Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ацетил - СоА - карбоксилаза: изучение субстратной специфичности и регуляции каталитической активности

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Ацетил - СоА - карбоксилаза: изучение субстратной специфичности и регуляции каталитической активности"



ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Великодворская Вера Вадимовна

АЦЕТИЛ - СоА - КАРБОКСИЛАЗА: ИЗУЧЕНИЕ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ И РЕГУЛЯЦИИ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ.

03. 00 03. Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в лаборатории химических основ биокатализа Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Научные руководители: доктор хим. наук А.Г. Габибов

канд. биол. наук А.Г. Рабинков

Официальные оппоненты: доктор хим. наук, профессор С.Н. Кочетков

доктор хим. наук В.И. Тишков

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва В-334, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта.

Защита состоится Диссертационного

часов на заседании совета Д 002. 79. 01 при Институте

часов на заседании

Реферат разослан

Ученый секретарь диссертационного«у1|^а' канд. хим. наук /

А.М. Крицын

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование биосинтеза жирных кислот являлось в течение нескольких десятилетий точкой приложения интересов многих биохимических лабораторий. Это связано, во-первых, с вниманием биохимиков к проблемам регуляции ^ метаболических путей, нарушение которых приводит к тяжелым патологическим состояниям организма и, во-вторых, с особенностями ферментов, принимающих участие в этих процессах и значением их исследования для фундаментальной энзимологии. В последние годы интерес к проблемам метаболизма жирных кислот, с точки зрения медицинской биохимии, сосредоточен вокруг проблемы атеросклероза. Исследование же участников метаболических превращений, отдельных ферментов протекает достаточно равномерно последние двадцать лет. Так, исследование ключевого фермента биосинтеза жирных кислот, ацетил-СоА-карбоксилазы, было начато еще в 70-ые годы. Безусловным успехом • в этой области следует считать обнаружение Линеном образования в процессе реакции кинетического и структурного интермедиата-карбоксибиотина. Эта стадия оказалась общей для всех карбоксилаз и была изучена с помощью ингибиторного анализа достаточно детально. Несмотря на интенсивные кинетические и структурные исследования карбоксилаз, многие принципиальные вопросы функционирования этих ферментов остаются невыясненными. Безусловно, наиболее интересным вопросом, связанным с механизмом действия, особенно in vivo, являются многообразные пути регуляции их активности. Регуляция происходит, как на уровне кинетического механизма, так и на уровне формирования четвертичной структуры фермента, ассоциирующегося в активный полимерный комплекс под действием аллостерического регулятора цитрата. В последние годы было обнаружено, что регуляция активности

карбоксилаз осуществляется также посредством пост-трансляционных модификаций, в частности фосфорилирования.

Цель ц задачи исследования. В настоящей работе предпринята попытка детально исследовать взаимодействие ацетил-СоА-карбоксилазы с субстратом, ацетил-СоА, а также регуляцию активности фермента, а именно установить взаимосвязь полимеризации с процессом фосфорилирования .

В задачи работы входило:

Разработать быстрый и эффективный метод очистки полимерной и протомерной форм фермента.

Установить влияние различных фрагментов молекулы ацетил - СоА на активность ацетил - СоА - карбоксилазы.

Исследовать физико-химическими методами процесс ассоциации ферментативного комплекса.

Исследовать взаимосвязь регуляции активности фермента на уровне полимеризации с пост - трансляционным фосфорилированием молекулы ацетил - СоА - карбоксилазы.

Научная новизна и практическая ценность исследования. В настоящей работе удалось предложить быстрый и эффективный метод получения препаративных количеств фермента, который может быть использован в лабораторных исследованиях, посвященных метаболизму жирных кислот и проблемам атеросклероза.

В работе впервые исследовано взаимодействие фермента с широким набором аналогов ацетил - СоА. Сделаны выводы об участии отдельных фрагментов молекулы в процессе специфического взаимодействия. Показано, что определяющим во взаимодействии ацетил-СоА-карбоксилазы с субстратом является продуктивное связывание ацетильного радикала.

В работе впервые предложен непрерывный метод регистрации ассоциации ферментного комплекса, и исследована кинетика этого процесса.

Выдвинута гипотеза о роли фосфорилирования фермента.в процессе ассоциации протомерной формы. Установлено, замедление ассоциации фосфорилированных форм фермента. . Апробация работы.Материалы диссертации докладывались на:

1. XX конференция ФЕБО, Будапешт 1990.

2. IV школе - семинаре молодых ученых "Перспективные направления молекулярной биологии", Юрмала, 1990 г.

3. 15 съезд МРБА, США, 1994.

Основные результаты диссертации отражены в 4 публикациях. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы.

Работа содержит страниц машинописного текста, рисунков,

схем. Библиография включает литературных источников. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выделение и характеристика Ацетил - £сД - карбоксилазы ¡и

печени крь|СМ-

Выполнение структурно - функционального исследования ацетил -СоА - карбоксилазы требовало значительных количеств, фермента. В связи с этим, на первом этапе исследования нами была поставлена задача усовершенствовать ранее существующие методики выделения.

Методические особенности поставленной задачи требовали получения как полимерной, так и "безцитратной", протомерной формы ацетил-СоА- карбоксилазы. Необходимо было разработать новый метод очистки, который бы позволил получать фермент в короткие сроки, с высоким выходом, при минимальной потере активности.

Для получения протомерной и полимерной форм Ацетил-СоА-карбоксилазы были разработаны 2 варианта метода очистки. В качест-

ве основной стадии для получения обеих форм фермента была выбрана аффинная хроматография на авидин - сефарозе, на которой фермент сорбировался благодаря биотиновой простетической группе. Для получения полимерной формы фермента процесс выделения состоял из пяти стадий (см. рис. 1 ).

Определение изоточки фермента в кислой области обосновало применение анионообменника.. Как заключительную стадию очистки использовали гель-фильтрацию на суперозе 6В, что позволило избавиться от присутствующей в препарате фермента протомерной формы Ацетил - СоА

- карбоксилазы. Итак, как ухе было сказано выше, предложенная на-

ми схема очистки включала следующие 5 стадии:

1. гомогенизация печени крысы

I

осаждение

2. сульфатом аммония до 33% насыщения

аффинная хроматография на авидин-сефарозе

3. элюция 2 мМ раствором биотина

ионообменная хроматография

4. на ОЕАЕ - Т5К 5¥ НРЬС градиент ИаС1 ( 0,1 - 0,5 М )

гельфильтрация

5. супероза 6и РРЬС

Рис 1. Стадии выделения полимерной формы Ацетил - СоА -карбоксилазы.

В результате очистки фермента по предложенной методике, удалось получить гомогенный препарат с удельной активностью 11,6 Ед./мг.

2Ъ0*Ао .

120кАа -

Рис. 2а) СДС электрофорез ацетил-СоА-карбоксилазыв 596 ПААГ. б) радиоавтограмма СДС электрофореза Ацетил-СоА-карбоксилазы.

Как видно из данных, приведенных на рисунке 2, кроме белковой полосы, соответствующей молекулярной массе 230000, на электрофорезе видна минорная полоса с молекулярнолй массой 120000. Проинкубировав гель с [ 14С ]-метил-авидином, мы показали, что обе эти полосы гибридизуются с авидином, то есть обладают биотиновой про-стетической группой (см. рис. 2). Следовательно, минорная полоса, соответствующая молекулярной массе 120000, это фермент, подвергшийся частичному протеолизу в процессе очистки, несмотря на использование нами на всех стадиях выделения, целого ряда ингибиторов протеаз. Полученные данные о протеолитическом расщеплении фермента в ходе очистки, соответствуют имеющимся литературным сведениям по ацетил-СоА-карбоксилазе. Тот факт, что нам удалось свести до минимума число сопутствующих минорных полос и доказать их принадлежность ферменту, по всей видимости, свидетельствует об эффективности и быстроте, предложенный методики.

Для получения протомерной формы фермента применялся второй вариант метода выделения. Как ухе было сказано выше, в отсутствии цитрата фермент крайне нестабилен, что и потребовало, по возможности, сократить количество стадий выделения. При изучении влияния содержания сульфата аммония на активность фермента нами было показано, что в пределах от 20 до 40% насыщения сульфат аммония обладает стабилизирующим действием. Из литературных данных известно также, что протомерная форма ацетил-СоА-карбоксилазы более стабильна в комплексе с авидином. Исходя из этого, предложенная нами схема очистки протомерной формы ацетил-СоА-карбоксилазы включала следующие 3 стадии:

1. гомогенизация печени крысы

I

2. дробное осаждение

сульфатом аммония до 25% насыщения и 40% насыщения

I

3. аффинная хроматография

на авидин - сефарозе элюция раствором 2мМ биотина

Рис. 3. Стадии выделения протомерной формы Ацетил -СоА -карбоксилазы из печени крысы

Здесь следует отметить, что ЮмМ цитрат присутствовал только в буфере при гомогенизации. После первого высаливания мы имели дело только с протомерной, "безцитратной" формой фермента. Более эффективного разделения при использовании стадии осаждения сульфатом аммония нам удалось добиться благодаря тому, что в пер-

вом случае, при 25% насыщения высаливалась полимерная форма фермента ( в буфере для гомогената присутствовал цитрат ), надоса-дочная жидкость отбрасывалась, а осадок разводился буфером без цитрата, при втором высаливании, до 40% насыщения протомерная форма оставалась в надосадочной жидкости, которая затем и наносилась на аффинную колонку.

Таким образом, в результате оптимизации стадий выделения нам удалось получить до 20 мг. гомогенного препарата ацетил-СоА-карбоксилазы, очищенного в 516 раз.

Отличительной особенностью предложенных методик явилась относительная быстрота, один день для получения протомерной и три дня для получения полимерной форм фермента.

Изучение субстратной специфичности Ацетил - £оА -карбоксилазм щ печени крысм ( Ацетил - £оА

связывающий центр ).

В настоящем разделе исследовано взаимодействие Ацетил - СоА -карбоксилазы с последовательным рядом предшественников СоА и их 5 - ацетильных производных, что позволяет оценить вклад различных фрагментов молекулы ацетил - СоА в формирование его субстратных свойств. Следует отметить, что СоА является основной биологически активной формой производных пантотеновой кислоты или витамина В3 . Ряд его предшественников находит широкое применение в медицине.

Субстратную специфичность ацетил - СоА - связывающего участка устанавливали по результатам изучения взаимодействия с ферментом аналогов и предшественников Ацетил - СоА. На рис. 4 представлена молекула ацетил - СоА, нумерация фрагментов молекулы соответствует порядковым номерам исследованных соединений, приведенных в табл 1. Каталитическое превращение исходного субстрата и его аналогов подчинялось кинетике Михаэлиса - Ментен. Для соединений, лишенных

субстратных свойств, сродство к ферменту оценивали по величинам констант ингибирования (К( ) в реакции'синтеза малонил СоА. Было исследовано взаимодействие Ацетил - СоА - карбоксилазы с 9 соединениями. (См. табл. 1 ).

Рис. 4. Нумерация фрагментов молекулы ацетил-СоА, соответствующая порядковым номерам исследованных соединений.

приведенных в табл. 1.

Вещество Субстратные сооЛстаа Ннгнбированне конкурентно« (смешан* нос) (по отношений) к ацетил-СоА) К{, им

Кт. мИ V. •/.

I. Ацетил-СоА II. Дефосфо-ацетил-СоА III. 4'Фосфат S-ацетилпан-тетейна IV. S-Ацетилпантетеин V. S-Ацетилцистеамин VI. Пантетеин VII. 4'-Фосфат дантетеина VIII. Пантотенат кальция IX. 4'-Фосфат пантотената кальция 0,2±0,03 0,3±0,02 2,5±0,4 7,6±1,2. 100 96 15 1,5 + + 5,7+1,1 13,0--2,0 4,0±0,5 (3,15±0,35) (2,20±0,3)

Таблица 1. Взаимодействие предшественников СоА и их Б-ацетильных производных с ацетил-СоА-карбоксилазой печени крысы.

Представленные данные позволяют выявить небходимые условия проявления субстратных свойств " активного ацетата " в случае ацетил- СоА - карбоксилазы. 3' - Фосфатная группа в разной степени важна для взаимодействия с различными СоА - зависимыми ферментами. Известны разнообразные варианты влияния данной группы на субстратные свойства: от абсолютной необходимости для фосфотрансацетилазы из Е. coli, до практически полной нечувствительности у ацетил-СоА

- синтетазы. Как видно из таблицы 1, ацетил - СоА - карбоксилаза печени крыс тоже нечувствительна к отсутствию 3' - фосфата в ри-бозном кольце ацетил-СоА. Ацетил-дефосфо-СоА (II) практически не уступал природному субстрату ни в сродстве, ни в скорости превращения ферментом.

Следующим этапом работы явилась оценка роли всего остатка 3'

- фосфо - ADP для проявления субстратных свойств ацетил - СоА . S

- Ацетилпантетеин ( IV ), как видно из табл. 1, сохранил способность карбоксилироваться. Однако его сродство к ферменту (1/Кя) было приблизительно в 40 раз слабее, а максимальная скорость реакции составляла 1,5% от скорости синтеза малонил - СоА. 4* -Фосфат S - ацетилпантетеин ( III ) также является субстратом ацетил - СоА - карбоксилазы. О важной роли 4' фосфатной группировки свидетельствует существенное улучшение субстратных свойств данного соединения по сравнению с S-ацетилпантетеином, см. табл. 1, выразившееся в трехкратном возрастании сродства и десятикратном увеличении максимальной скорости реакции. Сродство и скорость реакции для 4* фосфата S-ацетилпантетеина были ниже в 10 и 7 раз соответственно, чем у ацетил-СоА.

В качестве минимального фрагмента ацетил - СоА был исследован S - ацетилцистеамин (V), который не проявил субстратных свойств, но конкурентно ингибировал активность фермента. Эти данные сви-

детельствуют о необходимости наличия пантотенильного остатка для продуктивного связывания и каталитического превращения субстрата. О существенной роли ацетильного радикала свидетельствует более чем 20 - кратное различие в связывающей способности ацетил - СоА и СоА. В случае удлинения ацильного радикала ( пальмитоил-СоА ) наблюдалось дальнейшее усиление взаимодействия с ферментом, что свидетельствует о наличии протяженной гидрофобной области в участке связывания ацетил - СоА. Пантетеин и 4* - фосфат пантетеина аналогично СоА конкурентно ингибируют активность фермента. Причем, как и в случае их Б - ацетильных производных, наличие 4* - фосфатной группы существенно повышает связывание. Пантотенат и 4* -фосфат пантотеновой кислоты ингибируют ацетил - СоА - карбоксилазу по смешанному типу. Это свидетельствует о важной роли р-меркаптоэтиламинового фрагмента во взаимодействии ацетил - СоА с ферментом.

Слабо выраженные субстратные свойства ацетилпантетеина позволили оценить его взаимодействие с ацетил - СоА - карбоксилазой по ингибированию карбоксилирования ацетил - СоА. Ацетилпантетеин конкурентно тормозит активность фермента.( К( =5,1+1,4 мМ ). Полученная величина константы ингибирования существенно не отличалась от Кт для аналога. Это дает право рассматривать характер взаимодействия ацетил - СоА и его аналогов с ацетил-СоА-карбоксилазой как соответствующий варианту Ки ; К5 .

Построение температурных зависимостей реакции карбоксилирования ацетил - СоА и ацетилпантетеина дало возможность оценить влияние остатка 3* - фосфо - АБР ( в ацетил - СоА ) на термодинамику взаимодействия с ферментом. При изучении влияния температуры на скорость ферментативной реакции ( рис. 5. ) были установлены границы ее линейности ( в наших условиях 18 - 30° ). Зависимости величин К от ,температуры представлены на рис. 6. Результаты пред-

ставлены в табл. 2.

4,имп/мин 5Ш\— —

3000

то

±

У

1 ' 1 ' ' 1 ' ' 1 ' ' 1 ■ ■ 1 I ' I ■ ■ ' ■ ■ '

lili

О ООооооооо

10 13 16 /9 2?. 25 7Я V VI 17 Рис. 5. Зависимость скорости катализируемой Ацетил-СоА-карбоксилазой реакции от температуры.

Субстрат AG АН AS

ккал/моль ккал/моль ккал/(моль град)

Ацетил-СоА -34 -60,2 -189

Ацетилпантетеин -28 -38 -116

Табл. 2. Термодинамические характеристики взаимодействия ацетил -СоА и его безнуклеотидного аналога с ацетил - СоА карбоксилазой

печени крысы.

10*/т. к"1

Рис.6. Влияние температуры на величины Кв ацетил -СоА ( 1 ) и ацетилпантетеина ( 2 ). Как следует из табл. 2. Ав связывания ацетил - СоА существенно больше ( на 6 ккал. ), чем для ацетилпантетеина. Особенно сильно различаются величины ДН обеих реакций-, что отражает наличие дополнительных участков связывания в молекуле ацетил-СоА, по сравнению с ацетилпантетеином. Полученные данные подтверждают результаты изучения взаимодействия ацетил-СоА -карбоксилазы с аналогами субстрата и свидетельствуют о важной роли нуклеотидного фрагмента ацетил - СоА для продуктивного связывания и ориентации субстрата в активном центре фермента.

Таким образом, проведенное исследование субстратной специфич-

ности ацетил - СоА - карбоксилазы позволило выявить значение различных участков молекулы ацетил - СоА для взаимодействия с ацетил--СоА-связывающим участком активного центра фермента. Повидимому, 3' - фосфатная группа не участвует в связывании субстрата с белком. В целом, роль нуклеотидного фрагмента заключается в правильной ориентации и активации ацетильной группы в активном центре. При этом важная роль в связывании субстрата принадлежит 5' - 3 - фосфату остатка 3' - фосфо - АОР. Пантотеиновый фрагмент обеспечивает доставку ацетильной группы к специфичному гидрофобному локусу активного. центра. Полученнные данные свидетельствуют также о том, что к гидрофобной области, связывающей ацильные радикалы, прилежит участок, специфически узнающий 0 - меркаптоэтильный остаток пантетеина. Посадка ацетата в соответсствуицую область активного центра, вероятно, является определяющей для взаимодействия с ферментом. Связывание остальных структур лишь способствует его ориентации и активации.

Исследование ассоциации ацетил - £аД - карбоксилазы.

В настоящее время нет адекватного„физико - химического метода, позволяющего наблюдать за кинетикой образования активного полимерного комплекса фермента и регистрировать его олиго-меризацию. Важность разработки этого метода для понимания функционирования ферментативного комплекса очевидна. Нами для этой цели предложены методы флуоресцентной спектроскопии и светорассеяния. Протомер ацетил-СоА-карбоксилазы имеет в своем составе 46 остатков триптофана различной экспонированности. В предыдущих исследованиях было показано, что взаимодействие фермента с цитратом сопровождается процессом ассоциации субьединиц фермента. В связи с этим можно было ожидать изменение в спектре флуоресценции фермента, в результате изменения мнкроокруяення молекул хромофора. На рис. 7

представлен спектр флуоресценции Ацетил-СоА-карбоксилазы в отсутствии и присутствии 10 мМ цитрата натрия, после 10 минут инкубации (кривые 1 и 2 соответственно). Наряду с обнаруженными изменениями в .спектре флуоресценции белка ( возрастание флуоресценции при взаимодействии с цитратом ),- нами было зарегестрированно также возрастание светорассеяния системы. Как видно из рис. 8, светорассеяние менялось в минутном временном .интервале после взаимодействия фермента с цитратом. Аналогичная кинетическая кривая была получена .и с использованием эффекта флуоресценции. Это дало основание предположить, что природа этих эффектов близка. Как следует из рис. 8, обнаруженная константа псевдопервого порядка равна 0,16 мин.

Необходимо было подтвердить первоначальное предположение о связи обнаруженных оптических эффектов со структуризацией ферментативного комплекса. С этой целью процесс полимеризации исследован нами и по данным ферментативной активности. Данные по активации фермента под действием цитрата представлены в таблице 3.

300 400 11. ни

Рис. 7. Спектр флуоресценции Ацетил-СоА-карбоксилазы в отсутствии

и присутствии 10 мМ цитрата натрия, после 10 минут инкубации

(кривые 1 и 2 соответственно).

Рис. 8. Кинетика изменения рассеяния света после взаимодействия фермента с цитратом 10 мМ (а). Обработка данных по методу Гугенгейма (б).

Исходный препарат Время инкубации с цитратом ( 10 мМ ) Включение С1 4 имп/мин*

1.Ацетил-СоА-карбоксила-за без цитрата натрия 5 12940

2. - / - 8 18290

3. - / - 18 26020

4. - / - 20 27300

5. -/- 25 26900

6.Ацетил-СоА-карбоксила-за с цитратом Na, 10 мМ. - 32000

• Включение 14 С в реакции : Hj C-C-S-CoA + ATP + Н14 ->

"00С-1 4 CHj -CO-S-CoA + ADP + Р, + Н*

Таблица 3. Активация ацетил - СоА - карбоксилазы под действием цитрата натрия.

Из анализа данных приведенных в таблице 3 следует, что процесс укладывается во временные рамки, обнаруженные в ходе регистрации реакции по флуоресценции и светорассеянию. Следовательно предложенные оптические методы, по всей видимости, могут адекватно описывать процесс активации фермента, состоящий в ассоциации прото-меров, с образованием активной полимерной формы. Секундные и мили-секундные стадии реакции нами не регистрируются. По всей видимости они отвечают 'за стадию связывания фермента с субстратом. При этом в молекуле белка осуществляются конформационные переходы, способствующие полимеризации. Этот процесс происходит значительно медленнее и регистрируется с помощью оптических методов. Наши

попытки зарегестрировать кинетику в секундном интервале, с применением быстрокинетической аппаратуры, не привели к успеху. Скорее всего это связано с очень незначительным вкладом амплитуды быстрых стадий процесса в общий оптический эффект зарегистрированного нами эффекта.

Исследование влияния фосфорилирования на ПРОЦЕСС активации Ацетил - £оА - карбоксилазы.

Как было отмечено выше, процесс регуляции активности ацетил-СоА-карбоксилазы связан с пост-трансляционными модификациями фермента и, в частности, с фосфорилированием. Несмотря на наличие большого числа исследований, посвященных определению сайт - специфичности различных протеинкиназ, механизм влияния посттрансляционных модификаций на активность фермента нельзя считать установленным. Известно, что процесс фосфорилирования может вызвать, как изменение субстратных свойств белка, так и изменить его характеристики при белок-белковом специфическом взаимодействии. В связи с этим нами была выдвинута гипотеза о влиянии посттрансляционного фосфорилирования на процесс активации ацетил-СоА-карбоксилазы на стадии ассоциации. Разработка нами независимых оптических методов регистрации процесса полимеризации позволила использовать этот подход для изучения влияния фосфорилирования на процесс полимеризации и активации фермента.

На первом этапе исследования нами было выбрано несколько протеинкиназ - потенциальных эффекторов ферментативной активности ацетил - СоА - карбоксилазы. ( см. табл. 4.. )

протеинкин'аза Ацетил-СоА-карбоксилаза V К мМ тех ш мкмоль/мин.мг.

1. 4,5* 0,2*

2. Са калмодулин зависимая 4,32 0,30

киназа

3. Казеин-киназа 4,26 0,28

4. сАМР зависимая киназа 2,6 0,31

.5. Киназа С 1,6 1,2

Таблица 4. Кинетические параметры ацетил-СоА-карбоксилазы, измеренные * до и после фосфорилирования фермента рядом протеинкиназ.

Как видно из таблицы 4, сАМР зависимая протеинкиназа вызывает обратимое изменение активности фермента, уменьшая V х . Киназа С вызывает сильное изменение в значениях К_, и V Казеин - киназа

III 1Л в X .

II и калмодулин зависимая киназа оказывают менее значительное ингибирующее влияние на фермент. Представилось также целесообразным проверить кинетику фосфорилирования ацетил - СоА -карбоксилазы различными киназами. Из рис. 9 следует, что за 60 минут при температуре 32°С происходит практически исчерпывающее фос-форилирование фермента.

Рис.9. Фосфорилирование протомерной формы ацетил-СоА-карбоксилазы сАМР зависимой киназой ( 1 ), Са калмодулин зависимой киназой ( 2 ),

казеин - киназой ( 3 ), киназой С ( 4 ). Таким образом, проведенный анализ показал, что исследуемые киназы по разному влияют на активность ацетил-СоА-карбоксилазы. В случае киназы С ( см. табл. 4 ) наблюдается " замедление " ацетил - СоА -карбоксилазы как фермента ( уменьшение ) и " ухудшение " ее

сорбционных свойств ( изменение Кщ ). Известно, что киназа С зависит от действия фарболовых эфиров и может регулироваться действием жирных кислот. По всей видимости, ацетил- СоА - карбокси-лаза может участвовать в механизме обратной связи по отношению к обмену жирных кислот в организме. На следующем этапе нами исследовалось влияние фосфорилирования на процесс ассоциациии. Установление изменения кинетических параметров, в результате фосфорилирования ацетил - СоА - карбоксилазы киназой С, свидетельствуют о

достаточно серьезных конформационных изменениях в молекуле фермента. Мы провели исчерпывающее фосфорилирование фермента кина-зой С. Согласно данным, представленным в на рис. 9 в молекулу фермента было введено до 1,42 моля фосфатных остатков. Данные по исследованию кинетики ассоциации ацетил - СоА - карбоксилазы представлены на рис. 10.

I (а)

уо го зо чо нин.

Рис. 10. Кинетика изменения рассеяния света после взаимодействия фосфорилированной формы ацетил-СоА-карбоксилазы с цитратом 10 мМ(а).

Обработка данных по методу Гугенгейма (б). Обработка кинетических данных по методу Гугенгейма привела к зна-. чению константы псевдопервого порядка 0,02 мин. Сравнение этих данных со значением константы, полученной в предыдущем разделе приводит к выводу о существовании " замедления " процесса ассоциации фосфорилированного фермента. Вместе с 'тем, фосфорилирование, в результате которого происходят сильные конформационные изменения, влияет на кинетические параметры собственно каталитического превращения, изменяя также сродство фермента к субстратам.

Таким образом процесс влияния пост-трансляционных модификаций на активность ацетил-СоА-карбоксилазы имеет комплексный характер.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован метод выделения полимерной и протомерной форм ацетил - СоА - карбоксилазы из печени крысы с использованием аффинной хроматографии.

2. Исследовано взаимодействие фермента с аналогами ацетил-СоА. Ингибиторный анализ показал, что З'-фосфатная группа молекулы ацетил-СоА не оказывает влияния на взаимодействие с ферментом; нуклеотидный фрагмент в молекуле оказывает выраженное влияние на термодинамику взаимодействия данного субстрата с ацетил-СоА-карбоксилазой. Показана важная роль р-фосфатного остатка АБР в связывании субстрата с ферментом. Полученные данные свидетельствуют также о том, что к гидрофобной области, связывающей ацильные радикалы, прилежит участок, специфически узнающий (З-меркаптоэтильный остаток пантетеинового фрагмента СоА. Сделан вывод о том, что определяющим во взаимодействии ацетил-СоА-карбоксилазы с субстратом, являе:тся продуктивное связывание ацетильного радикала, в то время, как отдельные фрагменты молекулы СоА в различной степени способствуют данному процессу.

3. Предложен метод прямой регистрации процесса ассоциации - диссоциации ацетил - СоА - карбоксилазы. Метод основан на увеличении квантового выхода флуоресценции остатков триптофана фермента при олигомеризации фермента. Аналогичные кинетические кривые получены и по светорассеянию.

4. Измерена кинетика ассоциации. Продемонстрировано, что процесс, регистрируемый с помощью флуоресценции адекватно связан с изменением активности фермента.

5. Исследовано влияние фосфорилирования.на активность Ацетил - СоА

- карбоксилазы. Использован широкий набор протеинкин'аз, при этом продемонстрировано, что протеинкиназа С 'вызывает обратимое падение активности фе>рмента, изменяя Vmtx и Кя ; сильное ингибирующее действие на фермент оказывает сАМР зависимая киназа; калмодулин зависимая киназа и казеин зависимая киназы в меньшей степени ингибировали активность фермента.

6. Показано, что фосфорилирование может влиять на процесс

»

ассоциации диссоциации фермента.

Список публикаций по теме диссертации.

1. A.G. Rabinkov, V.V. Velikodvorskaia, V. M. Kopelevich, E. A. Tolosa, V. I. Gunar. Interaction of acetyl - CoA fragments with rat liver acetyl - CoA carboxylase. Eur. J. Biochem. 1990, 193, 351-353.

2. В. В. Великодворская, А.Г. Рабинков, В. M. Копелевич, Э. А. Толоса, Л. Н. Буланова, В. И. Гунар. Изучение субстратной специфичности Ацетил-СоА-карбоксилазы печени крысы. Биохимия, 1990,т.55, вып. 6, 1018 - 1023,

3. В. В. Великодворская, А.Г. Рабинков А. Г. Габибов. Ацетил-СоА-карбоксилаза: Исследования процесса образования активного полимерного комплекса. Доклады Академии Наук, 1993 т. 332, н. 4, 512 - 514.

4. Velikodvorskaia V. V., Gabibov A. G., Rabinkov A. G., Registration of active polymer complex J, Protein Chem. 1994, vol. 13, p. 541.