литературы (75 ссылок).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Аффинная модификация активного центра ацетил-СоА-карбоксилазы

2',3'-диоксо-АТР.

2* ,3'-диоксо-АТР в настоящее время хорошо изучен в качестве модификатора белков и, в частности, аффинного модификатора активных центров целого ряда ферментов. Как было показано в ряде работ, это соединение высокоспецифично модифицирует аминогруппы.

Рис.1. 2',3'-диоксо-аденозин-5'-трифосфат

Таким образом,' благодаря высокой специфичности этого аффинного агента удалось для ряда АТР-зависимых ферментов показать наличие в активном центре функционально важной аминогруппы. Поэтому и в случае ацетил-СоА-карбоксилазы, для которой АТР также является субстратом, было логично изучить взаимодействие этого фермента с 2',3'-диоксо-АТР.

Нами было покэано, что степень инактивации возрастает со временем (рис. 2) и при этом заингибированный фермент не реактивируется при диализе. Это свидетельствует о необратимом

характере ингибирования фермента 2 ,3 -диоксо-АТР.

Из рисунка 3 видно,, что прямые, отражающие зависимость

обратной величины начальной скорости инактивации от обратной

величины концентрации ингибитора, не проходят через начало

координат и отсекают на оси ординат в положительной области

отрезок, соответствующий предельной скорости процесса

инактивации. Такой характер кинетики позволяет сделать вывод о

существовании в процессе модификации фермента начальной стадии,

на которой происходит образования обратимого комплекса фермента с

ингибитором. Величина К^ составила 0.35±0.04 мМ, а константа

-1

модификации (к) 0.11±0.008 мин .

% остаточная активность

Рмс.2. Зависимость активности ацетил-СоА-карбоксилазы от времени инкубации с 2',3*-диоксо-АТР. Концентрация 23'-диоксо-АТР: о - 0.4 мИ; а - 0.2 мМ; • - 0.15 мМ: ■ - 0.1 мМ; + - 0.06 мМ

Рис.4. Влияние ATP (0.5мН>- о; бикарбоната (ЮнН)- в; СоАЗН (1мМ)- о;

I I

на инактивацию ацетмл-СоА-карбоксилазы 2.3-диоксо-АТР. Контроль- +

Важнейший признаком того, что процесс ингибирования имеет аффинный характер, является защита фермента от инактивации субстратом. На рисунке 4 показано влияние субстратов реакции, катализируемой ацетил-СоА-карбоксилазой, на скорость инактивации фермента. CoASAc не влияет на динамику процесса.

Это, очевидно, свидетельствует о том, что 2*,3'-диоксо-АТР в процессе модификации не взаимодействует с областью CoASAc-связывающего участка активного центра, а также о том, что CoASAc не обладает заметным сродством к АТР-связывающему участку активного центра. Бикарбонат-ион ускоряет инактивацию и лишь АТР оказывает выраженный защитный эффект. АТР в данном опыте был взят в концентрации 0.5 тМ (то есть приблизительно 2 1^). Мы не ставили перед собой задачи продемонстрировать полное ЮОХ-ное подавление процесса инактивации, за счет использования насыщающих концентраций субстрата,поскольку при более высоких концентрациях АТР начинает проявляться ингибирование ацетил-СоА-карбоксилазы субстратом.

Таким образом, используя относительно низкие концентрации АТР, мы старались наблюдать кинетику процесса инактивации в чистом виде, избежать наложения побочных эффектов. Тем не менее, если сопоставить продемонстрированный в опыте защитный эффект с расчетным, сответствуюшим данным концентрациям лигандов, который можно вычислить, используя элементарное соотношение для случая конкурирующих лигандов:

(CLE] - относительная (11

Фермент-лиганд; С - ——

lLEJ " сТГ

концентрация обратимого комплекса нормированная концентрация),

то Ыожно сделать заключение, что ожидаемая и полученная в эксперименте величины защитного эффекта достаточно хорошо совпадают (см.таблицу 1). (Под защитным эффектом мы понимали отношение начальной скорости инактивации в контрольном опыте к этой величине определенной в присутствии субстрата). (Поскольку мы исходили из предположения о конкурентности лигандов, то данный результат является дополнительным подтверждением того, что 2',3'-диоксо-АТР является конкурентным по отношению к АТР ингибитором ацетил-СоА-карбоксилазы.)

Таблица 1.

Контроль АТР Защита

О-АТР 0.35 Kj 0.35 Kj

АТР - 2 Kj

II-E1 26Х 11*

IS-EI 0 S9X

IL-EI 262 70%

I - оАТР; 3 - ATP; Е т- фермент Задитний эффект : ожидаемый - 26.XN11X = 2.4 ;

экспериментальный - 2 (33*)

На рисунке 5 представлены результаты, полученные при

з ' 1

исследовании стехиометрии включения. 0-1 Н1-2 ,3 -диоксо-АТР в нативныя фермент. Кинетика включения метки совпадает с процессом инактивации фермента. Эти два процессы развиваются во времени синхронно. Это позволяет с достаточной долей уверенности утверждать, что включение в молекулу фермента 2'3'-диоксо-АТР является непосредственной и единственной причиной необратимой инактивации фермента.

График включения метки демонстрирует также тот существенный

факт, что полной потере активности ацетил-СоА-карбоксилазы

» » _

соответствует включение 1.06±0.08 экв 2 ,3 -диоксо-АТР на субъединицу фермента (240-кДа). Случай, когда максимальное количество включенной в белок метки соответствует 100*-ноя

инактивации и состав ляет^еличину - 1 молекула модификатора на

1 субъединицу, позволяет сделать вывод о том, что модификация имеет" строго аффинный характер (т.е. не идет параллельно неспецифическая модификация), и, таким образом, модификации

подвергается один сайт, находящийся в активном центре.

* *

При изучении' влияния 2 ,3 -диоксо-АТР на перЕую и вторую

полуреакции ферментативного процесса было показано, что • ! 1

2 ,3 -диоксо-АТР полностью ингибирует первую полуреакцию

(ADP/ATP-обмен), и, при этом, модифицированный фермент продолжает

катализировать вторую полуреакцию (CoASAc/CoASMal-обмен)

(Таблица 2). Таким образом, наличие стадии обратимого комплекса

фермент-ингибитор, защитный эффект субстрата первой полуреакции,

АТР, соответствие полной инактивации фермента включению 1 экв 3 1 1

в— [ Н ]—2 ,3 -диоксо-АТР на субъединицу фермента, необратимое ингибирование избирательно первой полуреакции доказывает, что

1 I

2 ,3 -диоксо-АТР является аффинным модификатором АТР-связывающего участка активного центра фермента, не затрагивает биотиновую простетическую группу и оставляет в интактном состоянии ацетил-СоА-связывающия участок активного центра.

Сейчас известно, что в результате взаимодействия

* *

2 ,3 -диоксо-АТР с аминогруппой лизина могут реализоваться различные варианты продукта (Рис. б). Может образоваться малостабильное основание Шиффа с 2 или 3 -углеродными атомами рибозного кольца (1), которое при восстановлении NaBH^ дает стабильное производное. В другом случае реакция сопровождается элиминацией трифосфатной цепочки, при этом образуется либо стабильное конъюгированное основание Шиффа.(2), либо стабильное 4',5'-дидегидро-2',3'-дигидроксиморфолиновое производное (3).

но

ж

о

I 1 ■

Аск

ХУ,

N

I

К

"ОН

О

Ас1е

V ^

И \\ N О I

Я

Ас1е

11

N о

Рис.6. Варианты продукта, образующегося при модификации аминогруппы 2',3'-диоксо-АТР.

Нами было показано, что модифицированный фермент не реактивируется в присутствии триса или 2-меркаптоэтанола в концентрации 0.05 мМ, хотя этого следовало бы ожидать в случае образования производного типа(1).

Ч • 1

При модификации фермента смесью 6-1 Н1-2 ,3 -диоксо-АТР и

32 ' ' 3

а- Р-2 ,3 -диоксо-АТР включение Н составило 1.0 экв на

32

субъеднницу, включение Р составило менее 0.03 экв на субъединицу. Следовательно в результате модификации происходит элиминирование трифосфатной цепочки. Из этих фактов

(невозможность реактивировать модифицирований фермент аминами или

тиолами, элиминация трифосфатной цепочки 2 ,3 -диоксо-АТР в процессе модификации фермента) можно заключить, что в данном

I I

-случае, при модификации ацетил-СоА-карбоксилаэы 2 ,3 -диоксо-АТР, по всей вероятности, образуется конъюгированное основание Шиффа (2) либо морфолиноподобная структура (3).

Таким образом, резюмируя изложенные факты можно сказать

I I

следующее. 2 ,3 -диксо-АТР является аффинным необратимым ингибитором ацетил-СоА-карбоксилазы, з результате взаимодействия с АТР-связывающим участком активного центра модифицирует, по всей вероятности, аминогруппу, находящуюся в этом участке.

ТАБЛИЦА.2 Влияние аффинных модификаторов на стадии

Ферментативной реакции, катализируемой ацетил-СоА-карбоксилазой.

Обмен [ИСШР\АТР 1полуреакция Обмен [14С1СоАЗАс\СоАЗКа1 Иполуреакция Активность ! фермента ! в полной реакции !

¡СИШНрррА 100* <10* <0.3* !

! СШННррА 100* <5* <0.2* |

| о-АТР <0.5* 80* <0.2* !

! Контроль 100* 100* 100* !

Аффинная модификация ацеткл-СоА карбоксилази алкилмруювдмм

амидами ADP к А ТР.

Нами было также предпринято сравнительное изучение взаимодействия ароматических 2-хлорэтиламинопроизводных АТР и ADP (4-(Н-хлорэтил-К-метиламино)-бензйл-г-амиды АТР и ADP) с ацетил-СоА-карбоксилазой. Соединения этого ряда также как и 2',3'-диоксо-АТР неоднократно использовались при исследовании активных центров ферментов в качестве аффинных модификаторов аналогов нуклеотидов. В отличие от 2',3'-диоксо-АТР эти аффинные инактиваторы принципиально иного типа. Их аффинные свойства и модифицирующая функция пространственно разделены. Нуклеотидная часть молекулы выполняет функцию своего рода якоря, а R-Cl-радикал является щупом, который зондирует окружение активного центра и при наличии подходящей группы осуществляет пришивку.

Следует отметить также, что эти реагенты в отличие от 2*,3'-диоксо-АТР парраллельно со' специфической реакцией в комплексе с ферментом расходуются на превращения вне комплекса. Лимитирующей стадией реакции является отщепление иона С в результате внутримолекулярного замещения у атома углерода C-Cl-свяэи с образованием активного промежуточного этилен-иммониевого катиона, причем, эта стадия имеет одинаковую константу как в комплексе так и в растворе.

1 t

И в данном случае, как и в случае с 2 ,3 -диоксо-АТР удалось убедительно продемонстрировать, что оба алкилирующих

агента являются аффинными необратимыми ингибиторами фермента. Из

-1 -1 -1 линейной анаморфозы к„._ от [II ,(мМ ) (рис 7) видно, что

К&Ж

зависимость начальной скорости инактивации от концентрации

Рис.7. Зависимость кахувеяся константы скорости инактивации ацетил-Со Агкарбоксилазы ,кказс' от концентрации аналогов: АТР-аналог (А) и АБР-аналог СБ) в обратных координатах.

Рис.8. Образование этмлениммониевого катиона.

ингибитора имеет гиперболический характер, при этом на оси абсцисс прямые отсекают отрезки храктеризующие степень аффинности ингибиторов(Kj-1 ). В результате были расчитаны значения констант (- 0 .16±0.02 мМ и 1.1 ±0 .4 мМ для аналога АТР и ADP соответственно. к модификации - 0.027±0.002 Ыин"1 и О.45±0.07 мин-1 для аналога АТР и ADP соответственно.)

Таким образом, алкилирующий аналог ADP, обладая существенно меньшим сродством к ферменту имеет значительно более высокую константу алкилировалия по сравнению с алкилирующим аналогом АТР. Величина к для аналога АТР близка к величине константы скорости лимитирующей стадии алкилирования хлорэтилалкилариламинами -ионизация С-С1-связи(к0), определенной для 4-(М-хлорэтил-Ы-метил-амино)-бензил-а-амида UMP(0.023 мин-1). Учитывая, что соединения этого типа нестабильны и подвергаются спонтанному гидролизу по S^j-механизму, можно предположить, что реакция алкилирования ацетил-CoА-карбоксилазы алкилирующим аналогом АТР, вероятнее всего,' поисходит по механизму SN1 через образование промежуточных высокореакционноспособных этилениммониевых катионов, возникающих в результате внутримолекулярного замещения у атома углерода С-С1-связи Рис. 8).

Увеличение максимальнря скорости модификации аналогом ADP на порядок, по сравнению с величиной , связано, по-видимому, с изменением механизма реакции, при котором ковалентное присоединение протекает по S^-механизму без предварительного образования этилениммониевого катиона. Таким образом, можно предположить, что алкилируюшие аналоги АТР и ADP модифицируют одну и ту же группу (хотя и нельзя это утверждать категорически), так как общая' длина аналога ADP по сравнению с аналогом АТР

практически не меняется: размер исключенного из АТР Р02"0-фрагмента (0.28нм) равен длине СН2-СН2-<ррагмента (0.3 нм) химически активной группы реагента при прямом алкилировании амиинокислотного остатка с помощью аналога ADP по Э^-механизму.

Поскольку изучаемые ингибиторы являются аналогами АТР и ADP и, следовательно, способны взаимодействовать с АТР-связывающим участком активного центра, защитное действие АТР вполне закономерно. CoASAc благодаря нуклеотидному фрагменту в его молекуле также мог бы обладать определенным сродством к АТР-связывающему участку активного центра.

Рис.9. Зависимость остаточной активности ацетил-СоА-карбоксилази

—4

от времени предынкуОацхм с С1ИСН> ННрррА, 4*10 N (А) и ClRCH2NHppA, 2"10"2М (Б): 1- в отсутствие субстратов; 2 и 3 в присутствии АТР (1иМ) м СоАЗН (ОЛмМ) соответственно.

Однако отсутствие у даного субстрата, в отличие от АТР, защитных

I I

свойств при инактивации фермента 2 ,3 -диоксо-АТР, как было описано выше, позволяет исключить такую возможность. Поэтому защитный эффект при инактивации фермента данными алкилируюшими аналогами АТР и ADP можно объяснить лишь тем, что располагаясь в АТР-связывающем участке нуклеотидной своей частью модификатор алкилирует группу, находящуюся в области CoASAc-евязывающего участка активного центра фермента. Это было подтверждено при исследовании влияния модификации ацетил-СоА-карбоксилазы на первую и вторую полуреакции, т.е. на реакцию бикарбонат-зависимого [ 14С ЬАБР/АТР обмена и на реакцию [ 14С 1-CoASAc/CoASMal обмена. .Данные по влиянию алкилируюиих аналогов АТР (CIRCHgNHpppA) и ADP (ClRCH2NHppA), в процентах от активности нативного фермента, приведены в таблице2. Оба аналога добавляли в реакционную смесь в концентрациях, практически полностью инактивйруюиих фермент в полной реакции (1 и 10 мМ для аналога АТР и ADP соответственно).

Из приведенных данных можно видеть, что оба аналога, не влияя на первую полуреакцию, практически полностью ингибируют вторую полуреакцию (С14СJ-CoASAc/CoASMal обмен). Это является прямым доказательством локализации модифицируемой группы в CoASAc-евязывающем участке активного центра. Возможно, алкилирование фермента нарушает связь нуклеотидного фрагмента аналогов в АТР-связываютем участке, что приводит в конечном итоге к полному освобождению АТР-связываюшего участка активного центра фермента, чем и объясняется сохранение активности фермента в первой полуреакции фактически в полной мере после модификации. Можно также утверждать, что модификация не затрагивает биотин,

так как в противном случае ингибировались бы обе полуреакции.

Полученные результаты позволяют провести ориентировочную оценку расстояния между местом связывания )-фосфатной группой реагента в нуклеотидсвязывающем участке активного центра и модифицируемой группой в участке связывания СоАЭАс в активном центре карбоксилазы. Учитывая динамическое поведение фермента и лиганда, когда реакционноспособная группа реагента атакует химически активную группу белка в данном, конформационном состоянии, возможно отличающемся от основного, это расстояние можно оценить в пределах 0.6-1.2 нм

Рис.9. Схематическое изображение активного центра ацетил-СоА-карОоксилази.

Влияние бикарбонат-иона на инактивацию ацетил-СоА-карбоксилазы аффинными модификаторами.

Как уже отмечалось выше, нами было обнаружено, что в отличие от субстратов АТР и ацетил-СрА бикарбонат-ион не оказывает защитного действия при модификации ацетил-СоА-карбоксилазы как 2',3'-диоксо-АТР так и алкилируюшими амидами АТР и ADP. Напротив, в присутствии бикарбонат-иона скорость инактивации фермента во всех трех случаях значительно возрастала. Мы предприняли изучение влияния бикарбонат-иона на кинетику модификации фермента. Результаты этих исследований представлены на следующих рисунках. Оказалось, в частности, что бикарбонат-ион практически не влияет на сродство аффинных модификаторов к ферменту, поскольку значения константы ингибирования (К^) расчйтанные для процесса инактивации в присутствии и в отсутсвие бикарбонат-иона совпадают в пределах ошибки (в случае 2',3'-диоксо-АТР значение К^ , видимо, даже несколько ухудшается (см.таблицу 4). С другой стороны, во всех трех случаях происходит увеличение значений констант модификации (к) в присутствии бикарбонат-иона. Так, в... случае 2',3'-диоксотАТР константа модификации (к) в присутствии бикарбоната увеличивается приблизительно в 2 раза (от 0.11 до 0.21. мин-1), а в случае алкилируюших амидов ADP в 1.5 раза (от 0.45 до 0.79 мин-1 ) и АТР даже в 3 раза (от 0.027 до 0.087мин-1).

Таким образом, из кинетического анализа становится ясно, что ускорение процесса инактивации фермента в присутствии бикарбонат-иона во всех трех случаях обусловлена не увеличением сродства

2',3'-диоксо-АТР к ферменту, а возрастанием константы модификации (к), то есть, по всея вероятности, повышением реакционной способности модифицируемой группы ацетил-СоА-карбоксилаэы. Тонкий механизм этого явления не ясен, но это с полной определенностью свидетельствует о том, что роль бикарбоната не сводится лишь непосредственно к карбоксилированию биотина. Взаимодействуя с активным центром фермента, бикарбонат-ион приводит к значительной перестройке активного, центра.

Таблица 4. Значения кинетических констант процесса инактивации для исследованных аффинных кодификаторов в отсутствие и в присутствии бикарбонат-иона (10 мИ>.

К1 (гаМ) к <01п-1> х102

- НСО" - нсо;

о-АТР 0,35±0.04 0.50±0.06 11 21

АОР-ШП 11 ±4 13±2 45±7 79 ±3

АТР-ПС1 0.21±0.03 0.18±0.02 2.7±0.2 8.7±0.8

4-(Н-хлорэтил-И-метилаиино)-бензил-а-амид 1ЖР

[константа ионизации С-С1 связи к0 = 2.3 ' 10~2 (в1п_1)1

Выводи

1.Показано, что 2',3'-диоксо-АТР (высокоспецифический модификатор аминогрупп) осуществляет аффинную модификацию АТР-связывающего участка активного центра ацетил-СоА-карбоксилаэы. При этом в результате модификации отщепляется трифосфатная часть молекулы 2*,3'-диоксо-АТР и образуется стабильное производное (конъюгированное основание Шиффа, либо морфолиноподобная структура). Определены значения констант К^ и константы модификации .

2.Показано, что 4(Ы-хлорэтил-Н-метилаыино )-бензил-г-амид-АТР и аналогичный В-амид ADP являются аффинными, необратимыми ингибиторами ацетил-СоА-карбоксилазы. Обратимо связываясь нуклеотидной частью молекулы с АТР- участком активного центра эти соединения модифицируют функциональную группу, находящуюся в области ацетил-CoА-связывающего участка активного центра, при этом модифицированный фермент сохраняет способность катализировать первую полуреакцию ферментативного процесса (биотинэависимый ADP/ATP обмен). Определены значения констант процесса инактивации. Оценено расстояние между участком связывания г-ф°сфата и ... ацетил-СоА-связывающим участком 0.6-1.2нм.

3.Показано, что роль бикарбонат-иона не сводится лишь непосредственно к карбоксилированию биотина. Взаимодействуя с активным центром фермента бикарбонат-ион приводит к увеличение реакционной способности модифицируемых групп, находящихся в АТР-связывающвм участке активного центра, и в ацетил-СоА-участке активного центра. Определены значения констант процесса

инактивации фермента аффинными модификаторами в присутствии бикарбонат-иона.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Амонтов С.В., Бунева В.Н., Рабинков А.Г., Горяченкова Е.В. Исследование взаимодействия ацетил-СоА-карбоксилазы из печени крысы с алкилирующими амидами АТР и ADP.- Биохимия, 1986, т.53, N.10, с.1654-1659

2. Рабинков А.Г., Позднев В.Ф., Амонтов С.В., Копелевич В.М., Гунар В.И.

Биотинилирование аминов пентафторфениловым эфиром D-биотина. Химия природных соединения, п.З, с.403-408, (1989)

3. Амонтов С.В., Рабинков А.Г.

Ацетил-СоА-карбоксилаза: модификация АТР-связывавшего участка активного центра 2'-3'-диальдегидныы производным АТР.-Мол.биол., 1989, т.23, N6, с.1516-1522

4. A.G. Rabinkov, S.V. Amontov

Affinity labelling of rat liver acetyl-CoA carboxylase by a 2' ,3'-dialdehyde' derivative of ATP. - BBA, 1990, 1013, p.216-220

Черметинформавия, зак.824, тир.100, уч.-издл.0,95, печл.1,5, усл.кр.-оп.1,75, подписано к печати 21.08.90 г.