Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение проводимости плазматической мембраны в ходе клеточного цикла зародыша вьюна

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Изменение проводимости плазматической мембраны в ходе клеточного цикла зародыша вьюна"

ТЗ'ЛЙССК& Г0С5ХАРСТВЗН1М1 УНИВЕРСИТЕТ ■ ИЛ. И. ДлАЗ АДЕЗИДИ

На правах рукопися

ГЕдЗВЛКШЕШ Марина Шотаевна

из:.кзее проводаюсти тзшитаюй

жетлш В ХОДЕ КПЗТОШОГО 1ЩМ. ЗАРОДИЛ *ВЬША

03.00.11 - Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнила, в Институте молекулярной биологии и баодогической физики АН Грузии .

Научный руководитель доктор биологических

наук ВЛ.НШКОВА

Официальные оппоненты • доктор биологически*

наук И.В.ЧЕЛИДЗЕ

кандидат биологцчесыя наук С .Н .ЦАГАРЕЗЩ

Ведущая организация - Институт физиологии им.И.С .Беритадшили АН Грузии •

Защита диссертации состоится " "__1992 г,

в_час. ва заседашш Специализированного совета К 057.03'.г;

Тбилисского государственного университета.

Адрес: 380029.Тбилиси.Университетская 5.2.1г.олог::чгск::Л

С диссертацией могло ознакомься в библиотеке Тбилисского государственного университета.

Автореферат разослан " "_______ 1932 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

канд.йаол.яаук, доцент НЦшК'^р Н.:л.ШШЦЩБ

' ' . • ■' ОВ^.ХаРАКГЕРИСКШ РАНЯН

Актуальность проблемы. Способность к делянки является фундаментальным свойством любой клетки. У яйцеклеток оплодотворение запускает серию быстрых клеточных йиклоз, оббспвчЕвзащах их дробление. Клеточные . циклы у ранних эмбрионов аазкваш простыми, так как в них на происходит увеличения объема цитоплазмы. Считается, что, несмотря на упрощенность раннего клеточного цикла, его контрольные точка те se, что у дрогшей и клеток млекопитающих (ffbiteJcer, Patel, 1990) -- это старт'клеточного цикла, зход a uavoa а выход из митоза. . Старт запускается внешним сигналом -оплодотворением, далее клеточный цикл саморегулируется. Полученные в последнее время д&чныз сви- • детельствуэт о главенствующей.роли белков в регуляыцп клеточного цикла (Maller, КгеЪз, 1980; Arlón, Beach, 1983 ; Rudermwi, buca, 1989; Hunt, 1989; Murray, Kirschner, 1909"). С другой стороны известно, что клеточные циклы у культивируемых клеток зависят от различных факторов среды я, следовательно, опосредованы клеточной мембраной. Исследование процесса оплодотворения продемонстрировало важную роль мембраны в инициации клеточных циклов (Ерэ1, I97Q"Giliot et al., 1990). Однако данных об изменениях мембранных свойств во время самих делений дробления мало. У ряда дробящихся зародклэй, тем не менее, описаны изменения ионных потоков через плдсматдчоск^ v_s!.:á?£= ну и электрических характеристик, синхронный с клетечняч никлом (Woodward, 1968; Квавиладшля и др., 1971; Бескова я др., IS74; da boat, Bluemink, 1974; Payan et ni., 1931; block, Moody, IS34; Medina,-Brejestovski, Г5Бо; 31ock, Moody, 1990). ScXb предпосылка считать, что колебания .мембранных характеристик связаза с язменекля-ма прошщаемоста плазгаатятесках шлфан (лвазадгазалз я IS71; Богкова Я др., 1974; Medina, srejeetovaki, 1933)« С-ДНакО, 2 ?/£<? работ эта изменения была обьясяегш осс'бэгуосглмя глтогллзза, vro p.s имеет прямого от.чоаеалл к регуляол улетев:ого никла (nobimirá, IS6--3,

о

<3е ьааг, в1иег.11л;к, 1374). Таким образом, несмотря на большой кнте-рас-к-изучению эльктраческих параметров мембран развивавшихся зародышей, к настоящему Бремена до конца не ясен механизм колебаний уровня Ш и ионной проводимости плазматических мембран, а такЕб на выяснено их значение для клеточного цдкла. Это делает актуальным дальяейиез изучение мембранной проницаемости в период делений дробления.

Цель д задачи исследования. Целью настоящей работы■было изучение своЗств проводимоста-плазматических мембран в период дробленая бластомеров вьюна а ах связь с.другими параметрами клеточного цикла, в частности с клеточной формой.

Для того, чтобы исключить влияние- цятотощш и мвкклеточншс контактов на,изменения электрически;: характеристик бластомеров, мы использовала кроме нормально дробящихся ошюдотвореяных яйцеклеток вьюна еще и искусственно активированные яйца, в которых из-за от-сутствш пентряола, вносимой обычно в цк'тсплазму спермием, штотом: не происходит. Активирующие воздеаствяя'вьзнваэт начальные измене-, ния яйца, свойственные оплодотворению: Ецдзленэд содержимого кортикальных альвеол, образование перавителлинового пространства, ооплаз; ¡латичесхув сегрегации и'формирование бластодиска (Гинзбург, 1974). По нашим наблюдениям (ск.результатц), после активация яйцеклеток, вьюна пресной зодсй Е'НИх происходят и процессы, аналогичные нормал кому клеточному циклу, внешне-щюявдядцпеея в изменении форш блас-тодиска.

Таким образом, искусственно активированные яйцеклетки ркб мы использовала как 'юдодьяуа сисчвщ дая изучения клеточных циклов, в огсутзтБаи цятотомия.

Друг.км способом устранения цатотоши у клзтрк является обработ ки чгзшш, звзруаащйма веретено деления, например, колхицаном. Б •:-Е;1пх со .асам виге сказанный прд зшолязляи работы нами б'_1ал поста;;-

деан следующие задача:

1, Изучить характер изменений мембранного потенциала (Ш) я явяфаявого сопротивления (й^) з течение первых клеточных. циклов V у оплодотворенных яйцеклеток вьюна;

2. Изучить поведение мембранных характеристик у активированных яйцеклеток вьюна, ллззщях подобный яоршльяому кяеточпкй цикл б отсутствии датотомиа; •

3- Изучить поведение мембранных характеристик у' оплодотворенных яйцеклеток, вдтотомпя которых ингибкровааа'обработкой колхицином; •

4. Провести полок возможной связи аабл2кае:шх изменений с'аз- . мененияш других свойств поверхности, в частности, ее формы а сокр атпмости.

■ Научная новизна. 3 результате нрсзздзнной работы подучена данные об изменениях проводимости плазматической мембраны дробящихся 'и активированных яйцеклеток вьюяа, синхронные с процессами клеточного л "квазиклеточного" цикла. Выявлено,, что циклические изменения мембранных характеристик (МП я Ивх) происходят я в отсутствии цито-, кинеза. Показано, что, несмотря на отсутствие цитокинеза, в активированных яйцеклетках токе как а в норма, происходит изменение формы бластодаска при переходе из-митоза к интер^зб я, наоборот. Впервые показана' связь между мембранными характера с? .жми я лгмоненаяг>-л клеточкой формы. Установлено, что рост ыембраннох'о сопротивления (ЗрХ) совпадает по временя-с уплощением бластодаска (бластоаерсз), а ушнышная В|ВХ - с их округленном. Показано, что изменения торга хаагоз сопровоядазтся лзшяенаягет рельефа. клеточной поверхности. Заядадя» аредполоаенив о связи транспортам свойств пдаз:ла?дпес:«3 мембраны 2 клеточном цикле с организаций яр'^мфашого цато с/слета*

Научно-практическая ценность работ?;. Основная пацзявлеяяоссь работы состояла з проведении гундаксятальяиз: теоретических и з:-:сяог.2~ ментальных исследований межнизкоэ'пер:ю.<1лчсспх яояьЧаая! урсзн?:

МП и ^ у .развдзаэдихся зародкпе£ рыб. Полученные нами результаты могут применяться в научных разработках, посвященных проблеме целенаправленной регуляции нашего развития ливотных, а та:с;в при. чтении спецкурсов по биологии развития. Электрические характеристики плазматической мембраны как критерии, отралаицае физиологическое состояние эмбриональных клеток, могут использоваться для определения .жизнеспособности развдзалдихся зародышей в рыбоводческих хозяйствах.

Мы счатаем, что в процессах слокных заболеваний наряду с белками немаловаяшую роль играет клеточная мембрана и поверхность клетка в целом, которые осуществляют связь внутриклеточных процессов с внеш ной средой» К только после выяснения того, как белки и их модуляторы ззаяшдейсгвуао.' с сигнала1.®, идущими из внешней среды, станет возмогшим разобраться в механизма таких заболеваний,как рак, при которых' нарушается нормальное функционирование рехуляторов и всего клеточного пдоа.

Апробапдя работы. Материалы диссертации догадывались на рабочих семинарах в Институте молекулярной биологии и биологической физики АН Грузна (Тбилиси), в-Институте проблем передача информации АН России (Москва), на УП Европейском эмбриологическом конгрессе > (Израиль, Иерусалим, 1991) и на рабочем семинара в Утрехтском университете (Нидерланды, 1992).

Объем а структура работы. Диссертация изложена на 109 страница; машинописного текста а состоит гз введения, обзора литературе, описания объекта и мотодое исследований, собственных результатов иссле-довашш п их обсут.дзпия, еыводов, списка литературы. .Работа иллюстр: рована 14 графиками а '¿1 фото. Список литературы содерх-дт 159- источников.

Автор варакаэт признательность какд.биол.наук И.Ш.Квэвилашвкли за по!«:одь.:б проведения экспериментов и постоянный интерес к работе.

• ОБЪЕКТ И МЕТОД! ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на*зародышах вьюна, освобожденных от перивитвллиновой оболочки. Зрелую икру вьюна получала я оплодотворение' проводили по известной методике НеВфаха (1Э59). Во всех опытах зародышей инкубировали при 19-214) в отстоянной водопроводной воде, ила в растворе Гольтсюетера двойной концентрации, содержащем 119 Ш N£01, 1.4 Ш Н31, 1.8 Ш СгС12, 2.5 Ш тряс, рН 7.2. Стадии развития.характеризовали временем, прошедшим после оплодотворения, или числом бластомеров. Наблюдения над формой яйцеклеток проводила' под микроскопом Биолам (ЛО'.Ш при увеличении >~12.

Яйца вьюна активировала помещением ях в пресную, отстоянную воду, а обработку оплодотворенных-яиц колхицином проводили следующим образом: через 40 мин. после ошюдотворзняя яйца помещали в раствор колхицина концентрацией I М, приготовленный на растворе Гольт.йаета-ра двойной концентрата а вндоршшали в нем' э течение 1-го часа. После этого яйца отмывали отстоятой водой и в даль пойл ем инкубировали их в воде.

.Измерения электрических характеристик яиц проводила на элеятро-фязиологической системе для внутриклзточньк исследований фирмы "Ехрег1гае1:г1а,[вНР). Дополнительно к система использовала С£"0ИИС9Ц " Епл 1га622.01" (ГДР). Для'внутриклеточные регистрация мембранного потенциала (Щ) а сопротивления нами были, использованы стеклянные макроэлектроды, которые вводили в область ээдтка. Ира пропускании импульсов тока I через один электрод (полярпзуагаИ), другой (отводящий) регистрировали изменение потенциала (и) на сопрстивла-няе, находящемся мззду внутренней частью клетки а нарукнш раствором. Н|эх .вычисляли как -2-

Для наблюдения на поверхность яйцеклетка в РЗН зпроднш я аета-вированяые яйца 'фиксировали в 2%' растворе г лугарадьд * гзда' ( пака,

suitee;ri&nd) • «а солевом растворе Хеякса, ила на 0.15 М качрдилатном буфере'(Волкова а др., 1983). После дегидратирования в увеличивающихся концентрациях ацетона препараты выруливали методом критической точка В аппарате BUCO Critical Point Dryer DX-I (japan), ВысушеН-нив препараты напыляли золотом и просматривали в temscah -100 CxII

МИфОСКОПО (Japan),

Для цитологических исследований яйца вьюна фиксировали жид- . костью Буэна (Ромейс, 1953) а приготавливали серийные срезы толщиной 7-ив, которые опрашивали метиленовым синим - эозином по Манну (Ромейо, 1953).

Часть работы выполнена в Институте проблем передача информация ЧН России (Москва).- -

' РЕЗЛЬТАТЫ ЮСЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСИШШЕ

I. Циклические изменения электрических характеристик мембран дробящихся и активированных яиц вьюна' • При непрерывней регистрации HgX а Щ в развивавшихся яйцеклетках вьюна наия еде раз было подтверждено существование циклических изменений этдх параметров в ходе делений дробления. Период этих, изме нений совпадает с продолжительностью шготлчзского цикла. Как видно' as результатов, представленных на рис.1, уменьшению 'RBX соответствует рост (по абсолютному значению) МП и наоборот. "Изменения в клеточном дасао значительны (1.3-2.5 раза). Рост й^ начинается за 5-10 мин. до появления первых признаков цитокинеза, который совпадает с максимумом Ра^. Во время зазершения цитокинеза начинается умен! шение Е^. Этот фист может быть объяснено тем, что'вновьсинтезировш ная" мембрана в борозде деления обладает более высокой проницаемость! для ионов К^", чо м"пр едсущаствузцая". Однако, рост RBX в 1-ом клеточном никла не штат быть связан с цитокинезом,', т.е. предшествует, ему.

1 8 1 в "м 12 10 в б 4 2 О

1А.

-1---1___' •

-1_!_и

13 26- 39 52 65 78 91 104 117 130

104 117 130 1, мин.

Ряс.1. Циклические изменения (а) я Ш (б) в период 1-Й клеточных циклов дрсбядагося яйца вьюна, инкубированного а подо» Стрелками 1-4 .указали моменты появления борозд дплйния. '

.Что касается колебаний МП, то они происходят яа фоле "общего роста Ш и выраланы слабее. До начала дробления МП равен - 20 мВ и на стадии 0 бластомеров он достигает -50 мВ. " . '

Измерения 5^х в наших опытах проводились в тех условиях, когда о.ба электрода (поляризующий и регистрирувдий) были расположены в желтке. Утверздение, что в этом случае -отражает сопротивление мембран, бластомеров л желтка, включенных параллельно, справедливо аз-за отсутствия барьера проницаемости меяяу бластодиском и келтко;, в связи с неполным дроблением яйца.

У активированных яац так же, как у нормальных наблюдаются цаю ческяе изменения что ке касается МП, то в большинстве случаев '.он оставался на постоянном уровне. Как видно из рис.2, меняется циклически в довольно широких пределах (в 2-6 раза) и его максимум достигает более высоких значений, чем у оплодотворенных яац, в то время как Ш претерпевает незначительные, не периодические изме нения. Лишь в 4-х случаях из более чем. бо' наблюдений мы зарегистри роволи небольшие циклические изменения МП, синхронные с изменениям (рис.3). •

Период циклических изменений активированных яиц в 1-ом и во 2-ом циклах почти совпадает с таковым у оплодотворенного яйца, з последующих постепенно увеличивается:. , Периодические изменения В^ . сохранялись как у оплодотворению так и у активированных яиц, инкубируемых в растворе Гольтфретера двойной концентрации.

Поскольку периодические изменения яабладалирь в наших ош 1-ах в отсутствии цитокинеза, это значит, что процессы клеточного цикла мо.туг омывать прямое влияние на электрические свойства мш паи. По гистологически!.! данным уменьшение проводимости мембран щи ' ходит в штотической части клеточного цикла, а увеличение - в инт -фазе.

м0г1 .л 5 а

и -

пп;*пВ

- 40

-30 -

-20

-10 ■

0

18 36 51 72 90 108 .126 144 1 §2 150

1в 36 54 72 90 108 126'. 144 162 180

■Ь, мин.

Рис.2. Динамика В^ (а) и МП (б) активированного яйца, инкубированного в вода

Обнаруженные ранее периодические изменения мембранных характеристик у зародшей амфибий (чгооа«ага, 1968; 4в Ьад*. в1иатИ*197-1). объясняемые как изменения структуры борозды деления, теюа возюгпо являются следствиями изменений удельных характеристик мембран в клеточных циклах, хотя поправку на влияние структуры бластодерш делать

все равно необходимо.

Действительно, налш электрошюмикр.оскопдчаские данные подтверди дают тот факт, что в каждом клеточной цикле в борозду деления вводятся дополнительные участкл'новообразованноп'мембраны. Она, по-видимому, обладают более высокой проницаемостью а Ш* чеи^вд<глясгауидая* мембрана, поскольку дробленио сопроводаётсд ростом Л1 .а падением йзх, кроме того \х активлревачных яиц (без борозды хвлвшя)

МП, мВ -4Qr

30 60 90 1 2o 150 180 210 240 270 300

Rg„ «Он

л 4

\2 ч

10

8

е

4

2

0 1

-j—i—i-1_* * i _ »_i—i—1_i-a——i—»

30 60 . 90 120 150 18Ö- 210 240 .270 300

t, пин.

Ряс.З. Циклические изменениями (a) (б) активирован-

ного яйца, ¿нкубарсваннего в воде >

Ряс .4. Эквивалентная электрическая схема оплодотворенного яйца '

чем нормально дробящихся в 2-6 раза. Эквивалентная электрическая схема зародыша после 1-го деления с учетом гетерогенности поверхноэ-ти тлеет вид, показанный на рис.4, где Е£ и - ЭЛ.С о и оонроткв-ление "предсуществутащей" мембраны с удельным сопротивлением Е^^Ч а Е2 и Ез -'Э.Д.С. и сопротивление участков "новообразованной'-мембраны с удельным сопротивлением Ь»^4. При достоянном Е^ будет уменьшаться в каждом последующем делении в связи с увеличением площади "новообразованной" мембраны. Наличие Ик в эквивалентной > электрической схеме отражает тот фаг.?, что на граница «-¡езду "првд-сущоствутсщой" и "новообразованной" мембраной формируются влотнш контакты, которые создают дополнительное сопротивление меяду наружной и" внугризародиЕэвой сродой. Если В^ периодически меня&тся в каждом клеточном цикле, то периодически будут изменяться и и МП. Такого рода процессы в борозде деления могут маскировать ала накладываться на изменения удельных.;свойств проницаемости, связанные с прохождением клеточного дакла.' Эта изменения, как следует из пашах дачных, полученных па активированных яйцах, в.Которых мы не обнаружила накатах признаков "новообразованной" мембраны, происходят в "прздсущпствукщей" мембране яйца, но, до-влдимоцу, в нормально дробящихся яйцах ош затрагивает а "нозообразсвандуэ" мембрану тояз .(МеаШа, Вге';|еэ1:о-гак1,-19В8).

Л

■ 2. Изменение формы бластомеров в клеточном цикле • Л его связь с циклическими изменениями

Как известно, у яиц вьюна с момента оплодотворения и вплоть до первых делений дробления, на анимальном полюсе сферического яйца образуется бугорок (бластодиск), высота которого в первые 2-3 часа после оплодотворения постепенно увеличивается (см."Объекты биологии развития")* В процессе первых клеточных циклов форма бластодиска (бластомеров) претерпевает изменения. За 10-15 мин. до начала цитокинеза сферическая поверхность бластодиска (бластомеров) уплощается и принимает форму усеченного сферического сегмента, а непосредственно ".перед началом цитокинеза, или сразу во"время появления его первых признаков бластодиск вновь осферивается я сохраняется .таковым до еле дующего цикла деления. Во время уплощения происходит замедление ско роста увеличения высоты бластодиска, а во время округления - ев увеличение (рис.5). '

При 20-21^ I—os отчетливое уплощение бластодиска наступает на 55-65 мин. цогле оплодотворения, а первые признаки - на "¡0-80 мий. Период между I и П делениями составляет 33-35 мин., а каждое поете-1 дупл ее уплощение бластомеров наступает за 7-10 мин. до начала деления, В целом процесс уплощения бластодиска может быть охарактеризо-( ван как его временное сокращение..

По гистологическим данным 1-ое уплощение приходится на метафа-ву-анафазу 1-го" клеточного цикла,- начало цитокинеза первого деления i на тедофазу-иктерфазу, а завершается датотомия 1-го деления - на ' иатерфазе 2-го клеточного цикла (рис.5). В следующем клеточной цикле наблюдается аналогичная временная связь изменений формы бластомеров

Рпс.5. Изшнацаа форгли йластодаска (бластошров) оплодотворошюго mica

с базами клеточного цикла.

У активированных яиц тог,в происходит процесс обособления бластодиска, а тагаа сохраняются периодические изменения его формы (рис.6). 1-ое уплощение и последующее округление ^происходят одновременно с оплодотворенными яйцами, но затем период изменений заметно увеличивается. 1-ое уплощение бластодиска происходит на 51±5 млн. после активавди, Ы-ое уплощение - на 85±7 мин., Ш-е - на 158±15 мин. Длительность фаз уплощения и огфутления в I периоде составили соответственно 13 и 21 мин., во 2-ом периоде - 24 и 49 мин.

Наш было .проведено сопоставление изменений электрических харак

ч ~

теристик мембран с фазами изменения формы бластодиска (бластомеров) как в оплодотворенных, так и в активированных яйцах. Оказалось, что рост Й£Х у оплодотворенных яиц приходится на период уплощения бластодиска (бластомеров) ,а уменьшение йд -имеет место в фазе округлого бластодиска (бластомеров). У активированного яйца, как и у оплодотворенного, уплощение бластодиска сопровождается ростом R^x' а П9'РЙ°Д его округления я увеличения совпадает с падением Ивх (рис.7). Такую, закономерность мы наблюдали во всех случаях одновременной регистрации электрических характеристик и морфологических изменений.

Мы предполагаем, что изменение форма клетск зародьшой вьюна свя заио с перестройка!.«! кортикального цитоскелета, на реорганизацию которого, в частности, указывает изменение рельефа клеточной поверхности у бластодиска вьюна (см.далее). Какова причинно-следственная связь между изменениями фэрмн поверхности и свойствами проницаемости пока не ясно. Возможно, в мембране делящихся клеток функционируют механочувствительные каналы, которые активируются (инактивируются) •ди растякении (сокращении) поверхности ( Medina, Bre;)estovsk:i.,I988) Вследствие этого в матотической части клеточного цикла происходит торможение пассивного транспорта ионов через плазматическую мембрану, а в ачтерфазе - его увеличение..Кроме пассивно?.' проницаемости

. Чг, мин-

Рио.7. Сопоставление, цикпичосшх изменений с формой

бласюдиска активированного яйцз

"Ь, мин.

Рис.8. Синхронизация циклических изменений Н^ с формой бластомероз (бластодлска) оплодотворенного я:'ша, обработанного колхицином

для ионов в митозе уменьшается и проницаемость для аминокислот (тир-рвг вг а!., 1976; 01азау, Риг1опе, 1981). ВидиМО, в этот период большинство мембранных транЬпортных систем функционирует на минимуме, предохраняя жизненно ванный процесс .от внешних влияний.

• Другая гипотеза состоит в том, что в изменении формы клеточной поверхности (в ее сокращении, формировании выростов) принимает участие процесс полимеризации-деполимеризации актина, сопровождакщоЗся за счет этого изменением осмотического давления внутри клетки (Овгег, Реге1зоп, 1387;сГЬеег вt а1., 1987; гтпеакоу вt а!., 1990). В митозе большая часть актина полимеризована, в то время как в интерфазе деполимеризована. Для ограничения осмотического потока воды внутрь яйца в интерфазе из бластомеров удаляется некоторое количество ионов вдтоплазмы. (для уменьшения осмотического давления), чему способствует увеличение проницаемости мембраны в этот период.

3. Рельеф поверхности у дробящихся-и активированных яиц

Наблюдения оплодотворенного яйца в РЭМ показали различия между рельефом поверхности в области йластодаска и желтком (воЛкоуа в-ь .а!., 1983). Мы исследовали более подробно особенности рельефа в разные фазы клеточнбго цикла и обнаружили, что поверхность яйца перед 1-ым уплощением в зоне бластодиска имеет многочисленные глубокие складки, глубина.и плотность которых плавно уменьшается при удалении от анимального полюса к экватору яйца. Рельеф хелтка был значительно более гладким (даже-практически совсем гладкий), за исключением редких одиночных складок. Временное уплощение (сокращение) бластодиска сопровождается углублением складчатости его поверхности яа аиимальном полюсе, смещением границы между складчатой и гладкой поверхностью блике к ани(лальному полюсу. Так что, граница между складчатой поверхностью бластодиска и гладкой поверхностью желтка отано-

зится более резкой и четко выраженной .Со стороны бластодиска на гра наш появляются необычные группы складок в виде "звезд", а иногда сетей.

При цитотомии вначале в зоне будущей борозды появляются крупны параллельные складки, характерные для сократительного процесса, а потом в области углубляющейся борозды появляется поверхность, которая Имеет более гладкий рельеф, чем наружная поверхность бластомеро я желтка. В самом центре гладкого участка располагается ряд сфериче ких тел, прикрепленных к поверхности и особые образования - рафлы, представляющие .собой ламеллярные образования, оканчивающиеся мшфо-ворсинками. По этим признакам они отличаются от'предсуществущей"

к *

мембраны яйца и, по-видимому,-представляют собой новообразованные в процессе цитотомии участки ( В1иет±пк, <3е Laat, 1973; вогЫ^а et а1, 1983).

Полярные различия поверхности яйца, аналогичные с нормальнц-ми, обнаруживаются и в активированных яйцах, у которых, как ив оплодотворенных, бластодиск формируется под поверхностью, примыкающей-к микропило яйцевой оболочки. Однако, ввиду отсутствия цитотомии в активированных яйцах "вновьсинтезированная" мембрана не образуется, в то время как циклические изменения рельефа "цредсуществующей" поверхности становятся более отчетливыми. Округление и повышение высоты бластодаска в каждом цикле изменения формы сопровождалось частич-ныгл разглаживанием поверхностных складок и появлением на поверхност! яйца сферических образований, или пузырей, как-будто наполненных кид-костью. При уплощении бластодиска число пузырей и сферических складок вновь уменьшается я они становятся более плотными. Выпуклый характер складок был более заметен во втором цикле изменения формы, чем в первом.

Изменения рельефа поверхности, видимо, являются обеим свойство:.: мнтстаческах клеток. Они набладались так::в у дробящихся яйцеклеток

асцидий (satoh, Deno, 1984) и у культивируемых клеток млекопитающих (Sanger, Sanger , I960 ) .

4. Изменение формы и Нвх оплодотворенных яиц, •обработанных колхицином

-5

Тот факт, что в присутствии колхицина в концентрации 5*10 М, полностью блокируется процесс дробления яиц вьюна (Никольская и др., 1967),при сохранении деления ядер, был использован нами для проведения экспериментов с оплодотворенными яйцами, в которых как и при активации должна отсутствовать штото;яш. Параллельно о регистрацией R3x посла обработки колхицином мы наблюдали форму бластодаска (бластомеров).

Если колхицин добавлялся через 40 миа.после ойлодотворения он не блокировал 1-го деления дробления и зародыш достигал двухклеточ-ной стадии. Так ке, как и в нормальных яйцах 1-ое уплощение бластодаска в среднем наступало через 54±5 мин.после оплодотворения, ощ)уг-ление перед первым делением через 63±6 мин., I признака борозды деления появлялись на 74±5 мин. После этого зародыщ. переходил на стадию 2-х бластомеров (80±9 мин.), а далее., несмотря на то, что яйцо после 60-минутной инкубация в раствора с.колхицином отмывали, переход к стадии 4-х бластомеров полностью блокировался. Более того, борозда 1-го деления выпрямлялась и постепенно исчезала (160±-7 мин.) и бластодаск зародыша принимал форму бластодаска недробящегося яйца (IB3t5 млн.), в который после округления вновь уплощался (210*5 мия.Х

>

В отдельных случаях изменение формы- бластодаска на этом прекращалось.;

' у V

Но в большинстве случаев мы наблюдали еще одщ цикл изменений фор- : мы (рис.8).

Параллельно с наблюдением за измэнвнием формы бластодаска (бластомеров) яиц, ш регистрирован; и Э^. Электроды вводили сразу после отмывки колхицина на стадии 2-х бластомеров и измерения прово-1

дили непрерывно в течение 3-3,5 часа.

Как видно из типичных результатов (рис.8), Н^ посла-распрямления борозды, продолжает меняться циклически. Период колебаний или' совпадает с длительностью митотического цикла у нормальных- яиц,' или становится более длинным, как у активированных. Величина Незаметно ниже (в 2-3 раза), чем в оплодотворенных и.активированных яйцах. Из сопоставления изменений Евх с зарисовками формы бластодиска ясно, что в обработанных колхицином яйцах так ке, как и в активированных наблюдается синхронизация изменений электрических и морфологических характеристик. Почти во всех циклах уплощению бластодиска соответствовал рост а округлению - его уменьшение, так что максимум приходился на фазу уплощенного бластодиска, а минимум'- на фазу ок-" руглого бластодиска.

Таким образом, поведение обработанных колхицином оплодотворенных яиц сходно с таковым у активированных яиц. По-видимому, сходство связано с тем, что в том и другом случав клеточные циклы происходят в отсутствии веретена деления. В случае активации веретено деления не собирается из-за отсутствия центриоли," обычно вносимой в яйцо спершем. В случае обработки оплодотворенного яйца колхицином сборке веретена деления препятствует этот агент, вызывающий деполимеризацию тубулина мшфотрубочек веретена (31ис1ег, 1979). Известно,- что в отсутствии веретена деления клеточные циклы могут иметь большую длительность, чем в норме (51и4ег, 1979; Божкова, Чайлахян, 1983).

ВЫВОДЫ

I. Подтверждены ранее полученные данньи (Квавилашвили и др., 1971; Еог-кова и др., 1974), что при дроблении яйца вьюна происходят циклические изменения Евх и Ш с периодом, совпадающим с продолжительностью млтотичоского цикла. В^ изменяется в 1,5-2,5 раза, а Ш - на 10-15 при этом уменьшение 2ВХ соответствует росту Ш и наоборот. Рост Евх в 1-1У клеточном цикла начинаетея за 5-10 минут до

:оязлекия первых признаков борозды деления, гак что цитокинез прихо-гится на максшда RBX> Во время завершения цитотомил начинается рменьшение Р^^, которое цродолжается в интерфазе.

2. Показано, что в-активированных яйцеклетках вьюна происходят тклические изменения ИдХ в 2-6 раза, подобные такозым в оплодотво-)енннх яйцах. Ш в большинстве случаев остается на постоянном уровне . Период циклических изменений в 1-ом меточном цикле совпадал с периодом клеточного цикла у оплодотворенных: яйцеклеток, а

i атем увеличивался в 3-4 раза.

3. В процессе первых клеточных циклов как у оплсдотЕоренинх» гак и у активированных яйцеклеток форма бластодяска (бластометзов) меняется: за 10-15 мин. до начала цитокинеза поверхность уплощается и принимает форму усеченного сегмента, а перед началом цитокинеза или сразу во время появления его первых признаков, бластодяск (бластомеры) ваозь оспариваются и сохраняются такозкми до следующего цикла деления.- У-активированных яйцеклеток перзые две фазы изменений (1-ое уплодение-и последующее огаугление)-происходят одиовремен-но с'оплодотворенными яйцами, но затем период изменений заметно увеличивается.

. 4. Сопоставление фаз изменения мембранных характеристик с фазами изменения формы оплодотворенных и активированных яйц показывает, что ушюдеиие бластоднска сопровождается. ростом а период его округления и увеличения размеров созцадает с падением RgX.

5. По гистологически:.! данным, у оплодотворенной яйцеклетки уп-лощениз бластодиска приходится на метафазу-анафазу клеточного цикла, начало цитокинеза - на телофазу-ьнтерфазу; а завершается пято-тoí,пя на яятерфэзе следующего клаточаого цгисла.

6. Наблюдение поверхаости нормальных и активированных яиц в разные фазы изменения формы бластомеров выявили изменения организа-

ции поверхности, fla всех стадиях поверхность бластодиска, в отличие от г.блтка, шела многочисленные складки, которые углублялись или частично распрямлялись в зависимости от фазы изменения формы клеток. Кроме того, в фазе уплощения на граница бластодиска с аелтком появлялась необычные группы складок в виде "звезд" или сетей, вызванные, видимо, оснащением поверхности бластодиска.

7. В оплодотворенных яйцах, у которых после обработки колхицином был ингибирован цитокинез, сохранялись циклические изменения В^. аналогичные таковым в корме и у активированных яйцеклеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации . , -I. М.Ш.Гедеванипвали, И,Ш,Квавилапвили, ВЛ.Боккова, В.В.Тев-дорадзе. Изучение входного сопротивления и мембранного "потенциала активированных яиц вьюка. Сообщ.АН Грузии, 1990, т.138,№1,с, 143-147.

2«Bozhkova v.P., Gedevanlshvili M.Sh., Kvavilashvili I.Sh. VorcnoY D.Ao Cyclic changes of membrane conductivity in loach eggs

during coil cycles as related to the cell 3hape, Бит. Devel. Biol.

* *

Cong0 EPBC-9I. Jerusalem, Israel, August 11-15, 1991.

3«Bozhkova V.y.j Geaevahishvili M.Sh., Kvavilashvili I.Sh. Voronov 11.Л. Cyclic changas of membrane conductivity in fertilized and activated eggs of teleos.t (Misgurnus fossilis) and their relation ic the cell shape.. Int.. J. of Develop .Biol« {m ргеаз).-

4. М.ПЦ'едеванишвили, ЗЛ.Бошсова, И.Щ.Кваиишвлда. Измезеяпв формы а входного сопротивления. (RgX) оплодотворенных яац, офабвяез них ко.лхацином. Подготовлена к печати в Еурн."Онтогенез1"«

JA ■ Зе^аим

uiw