Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование условий получения межлинейных химер мышей

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Исследование условий получения межлинейных химер мышей"

А К А Д Е м Л Я И А У К СССР ИНСТИТУТ БАЛСЛНИ РАЗВИТИЯ и;/.. Н.К.КОЛЬЦОВА

На правах рукописи

3 У Б И Н Михаил Николаевич

УДК ¿91.392

ЛССШШалЛЕ УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ЖШШНЫХ »МБР ШЕЙ.

Ш.ОО.П - Эмбриология и гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1989

Работа выполнена в Институте биологической физики АН СССР Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Б.Н.Вепринцев Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Н.Н.Ротт

кандидат биологических наук Б.Н.Киндяков

Ведущая организация: Ленинградский государственный университет

Защита диссертации состоится."-//" ¿¡^//^¿¿У?_ 1Ь0Ф

в /У час. на заседании специализированного совета Д0и2.85.01 при Институте биологии развития им.^.К.Колыюва АН СССР по адресу: Н7334, Москва, ул.Вавилова д.26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. К.К.Кольцова АН СССР. Автореферат разослан " /" ¿(¿¿//^2*'

Ученый секретарь спеш;али,зированного совета кандидат биологических наук

Е.М.Протопопова

,i ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Химерные животные, в которых сосуществу-эт^^^ционируют и включены в общую регуляторную систему орга-зизма клетки с разнородной генетической информацией, представ-1яют собой модель, удобную для изучения широкого спектра проб-lew. экспериментальной эмбриологии (Мс Laren, 1976 )-

Повышение 'жизнеспособности в химерах клеток с метаболически-ш и генетическими нарушениями (Surani et al. ,I977;^ennet,I978), i также возможность успешного соединения зародышей различных вдов и получения половозрелых межвидовых химер

позволяет надеяться на создание способных к размножению организмов, в которых сохранена генетическая информация гредставителей исчезнувших видов (Веприниев, Ротт, 1978; IS84). ¡ce эти и многие другие исследования основываются прежде всего ja получении химер.

Основным модельным объектом для изучения приемов и методов создания химерных животных являются, мыши. Использование эмбрио-шв мышей связано с их доступностью и сравнительно высокой стернью изученности, но вместе с тем лимитируется техникой микро-данипуляшй и некоторой сложностью работы с мелкими животными 1ри получении и трансплантации эмбрионов (Дыбан, IS74).

Несмотря на то, что методы получения химер в основном разра-ютаны, используемые подходы не позволяют обеспечить оптималь-1ые пути их реализации. Видимо, это обусловлено не только слож-юстью экспериментов, но и тем, что первые работы по химерам /.ышей появились сравнительно недавно (Tarkowski, 1961; Mintz, l96'¿) , и наблюдается ещё некоторое несоответствие мевду теоре-гическими предположениями и их экспериментальными подгвержде-

ШЯШ .

Исследования отдельных этапов процесса получения химер, та-<их, как микрохирургия, вымывание и трансплантация эмбрионов, :ами по себе представляют значительный теоретический и практи-шский интерес, т.к. необходимы для внедрения результатов экс-шриментальной эмбриологии в практику животноводства, гинекологии и экспериментальной медицины,

Дели и задачи исследования. Цель исследования заключалась в )азрабатке комплекса экспериментальных подходов, оптимизирующих условия восстановления генотипа посредством получения и скрещи-|ания химерных животных.

Работа выполнена в соответствии с плановой тематикой Мнсти-:ута "Длительное сохранение генетической информации, физикохи-шческие основы консервации клеток и клеточных систем/ № гос-

регистрации ¿.28.3.г.1 и по Программе сотрудничества стран-членов СЭВ и СФРЮ по проблеме "Исследования в области биологической физики" на 1S84 - lisöo годы (тема III).

Б соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи: 1) Разработать метод нехирургического (нетравматического) пилучения доимплантационных эмбрионов. 2) Разработать метод -получения химерных эмбрионов, позволяющий работать с ограниченным количеством донорского материала. 3) Разработать метод нехирургической (нетравматической) трансплантации эмбрионов, уменьшающий потери и повреждения при манипуляциях. 4) Разработать устройства для хирургической трансплантации в матку и яйцевод, позволяющие повысить надежность этой операции. 5) Добиться ролщения мышат из химерных эмбрионов, полученных различными способами. 6) Получить половозрелых химер и потомство от них, оценив возможность скрещивания химер между собой и особенности фенотипа у потомства.

Научная новизна диссертационной работы состоит в следующем: I. Экспериментально продемонстрирована возможность реализации генетической информации, посредством получения и скрещивания соответствующих химер, при условии отсутствия взрослых особей данного генотипа в исходном материале. 2. Рйзработаны методы и устройства, повышающие надежность микроопераций, вымываний и трансплантаций эмбрионов. Предложенные подходы позволяют работать с ограниченным количеством донорского материала и повышают возможность реализации генетической информации каждого отдельно взятого животного. 3. Показано, что вне зависимости от способа получения химерных-эмбрионов существует корреляция между числом, стадией развития, взаиморасположением донорских клеток относительно репишентных и $ено.типом химер, не выявляемая при изолированном рассмотрении каждого из условий. 4. Показано расщепление потомства химер на исходные линии и их гибриды. Обнаружено, что расщепление идет в том же соотношении, в каком соотносятся признаки родительских линий в химерах.

Практическое значение. В результате проведенных исследований предложены и нашли практическое применение следующие методы и инструменты: I) ш1етод нехирургического вымывания эмбрионов, пригодный для получения доимплантационных эмбрионов у мелких животных. 2) модификация операционного столика для экспериментальных животных. 3) Тшнцет для нетравматического удержания яйцевода. 4) Микрооперации с зародышами, обеспечиваемые микроинструментами с пневматическими, механическими и жидкоетно-возду-шными фиксаторами для клеток. 5) Способ очистки и стерилизации

стеклянных юлкроинструкентов для манипуляций с бластомерами и способ защиты микроинструментов от механических повреждений. 6) Способ получения химер путем инъекции бластомеров под прозрачную оболочку zona peilucida 7) Устройства для хирургических трансплантаций эмбрионов в яйцевод и в матку. 8) Нехирургическая трансплантация эмбрионов, осуществляемая на основе разработанного комплекса приспособлений. Предложенные методы использу-отся в Институте биологической физики (ИБФ) АН СССР (Пущино), '¡нституте экспериментальной медицины (НЯйЭМ) АМН СССР (Ленин-?рад), Институте криобиологии и нриомедииины (Ш1К и К) АН УССР Царьков), Зоологическом институте (ЗИН) АН СССР и Институте шушерства и гинекологии (НАГ) АМН СССР (Ленинград), ВНИИФБ и 1 с-х животных (Боровск), институте исследования позвоночных швотных (Берлин, ГДР), Институте молекулярной генетики (ИМГ) ЮАН (Прага, ЧССР).

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертации были доложены на Всесоюзном рабочем совещании по консервами генетических ресурсов, г.Пущино, 1985 г., на II Всесоюзном ювещании по морфогенетически активным веществам "Морфоген-2" '.Пущино, 1988 г., на 24 международном симпозиуме по биомоделям 988 г., ЧССР, и на Всесоюзном рабочем совещании "Создание ге-етических коллекций лабораторных животных", 1989 г., г.Пущино.

Публикации. lio результатам диссертации опубликованы 7 и ринято в печать 3 работы в виде статей и тезисов докладов. Поучено 3 авторских свидетельства на изобретения СССР и 10 удос-оверений на рационализаторские предложения.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из вве-ения, обзора литературы, описания методов исследования, экспе-иментальной части, обсуждения результатов, выводов. Список итируемой литературы состоит из "ZVO ссылок: SO на отечествен-ые и й/0 на зарубежные источники. Работа изложена на ¿58стра-дцах, включая 38 рисунков и 26 таблиц.

КРАТКОЕ СОДьРлСАШЕ РАБОТЫ.

Известно, что на доимплантапионных стадиях развитая возможно 5ъединение различных по происхождению эмбрионов млекопитающих единый зародыш, из которого можно получить половозрелую хи-зрную особь (Мак-Ларен, I97S). Известно также, что в тех слу-аях, когда прямая межвидовая трансплантация эмбрионов неосу-зствима, её можно провести с помощью создания межвидовых химер Rossant, Chapman,1983; Fehilly et al,1984; Meinecke-Tillmann, Meinecke, 1984 ).

В связи с этим было высказано предположение о возможности использования химер для восстановления редких и исчезающих видов (Беиринцев, Ротт, 1^78; 1984). Экспериментальная проверка этой гипотезы определила цель данного исследования.

В результате удалось показать возможность восстановления популяции при отсутствии взрослых особей данного вида в исходном материале. Однако, для этого необходимо было значительно изменить существующие подходы. Уничтожение донора при вымывании эмбрионов, тяжелые полостные операции при трансплантации, большой расход эмбрионов при агрегации и инъекши недопустимы при работе с особями ценных видов.

Потребовалась разработка щадящих (нехирургических) подходов и создание комбинационного метода получения химер (рисЛ: III), что в совокупности позволило экспериментально осуществить полный цикл реализации генетической ин(|ормаши, пригодный для'последующей работы с редкими и исчезающими видами животных.

Только оптимизация всех процессов получения, трансплантаций и микроопераций эмбрионов; получение и скрещивание химер с расщеплением на чистые линии позволили объединить найденные пути в единую схему (рис.1).

Рис Л Экспериментально реализованные пути получения межлинейных химер из различного исходного материалам, б, в, г, д-уро-вни экспериментальных исследований:а) подготовка исходного материала, о)шлучение интактных зародышей, в) проведение микро-

шераций, г) получение химерных эмбрионов, д) получение химер-шх животных; 1, II, III - способы получения химер: 1-агрегаии-)нныи, il-инъекшонный, Ш-комбинашонный; 4. - скрещивание хилер, 2 - расщепление в потомстве химер на исходные линии и их "иориды, 3 - получение особи с геномом, идентичным геному ис-содного материала (зародыша), 4 - восстановление популяции при условии отсутствия взрослых особей данной линии (вида).

I. Объект и методы.

Работу проводили на доимпланташонных эмбрионах инбредных шний мышей, в лаборатории биофизики клетки ИБФ АН СССР г.Пущи-ю. Часть экспериментов по диссоциации эмбрионов на отдельные >ластомеры, культивированию и инъекции была начата совместно с ¡отрудниками отдела эмбриологии ШЙЭМ АМН СССР, г.Ленинград.

Микроинструменты изготавливали самостоятельно. Микрооперации ipсводили с помощью микроманипулятора фирмы "Лейти" и микрома-шпулятора КМ производства ОКБ БГ1 г. Пущино.

Для получения, культивирования и трансплантации эмбрионов шределенных стадий развития, синхронизации самок-доноров и ре-ушиентов применяли классические подходы (Gates, I97I; Daniel, ,ъ71; Дыбан, Lb74), видоизменяя их на основе получаемых резуль-:атов с учетом поставленных задач.

'при получении химер пользовались как агрегаиионными (Tarkovski, 1961; Ivïintz, 1962 ), так И инъекционными (Gardner,1968) (етодами, в зависимости от условий эксперимента, сочетая их с сирургическими и нехирургическими трансплантациями.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с юмощью критерия Стьюдента. Доверительный интервал для Р=0,95.

II. Получение интактных зародышей.

Эмбрионы ранних доимплантапионных стадий развития (I-2-й [ень беременности) получали из яйцеводов хирургическим способом, '¡орулы и бластоиисты на 3 - 4-й день беременности вымывали из »атки. В этом случае удалось реализовать два подхода - хирурги-1еский и нехирургический. Очевидно, что широко распространенный 1 настоящее время хирургический способ абсолютно неприемлем для юботы с ценными животными. Для получения нескольких эмбрионов фиходилось убивать самку-донора. При этом никаких гарантий в ?ом, что эмбрионы будут действительно получены, не было, т.к. iacTO самка оказывается ложнобеременной (Табл.1). Кроме того, юлучение эмбрионов от разных доноров вносит существенную нео-феделенность в экспериментальный материал.

^днако, опыты по нехирургическому получению эмбрионов про-:очным двухканальным способом ( кгаетаг, 1983) (Рис.2а) пока-¡али, что в 1э/ь случаев самкам-донорам всё равно наносятся пов-

реждешя (табл. 1а), а кроме того, наблюдались потери эмбрионов в большом количестве промывной среды на выходе из первикального отверстия в вагину.

Для того, чтобы уменьшить вероятность повреждения половых путей (табл. 16), упростить операцию и предотвратить потери эмбрионов, был предложен одноканальньй двухтактный способ, сущность которого заключается в том, что в матку вводили лишь один тонкий перфорированный по всей поверхности эластичный катетер (рис.26), через который промывную среду сначала подавали, а потом отсасывали вместе с эмбрионами. Находящиеся в это время в роге матки в неприкрепленном (доимпланташюнном) состоянии эмбрионы устремляются вместе с промывной жидкостью через ближайшее к ним отверстие в катетер.

Рис.2 Устройства для нехирургического вымывания эмбрионов из матки: а) проточным двухкзнальным способом (Кгаетег, 1983): 1-кате-тер для подачи промывной жидкости, 2-катетер для сбора среды с эмбрионами, 3-насадка для синхронной подачи и сбора среды, 4-вход в половые пути (первикальное отверстие), ¿-стопор, предотвращающий погружение катетера для сбора среды с эмбрионами в матку; б) одноканальным двухтактным способом: 1-основная трубка-катетер, 2-рабочлй конец катетера (вводимый в половые пути), 3-отверстия на рабочем конце (300-400 мкм 0), 4-передняя часть рабочего конца, о-расшрящаяся средняя часть катетера, 6-ыягкая резиновая трубка, 7-шарообразная камера, 8-поршень шприца.

Таким образом, за счет создания замкнутой системы с оптимальной траекторией движения потоков промывной жидкости в полости рога матки удалось предотвратить потери эмбрионов; обеспечить асептические условия; практически полностью исключить повреждения половых путей и получать до 5 эмбрионов из каждого рога матки при естественном спаривании и более 10 - при суперовуляции (табл. 16).

Таблица I. Эффективность нехирургического вымывания доимп-ланташонных эмбрионов различных линий мышей: проточным двухканальным (а) и одноканальным двухтактным способом (б).

общее эмбрио- среднее кол-во эмбрионов, по-

кол-во нов нет „^пр лученных из одного рога матки

опера- (кол-во дри пРи естествен-

шй операц.) овуляши ном спаривании

а б а б а б а_б_а_б_

■7CR JU 25

CBIi/A 6U 60

СВА/^ас 4о 50 Со7ВЛ<6 35 55 GBA/Co7Bi/6 35 60

11 10 4 U 1У 23 9 0

12 16 4 0 14 14 6 0 19 18 6 0

7(3-11) 8(3-13)

7(2-13) 7(2-11)

6(3-10) 5(2-10)

5(3-12) 6(3-11)

6(2-11) 7(2-12)

3(1-4) 3(1-5) 2(1-3) 3(1-4) 3(1-4) 2(1-3) 2(1-3) 2(1-4) 2(1-4) 3(1-4)

ИШЮ: 195 250 75 81 29 0 6(2-13) 7(2-13) 2(1-4 ) 3(1-5) В скобках указаны предельные значения.

Проведение нехирургического вымывания морул и бластоиист позволило получать эмбрионы от одних и тех же доноров, не уничтожая их, и таким образом повысить возможность реализации их генетической информации.

II. Микрооперации in vitro по получению химерных эмбрионов.

К манипуляшям по получению химерных эмбрионов относятся следующие операции: культивирование in vitro; снятие прозрачной оболочки zona peliucida; диссощашя эмбрионов на отдельные клетки или конгломераты клеток;инъекшя (введение) бластеров зародыту-решпиенту; агрегация (соединение) бластомеров.

Существующие способы создания химерных эмбрионов требуют засхода большого количества эмбрионального материала.Было проанализировано 28 вариантов агрегации (табл.2)(рис.1: 1), опро-5овано четыре независимых способа приведения зародышей во вза-шодействие (рис.3). В результате (табл.2) было получено 3745 ¡грегашонные пары и показано, что эффективность агрегации в ¡реднем составляет от 9 до 16$ и зависит от стадии развития ¡оединяемых эмбрионов: лучше всего агрегируют зародыши 4-х -i-миклеточной стадии развития, несколько хуже 2-хклеточные и юрулы, практически отсутствует агрегация бластоиист; лучше дет агрегация эмбрионов, синхронных по степени развития. Ре-■удьтат операции не зависит от количества соединяешх клеток.

Такая низкая в целом эффективность агрегации объяснима, так :ак часть эмбрионов дефектны изначально,часть гибнет при куль-

Таблица '¿. Эффективность получения химерных эмбрионов путем йгрег-аиди: синхронных (а) а асинхронных (б) по срокам развитая зародыше^; одного эмбриона с частью другого (в).

на-рп— ант стадия ■ развития эмбриона решхшен. стадия развития эмбриона донора кол-во донорских клеток кол-во пар донор-ре-пи пи ент кол-во химерных бласто-шст ДОЛЯ В.% химерных блзстопист

1. 2 кл. 2 кл. 2 291 41 14 + 3,9 %

4 кл. 4 кл. 4 186 30 16 + 5,1%

о. Ь кл. 3 кл. 8 14и2 260 19 + 1,9 %

4. 16 кл. 16 кл. 16 На 17 1о + 6,6%

0 . морула морула цела я 119 9 8 + 4,'

0. 7. поздняя корула 6 лас то-шста поздняя морула бласго-писта пелая целая 90 74 I 0 1 0% + 0,9%

а) ЭТОГО: 2277 363 16 + 1,5%

0. 2 КЛ. 4 кл. 4 86 12 1э + 7,6 /ь

ъ. 2 кл. 8 кл. 8 95 11 12 + 6,4%

10. 2 кл. 16 кл. 16 84 8 9 + 4,9%

11. 2 кл. морула целая 68 2 3 + 2,6%

12. 4 кл. 8 кл. 8 76 12 16 + 8,2%

и. 4 кл. 16 кл. 16 47 7 14 + 8,0%

14. 4 кл. морула целая 81 3 4 + 3,3%

10 . 8 кл. 16 кл. 16 109 15 14 + 6,2%

16. Ь кл. морула целая 79 4 5 + 3,6%

17. 16 кл. морула целая 86 2 2 + 1,7%

б) ИТОГО: 805 76 9 + 1,7%

16. 4 кл. 4 кл. 1 71 7 10 + 6,9%

19. 4 1\Л. 4 кл. 2 44 5 11 + 9,2%

2и. 4 кл. 4 кл. 3 69 6 9 + 6,3%

21. 8 кл. 8 кл. I 38 4 II + 9,9%

22. 8 кл. 8 кл. 2 52 8 15 + 9,7%

23. 8 кл. 8 кл. 3 70 10 14 + 8,0%

24. 8 кл. 8 кл. 4 88 14 16 + 7,6%

2а. 8 кл. 8 кл. 6 66 8 12 + 7,8%

26. 16 кл. 16 кл. 2 40 4 10 + 9,2%

2?. 16 кл. 16 кл. 4 53 4 8 + 7,3 %

28. 16 кл. 16 кл. 8 72 8 11 + 7,2%

в) ИТОГО: 663 78 12 + 2,5%

8 ОБЩИЙ ИТОГ: 3745 517 14 ± 1,12

жировании, часть при снятии прозрачной оболочки, значительная часть пар так до конца и не соединяются в единый зародыш в силу целого комплекса причин ( скачки температуры, рН, микросотрясения и т.д.), и наконец, большая часть зародышей останавливается в развитии при культивировании без прозрачной оболочки.

Рис.3 Схема соединения эмбрионов для обеспечения процесса агрегации а) агрегация на плоскости с помощью микроинструментов; б) агрегация в лунке; в) агрегация с помощью стеклянных микроколеи; г) агрегация в капле среды за счет сил поверхностного натяжения; стрелками показаны направления возможных движений.

Проведенные исследования инъекционного способа (рис.1: II) показали (табл.3), что эффективность его составляет в среднем 58%. При этом, в противоположность агрега-шоиному методу, практически не сказывается стадия развития соединяемых клеток, синхронность или асинхронность по степени развития. В то же время наблюдалась зависимость от количества инъецируемых клеток. Видимо, это объясняется тем, что полость, б которую проводится инъекция ограничена, а попавшие внутрь реиипиентного эмбриона донорские клетки уже не могли выйти из него, они оказывались в окружении реыипи-ентных клеток, что резко увеличивало площадь контакта и элиминировало всю массу случайных факторов расхождения бластомеров.

Но инъекционный метод оказался неизмеримо сложней агрегашо-нного. Получение полноценных донорских клеток затруднено, оно представляет собой многоступенчатую процедуру, включающую столь сильные воздействия, необходимые для разрушения прочных межклеточных контактов эмбрионов поздних стадий развития, что расход донорского материала в итоге был очень большим.

Наши попытки внести некоторые усовершенствования привели к тому, что был создан ряд микроинструментов, повышающих надежность микроопераций (рис.4). Кроме того, была обнаружена возможность инъекции донорских бластомеров в реиипиентный эмбрион на более ранних стадиях развития, чем бластошста (рис.5) и показано, что введенные иод прозрачную оболочку Zona peilucida чужеродные бластомеры способны приникать участие в формировании нормального зародыша (рис.1: III).

Таблица о. Э^ектавносгь получения хакерных эмбрионов путем инъекции донорских клеток в полость бласгошсты.

число

стадия кол-во ч,0„п ПГ1Р_ кол-во кол-тш

развития клеток ^„прян тх повревд., эмбрионов

эмбриона инъеш- погабтх, потерявших

донора руемых ^иоуионов неразвив. донорские эморионов

._эмбрионов клетки

4 КЛ. 1 60 18 9 33 (66-12,6%)

4 кл. 2 61) 24 ID 21 (36±12,Г/о)

8 кл. 1 7 U 14 12 44 (63±11,3%)

8 кл. 2 7U 16 12 42 (60±11,6%)

8 кл. 3 76 23 14 38 (оХ±П,3%)

8 кл. 4 76 28 22 25 (33±10,6%)

16 кл. 2 60 S 3 48 (8и-Ю,1%)

16 кл. 4 6U 3 6 4э (?6±lu,S%)

16 кл. 8 60 18 16 27 (4о±12,6%)

морула меньшая часть 46 7 4 34 (76±1г,6/0)

морула большая часть 70 26 14 31 (44±П,6%)

бласто-циста 1-2 кл. ВКМ оО 6 3 42 (84±10,2%)

бласто-циста меньшая часть ВКМ 60 8 6 47 (?8±10,э%)

бласто-циста большая часть ВКМ SO 26 18 46 (61±10,3%)

ИТОГО: S06 230 Ь 2 о 23 (о8 ±3,2%)

В скобках указана доля в % от кол-'ва прооперированных эмбрионов

Рис.4 Микроинструкенты для операций на доимплантацион-ных эмбрионах: а) присоска; б) инъектор; 1-демпфирующее отверстие (жидкостно-воздуш-ный клапан), 2-иневматичес-кий держатель, 3-механичес-кий держатель.

Рис.о Химерный эмбрион, полученный путем инъекции 2-х бластомеров восьмиклеточной стадии развития под прозрачную оболочку четырехклето-чного эмбриона: 1-донорскае клетки, 2-решши-еншый эмбрион, 3-прозрачная оболочка Zona pellucida.

межклеточные контакты на ранних стадиях дробления ещё не зочны, поэтому легко получать отдельные бластомеры, не нанося < повреждении.

Путем инъекции 3-х бластомеров воськиклеточной стадии разви-1я под прозрачную оболочку ьосьмиклеточных зародшей было про-1ерировано ¿40 зародышей, из которых развитие i37 (40%) химер-1ъ эмбрионов было прослежено до стадии бластошсты. Провели >1 инъекиию j-x бластомеров 16-тиклеточной стадии развития под юзрачную оболочку эмбрионам '16-тиклеточной стадии, из которых звилось в культуре до бластошсты 143 (оо%) хикершх эмбрио-IB. Под прозрачную оболочку четырехклеточных эмбрионов инъеш-вали различное количество донорских бластомеров как синхрон-х, так и асинхронных по степени развития с решпиентными абл.4).

Таблица 4. Эффективность получения химерных эмбрионов путем инъекции бластомеров различных стадии развития под прозрачную оболочку zona peiiucida 4-хклеточшх эмбрионов.

адия развития „5™?!! кол-во

'ориона донора ЛЖС °ваншх"" химерных

клеток эмбрионов бластопис

4 кл. I 40 26 (65 + 14,8%)

4 кл. а 5U 10 (20 + II, 1/о)

4 кл. 3 20 0 ( 0%)

8 кл. 1 оЗ 29 (55 + 13,4/6)

8 кл. 2 о 26 271 (52 + 4,3%)

8 кл. 3 69 28 (41 + 11,6%)

8 кл. 4 30 4 (13 + 12,0%)

а кл. 0 20 1 ( 5 + 4,9%)

8 кл. 6 20 0 ( 0%)

16 кл. 1 45 26 (о8 + 14,7%)

16 кл. 2 64 37 (¿8 + 12,1%)

16 кл. 4 74 41 (оо + 11,3%)

16 кл. 8 26 2 ( 8 + 7,1%)

16 кл. 1U 20 0 ( 0%)

жобках указана доля в > от кол-ва прооперированных эмбрионов

Из таблицы 4 видно,что: Г)эффективность такого подхода колемся от О до 65% в обратной зависимости от количества инъеии-мкх клеток; 2) нет зависимости от стадии развития и степени хронизавди донорских и реципиентных клеток. Соединение (аг-ашя) бластомеров ранних стадий и дальнейшее развитие химер-

ных эмбрионов идет в оптимальных условиях (под защитой прозрачной оболочки), что позволяет ограничить количество донорского материала и провести -трансплантацию-сразу после микрооперации. а при необходимости проконтролировать развитие химерных зародышей in vitro довольно длительное время.

Таким образом, предложенный метод за счет инъекции, проводимой на эмбрионах ранних стадий дробления, дает возможность в несколько раз по сравнению с. известными сократить количество используемых донорских клеток.

1У. Трансплантация эмбрионов.

Трансплантацию эмбрионов 2-х-, 4-х-, 8-ми- и 16-тиклеточной стадии развития проводили в яйцевод хирургическим способом.Мо-рулы и бластоцисты пересаживали в матку как хирургическим, так и нехирургическим способом. Проведенный сравнительный анализ полученных результатов показал, что хирургические методы не позволяют обеспечить сохранность реципиентов. Проведение полостных операций с нанесением серьс^иыл травм на мелких животных сказывается особенно тяжело. В случае неудачи мл фактически теряем реципиента вместе с пересаженными эмбрионами. Поэтому было уделено особенно много внимания разработке нехирургического метода.

Однако попытки провести нехирургическую тра'нспланташю по принципу микроинъекшй (llarsk, Larson, 1971; Moller et al., 1979) окончились неудачно. Оказалось, что: а)эмбрионы теряются из открытого конца инъектора; б) пузыри воздуха, играющие роль "пробок", не надежны, а кроме того, они,как и большое количество культуральной среды, которая при такой операции неизбежно вводится в рог матки, стимулируют спонтанное абортирование. При этом струя жидкости подается под давлением, а полость матки столь мала,что под действием тех же самых сил эмбрионы вымываются из матки. Кроме того,изготовить микроскопическую инъекционную иглу из мягкого материала невозможно, а крупная или жесткая неизбежно приводит к травмам половых путей.

Поэтому был предложен иной способ нехирургической трансплантации, основанный на принципе прямого механического переноса зародцшей в матку. Это удалось осуществить за счет создания эластичного микрокатетера с внутренним подвижным стержнем(рис. 6) .Эмбрионы,'помещённые в выемку боковой части стержня(рис.ба), оказываются внутри закрытой со всех сторон камеры (рис.66).Для того, чтобы провести трансплантацию, достаточно поместить рабочий конец катетера на дно рога матки и,выдвинув стержень,вы-

авести из камеры эмбрионы (рис. 6в). Для того, чтобы облегчить зботу, рассмотренное выше устройство было дополнительно моди-лиировано (рис.7), что позволило уменьшить диаметр вводимого в зтку катетера до 200 мкм и сделать его ещё более эластичным.

Рис.6

Устройство для яехирургияее-кой трансплантации: а) укладка эмбрионов в камеру; б)эмбрионы в камере, которая полностью закрыта; в) вывод из камеры эмбрионов; 1-эластич-ная трубка катетер, 2-сплош-ной гибкий стержень, 3-камера для эмбрионов, 4-шарообразный конец стержня, 5-риска, 6-за-щитная трубка, 7-эмбрионы.

ОбЭу^вр—.... 3-1 Рис.7

"' ^ - Устройство для нехирургичес-- кой трансплантации (усовершенствованное) : 1-эластичная

трубка катетер, 2-гибкий стержень, 3-внешняя напра^-ляющая,4-внутрен-яяя направляющая, о-камера для эмбрионов , 6-шарооб-разный конец стержня, 7-резиновая трубка, 8-суженная

сть внешней направляющей, 9-отогнутый конец направляющей, 10-окладка, 11-наружный боотик катетера, 12-кольцевые расширения -резиновая трубка, 14-эмбрионы.

Таким образом, удалось устранить потери эмбрионов, попадание половые пути воздуха и излишков среды, обеспечить асептичес-е условия и практически полное отсутствие травм половых путей абл.5). Тщательно подбирая самок-решпиентов (выбраковка боль-х), контролируя их физиологическое состояние и материнские зтинкты, режим, правильность кормления, удалось снизить пост-оланташонную гибель эмбрионов и каннибализм реципиентов, что звою очередь позволило повысить рождаемость до 50% (табл.5). Ввиду невозможности использования нехирургических способов 5 работы с эмбрионами ранних стадий дробления был разработан I устройств для хирургической трансплантации (рис.8). Предложив микроинъекторы позволили в целом повысить надежность Грации по вводу эмбрионов в узкие проходы половых путей, что 1 таких мелких животных,как мышь, является лимитирующим фак-)0М.

Таолиьа о. аффектиьность нехлрургяческой тренсшшнташи бластошст разллчньх ланий мышей.

донор линии реципиент линии трансплантировано бластошст кол-во повреждений половых путей родилось ,,„„..„„. мышат в % от кол-ва мыыст пересаж< бласгои.

СВА/Сэ7Б/-6 США юи 0 26 26 ± 8,5%

Со'Д& 6 Сь^А 30 0 14 47 ±17,9%

СБ АД ас СВМ/А 30 0 15 50 ±17,9%

СВА/Со7В£6 Хё. 20 1 7 35 ±20,9%

СУМ, 6 1о 0 о 33 ±23,8%

сам СВА/Сэ7Ы/6 60 1 22 27 ± 9,7%

СВ1/А СоШб 60 0 18 30 ±11,6%

СВ'лФ {%к/Ььс 30 и 13 43 ±17,7%

7СЯ СВА/Со7В//6 20 0 5 25 ±18,9%

¡?ся СэТЪЬб 1о 0 6 40 ±24,8/6

Ш'ОГ.О: 400 2 1^1 33 ± 4,6%

Рис.8 лнъекторы для хирургической трансплантации: а) в яйцевод; 1-суже-нная часть капилляра, 2-стеклянный капилляр, 3-метал-лическйи поршень, 4-направляющий выступ, о-боковое отверстие, 6-элас-тичный стопор, 7-стеклянная трубка, 8-резш;овая прокладка, 9-пластико-вый держатель прокладки (8), 10-де-ьжатель прокладки, П-металический фиксатор, 12-рези-новая трубка, 13-

-эмбрионы; б) б матку: 1-суженная часть капилляра, 2-голстос-тенный капилляр, з-кикропгла, 4-эластичный стопор, 5-металиче-скии поршень, 6-резиновая'прокладка, 7-8-пластикоЕые держатели прокладки, ^-пластиковый поршень, хи-металяческий фиксатор, 11 - эмбрионы.

Сравнительный анализ полученных данных (табл.о,6) показал, что хирургическая трансплантация в целом более эффективна, чем нехирургическая. Она достигала от 4о до 637» (табл.6) рождаемости при трансплантации в яйцевод, и от 4и до 66% рождаемости при трансплантации в матку (табл.6 б).

Таблица 6. Эффективность хирургической трансплантации: а) эмбрионов 4-8-миклеточной стадии развития в яйиевод; б) блас-тоцист в матку различных линий мышей.

,онор реципиент ИЩИ линии

трансплантировано эмбрионов

родилось мышат

родилось мышат в % от кол-ва трацспл.эмбрионов

щ СВА/СоТВЛб 60 31 02 + 12,6%

Б^А 0о7В£ 6 80 36 45 + 10,9%

ВА/сзтб 7СК 30 57 63 + 10,0%

о7В/г6 Шк ПО' 62 56 + 9,2%

а) ИТОГО: 340 186 55 + 5,3%

Вк/СдШ 6 СВ^А 51 25 49 + 13', 7%

т/к 43 26 60 + 14,6%

ЗА//, ас Ш/к 47 31 66 + 13,5%

ЗА/СоТВй'б 32 17 53 + 17,3%

07В//6 зт. 19 11 58 + 22,1%

Ш СВА/Со7В/-6 45 23 51 + 14,6%

31УА СоТВЛб 48 26 о4 + 14,1%

Ш СВА/^ас 44 25 57 + 14,6%

Ж СВА/СбТВЛб 36 22 61 + 16,9$

ж СВА/Лас 25 12 48 + 19,6%

5) ИТОГО: 390 218 56 + 4,9%

У. Получение и скрещивание взрослых химер.

Возможность получения половозрелых химер отмечалась ранее <1ак-Ларен,1379). Однако прям.ые экспериментальные исследования этомства химер противоречивы. Оставались открытыми вопросы о )зможности скрещивания химер между собой, о расщеплении в по-жстве и возможности появления отклонений фенотипа. В наших ^следованиях после трансплантации химерных эмбрионов, Полуниных различными способами, .родилось 38 химерных мышат.

у\з агрег-ашонных химерных эмбрионов, с частями асинхронными ) срокам развития, например, 2-хклеточного с 16-тиклеточным, щучить животных с четко выраженными признаками химеризма не 1алось; обычно преобладали детеныши с признаками старшего за-щыша.То же самое наблвдалось при инъекции в бластоцель бластеров ранних стадий развития. Эмбрионы,полученные соединени-1 решшентного зародыша с одной донорской клеткой, как агре-шионные, так и инъекционные, также дали начало особям, фено-шически не отличающимся от линии донора пелого эмбриона. В 1учае инъекции двух и более клеток получить химер удалось. Но

:.о всех подобных случаях в хакерах преобладал репипиентный фенотип. Только при агрегапии равного количества донорских и ре-ылппентных клеток л янъекшш в бластоиель большей части клеток были получены химеры с равным отношением донорского и реии-пнентшго аенотипз. Таким образом, чем больше было донорских клеток в химерном эмбрионе, тем сильнее они проявлялись в родившемся животном, но при условии соответствия донорских и ре-ыипиентных клеток по стадиям развития. Анализ химер, полученных ¡шъекшей отдельных клеток под прозрачную оболочку, показал,что химеры всё-таки рождаются при агрегапии ьелиго зародыша с двумя тремя клетками от другого зародыша, но для этого необходимо, чтобы донорские клетки попали внутрь зародыша. Таким образом, в целом необходимо учитывать все три перечисленных условия в совокупности, т.е. только при попадании внутрь достаточного количества донорских клеток (бластомеров) синхронных по степени развития с реиипиентныш хиыеризм проявлялся фенотигшчески.

Репродуктивные способности химер оиенивали путем скрещивания их с родительскими линиями. Полученные по этому вопросу данные однозначно показывают, что межлинейные химеры мышей чаще всего обладают нормальной репродуктивной способностью, хотя среди них встречаются гермафродитные особи (8%). бесплодные, но так же,как и другие химеры, без резких стенотипических отклонений.

Проведено перекрестное спаривание химер между собой. Было обнаружено, что химеры нормально спариваются и дают плодовитое потомство (табл.7) С рис.9).

Рис.9 Аамера с потомством.

Проанализировано десять различных вариантов скрещивания химер между собой (табл.7). В первом и последующих поколениях во всех случаях получалось потомство, представляющее собой исходные линии и их гибриды. Расщепление шло примерно в том же соотношении, ±> каком соотносятся признаки родительских линий в химерах. ла протяжении нескольких поколений мышей - потомков химер каких-либо ренотипических отклонений от нормы не обнаружили.

Таблица 7. Скрещивание химерных особей.

химеры - самки льбиносн. пигмент, часть часть ъ %_в %

химеры - самш кол-во кол-во

альбиносн. пигмент, родив- мышат д"

часть часть шихся альби-

в % в % мышат носов

3SfA -*->СВА/Со?В^6 30%. 70%

Ш ^СЬА/0о7ВЛ6

Ш Со7В/*6 эи% а О %

Ш <*-»Со7В£6

7CR «е-"»СЬА/Со7ВЬ6 10% 60% ?CR <-^CbA/(jo7Bii 6

MA <- CbA/(Jo7iii6 30% 20%

iVri <- ОЗА/ОО7В46

C3A/Co7B^6 ¿0% 10% ftR*- ОЗА/СоТБбб

CB^A o0% CBWA 10%

CBWA

PU'B o%

ЭШ <~>

3U%

cbwa

CBWA -e-=>

4o% CBWA 10%

oO%

s'CR«-?

60%

CBA/Co7BZ/6

50% Со7ВД6

so%

CBA/Ziac 6o% CBA/Ca7Bi>6 55%

Со7ВЬ6 70% CBA/Co7BL6 5%

Co7B^6 55$ CdA/Co7BA6 8o%

CBA/Lac 50% CBA/Co7BZi6 40%

8

10

12 II

1 (13%) 0

2 (29%) 0

1 (10%)

3 (33%)

2 (50%) I (17%)

5 (42%)

6 (55%)

7 (Ь75ь) 9(100$)

5 (71%) 6(100$)

9 (90$)

6 (67$)

2 (50$) 5 (83$)

7 (58%) 5 (45$)

ЛТ0Г0: 82 мышенка, в среднем no 8 - 2 на одну самку, агрегаиионные химеры, инъекционные химеры скобках указана доля в % от общего кол-ва родившихся мышат.

Таким образом, скрещивание химеры-самки с химерой-самиом мою представить себе как модель восстановления исчезнувшего ви-i (рис.1: 111-1,2,в,4), если предположить, что удалось полу-1ть этих химерных жиеотных с клетками исчезнувшего вида, регулированными, например, после криоконсерваши.

ВЫВОДЫ

Разработан одноканальный двухтактный метод вымывания доим-¡анташонных эмбрионов у мышей, йетод позволяет: а)предотвра-ть неконтролируемые потери эмбрионов, б)обеспечить асептичес-е условия, в)шлучать до 5 эмбрионов из каждого рога матки ■и естественном спаривании и более 10 эмбрионов при суперову-ции, г)практически полностью исключить повревдения половых тей.

Предложен комбинационный метод получения химерных эмбрио-в, позволяющий работать с ограниченным количеством донорского териала. Метод дает возможность в несколько р'аз по сравнению известными сократить количество используемых донорских клеток счет эффективной инъекции отдельных бластомеров эмбрионам

9

7

6

9

4

6

ранних стадий развития.

3. Разработан метод нехирургической трансплантации эмбрионов, основанный на принципе прямого механического переноса зародышей в рог матки через полости половых путей. Метод позволяет: а)ус-транить потери и повреждения эмбрионов, посредством заключения их в закрытую камеру, б)предотвратить попадание в половые пути воздуха и излишков культуральной среды, в)повысить рождаемость до 50%, г)обеспечить асептические условия и практически полное отсутствие травм половых путей.

4. Разработаны устройства, повышающие надежность хирургической трансплантации эмбрионов в матку и яйцевод. Предложенные микроянъекторы позволяют при трансплантации как в матку, так и в яйцевод достигнуть рождения в среднем 55% от общего количества пересаженных эмбрионов.

5. Получено 38 химер различных линий мышей. Показано, что вне зависимости от способа получения химерных эмбрионов наблюдается корреляция между числом, стадией развития, расположением донорских клеток относительно рещпиентных и фенотипом химер.

6. Получено потомство в десяти различных вариантах скрещивания химерных особей между собой. Выявлено расщепление на исходные линии и их гибриды. Обнаружено, что расщепление идет в том же соотношении, в каком соотносятся признаки родительских линий в химерах. На протяжении четырех поколений мышей-потомков химер фенотишческие отклонения отсутствовали.

7. Предложенные экспериментальные подходы, включающие методы получения химер и восстановление генотипа путем их скрещивания, в совокупности, могут быть рекомендованы для работ с редкими и исчезающими видами, как возможный путь реализации их генетической информации.

список работ, опушмкшанных по теме диссертации.

1. Вепринцев Б.Н., Крастс И.В., Гахова Э.Н., ¿^ежевикина Л.¿Л., Березовская О.Д., Зубин iVi.H. - Отчет за IS84-I985 гг. по программе сотрудничества стран-членов СЭВ и СФРЮ, Пущяно, ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1S86, с.301-302.

2. Зубин М.Н., Вепринцев Б.Н. Нехирургическая трансплантация зародышей у мышей. - Онтогенез, 1987, т.18,М, с.434-437.

3. Зубин М.Н. Устройство для трансплантации эмбрионов млекопитающих. Авт.свид. И287871, Бюлл. "Открытия,изобретения......",

1987, №5, с.28

4. Зубин М.Н., Вепринцев Б.Н. Химеры мышей, методы, проблемы, перспективы. - Консервация генетических ресурсов. Пущияо, ОНТИ

НЦБИ АН СССР, 1988, с.1-41.

5. Зубин М.Н. Химеры как возможная модель для изучения морфо-генов. //Тез.докл.Морфоген-2. Пущино, 1988/ - Онтогенез, 1988, т.19, №5, с.¿39.

6. Зубин М.Н. Комбинационные химеры млекопитающих. Вестник ЛГУ, 1989, сер.З, вып.2, МО, с.103-105.

7. Зубин М.Н. Устройство для нехирургического вымывания доимп-лантационных эмбрионов у мелких животных. Авт. свид.Ж482690, Бюл. "Открытия, изобретения ....", 1989, 1420 с.33

I

В печати.

Зубин М.Н. Устройство для трансплантации эмбрионов млекопитающих. Решение о выдаче авторского свидетельства от 5.02.88г.

Зубин м.Н. Межлинейные химеры мышей. //Тезисы конф.молодых ученых/. Пущино ОНТИ НЦБЛ АН СССР, 1989.

Зубин М.Н. Проблема получения химерных животных. //Сб.по мат. конф. Создание генетических коллекций лабораторных животных. Пущино, 1989 г./

Т-11512 6.09.89 г. Зак. 2048Р Тир. 125 экз. Уч.-изд.л. 1.0

Отпечатано на ротапринте в 0НТИ НЦБИ