Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение, генетическая трансформация и использование эмбриональных стволовых клеточных линий

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение, генетическая трансформация и использование эмбриональных стволовых клеточных линий"

Р Г 6 од

9 т1 * * 1 -'г-р.о

I I . С,

всеросс и иски й научно- е !с с11е до вате льск и й институт экспериментальной ветеринарии имени я.р. коваленко

российская академия сельскохозяйственных

НАУК

На правах рукописи

Полежаева Ирина Анатольевна

ПОЛУЧЕНИЕ-,-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ

03.00.23. - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени канцицага биологических наук :

МОСКВА - 1993 г.

Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии отдела биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института животноводства, в лаборатории генетики развития Медико-генетического центра РАМН и институте молекулярного животноводства университета Людвига Максимилиана (Мюнхен).'

Научные руководители: академик РАСХН Л.К.'Эрнст,

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Заслуженный деятель науки РСФСР Л П. Дьяконов (ЕИЭВ);

Ведущее учреждение - НП Биотехнологический центр по животно-

на заседании Специализированного совета К 020.28.01. при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я Р. Коваленко.

Адрес: 109472, г. Москва, Кузьминки, В11ЭВ. . С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ. Автореферат разослан " (о " ЛЛ&лР, 1993 года.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат ветеринарных наук Ф. Г. Тереикоь

проф. Г. Брем ( ФРГ).

кандидат биологических наук А. О. Бенюмов (МГУ).

водству РАСХН.

Зашита состоится

Л. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Эмбриональные стволовые (ES) клетки -плюрипотентные клетки, полученные непосредственно из эмбрионов млекопитающих предимплантациснных отадий развития. ES клетки мыши способны длительно расти в культуре, и при определенных условиях сохранять свой плюрипотенгный статус. После реинтро-дукции в полость бластоцисты и последующей трансплантации в матку ложнобеременной самки, ES клетки, как пп=>г\:-.г, участвуют • в образовании всех тканей и органов, включая линию половых клеток, химерного потомства.

ES клетки представляют собой новый генетический инструмент, который используется для различных целей: как. модель in vitro (Martin & Lock, 1983; Doetschman et al., 1985) эмбрионального развития млекопитающих; для изучения регуляторных элементов генной экспрессии у химерных животных (Takahashi et al. , 1988); для получения трансгенных мышей (Robertson et al., 1989; Gossler et al., 1986) и как новый путь для идентификации регуляторных генов развития (Gossler et al. , 1989). Главный интерес представляет возможность осуществления экспериментов по гомологичной рекомбинации ES клеток и получению швей с детерминированными свойствами (Baribault & Kemler, 198Э).

Перенос генов, опосредованный трансформированными ES клетками, имеет ряд преимуществ. Генетически трансформированные ES клетки можно подвергать скринингу по критериям, наилучшим способом удовлетворяю®™ требованиям изучаемой экспериментальной проблемы. Целостность конструкции, введенной в ES клетки, всегда может быть проверена перед инъекцией клеток в бластоцисту. Использование ES-клетсчных линий создает возможность воспроизведения условий эксперимента, что ке может быть достигнуто при использовании других методов трансгенеза. Это свойство дает, преимущества при тестировании вновь созданных векторов (Gossior et al. , 1986 ).

ЕЗ клетки, подученные от домашних животных, могли бы открыть путь для новых подходов, облегчить и улучшить получение трансгенных сельскохозяйственных животных по сравнению с широко используемым методом микроинъекций в пронуклеус. Однако, до настоящего времени нет положительных данных о способности ЕЗ клеточных линий, полученных от различных видов млекопитающих, участвовать в формировании химерного организма.

В то ке воемя несмотря на то, что ЕЗ клетки мышей были изолированы более 10 лет назад, число ЕЗ клеточных линий, способных давать начало линии половых клеток, все еще ограничено. Причем, все указанные выше эксперименты были проведены с ЕЗ клеточными линиями, полученными от инбредной 129/Зу линии мишей. Таким образом, метод получения ЕЗ клеточных линий остается недостаточно отработанным'даже у мышей, которые являются самым изученным объектом среди млекопитающих. Отечественная литература не содержит данных по получению химерных животных с использованием эмбриональных стволовых клеточных линий, а также по их генетической трансформации.

Яель' и задачи исследований. Целью исследований являлась отработка биотехнологических приемов получения эмбриональных стболовых клеток мыши, их генетической трансформации, а также использование ЕЗ клеток для получения генеративных химер.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- отработать методы получения ЕЗ клеток;

- сравнить.влияние различных методов выделения внутренней клеточкой массы (ВКМ) и различных культуральных условий на эффективность получения ЕЗ клеток;

- провести ритровиручную трансфекцига, сравнить ее эффективность с шешшизя литературными данными но другим- методам трансформации ЕЗ клеток;

- отработать метод получения химер с использованием ES

клеток;

- проБести оценку химерных мышей на их способность передавать потомству ES генотип.

Научная новизна. Научная новизна работы заключается в том, -что вперrde в нашей стране подучены стабильные ES клетки мыши. Шиорипотентность полученных ES клеточных линий подтверждена тестом на специфичен«™: активность щелочной фиефатгзы, а также способностью ES клеток образовывать змбриоидные тельца в культуре.

Получены химерные мыши при использовании клона Б/43 D3-ES клеточной линии, одна аллель CNTF гена у которого инактивирова-на с помовфю гомологичной рекомбинации (CNTF-D3). Три из полученных химер оказались генеративными (передавали потомству ES генотип).

Путем ретровирусной инфекции конструкцией pPSneo (R С. Прасолов, И М. Чумаков, 1988), получены генетически трансформированные ES клетки, содержащие бактериальный ген neo, придающий клеткам устойчивость к антибиотику генетицину G418.

ИроЕеден сравнительный анализ ретровирусной инфекции с другими методами введения чужеродных генов в ES клетки. Показана более высокая эффективность (на один-два порядка) ретрови-русного метода трансформации по сравнению с литературным! данными по трансформации ES клеток метолом злектропорации и кальций- фосфат/ДНК преципитации.

Практическая значимость. В процессе экспериментов представлены данные показывающие влияние различных культуралькьк условий на эффективность получения стабильных ES клеточных линий из бластоцист С57В]/6 линии мышей. Представлены практические" рекомендации по получению инъекционных химер мыши с использова-

нием Е5-03 клеточной линии. Показано, что в качестве реципиент-ньк б .-ас то цист предпочтительней использовать линию . мышей С57В1/6. Сочетание СЫТГ-ОЗ — С57Е1/6 дает Солее высокий процент как химер среди потомства, гак и генеративных химер по сравнению с сочетанием СМТГ-ЭЗ — Ва1Ь/с.

Результаты по трансформации Е5 клеток ретровирусной инфекцией показывают перспективы ло использованию конструкции рРЗпео в экспериментах по введению чужродных генов в ЕЗ клетки.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на первой республиканской научной конференции Украины " Биотехнологические достижения и перспективы их развития" (Львов. 1990); на 44-й научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых ВИЖа ( п. Дубровицы, 1991); на VI съезде общества генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова ( Минск, 1992); на Всероссийской конференции " Клеточные культуры в биотехнологии и ветеренарии" (Москва, 1993); на семенарах лаборатории генетики развития Ыедико-генетического научного центра РАШ и лаборатории клеточной инженерии ЕИЖа ( 1991-1993).

Публикации. Ло материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературу, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 7-ю таблицами и 23-мя рисунками. Список литературы содержит 124 источника на русском и иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Биологический материал

Для получения эмбриональных стволовых клеток использовали

мышеА инбредной линии C57BI/G.

Фидерный слой является необходимым элементом в процессе изоляции и поддержания ES клеток з недифференцированном состоянии. В качестве фидерного слоя использовались перевиваемые клеточные линии фкбробластов NIH ЗТЗ и ST0, любезно предоставленные институтом канцерогенеза, а также первичные эмбриональные фибробласты мыши. При достижении монослоя фидерные клетки ыито-. тически инактивироЕмчсь либо с использованием митомицина С,. либо рентгеновским облучением (5500 rad).

Основной средой для культивирования эмбрионального материала и эмбриональных стволовых клеток служила среда альфа-MEM (Bibco, England обогащенная 10 Z FCS (сыворотки плода теленка) и 10 X WCS ( сыворотки новорожденного теленка) (Gibco) с добавлением 2-ыеркаптоэтанола Культивирование клеток перевиваемых линий проходило в среде DMEM с 10 X KCS.

EEL- кондиционированная среда была использована для получения ES-клеток мышей в отсутствии фидера и готовилась по прописи, лредложнной Gossler ( 1989 ). Клетки BRL были любезно предоставлены проф. Kemler.

Трансфе-кдию ретроЕирусным вектором проводили на эмбриональных стволовых клетках, полученных из эмбрионов мышей линии 14 C0S/G1 w ( Institut Гиг Tierzucht und Tierverhalten. Mariensce, Gerrrany). Линия клеток упаковщиков у- 2, продуцирующая ретровирусяый вектор pPSneo с геном резистентности к антибиотику генетицину ( G-418 ) .любезно предоставлена "д.б.н. В. С. Прасолов™ из института молекулярной биологии. Клетки,-включившие последовательности гена neo, приобретают способность* синтезировать фермент - неошцин!$осфотрансферазу, ннатанвирую- _ -тую G-418 - синтетический аналог неошнина. Таким образом, '. обеспечивается селекция трансформированных клеток.

Для получения мутантных мышей использовали клон эмбриональных стволовых клеток 5/43, полученный на основе D3-ES клеточной линии. Одна аллель CNTF (ciliary neurotrophic factor) гена была инактивнрована с помощью гомологичной рекомбинации Masu et al. (неопубликованные данные).

При получении химер путем инъекций CNTF-D3 клеток в-полость бластоцисгы в качестве доноров бластоцист использовали - Ва1Ъ/с и С57Б1/6 линии мышей. Реципиентами являлись мкш линии NMR1. Для анализирующего скрещивания с целью выявления генеративных химер использовали ;,!ьлаей линий C5VB1/6 для скрещивания с инъекционными химерами CNTF-D3 -<- С57В1/6 и NMRI для скрещивания с COTF-D3 — Balb/c (Рис.1).

2. 2, Приборы и оборудование Стерильность при пересеве клеток, а также проведение личных манипуляций с клетками и эмбрионами обеспечивалась проведением работ в ламинарном боксе с подачей стерильного воздуха производства фирмы Flow Laboratories. Инкубация клеток проходила Б C0Z~ инкубаторе с увлажнением воздуха и автоматической по-дач'ей C0A, прс::г-геденным той ¡ке фирмой. Для получения сверхчистой воды, используемой при производстве сред применяли деиони-аатор еоды Elgastat UHQ (ELGA). Манипуляции с клетками проводили под инвертированным микроскопом ЮМ фирмы "OPTON", оборудованным фотонасадкой Nicon F-301.

2. 3. ИЗОЛЯЦИЯ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ

Лля получения эмбрионов на 3,5 сутки беременности забивали самок методом цервикальной дислокации и отрезали рога матки в местах соединения е яйцеводом и ее шейки с влагалищем. Вводя , инъекционную иглу, соединенную со шприцем, в просвет рога матки

С57В1/6

Получение колоний Е5 клеток нз бяаегещиет на фздеркол слое фябробластов

Трансфо^шш Гомс

нгзстоцисты еолучвнкью от С57В1/6

ш Ва14,/с

Гомологичная рекомбинация Селекция к скрининг

Трансплантация йгаотсцкат лсшюбвремэнной самке

Инъекция — генетически модифицированных ЕВ ялаток в бластоцисту

Раза»Дакке химер

длффарекцирозка в гморяовдные тела

Тест на активность щелочкой фосфатазы

Изучение развития

X

03(129 5*)«-С57 3/6 а С57 31/«

^25.

03(129 МЪ/е » МШИ

"Агути окраска указывает на передачу генотипа эмбриональных стволовых клеток потомству

Рис. I. Схема получения трансгеннкх мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток

- ft -

co стороны личнис.'! промывали Ü, Ъ tu írE среды с ВСА (бычьим сывороточным нльоуадшом!.

Для изоляции ES клеток использовали несколько способов- спон-танныЛ БЫ-КО.'; из zona pel lucida, удаление zona pel lucida ярона-зой и ¡•азд'ш.чярургичес'кое выделение ВКМ (внутренней клеточной маоеы).

Для удаления 6лестя;а?зй оболочки (zona реНи^а:*) эмбрионы переносили группами по ft-6 штук в кашпо 0,5 %--ного раствора проказы (Serva) под парафиновым маслом

Яи.мунолис'/рг^ческзе ьыделенну ВКМ включало: удалении гоп& pellucida с помощью 0,5 1 приказы-, инкубацию с антисывороткой (кролик против мыши!,- инкубации с комплементом морокой свинки, вызывающим лиаис клеток трофэктодерыы; удаление лизировавшихся трсфэтодермальных клеток путем пипетирования и освобожзние ЕКМ.

БКМ и BKÍ»-колонии (группа клеток образующаяся при прол;;4.?-~ рации внутренней клеточной массы или ВКМ разрастание) культивировали в присутствии фидерного слоя и бе<» него. Обычно, на а-Ь сутки пролиферации in vitro клетки внутренней ¡щеточной массы формируют характерную колони» возвышающуюся в форме шапочки, состояпую из Мс-иКйх клеток с крупными ядрами. Первичные колонии соответствующей морфологии изолировали, используя пастеровскую пипетку, отмьгеали фоефатко-солевым буфером и пёреносили в каплю 0,25 2-ного раствора трипсина < 0,02 Z раствора ЗДТА (Gibco). Диссоциировали с использованном пастеровской пинетки под постоянным визуальным контролем, используя инвертированный микроскоп. Суспензию клеток переносили в каплю культуральной среды с сывороткой для ингибирования трипсина и затем помещали на фидерный слой.

2.3.1, Т«стяроьанкг EZ клеток in vitro Способность обг/гйоьывать зы&рйоидиые тельца, по мнению

Robertson, Bradley (1686) и Evans с соавторами (1990а), является одной из характерных черт колоний ES клеток, поэтому мы рассматривали это свойстео эмбриональных стволовых меток как тест на подтверждение плюрипотентности in vitro.

Эмбриональные стволовые клетки обладают высокой активностью эндогенной щелочной фосфатазы (ALP), это свойство такие использовалось для диагностики in vitro (WobusA.U et al., 1984), Цитохимическое окрашивание сгюдизсн к связыванию ALP с субстратом нафтол AS-BÍ фосфатом (Sigma), в результате которого высвобождается синий пигмент.

2. 4. ТРАНСАКЦИЯ ES КЛЕТОК РЕТРОБИРУСНЫМ ВЕКТОРОМ pPS neo

Трансформацию ES клеток мышей линии 14C0S/G1W осуществляли с использованием упаковывающих клеток у- 2, продуцирующих рет-ровирусный вектор pFS neo. Перед проведением трансфекции определяли титр вируса на клетках линии MIH ЗТЗ, суммарную культуру грансгенных фибробластов NIH ЗТЗ/pPSneo, полученную в результате этого использовали в дальнейшем в качестве резистентного фидерного слоя при проведении селекции es клеток.

Инфицирование ES клеток проводили двумя способами:

1) путем однократного добавления ретровирусного еуперна-такта к культуре ES ¡слеток;

2) путем непосредственного культивирования ES клеток на клетках У ■■ 2, продуцентах ретровирусного вектора pPSneo.

Об экспрессии гена neo в составе ретровирусного вектора pPSneo судили на основании роста клеток з среде с антибиотиком Ü41S и образования трансгенных колоний.

ES/pPSneo клетки перед проведением молекулярко-генетичес-í.orn анализа культивировали в отсутствии фидерного слоя с использованием BRL-кондиционированной среды.

Еыявление чужеродного генетического материала в геномной ДНК стволовых клеток проводили методом блот-гибризации по Сау-аерну ( Маниатис, 1984).

2. Б. ПОЛУЧЕНИЕ ИНЪЕКЦИОННЫХ ХИМЕР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЕЗ КЛЕТОК

Самым распространенным методом создания инъекционных'химер является инъекция Е5 клеток в полость бластоцисты.- Иластоцисты вымывали на 3,6 день после суперовуляции от доноров линий С57В1/5 и Ёа1Ь/с, которые успешно использовались как реципиент-ные для Е5 клеточных линий полученных от 129/Бу линий мышей. Для увеличения числа предимплантацпонных эмбрионов овуляцию стимулировали гонадстропинами ГСЖК и чХГ, вводя их перед спариванием самкам в возрасте 6-8 недель. Мы использовали интервал между введением гормонов 44 часа и дозу обоих гормонов 5 И. 2, и 7 НЕ.' на животное для 8а1Ь/с и С57В1/6, соответственно. Еь:.-*;*-вание эмбрионов проводили также, как и при спонтанной овуляции (2. 3.).

Для микроинъекций использовали СЛТР-ВЗ клетки, культивируемые в средней плотности, без признаков ди<|:фэренцировки. Дезагрегацию клеток проводили раствором 0,25 X. трипсина и 0,01 %. ЕОТА около 5 минут при комнатной температуре. Мягкая дезагрегация клеток является важным условием успешного получения инъекционных химер, поскольку при разрушении большего числа клеток происходит их склеивание, приводящее, к сложностям при инъекции.

- ' ' Для микроинъекций использовали чашку Петри с диаметром 100 мм.- Каплю Ш среды + БСА помещали в центре этой камеры и покрывали зквилибрироЕанным -жидким парафином. Суспензию стволовых клеток, подготовленную как указано выше весдили б каплю со средой. Во время инъекции бластопмсгу удерживали держащей пипеткой за счет присасывания; во избежание движения в верти-

киль ной плоскости -мбрион опускали до касания дна инъекционной к.ч!л-1'Ы В ишекшонну» пинетку набирали клетки для одной инъекции, затем инъекционную пинетку подводили к поверхности эм-сриона и ьводили в полость бластоцеля, С помощь» мккроинъектора кдоткк «н'юииронали в полость блаотоцистн. После удаления инъекционной пинетки, и сжатия эмбриона, ЕЗ клетки вступают в контакт (; ьнутрггшой клеточной массой, Проинъещфованные змбрионн

э

культивировали в к> при 37 С, где они реэкспандировалиеь

б течении 30-60 минут.

Экспандкровниньр бдастоцнсты трансплантировали в матку локкобепеменннх самок на 2,5 сутки после выявления вагинальных пропек. Потомство обычно получали на 17 день после трансплантации.

В случае, когда эмбриональные стволовые клетки CNTF-D3, произошедшие от эмбрионов 129/Sv линии мышей, инъецировали в бластои'.исты альбино линии Balb/с химеригм выявляли немедленно после рождения по темной пигментации глаз. Если С57В1/6 бласто-цастн чсао.з/'с.огались как реципиеятные, химеризм определяли спустя неделю после рождения по присутствию на шерстном покрове участков с окраской " агути В возрасте около 8 недель химер скрешлвали для выявления передачи ES-клеточного генотипа потомству. Мы использовали С57В1/6 и MMRI линии мъией для спаривания f химерами основанными на С57В1/6 и Balb/c, соответственно. Присутствие трансгена в половых клетках выявлял!! по появлению б потомстве окраски " агути ".

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Получение и тестирование in vitro ES клеток

В наших .экспериментах использовано 95 эмбрионов мышей на

- -

•талаи поздней бластоцисты. Для изоляции ES клеток использовали •..азлачнь» фидерные системы-, освооодееяие от гопа peí lucí da осу-11^ствлйлй с помоаь» прогаан. гадав использовали бластогисть спонтанно вышедшие ял иопа peí'lucida

Результаты экспериментов по получении ыышинных ES клеточных линий представлены к Табл. i Как видно из табл. '.i. бласто-цисты освобожденные от гона peJJLwuia прикрепляются к субстрату лучие (89,4 %). чем интактные í целке) бластоцисты (64,Н sfe 95 Одастсциех 32 были культивирована на фидерном слое- ньрвичиых эмбриональных фабробдастоь (ШФ), 31 на фидерном слое перевиваемых фибробластов ÍI1H ЭТУ и потальные 3í¿ бластоцисты культивировали без фидерного слоя., с использованием 8Rf,--кондиционированной среды. Хотя 22 иг 3Z зыорионов, культивируемых без фидера, прикрепилось, жизнеспособность змйрионоь оы*а низкой и только fi и? них сформировали разрастание ВХМ, Самая высока* способность формировать ВКК разрастание отмечена лри исиодоо вшши ПЭФ, в этом случае 20 из 27- ш. прикрешшашся к субстрату эмбрионов дали начало ВКМ колонкам, которые был?, пригодны для дезагрегации.

Колонии, состоящие из малого числа круглых клеток с большим ядром и минимальным количеством цитоплазмы, были охарактеризованы гак колонии ES-подсбных клеток, Клетки в таких колониях расположены плотно друг к другу с трудной визуализацией отдельных клеток- Пересеянные клетки образовывали новые колоний, причем многий из них на нервы;-; пассажах даф^репцировались. В наших -экспериментах мы наблкдеш. олчдущж- типу диф^реииаро • ванных клеток: гигантские клетки тро<ойла<лч>, фиб^областоподоб-ные и эпит&лиоиодобные. Последуицас пассажи ирг>во;.иль только с колониями ствох&юлс ¡слеток, имевши/ епёции«че«кук;

Как показывает Табл. 1. , фидерний слой юлг^т важное значение

Таблица 1

Зффективность получения мышиных Е5 клеточных линий из блаетоцист, культивировавшихся при различных условиях

ОсьсОождение! Фидерные ■ Количество, шт. i Сформиро-; Получено Е2

от zona pei-i систеш ¡культизи-i прикрепив-! вано ВКМ i клеточных линий

lucida i !руемых i шихся змб-i разроета-i —' ~ -

* 'эмбрионов! рионов• ! кий, эт. ; 1 гаесаж 5 пассаж

i i БНЬ-к. среда ! 16 ! 9 ! 2 ¡ ! ~

Спонтанное i ПЭФ ! 16 1 Г2 ! 8 1 4 { 2

i i И1Н ЗТЗ ! 16 ¡ 10 ! 3 1 О ' к. 1

t ВЙЬ-к. среда ! 16 со 3 ! 1

С ПОМОЩЬЮ ! ПЭФ I 16 ! 15 ! А 0 1С i 0 1 1

ПрОНЕЗЫ ! N1Н ЗТЗ ! 15 1 14 ! б ! ^ 1

яри получении ?мбрйонаяышх стволовых клеточннх линии. Только при >; с п о л i > з о ь aL f л и первачннх змбриинайьиш Фиброолаотой в качестве- фидерногс ело« бьш, получены змбриональнме era? дог»« клетки, плар;«|с.геитность ko-iouuz оыла подтверждена ь доопейюм тестом на специфическую нтшность елочной фос{а?и»ы и их способность*. образовывать экбрпоядные тельца. При использований только HRL- ковдищганиройанной среды в отсутствие ^''.".'фного слоя не только не были получены первичные ES клетки» но в значительно снижается обрасованкс. ВЖ-разрастаний, которые е процентном отношении к числу змбр:ьгаоь лрикрешшиихен к субстрат* составляет всего 22,7 X при культивировавj-.i¡ с использованием БКЬ-кон -диодонкрованной среди, 74,1 X при иеиолььовании ь качестве фидера ПЗ-1> и 37,5 X - фидира КШ ЗТЗ. Способ осюбоадзний от zona р^З lucida oKssusiis: некоторое влияние на прикрепление зыбрио-ноб. Число црикрепиьшхея &шриоков яра удшь-нт- ~ '.п.-pel lucí da проназой выл«, чем при спонтанном ьыходе из zona pellucida, но при этом ВК." разрастания дакм- начало еерзлчкым ES колониям в 54,5 Z случаев при спонтанном выходе zona

pellucida и только в 22,2 Z случаев при использовании проназы. Таким образе;.:, предпочтительнее использовать при получении ES клеток спонтанно "вылупившиеся" бластоцисты.

Полученные в результате эксперимента эмбриональные стволовые клеточные линии кариотилироЕзлпсь две из них имели 38 XX гсариотип и одна 33 XY.

При имыунохирургическом выделении ЕКМ, мы неиедозешохи как фидер для дальнейшего культивирования только лорвичиш эморко-иальные фибрсбластк, как оказавшие сл наиболее " подходяща»® по нашим предварительным экспериментам. Кесмстр.: на эт-о, паи не удалось получить экбриональну. стволовые клетки этик способом.

Наиболее1 простым способом тезтироьанкя ES клеточных линий

¿а плюрипотентность является in vitro дифференцировка. Мы индуцировали образование эмбриоидных телец путем культивирования ES клеток в суспезии. На 3-4 сутки культивирования ES клетки формировали простые эмбриоидные тельца, представляющие собой плотные шаровидные образования.

Специфическая активность ALP у полученных нами ES-C57B1/6 клеток оказалась высокой, о чем свидетельствовало темносинее окрашивание колоний, эмбриональных стволовых клеток.

3.2. ТРАНСФЕЗЩИЯ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Попытка прямой ретровирусной инфекции ES клеток, путем однократного добавления суяернатанта оказалась безуспешной, пос-

ь

кольку титр вируса составлял 2,4 х 10 с. f. u. /ml (колонеобразую-щих единиц на 1 мл ретровирусного супернатанта). Это согласуется с данными Robertson, которая указывает на эффективность этого подхода только при очень высоком титре вируса, превышающем £

10 с. ГЛ1. /ml.

В дальнейшем мы использовали альтернативный метод:, инфицировали 4,95 х 10 ES клеток путем непосредственного культивирования их на метках V •• 2, чью митогэтескую активность подавляли митомицином С в присутствии 5 мкг/мл полибрена. После 5 дней культивирования ES клеток на У ~ 2 фидерном слое, продуцирующем ретровирусный вектор pPSneo, инфицированные ES клетки трипсини-зировали и переносили для проведения селекции на " генети-цин-резистентный" фидерный слой NIH ЗТЗ/pPSneo. Селекция потребовала проведения цитотоксического теста культуры ES клеток -на различные дозы антибиотика О 418, который показал, что эмбрио-. нальные стволовые клетки имеют высокую чувствительность к гене-тицину, так уж при содержании его в дозе 100 мкг/мл все ES клетки погибают. Рабочая концентрация генетицина взятая для сё-

• "'.6 -

лекции Е5 клеток составила 400 ыкг/мл б 418

На 10-е сутки проведения селекции было сформировано 289 резистентных морфологически кегифференицировачных КОЛОНИИ ЕЗ/рРЗпео. Таким образом, | 495000 ; 289 - 1713 1 одна из 1713 клеток трансформировалась и еоотетвекно коэффициент грансформа-иии составил 0,583 х 10 , Дальнейшее культивирование клеток проводилось в селективных условиях,

Молекулярно-генетичеекий анализ интеграции чужеродной ДНК, проведенный методом блот-гибридизашп; по Саузерну показан, что в ДНК линии кле-ток Е5/рР5пео, трансформированной ретровирусным вектором рРЗпео, выявляется гибридизумпийея Вап-Ш фрагмент величиной 2500 п.н. , который идентичен по длине аналогичному фрагменту вектора рРЗпео. В образце ДНК линии клеток Е5, взятом в качестве негативного контроля, гибридизуюшихся последовательностей ДНК не обнаруживается.

После проведения траксфекции клетки Е5/рРЗпео кариотипиро-вали, модальный класс хромосом составил 39 ( 78 X метафазных пластинок от общего числа имели 39 хромосом), что свидетельствует о потере одной хромосомы. Вследствие этого, использование этих клеток для получения трансгекных ливотных не представлялось возможным.

3. 3. Получение химерных мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток В нашем эксперименте для получения инъекционных химер мышей было использовано 107 эмбрионов мышей, из них 21 эмбрион от доноров линии С57В1/6 к £5 эмбрионов - линии Ва1Ь/'с. Эмбрионы вымывали у суперовулироЕаздих доноров.

Для инъекции использовали 5/43 клон змбркои&лышх стволовых клеток СМТЕ-СЗ.

Наиболее подходящая ориентация внутренней клеточной массы блаетоиистн во время инъекции показана на Рис. 2. Лучшей позицией для введения инъекционной пипетки является место пересечения между двум« ¡<жтками трофоблаета, так так при этом эмбрион повреждается минимально и успешное проникновение в полость бласто-иистн достигаете» наиболее легко.

------------------ ' - - '' •>»•». '• # >ч

Рис. 2. Инъокпня Е5 ¡слеток в бластошсту мыши: а) вертикальная центровка инъекционной пипетки перед инъекцией; Ь) инъекционная пипетка вошедшая з полость бласто-цисты; с) инъекция Ш-14 ЕЗ ¡теток; (3) сжатие бластоцисты после инъекции, Ув.; об. 20х , ок. 10х .

Мы инъецировали 10 -14 эмбриональных стволовых клеток на Зластоцисту, что по полученным предварительным результатам дало ¡аибольгаий выход химерного потомства и высокий процент шерстного химеризмз (Уо1Г, 1992).

Таблица 2

Изучение способности клона СМТ 5/43 Е5-03 клеток продуцировать химер

Дате, маки-; ЭмОрноков 1 пуляцин 1 проинъециро-1 : вано и транс-1 ! планировано ! Линия бласто- цист 1 Беременное -!ти/переоадки I ! Потомство! ИТ. 1 ! Химер по! окраске 1 шерсти ! шт. ! Степень шерстного химеригмй пи п-так,/'

0i.C7.92 : 1 4 1 10 1 С57Е1/6 Ва1Ь/с | 1/1 2 ! 5 1 2 3 ! 90-95 30-80

09. 07. 92 ! 14 ! ВаШ/'с ! 1/1 8 ! 5 1 20-80

2C.0V.92 ; ■ 15 * 1 Ва1Ь/с 1/1 2 ! 1 ! 50

22.07.92 ; •10 ! 5а1Ь/с 1 1/1 б ! б 5-70

23.07.92 , з : 3 ! С57В1/6 Е'а1Ь/с ! 1/1 ! 1 ! о ! 1 ! 3 ! 95 40-70

28. 07. 32 ; 8 1 Ва1Ь/с ! 1/1 3 1 2 1 ? гибель

<9.07.92 : ! 14 ! 2 ! С57В1/6 8а1Ь/с ! 0/1 ! 1 ! ! I

30.07.92 1 24 ! Ва1Ь/с : 2/2 10 ! 8 1 20-70

Итого 1 ! 21 . 1 об ! С5731/6 Ба1Ь/о ! 8/9 ! 1 3 ! 37 ! 3 1 28 ! 90-95 5-80

- трансплантировано в яйцеводы

Таблица 3

Анализирующее скревдвание для выявления генеративных химер

Химера, Линия Пол % шерстного Родилось Из них

номер бластоцисгы! химеризма потомства! agouti

361-20 C57B1/G- 95 13 0

361-22 Balb/c cf 50 38 0

361-23 Balb/c ? ? 35 11 0

362-29 Balb/c 25 16 0

362-24 Balb/c 70 0 G

362-25 Balb/c <f 70 2 2

362-26 Balb/c <f 10 26 0

362-27 Balb/c <r 15 52 0

362-28 Balb/c cT 10 42 0

372-34 Balb/c cf' 15 21 0

372-36 Balb/c tf 15 66 0

361-21 C57B1/6 (f 95 27 5

372-35 Balb/c 30 34 0

372-37 Balb/c cT 5 57 о •

372-33 Balb/c cT 70 0 0

372-38 Balb/c ? 60 Cf / • 0

372-39 Balb/c ? 60 9 1

374-31 C57B1/6 ? 95 0 0

374-32 Balb/c ? 30 7 0

382-40 Balb/c <f 30 50 0 .

382-41 Balb/o (f 35 57 0 .

382-42 Balb/c сГ 10 29 0

332-43 Balb/c $ 70 .0 0 .

332-44 Balb/c $ 60 6 •о

382-45 Balb/c ? 10 13 0

393-46 Balb/c <f 60 50 0

Эффективность эмбриональных стволовых клеток клока СМТТ 5/43 продуцировать химер после инъекции в бластоцисть,- представлена в таблице 2,

& трансплантировали от 3 до 7 микронноецироЕанных эмбрионов в каждый рог матки.

Как видно из Табл. 2. в результате проведенного эксперимента было получено 31 химерное животное после ипгс";.:..-:; СИТ Г-'-03 ' клеток. Процентное отношение химерных по шерстному покрову животных к общему количеству полученного потомства было высоким, ' так у линии С57В1/6 она составило 100 %., а у линии Ва1Ь/с 75,7 7,. Окраска шерсти, как отмечалось, служит наиболее наглядной системой для оценки химеризма (М^гХг, 1965). Процент химеризма по шерстному покрову у инъекционных химер СМТР-03 —*- С57В1/6 составил 30-95 а у СКТГ-Ю— Ба1Ь/с химер Е-80 %. На Рьс. 3.

рис. 3, Хшериые мши Сп1Т-03 Ва1Ь/с

представлены семь мышей одного помета, полученные после инъекции CNTF-D3 клеток в бластоцисты мышей линии Balb/c, шесть из них химеры с разным вкладом генотипа эмбриональных стволовых клеток. ; .

В дальнейшем, 26 (из них 17 самцов) .из полученных химер были использованы для скрещивания с целью выявления генер&тив- -ных химер. Результаты" суммированы в таблице 3. Три из полученных химерных животных передали генотип стволовых клеток потомству. Это химеры: 362-25 <f Balb/c; 361-21 О^С57В1/б и 372-39 ^ Balb/c.

Таким образом, полученные результаты показывают, что не только бластоцисты, полученные от мышей линий С57В1/6 являются компетентными для получения соматических и генеративных химер, но и бластоцисты линии Balb/c могут использоваться для этих манипуляций. Кроме того химерные самки, также передают ES генотип потомству. В то же время частота образования генеративных химер з нашем эксперименте оказалась выше у линии С57В1/6, чем у линии Balb/c и составила соответственно 33,3 У. и 8,7 X от общего количества полученных химерных мышей.

ВЫВОДЫ

1. Получены 3 линии мышиных ES клеток С57В1/6 генотипа. Представленные результаты показывают, что для получения эмбриональных стволовых клеточных линий целесообразно использовать спонтанно вышедшие из zona pellucida бластоцисты, культивирую-, щиеся на фидерном слое первичных эмбриональных фибробластов. . •

2. Плюрипотентносгь полученных ES клеточных линий подтверждена тестом на специфическую активность вдэлочной фосфатазы, а. также способностью образовывать эмбриоидные тельца in vitro при

мг,

культивировании без фидерного сдоя.

3. Получена генетически трансформированная ЕЗ клеточная линия путем инфицирования ретровирусным вектором рРЗпео. Присутствие гена пео в геноме ЕЗ клеток подтверждена Саузерн-блот анализом.

4. Ретровирусный метод трансформации ЕЗ клеток с использованием вектора рРЗпео на один-два порядка эффективнее (коэффи-'циент трансформации 0,58 х 10 ), чем трансформация ЕЗ клеток

методом электролорацяи (0о&ЬзсЬшап,1988) и кальций фосфат/ДНК преципитации (КоЬоПзоп, 1987).

5. Получены химерные мыши путем инъекции СЮТ-БЗ клеток в бластоцисты мышей линии Еа1Ь/с (СЫТГ-03— Ва1Ь/с) и С57В1/6 (СМТГ-ОЗ — С57В1/6). Анализирующим скрещиванием выявлено 3 генеративные! химеры.

6. Для проведения микроинъекций БЗ-ЕЗ клеток, с гомологичной рекомбинацией гена СЬ'ТР, в качестве реципиентных предпочтительнее использовать бластоцисты мышей линии С57В1/6, которая дает 33 % образования генеративных химер от общего количества полученных химер, по сравнении с 9 X у линии Ва1Ь/с.

СПИСОК РАБОТ, 01!УБЛЖ)ВЛННЬК 1Ю МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Макаревич А. В., Полежаева I. А. , Смирнов О. К. Розробка методу використакня стовбурових клотик тератокарцином для о держания трансгенних тварик. Теьи допор!дей 1 республ^канська нау-кова кокфгреншя " Б^отехколопчн! доел жжения 1 перспьктиви 1х розвитку". Львов. 1990. С. 116.

2. 1.А. , ЗЬг^сЫг,ко N. 3. КеЬго'/^гиз ^аг«-Г"ес1юп оГ етЬгуоШс зи-ш се11ь. 1п1егпаиопа2 сопГегеисе оГ Ь1сЛесЬг«о1ойу. ШЬга. С2есЬоз1о\'а}ла 1991. ( в печати).

•3. Полежаева И. А. Тр&нсген&з эмбриональных стволових' кле-

ток, Бюллетень научных работ. Выпуск 105. Дубровицы. 1992. С. 85-88.

4. Федоров Л. U., Полежаева И. А. , Сгрельченко а С. , Соколов В. С. Получение эмбриональных стволовых клеточных линий (ES) мыли и изучение их свойств in vitro и in vivo. Материалы VI съезда общества генетиков и селекционеров им. Н И. Вавилова. Шнек. 1992. Авторский указатель, часть 1. С. 32. ..■-■■

5, Полежаева ТС, Вольф Э., Врем Г. Использование змбрио-¡ачьных стволовых клеточных линий для получение трансгенных мы-гей. Тезисы докладов Всероссийской конференции "Клеточные куль-•уры в биотехнологии и ветеренарии". Мэсква. 1S93. ( в печати).